CN118139986A - 用于重组蛋白生产的经遗传修饰的生物体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于产生表达目标重组蛋白的经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织的方法，所述方法包括将提供目标蛋白的稳定表达的植物核酸构建体引入所述植物、植物细胞、原生织质体或植物组中的至少一个步骤；其中所述植物选自菠菜属、莴苣属和芸苔属，优选地所述植物是来自芸苔属的可食用植物，并且所述核酸构建体是包含在植物中对于可操作地连接的DNA、可操作地连接的编码蛋白的DNA分子和3'非翻译区的表达有活性的调节序列的单一合成构建体。本发明还包括根据上述方法获得的核酸、细菌菌株和植物，以及从本发明的经遗传修饰植物获得的植物产生的蛋白。

Description

用于重组蛋白生产的经遗传修饰的生物体

技术领域

本申请涉及用于重组蛋白生产的经遗传修饰的生物体和获得其的方法。

背景技术

为了治疗慢性疾病，生物制药工业努力开发新的和创新的药物类别。历史上，他们已经开发了治疗和延缓癌生长的化疗药。然而，近几十年来，已经开发了新的策略，例如使用单克隆抗体的免疫治疗(Kunert&Reinhart,2016,#)。这些抗体通常使用哺乳动物细胞系(Hela、CHO等)制备/生产(Kelley,2009,#)。

这种经典的制备方法已经成功地开发了多种抗体。实际上，大多数批准的重组生物药物，特别是一些最常用的单克隆抗体(mAb)如阿达木单抗(抗TNFαmAb)或纳武单抗(抗PD-1mAb)是在哺乳动物细胞系中生产(Rajan A,Kim C,Heery CR,Guha U,GulleyJL.Nivolumab,anti-programmed death-1(PD-1)monoclonal antibody immunotherapy:Role in advanced cancers.Hum Vaccin Immunother.2016；12(9):2219-2231)。然而，由于复杂的基础结构需要和操作成本，这种方法具有局限性。此外，对于成本，还存在技术和安全限制(Kelley B.Industrialization of mAb production technology:thebioprocessing industry at a crossroads.MAbs.2009；1(5):443-452.)。例如，生物生产设施可以容易地被真菌或支原体污染，导致生产批次的丢弃(Nikfarjam L,FarzanehP.Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture.CellJ.2012；13(4):203-212.)。然而，大规模、高质量、可负担且安全的重组蛋白的生产，特别是抗体的生产是生物制药工业的优先事项，其仍然有待改进。

植物提供优于常规表达平台的若干潜在益处，并且证明了用于生产高价值蛋白的系统的可靠性。实际上，已经显示生物制剂(即，由生物起始材料制备的药物，包括使用重组DNA程序产生的那些)，包括经修饰的人蛋白，可以在转基因植物中产生以解决安全性、病毒感染、免疫反应、产率和成本的问题。美国专利号6,391,638和PCT WO2008/135991教导了用于来自植物细胞培养的重组多肽的商业规模化生产的生物反应器装置。美国专利号7,951,557、美国专利申请号10/554,387和11/790,991教导了用于在植物细胞中重组表达人蛋白的核酸载体的构建和表达。PCT WO2007/010533教导了用于肠内施用的重组人多肽在植物细胞中的表达。附加背景技术包括：Finck等人的美国专利号7.915,225、Finck等人的美国专利申请号13/021,545和10/853,479、Li等人的美国专利申请号11/906,600、Warren等人的美国专利申请号10/115,625和Gornbotz等人的美国专利申请号11/784,538。因此，近十年来植物分子农业方法的进步已经使植物成为具有吸引力的生产系统，其甚至可以在短时间内实现商业上相关的生产水平，并且许多植物生产的治疗性蛋白处于临床前和临床试验中且接近商业化(Paul,M.；Ma,J.K.Plant-made pharmaceuticals:Leading products andproduction platforms.Biotechnol.Appl.Biochem.2011,58,58–67)。

然而，在该新兴领域中仍然需要改进的可靠方法，其允许获得重组蛋白的更高产量，特别是在复杂多聚体蛋白如抗体的情况下。

大多数重组植物产生的重组蛋白，特别是重组抗体已经从经遗传修饰的烟草或从细胞系获得。此外，为了优化产率，竞争者通常偏爱瞬时表达。在植物产生的抗体的情况下，通常使用2个质粒和/或需要杂交分别表达轻链和重链的植物后代以获得全抗体(参见Edgue G,Twyman RM,Beiss V,Fischer R,Sack M.Antibodies from plants forbionanomaterials.Wiley Interdiscip Rev Nanomedicine Nanobiotechnology.2017；9(6):e1462；Rattanapisit K,Phakham T,Buranapraditkun S,et al.Structural and InVitro Functional Analyses of Novel Plant-Produced Anti-Human PD1 Antibody.SciRep.2019；9(1):15205；Shanmugaraj B,I.Bulaon CJ,Phoolcharoen W.Plant MolecularFarming:A Viable Platform for Recombinant BiopharmaceuticalProduction.Plants.2020；9(7):842)。

因此，仍然需要用于在植物中生产重组蛋白，特别是多聚体蛋白如抗体，以及用于生产多聚体蛋白，特别是具有高产量和安全性的生物类似抗体的经遗传修饰植物的更快和可靠的方法。

发明概述

本发明提供了对先前提出的技术问题的答复，并描述了在植物中生产重组蛋白，特别是多聚体蛋白的创新方法。

使用化学合成的核酸构建体(即从头合成的)，本发明人现在设计了获得植物产生的蛋白，特别是植物产生的生物类似抗体的更快、更可靠的方法。实际上，与本领域的传统技术相比，不仅从头合成更不易于发生DNA突变，而且本发明人能够组合使用大的单一核酸构建体(>2000bp)以稳定地转化植物。因此，根据本发明从单个核酸构建体(或表达载体)产生多聚体蛋白，其中通常使用载体的组合。因此，根据本发明，所述多聚体蛋白(通常是抗体)可以从单一经遗传修饰的植物产生。

最后，本发明的植物生产的蛋白通常在整个植物中生产，特别是在具有重要生物质生产的可食用植物中生产，进一步允许生产的高产量。

因此，本申请涉及用于产生表达目标重组蛋白的经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织的方法，所述方法包括将提供目标蛋白的稳定表达的植物核酸构建体引入所述植物、植物细胞、原生质体或植物组织中的至少一个步骤；

其中：

-所述植物选自菠菜属、莴苣属和芸苔属，优选地，所述植物是来自芸苔属的可食用植物，和

-所述核酸构建体是单一合成构建体，其包含在植物中对于可操作地连接的DNA、可操作地连接的编码蛋白的DNA分子和3'非翻译区的表达有活性的调节序列。

通常，该方法还包括通过从接受核酸构建体的植物、植物细胞、原生质体或植物组织再生转基因植物来获得包含稳定表达目标蛋白的DNA构建体的转基因植物的进一步步骤。

通常，所述核酸构建体还包含一个或多个以下序列：5'非翻译序列、信号序列、增强子序列、顺式作用元件、内含子序列、转录终止子序列(TTS)和一个或多个选择性标记编码序列。

在一些实施方案中，目标蛋白是多聚体蛋白，任选地其中目标蛋白是抗体。更具体地，根据本发明，目标蛋白是抗体，并且编码蛋白的DNA分子是单一合成分子，其包含编码抗体轻链或其抗原结合片段的核酸序列和编码抗体重链或其抗原结合片段的核酸序列。在一些实施方案中，所述抗体是抗PD-1，特别是所述抗体是纳武单抗。

在一些实施方案中，编码多聚体蛋白的核酸合成分子包含位于每个单体编码序列的3'末端的2个标签序列，任选地，编码抗体的DNA合成分子包含位于轻链编码序列的3'末端的标签序列和位于重链编码序列的3'末端的标签序列，任选地，编码蛋白的核酸分子编码与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％同一性的蛋白序列，任选地，编码蛋白的核酸分子与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少60％(特别是65、70、75、80、85、90、95、99或100％)的同一性，并且其通常编码与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％同一性的蛋白。

在一些实施方案中，可使用以下方法将核酸构建体引入植物或植物细胞中：

(i)直接DNA摄取方法或

(ii)农杆菌介导的植物转化，通常其中将所述核酸构建体插入农杆菌介导的植物转化二元载体的DNA边界重复序列之间。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下预步骤：

a1)通过将核酸构建体引入细菌菌株来制备转化体；以及

a2)使用所述转化体转化植物、植物细胞、原生质体或植物组织。

通常，根据本发明，菌株是农杆菌菌株，特别是根癌农杆菌(A.tumefaciens)菌株。在一些实施方案中，在步骤a1)中，使用二元载体系统获得细菌菌株，其中所述细菌菌株用如前所定义的T DRNA二元载体和vic辅助质粒共转染，或其中用如前所定义的T/DNA二元载体转染卸甲T DNA的根癌农杆菌菌株。

本发明还涵盖获得植物产生的蛋白的方法，其包括：

-根据如先前提及的方法产生表达目标重组蛋白的经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织，以及

-从所述经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织分离和任选地纯化所述植物产生的蛋白。

本发明还涵盖如前定义的核酸构建体，特别是二元质粒载体，通常其中二元质粒载体包含T-DNA区域中的选择性标记和T-DNA区域外的选择性标记。

本发明还涵盖含有如上定义的核酸构建体的细菌菌株。

本发明还涵盖来自芸苔属的经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织，其表达如前定义的核酸构建体，或用如上定义的细菌菌株转化，或根据本文所述的方法获得。

本发明还涉及通过本文所述方法获得的植物产生的蛋白或多肽，其用于治疗，任选地用于免疫治疗，任选地其中所述植物产生的蛋白为药物组合物的形式。

附图说明

图1抗体的合成构建体。是插入以在芸苔属中表达PD-1、纳武单抗的合成基因构建体的示意图。总共产生了三种纳武单抗合成构建体。CaMV35S＝花椰菜花叶病毒启动子；NOS＝胭脂碱合酶；*HIS 6X标签＝多组氨酸标签；**HA标签＝人流感血凝素衍生标签。

图2质粒的描述。是二元质粒VB210429的图示。合成质粒。A.CaMV35S-GFP，B.CaMV35S-纳武单抗(拟南芥密码子优化)，C.CaMV35S-纳武单抗(原始序列)，D.NOS-纳武单抗(原始序列)。标记所选择的限制性内切酶位点(Ascl、Pad、Pmel)。缩写包括LB＝来自根癌农杆菌Ti质粒的左边界，RB＝来自根癌农杆菌Ti质粒的右边界区域，KAN＝卡那霉素；Hygo＝潮霉素。基因元件的描述参见表1。

图3凝胶消化。是显示合成基因构建体克隆至质粒VB210429的限制性消化的照片示意。质粒在1％琼脂糖凝胶上运行。A.CaMV35S-GFP，B.CaMV35S-纳武单抗(拟南芥密码子优化)，C.CaMV35S-纳武单抗(原始序列)，D.NOS-纳武单抗(原始序列)。所用的成对限制性酶是ApaLI+AflII；ApaLI+XbaI；ApaLI+NcoI。M＝标记，GeneRuler 1Kb DNALadder；P＝未消化的质粒；D＝消化的质粒。

图4显示抗体的斑点印迹。是显示芸苔属叶中表达HIS和HA标签的免疫检测的照片示意。顶行：经遗传修饰的芸苔属；底行：成熟芸苔叶的农化。第1-4列：CaMV35S-GFP，CaMV35S-纳武单抗(拟南芥密码子优化)，CaMV35S-纳武单抗，NOS-纳武单抗(左至右)。

图5 GMO植物。是显示GMO芸苔属植物的照片示意。A.在发芽(DAG)的第11天的野生型芸苔属植物(对照)。B.在DAG的第40天的野生型芸苔属植物(对照)。C.在DAG的第11天的GMO芸苔属。D.在DAG的第37天的GMO芸苔属。

图6抗体数量。A.用6X HIS标签和肌动蛋白在GMO芸苔属植物中检测标签抗体的斑点印迹。B.测定化学发光信号强度的图表。这些图表允许信号强度之间的量化和比例比较。

图7重组PD-1与PiB001的免疫沉淀(IP)。A.蛋白免疫印迹证明哺乳动物细胞产生的重组PD-1抗原与PiB001的结合。经PiB001处理但不经PD-1处理的Dynabeads不显示抗PD-1抗体的信号(阴性对照)。然而，经PiB001和PD-1处理的Dynabead显示PD-1的信号(箭头)。B.使用蛋白G的IP证实重组PD-1的结合和下拉，随后用抗PD-1抗体进行蛋白免疫印迹。这些结果表明PiB001结合蛋白A/G并且能够诱导其重组抗原的IP。

图8来自人肺肿瘤的PD-1的免疫沉淀(IP)。A.来自人肺肿瘤裂解物的PD-1的IP证明PD-1的结合和下拉，随后使用抗PD-1抗体进行蛋白免疫印迹。B.人Fc的蛋白免疫印迹表明存在结合蛋白A的人Fc。这些结果表明PiB001结合原发性患者肿瘤裂解物中的PD-1和重组PD-1。

发明详述

在本申请中，除非上下文另有明确说明，单数形式“一”，“一个”和“所述”包括复数引用。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

在提供数值范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值(除非上下文另有明确说明)至下限单位的十分之一，以及在该规定范围内的任何其它规定值或中间值，都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，受限于在所述范围中被特别排除的界限。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些包括的界限中的一个或两个的范围也包括在本发明中。

除非特别提及，本发明包括本文所述的各种实施方案的任何组合。

定义

如本文所用，术语“构建体”用于指将DNA片段从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子。术语“载体”有时可与“构建体”互换使用。术语“构建体”包括环状核酸构建体如质粒构建体、噬菌粒构建体、粘粒载体等，以及线性核酸构建体，包括但不限于PCR产物。如本文所用，术语“植物核酸表达构建体”或“植物核酸构建体”是指包含编码核酸序列(在本文中也称为“目标核酸”或“转基因”)的核酸构建体，其与至少一个启动子可操作地连接以指导核酸在宿主植物细胞中转录，并且其通常形成表达盒。

本文所用的术语“合成构建体”是指如上定义的非天然存在的核酸分子。通常，如本文所预期，合成构建体是从头合成的或化学合成的。

如本文所用，术语“核酸序列”是指以RNA序列、DNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，上述的组合)的形式分离和提供的单链或双链核酸序列。

本文所用的术语“表达构建体”是指由重组DNA分子组成的表达模块或表达盒，所述重组DNA分子含有所需编码序列和在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的适当核酸序列。在原核生物中表达所需的核酸序列通常包括启动子和核糖体结合位点，经常与其它序列一起。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和聚腺苷酸化信号。

本文所用的术语“载体”是指能够在宿主细胞中复制和/或另一个DNA或RNA片段可以可操作地连接到其上，以便引起所连接片段的复制的DNA或RNA分子。质粒是示例性载体。质粒是最常用的细菌克隆载体。这些克隆载体通常含有允许DNA片段插入的位点，例如多克隆位点或具有几个常用的限制性位点的多接头，DNA片段可以连接到这些限制性位点。插入目标基因后，通过称为转化的过程将质粒导入细菌。这些质粒通常还含有选择性标记，通常是抗生素抗性基因，其赋予转化的细菌在含有特定抗生素的选择性生长培养基中存活和增殖的能力。转化后的细胞暴露于选择性培养基，并且只有含有质粒的细胞可以存活。

如本文所用，术语“编码蛋白的核酸分子”是指包含编码蛋白的核酸序列(通常为DNA序列)的核酸分子或序列。编码蛋白的DNA分子可以与DNA构建体中的异源启动子可操作地连接，用于在用重组DNA分子或其部分转化并因此包含重组DNA分子或其部分的细胞中表达蛋白。

如本文所用，“可操作地连接”是指核酸序列的连接，使得一个序列可以为连接的序列提供所需的功能。在启动子的情况下，“可操作地连接”是指启动子与目标序列连接，使得该目标序列的转录由该启动子控制和调节。当目标序列编码蛋白并且当需要表达该蛋白时，“可操作地连接”是指启动子以使得所得转录物将被有效地翻译的方式连接到该序列上。如果启动子与编码序列的连接是转录融合并且所编码蛋白的表达是所需的，则进行连接使得所得转录物中的第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。或者，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合且所编码蛋白的表达是所需的，则进行连接使得与启动子和编码序列相关的包含在5'非翻译序列中的第一翻译起始密码子被连接，使得所得翻译产物在编码所需蛋白的翻译开放阅读框的框内。可以可操作地连接的核酸序列包括但不限于提供基因表达功能的序列(例如，基因表达元件如启动子、5'非翻译区、内含子、蛋白编码区、3'非翻译区、聚腺苷酸化位点和/或转录终止子)，提供DNA转移和/或整合功能的序列(例如，T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)，提供选择性功能的序列(例如，抗生素抗性标记、生物合成基因)，提供评分性标记功能的序列(例如，报告基因)，促进所述序列的体外或体内操作的序列(例如，多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(例如，细菌复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。

如本文所用，“转基因表达”、“表达转基因”、“蛋白表达”和“表达蛋白”意指通过将DNA分子转录成信使RNA(mRNA)并将mRNA翻译成多肽链的过程产生蛋白，所述多肽链可最终折叠成蛋白或可不最终折叠成蛋白。

本文所用的术语“转化”是指将外源核酸(通常为DNA)序列(例如载体、重组DNA分子)引入植物细胞或原生质体的过程，其中外源DNA整合到植物基因组中或能够自主复制。

短语“转基因植物”是指来源于转化的植物细胞、原生质体或其它转化的植物组织的植物或其后代，其中植物DNA含有最初不存在于相同物种的相应天然非转基因植物中的引入的外源DNA分子。

术语“序列特异性重组酶”和“位点特异性重组酶”是指识别并结合短核酸位点或“序列特异性重组酶靶位点”(即重组酶识别位点)并催化与这些位点相关的核酸重组的酶或重组酶。这些酶包括重组酶、转座酶和整合酶。

如本文所用的术语“内含子”是指通过主题方法产生的载体的结构域，其在5'末端侧接剪接供体位点并且在3'末端侧接剪受体位点，其中在适当条件下，内含子从由其存在于其中的载体表达的mRNA序列中剪接出来或去除。

术语“多接头”或“多克隆位点”是指核酸构建体上的限制性酶位点(通常是独特的位点)簇，其可用于插入和/或切除核酸序列，如基因的编码区、loxP位点等。

术语“终止序列”是指被宿主细胞的聚合酶识别并导致转录终止的核酸序列。原核终止序列通常包含具有双重对称性的富含GC的区域，随后是富含AT的序列。一个常用的终止序列是T7终止序列。多种终止序列是本领域已知的，可用于本发明的核酸构建体，包括来自λ噬菌体的TINT3、TL13、TL2、TR1、TR2和T6S终止信号，以及来自细菌基因如大肠杆菌的trp基因的终止信号。

本文所用的术语“聚腺苷酸化序列”(也称为“polyA⁺位点”或“polyA⁺序列”)是指指导新生RNA转录物终止和聚腺苷酸化的DNA序列。因为缺乏polyA⁺尾的转录物通常是不稳定的和快速降解的，重组转录物的有效聚腺苷酸化是所需的。表达载体中使用的polyA⁺信号可以是“异源的”或“内源的”。内源polyA⁺信号是在基因组中给定基因的编码区的3'端天然发现的信号。异源polyA⁺信号是从一个基因中分离并置于另一个基因的3'的信号，例如蛋白的编码序列。合适的polyA⁺终止序列的典型实例包括胭脂碱合酶(Nos)聚腺苷酸化信号和花椰菜花叶病毒35S聚腺苷酸化信号。

如本文所用，术语“选择性标记”或“选择性标记基因”是指编码酶活性并赋予在缺乏否则将是必需营养素的培养基中生长的能力的基因；另外，选择性标记可以赋予表达该选择标记的细胞对抗生素或药物的抗性。选择性标记可用于赋予宿主细胞特定的表型。当宿主细胞必须表达选择性标记以在选择性培养基中生长时，该标记被称为阳性选择性标记(例如，赋予在适当抗生素存在下生长的能力的抗生素抗性基因)。选择性标记也可用于针对含有特定基因的宿主细胞进行选择；以这种方式使用的选择性标记被称为负选择性标记。

如本文所用，短语“互补多核苷酸序列”是指使用逆转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶由信使RNA的逆转录产生的序列。这种序列随后可以使用DNA依赖性DNA聚合酶在体内或体外扩增。

如本文所用，短语“基因组多核苷酸序列”是指衍生自(分离自)染色体的序列，因此它代表染色体的连续部分。

如本文所用，术语“靶蛋白(或多肽)”是指通过根据本发明的基因工程方法在经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织中产生的蛋白或多肽，并且本发明不特别限于此。通常，包括需要大量生产的蛋白。

如本文所用，术语“蛋白”是指通过肽(酰胺)键连接的氨基酸链，并且包括以生物学功能方式折叠或排列的多肽链和不以生物学功能方式折叠或排列的多肽链。“序列”是指核苷酸或氨基酸的顺序排列。编码蛋白的序列的边界通常由5'末端的翻译起始密码子和3'末端的翻译终止密码子决定。

如本文所用，术语“多聚体蛋白”是指包含通过非共价蛋白-蛋白相互作用彼此结合的两个或更多个分开的多肽或蛋白链的蛋白复合物。所述两条或更多条多肽或蛋白链可以相同(在同源(多聚体)蛋白中)或不同(在异源(多聚体)蛋白中)。在一些实施方案中，多聚体蛋白含有30个氨基酸至2000个氨基酸，优选50个氨基酸至2000个氨基酸。在一些实施方案中，多聚体蛋白含有500至2000个氨基酸，优选700至2000个氨基酸，优选1000至2000个氨基酸。在一些实施方案中，多聚体蛋白优选含有多于500个氨基酸，优选多于700个氨基酸，优选多于1000个氨基酸，并且优选少于2000个氨基酸。在一些实施方案中，多聚体蛋白是如下定义的抗体或其片段。

可以将核酸构建体稳定地或瞬时地引入植物细胞中。在稳定转化中，核酸整合到植物基因组中，因此它代表稳定和遗传的性状。在瞬时转化中，外源多核苷酸由转化细胞表达，但它没有整合到基因组中，因此它代表瞬时性状。

如本文所用，术语“宿主”在本文中通常意指不仅包括原核生物，而且包括真核生物，如植物细胞。重组DNA分子或基因可用本领域普通技术人员公知的任何技术转化宿主。

如本文所用，术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”是指细菌酶，其各自在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA。

如本文所用，术语“植物产生的”特别限定与植物表达相关的化学特征，包括但不限于制剂中的宿主细胞杂质，其包含嵌合多肽和嵌合多肽本身的糖基化模式。

本文所用的术语“植物”包括整个植物，植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、叶、芽、茎、根(包括块茎)、植物细胞、原生质体、组织和器官。植物可以是任何形式，包括悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

如在此使用的术语“植物”特别包括属于超家族绿色植物(Viridiplantae)的所有植物，特别是选自包括以下项的列表的单子叶和双子叶植物(包括豆科饲料或草料植物)、观赏植物、食用作物、树或灌木：金合欢属(Acacia spp.)、槭属(Acer spp.)、猕猴桃属(Actinidia spp.)、七叶树属(Aesculus spp.)、贝壳杉(Agathis australis)、阿马拉合欢(Albizia amara)、三色桫椤(Alsophila tricolor)、须芒草属(Andropogon spp.)、落花生属(Arachis spp.)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、鹰嘴紫云英(Astragaluscicer)、多小叶红苏木(Baikiaea plurijuga)、桦属(Betula spp.)、芸苔属(Brassicaspp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、红紫丁香(Burkea africana)、紫铆(Buteafrondosa)、粉质胚乳白花菜(Cadaba farinosa)、朱缨花属(Calliandra spp.)、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属(Capsicum spp.)、决明属(Cassiaspp.)、距瓣豆(Centroema pubescens)、木瓜属(Chacoomeles spp.)、肉桂(Cinnamomumcassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、可乐豆(Colophospermum mopane)、绣球小冠花(Coronillia varia)、沙枸子(Cotoneaster serotina)、山楂属(Crataegus spp.)、甜瓜属(Cucumis spp.)、柏木属(Cupressus spp.)、银蕨(Cyathea dealbata)、榅桲(Cydoniaoblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅属(Cymbopogon spp.)、银背番桫椤(Cynthea dealbata)、榅桲(Cydonia oblonga)、货贝黄檀(Dalbergia monetaria)、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山蚂蝗属(Desmodium spp.)、粗糙蚌壳蕨(Dicksoniasquarosa)、拢双黄茅(Dibeteropogon amplectens)、迪奥豆属(Dioclea spp.)、镰扁豆属(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、锥形稗(Echinochloa pyramidalis)、拉菲草属(Ehraffia spp.)、穇子(Eleusine coracana)、画眉草属(Eragrestis spp.)、刺桐属(Erythrina spp.)、桉属(Eucalyptus spp.)、希氏假乌木(Euclea schimperi)、绒毛状金茅(Eulalia villosa)、荞麦属(Pagopyrum spp.)、费约果(Feijoa sellowlana)、草莓属(Fragaria spp.)、千斤拔属(Flemingia spp.)、河岸藤露兜树(Freycinetia banksli)、东亚老鹳草(Geranium thunbergii)、银杏(GinAgo biloba)、野大豆(Glycine javanica)、墨西哥丁香属(Gliricidia spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属(Grevilleaspp.)、鞘籽古夷布提木(Guibourtia coleosperma)、岩黄芪属(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemaffhia altissima)、黄茅(Heteropogon contoffus)、大麦(Hordeum vulgare)、红苞茅(Hyparrhenia rufa)、小连翘(Hypericum erectum)、Hypeffhelia dissolute、异花木蓝(Indigo incamata)、鸢尾属(Iris spp.)、雨伞草(Leptarrhena pyrolifolia)、胡枝子属(Lespediza spp.)、莴苣属(Lettuca spp.)、银合欢(Leucaena leucocephala)、单罗得草(Loudetia simplex)、Lotonus bainesli、百脉根属(Lotus spp.)、阿切尔结豆(Macrotyloma axillare)、苹果属(Malus spp.)、木薯(Manihot esculenta)、紫苜蓿(Medicago saliva)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、香蕉(Musa sapientum)、烟草属(Nicotianum spp.)、驴食豆属(Onobrychis spp.)、鸟足豆属(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)、非洲双翼豆(Peltophorum africanum)、狼尾草属(Pennisetum spp.)、酪梨(Persea gratissima)、碧冬茄属(Petunia spp.)、菜豆属(Phaseolus spp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、新西兰剑麻(Phormium cookianum)、石楠属(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松属(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativam)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、礼普格纳西亚草(Pogonaffhriasquarrosa)、杨属(Populus spp.)、瓜叶牧豆(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、星状老虎刺(Pterolobium stellatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、厚叶石斑木(Rhaphiolepsis umbellata)、美味棒花棕(Rhopalostylissapida)、纳塔尔漆树(Rhus natalensis)、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子属(Ribes spp.)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属(Rosa spp.)、悬钩子属(Rubusspp.)、柳属(Salix spp.)、红裂稃草(Schyzachyrium sanguineum)、金松(Sciadopitysvefficillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色高粱(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、流苏状鼠尾粟(Sporobolus)、Stiburus alopecuroides、矮柱花草(Stylosanthos humilis)、葫芦茶属(Tadehagi spp.)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、三叶草属(Trifolium spp.)、小麦属(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔属(Vaccinium spp.)、蚕豆属(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、苋属植物、朝鲜蓟、天门冬属植物、球花甘蓝、抱子甘蓝、卷心菜、油菜(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、散叶甘蓝(collard greens)、亚麻、羽衣甘蓝、兵豆、油籽油菜(oilseed rape)、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、苞谷、大麦、燕麦、花生、豌豆、小扁豆和紫花苜蓿、棉花、油菜籽、芥籽、胡椒、向日葵、烟草、茄子、桉树、树、观赏植物、多年生草和饲料作物。或者，藻类及其它非绿色植物可用于本发明的方法中。

十字花科植物通常称为芥菜科。十字花科含有约338个属和超过3700种开花植物。十字花科种的特征在于具有两个长雄蕊和两个短雄蕊的四瓣十字形花，并产生称为长角果的豆荚样果实。在十字花科中，来自芸苔属的甘蓝植物和相关植物是特别相关的。

芸苔属是十字花科内的多叶绿色、红色(紫色)或白色(淡绿色)植物。芸苔属植物通常在农业和园艺中作为食物来源生长，因为它们具有致密的叶头。大多数芸苔属植物是一年生或二年生的。该属中一些通常公认的蔬菜是芥菜、油菜、西蓝花、花椰菜、甘蓝、仙人掌和抱子甘蓝。通常生长的甘蓝重量在500至1000克的范围内。它们在pH为6.0至8的排水良好的土壤中培养，接受全日照。这些生长条件允许植物密集地发育。植物在土壤中需要足够水平的磷、钾和氮，特别是在生长的早期阶段。这些植物在4至24℃生长最好。温度变化可能导致植物吸干并产生花。在一些实施方案中，较低的温度可引起花的春化。因此，芸苔可以在寒冷期开始时种植，并且在诱导花之前存活直到稍后的暖和期。

甘蓝植物特别包括青菜(鸡毛菜，chinensis品种)、棕芥菜(芥菜)、西兰花(羽衣甘蓝、italica品种)、抱子甘蓝(羽衣甘蓝、gemmifera品种)、甘蓝(羽衣甘蓝、capitata品种)、花椰菜(羽衣甘蓝、botrytis品种)、羽衣甘蓝(collard)(羽衣甘蓝、acephala品种)、羽衣甘蓝(kale)(羽衣甘蓝、gongylodes品种)、球甘蓝(羽衣甘蓝、pekinensis品种)、油菜(欧洲油菜、napus品种)、芜菁甘蓝(欧洲油菜、napobrassica品种)和芜菁(鸡毛菜、rapa品种)。

根据本发明的其它非常适合的植物包括来自菠菜属的植物(最常见的成员是菠菜)，苋科的藜科亚科的开花植物属，和来自莴苣属的植物(最知名的代表是生菜或莴苣)，其为菊科，雏菊科的开花植物。

本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语抗体不仅涵盖整个抗体分子，而且涵盖抗体片段以及抗体的变体(包括衍生物)。在一些实施方案中，整个抗体分子包含500至1500个氨基酸，更优选包含1200至1500个氨基酸。在啮齿动物和灵长类动物的天然抗体中，两条重链通过二硫键彼此连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。存在两种类型的轻链，λ和κ。存在五种主要的重链类型(或同种型)决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在人类中有四种IgG亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(按照血清中浓度降低的顺序编号)。IgA存在于两个亚类IgA1和IgA2中。IgA1和IgA2均在外分泌(分泌性IgA)中发现，其中IgA2比在血液(血清IgA)中更显著。每条链含有不同的序列结构域。在典型的IgG抗体中，轻链包括两个结构域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区赋予重要的生物学特性，例如抗体链缔合、分泌、跨胎盘移动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。分泌性IgA是聚合的：2-4个IgA单体通过两个额外的链(免疫球蛋白连接(J)链和分泌成分(SC))连接。J链通过半胱氨酸残基之间的二硫键与两个IgA分子共价结合。分泌成分是多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的胞外部分的蛋白水解裂解产物，其结合含J链的多聚Ig。聚合IgA(主要是分泌二聚体)由邻近粘膜表面的固有层中的浆细胞产生。它与上皮细胞基底外侧表面上的多动免疫球蛋白受体结合，并通过胞吞作用被吸收到细胞中。受体-IgA复合物在分泌到上皮细胞的腔表面之前穿过细胞区室，仍然附着于受体。发生受体的蛋白水解，并且二聚IgA分子与称为分泌成分的受体的一部分(称为sIgA)一起在整个腔中自由扩散。

Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分，由一个轻链和一个重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变或互补决定区(CDR)的残基组成。有时，来自非高变区或框架区(FR)的残基可参与抗体结合位点或影响整个结构域结构并因此影响结合位点。互补决定区或CDR是指一起确定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别命名为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原结合位点通常包括六个CDR，其包含来自重链和轻链V区各自的CDR组。框架区(FR)是指介于CDR之间的氨基酸序列。因此，轻链和重链的可变区通常包含以下序列的4个框架区和3个的CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

抗体可变结构域中的残基通常根据Kabat等人设计的系统编号。1987年，Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDepartment of Healthand Human Services,NIH,USA(Kabat et al.,1992，下文称为“Kabat等人”)中阐述该系统。在本说明书中使用该编号系统。Kabat残基命名并不总是直接对应于SEQ ID序列中氨基酸残基的线性编号。实际的线性氨基酸序列可以含有比严格的Kabat编号中更少或更多的氨基酸，所述Kabat编号对应于基本可变结构域结构的结构组分(无论框架或互补决定区(CDR))的缩短或插入。对于给定抗体，残基的正确Kabat编号可通过将抗体序列中的同源残基与“标准”Kabat编号序列比对来确定。根据Kabat编号系统，重链可变区的CDR位于残基第31-35位(H-CDR1)、残基第50-65位(H-CDR2)和残基第95-102位(H-CDR3)。根据Kabat编号系统，轻链可变区的CDR位于残基第24-34位(L-CDR1)、残基第50-56位(L-CDR2)和残基第89-97位(L-CDR3)。本文描述了一些抗SARS-CoV-2抗体的预测的CDR，例如Cv2.1169、Cv2.5213、Cv2.3235、Cv2.1353和Cv2.3194。

本文所用的术语“单克隆抗体”是指单一特异性的抗体分子的制剂。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有衍生自或基于人种系免疫球蛋白序列或衍生自完全合成序列的可变区和恒定区。制备单克隆抗体的方法与结合特异性无关。

如本文所用，术语“重组抗体”是指通过重组手段产生、表达、生成或分离的抗体，诸如通常使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体或分离自动物(例如小鼠)或由于人免疫球蛋白基因而转基因的植物的抗体；或以任何其它方式产生、表达、生成或分离的抗体，其中特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)与其它DNA序列组装。重组抗体包括例如嵌合抗体和人源化抗体。在一些实施方案中，本发明的重组人抗体具有与天然存在的人抗体相同的氨基酸序列，但在结构上与天然存在的人抗体不同。例如，在一些实施方案中，由于重组人抗体的重组生产，糖基化模式是不同的。在一些实施方案中，通过相对于人中天然存在的人抗体的结构添加或减去至少一个共价化学键来化学修饰重组人抗体。

本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”(或简称为“抗体片段”)是指保持特异性结合抗原的能力的抗体的全长或一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。包含在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward et al.,1989Nature341:544-546)，或包含这些抗原结合片段的任何融合蛋白。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由分开的基因天然编码的，但它们的编码序列通常是根据本发明的连接，使用化学DNA合成以形成合成核酸。在一些实施方案中，编码VL和CH结构域的合成核酸可以包括合成接头序列，所述合成接头序列使得它们能够被制成单链蛋白，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.,1988Science 242:423-426；和Huston etal.,1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。

含有包含CDR结构域的可变结构域的抗体的抗原结合片段通常选自Fv、dsFv、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2。F(ab’)2片段可通过抗体在铰链二硫化物下方的胃蛋白酶消化产生；它包含两个Fab’片段，以及免疫球蛋白分子铰链区的一部分。Fab片段是可通过抗体的木瓜蛋白酶消化获得的单体片段；它们包含通过二硫键结合在一起的整个L链和H链的VH-CH1片段。通过切割铰链区中的二硫键，可以从F(ab’)2片段获得Fab’片段。F(ab’)2片段是二价的，即它们包含两个抗原结合位点，如天然免疫球蛋白分子；另一方面，Fv(构成Fab可变部分的VHVL二聚体)、dsFv、scFv、Fab和Fab’片段是单价的，即它们包含单个抗原结合位点。这些基本抗原结合片段可以进一步结合在一起以获得多价抗原结合片段，例如双抗体、三抗体或四抗体。这些多价抗原结合片段也是本发明的一部分，因为它们也可以用本发明的方法生产。Fv片段由通过疏水相互作用结合在一起的抗体的VL和VH结构域组成；在dsFv片段中，所述VH:VL异二聚体通过一个二硫化物键稳定化；在scFv片段中，VL和VH结构域通过柔性肽接头彼此连接，从而形成单链蛋白。

抗体重链或轻链的“可变结构域”或“可变区”的表达可互换使用，因为抗体的可变区由可变结构域组成。

短语“识别抗原(X)的抗体”、“针对抗原(X)具有特异性的抗体”、“抗X抗体”、“针对X的抗体”和“靶向X的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原(X)的抗体”互换使用。

上述抗体的可变区可以与抗体恒定区结合，如IgA、IgM、IgE、IgD或IgG，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。所述抗体的可变区优选与IgG或IgA恒定区结合；优选的是IgG1或IgA(IgA1、IgA2)恒定区。这些恒定区可以通过本领域已知的方法进一步突变或修饰，特别是用于修饰它们对Fc受体的结合能力或增强抗体半衰期。包含IgA恒定区的抗体可进一步包含J链和/或分泌成分以产生多聚体或分泌IgA。

本文所用的术语“IgG Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。人IgG重链Fc区通常被定义为包含从第C226位或从P230到IgG抗体羧基末端的氨基酸残基。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引的编号。

根据WHO的定义(参见https://www.who.int/biologicals/biotherapeutics/WHO_TRS_1004_web_Annex_2.pdf？ua＝1)，本文所用的生物类似单克隆抗体(mAb)指与原始/参考mAb几乎相同拷贝的mAb产物，其在质量、安全性和功效方面与所述已许可的参考mAb相似。

如本文所用，两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性％＝相同位置的数目/位置的总数×100)，考虑缺口的数目和每个缺口的长度，其需要被引入用于两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的测定可以使用数学算法完成，如下所述。

两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法确定(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988)，其已并入ALIGN程序(2.0版)，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12且缺口罚分为4。或者，可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444-453,1970)的算法，其已并入GCG软件包中的GAP程序中(可获取自http://www.org/com)，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性也可以使用例如算法来确定，例如用于核酸或氨基酸序列的BLASTN程序，使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝4作为缺省值，比较两条链。

本文所用的术语“蛋白标签”或“分子标签”是指遗传移植到重组蛋白上的肽序列。它们可以通过化学试剂或通过酶促方法除去，例如蛋白水解或内含肽剪接。它们可以被添加到靶蛋白的任一端，因此它们是C-末端或N-末端特异性的或C-末端和N-末端两者特异性的(并且因此分别添加在蛋白编码序列的3'或5'中)。一些标签也插入到目标蛋白的编码序列中；它们被称为内部标签。分子标签可以基于它们的分子大小、空间位阻、预期用途如纯化方法等来选择。分子标签特别包括：

-可用于使用亲和技术的纯化方法(通常来自粗生物来源)的亲和标签。这些包括壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Strep标签、poly(His)标签和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。Poly(His)(通过镍或钴螯合物结合的5-10个组氨酸)标签是广泛使用的蛋白标签，其结合金属基质。

-增溶标签通常用于帮助蛋白的正确折叠并防止它们沉淀。这些包括硫氧还蛋白(TRX)和poly(NANP)、MBP和GST。

-可用于改变蛋白的色谱性质以在特定分离技术中提供不同分辨率的色谱标签。这些通常包括聚阴离子氨基酸，如FLAG标签。

-表位标签是通常来源于病毒基因的短肽序列，可用于蛋白印迹、免疫荧光、抗体纯化和免疫沉淀实验。表位标签包括ALFA标签、V5标签、Myc标签、HA标签、斑点标签、T7标签和NE标签。

-在蛋白上给出可见读出的荧光标签通常包括GFP及其变体。

标签通常在纯化后除去，例如通过使用特异性蛋白水解。虽然一些常见的标签如SUMO和FLAG被特定的蛋白酶切割，但是在一些实施方案中可以设想添加一个或多个蛋白酶切割识别位点。典型的蛋白酶包括例如TEV蛋白酶、凝血酶、Xa因子或肠激酶、SUMO蛋白酶。

作为实例，众所周知的标签的经典列表包括：ALFA标签(从头设计的螺旋肽标签)、AviTag、C标签(与单结构域骆驼抗体结合)、钙调蛋白标签(与蛋白钙调蛋白结合)、GST、聚谷氨酸标签、聚精氨酸标签、E标签、FLAG标签、HA标签(由抗体识别的来自血凝素的肽)、His标签(由镍或钴螯合物结合的5-10个组氨酸)、HBH、MBP、Myc标签(由抗体识别的衍生自c-myc的肽)、NE标签(由单克隆IgG1抗体识别的18个氨基酸合成肽)、Rho1D4标签(指牛视紫红质的细胞内C-末端的最后9个氨基酸)、S标签(衍生自核糖核酸酶A)、SBP标签(与链霉亲和素结合)、Softag1、Softag3、斑点标签(由纳米抗体识别)、Strep标签(与链霉亲和素或经修饰的链霉亲和素(被称为streptactin)结合)、SUMO、T7标签(衍生自T7基因的T7主要衣壳蛋白的表位标签)、TAP、TRX、TC标签(由FlAsH和ReAsH二砷化合物识别的四半胱氨酸标签)、Ty标签、V5标签(由抗体识别)、VSV标签(由抗体识别)、Xpress标签。根据本发明的非常适合的标签值特别包括例如HA标签和poly(His)标签。

产生经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织的方法

本发明涉及用于产生表达目标重组蛋白的经遗传修饰的植物(在本文也称为经遗传修饰的生物体或GMO)、植物细胞、原生质体或植物组织的方法，其中

所述方法包括向植物、植物细胞、原生质体或植物组织中引入核酸构建体，所述核酸构建体向植物、植物细胞、原生质体或植物组织中提供目标蛋白的稳定表达；

其中：

-所述植物选自菠菜属、莴苣属和芸苔属，以及

-所述核酸构建体是单一的合成构建体，其包含在植物中对于可操作地连接的编码蛋白的核酸分子和3'非翻译区(3’UTR区)的表达有活性的调节序列。更具体地，该特征意为只有一种表达载体(通常是质粒)用于植物中靶蛋白的稳定重组表达。这在大的多聚体蛋白如抗体的情况下尤其有利。

植物

通常，植物是多叶植物。

在一些实施方案中，植物是香石竹植物，特别是具有表现出改变的花序的分枝型香石竹植物。改变的花序可以在任何组织或细胞器中，包括花、花瓣、花药和花柱。本文考虑的特定花序包括紫红色至蓝色范围内的颜色，例如紫色至蓝色。相对于皇家园艺协会(RHS)比色图表(RHSCC)方便地测量以确定颜色，包括颜色81A、86A、87A和在上述范围的任一端之间或附近的颜色。术语“花序”不应被狭义地解释并且涉及任何着色的细胞、组织细胞器或其部分，以及花和花瓣。

有利地，所述植物是可食用植物。

在优选的实施方案中，植物来自芸苔属。根据本发明的来自芸苔属的适合植物通常包括：油菜、西蓝花、花椰菜、甘蓝、青菜和抱子甘蓝。通常生长的甘蓝重量在500至1000克的范围内。它们在pH为6.0至8的排水良好的土壤中培养，接受全日照。这些生长条件允许植物形成密集的叶状头。植物在土壤中需要足够水平的磷、钾和氮，特别是在生长的早期阶段。这些植物在4至24℃生长最好。温度变化可能导致植物吸干并产生花。在一些实施方案中，较低的温度可引起花的春化。因此，芸苔属可以在寒冷期开始时种植，并且在诱导花之前存活直到稍后的暖和期。

在一些实施方案中，来自芸苔属的植物是甘蓝植物，优选选自以下的甘蓝植物：青菜(鸡毛菜，chinensis品种)、棕芥菜(芥菜)、西兰花(羽衣甘蓝、italica品种)、抱子甘蓝(羽衣甘蓝、gemmifera品种)、甘蓝(羽衣甘蓝、capitata品种)、花椰菜(羽衣甘蓝、botrytis品种)、羽衣甘蓝(collard)(羽衣甘蓝、acephala品种)、羽衣甘蓝(kale)(羽衣甘蓝、acephala品种)和球茎甘蓝(羽衣甘蓝、gongylodes品种)、球甘蓝(羽衣甘蓝、pekinensis品种)、油菜(欧洲油菜、napus品种)、芜菁甘蓝(欧洲油菜、napobrassica品种)和芜菁(鸡毛菜、rapa品种)。

在一些实施方案中，来自芸苔属的植物选自羽衣甘蓝种，例如选自甘蓝(羽衣甘蓝、capitata品种)、西兰花(羽衣甘蓝、italica品种)、抱子甘蓝(羽衣甘蓝、gemmifera品种)、花椰菜(羽衣甘蓝、botrytis品种)、羽衣甘蓝(collard)(羽衣甘蓝、acephala品种)、羽衣甘蓝(kale)(羽衣甘蓝、acephala品种)和球茎甘蓝(羽衣甘蓝、gongylodes品种)；鸡毛菜种例如选自油菜(欧洲油菜、napus品种)和芜菁甘蓝(欧洲油菜、napobrassica品种)。

在一些实施方案中，来自芸苔属的植物选自羽衣甘蓝种，例如是甘蓝(羽衣甘蓝，capitata品种)。

在一些实施方案中，来自芸苔属的植物是甘蓝。

在一些实施方案中，所述植物不选自莴苣属，通常所述植物不是生菜。

本发明的方法包括用本文定义的核酸构建体稳定转化植物、其部分或衍生物，所述核酸构建体靶向并插入核或叶绿体基因组。稳定转化的特征包括(1)可遗传的转基因，允许建立种子储备，以备将来使用，和(2)可扩展到田间生产的蛋白生产。通过在核酸构建体中插入选择性标记并通过在培养基上人工选择通常也容易检测到稳定的转化。优选地，根据本发明的植物的稳定转化允许目标核酸(即转基因)的全植物表达，特别是在包括或由叶、茎、种子和/或根组成的各种植物组织中。

包含植物表达盒构建体的核酸(DNA)构建体

已充分建立用于单子叶植物或双子叶植物的表达盒的构建。表达盒是包含可操作连接的启动子、编码序列和聚腺苷酸化序列的核酸构建体。

根据本发明，核酸构建体是化学合成的(即从头合成的)。通常，使用计算机辅助设计软件设计和操作合成的DNA(或核酸)构建体。然后将设计的DNA分成至多1-1.5kbp的可合成片段(合成子)。然后将合成子分解成重叠的单链寡核苷酸序列并化学合成。然后使用基因合成技术将寡核苷酸一起组装成设计的合成子。如果需要，可以将多个合成子一起组装成更大的DNA组件或装置。然后通常将组装的DNA克隆到表达载体中并进行序列验证。最近在Hughes RA,Ellington AD.Synthetic DNA Synthesis and Assembly:Putting theSynthetic in Synthetic Biology.Cold Spring Harb Perspect Biol.2017；9(1):a023812中综述了能够合成DNA寡核苷酸的工艺与技术。

目标核酸可以编码任何目标蛋白(或多肽)。然而，本发明目标蛋白(或多肽)是多聚体蛋白(或多肽)，特别是抗体。在本发明的一些实施方案中，植物产生的抗体是用于癌症治疗、抗感染性疾病或自身免疫疾病治疗的抗体。在一些实施方案中，抗体可以针对细菌、真菌或癌症抗原。癌症抗原是在可靶向癌症治疗的癌症环境中表达的抗原。在一些实施方案中，抗体针对肿瘤抗原或免疫检查点分子(特别是抑制性免疫检查点分子)。相关免疫检查点分子的实例包括PD1、PDL1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体或A2AR。通常抗体是抗PD-1。

在一些实施方案中，目标核酸编码多聚体蛋白，其分子量为20kDa至170kDa，20kDa至150kDa，60kDa至170kDa或60kDa至150kDa。

在一些实施方案中，目标核酸编码多聚体蛋白，例如抗体片段，其分子量为20至130kDa，25至130kDa，20至100kDa，25至100kDa，20至70kDa或25至70kDa。

在一些实施方案中，目标核酸编码多聚体蛋白，例如抗体，其分子量为130至170kDa，优选140至160kDa，更优选145至150kDa。

在一些实施方案中，所述抗体是参考批准的单克隆抗体的生物类似抗体，特别是纳武单抗的生物类似抗体。

在一些实施方案中，编码目标蛋白的核酸包含编码VL和VH序列的核酸序列，其与SEQ ID NO:1和2的VL和VH序列或其抗原结合片段，或其CDR部分具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％的同一性。

尽管VH和VL结构域都由不同的基因天然编码，但在本发明的从头合成的编码核酸中，编码VH和VL结构域的核酸序列通常融合以形成单一的合成核酸，使得整个抗体可以由单一的核酸构建体产生。

在一些实施方案中，编码目标蛋白(待产生的)的核酸包括可用于从植物(特别是如前定义的植物细胞或植物组织)纯化目标蛋白的一种或多种蛋白标签(本文也称为分子标签)。通常，在其中根据本发明的方法产生多聚体蛋白的实施方案中，合成核酸构建体，例如将分子标签从头连接至编码给定单体(即多聚体蛋白的多肽链)的每个核酸序列，特别是将不同的分子标签连接至每个“编码单体”的核酸序列。通常，分子标签附着于所述序列的3'端。

例如，在其中目标蛋白是包含VH和VL结构域的抗体的实施方案中，分子标签附着于分别编码VH和VL序列的每个序列。通常，分子标签附着于VH和VL编码序列的3'端。通常所述分子标签是不同的。

使用附着于核酸编码序列，特别是附着于对应于多聚体蛋白的每个编码序列的编码序列的标签是非常有利的，因为它可以发挥两种关键功能。首先，这些标记可用于检测重组蛋白的表达。实际上，使用针对所选标签的抗体可以容易地评价目标蛋白的表达水平。此外，它允许双重同时纯化重组多聚体蛋白的各种多肽链。特别是在重组抗体的情况下，使用附着于VH和VL结构域的每个编码序列的标签允许双重同时纯化全抗体。这种纯化方法提高了纯化的产率和效率，同时减少了浪费和流失。在一些实施方案中，选择的标签(如(poly)组氨酸标签)在亲和层析中，特别是在固定化金属离子亲和层析(IMAC)中也是有利的。具有一个以上标签是有利的，因为样品可以用每个标签依次纯化。

在一些实施方案中，目标合成核酸包含编码VL和VH序列的核酸序列，其分别与SEQID NO:3，特别是SEQ ID NO:3的VL和VH序列具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％的同一性。

在一些实施方案中，目标合成核酸包含编码氨基酸序列的核酸序列，其与SEQ IDNO:3具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％的同一性。

在一些实施方案中，目标合成核酸包含编码氨基酸序列的核酸序列，与SEQ IDNO:3相比，其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代。

在一些实施方案中，目标合成核酸包含与SEQ ID NO:4或5具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％同一性的核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，编码本发明的多肽或蛋白的核酸序列被优化用于在植物中表达。这种序列修饰的实例包括但不限于改变G/C含量以更接近通常在目标植物物种中发现的含量，以及除去通常在植物物种中发现的非典型密码子，通常称为密码子优化。在一个实施方案中，针对菠菜属、莴苣属或芸苔属优化编码多肽(例如嵌合多肽或蛋白)的核酸序列的密码子使用。

术语“密码子优化”指在结构基因或其片段中使用的合适DNA核苷酸的选择，其接近目标植物中的密码子使用。因此，优化的基因或核酸序列是指其中天然或天然存在的基因的核苷酸序列已被修饰以在植物中使用统计学上优选的或统计学上有利的密码子的基因。通常在DNA水平上检查核苷酸序列，并使用任何合适的方法确定在植物物种中表达而优化的编码区，例如Sardana等人所述的方法(1996,Plant Cell Reports 15:677-681)。在该方法中，密码子使用的标准偏差(密码子使用偏好的量度)可以通过首先找到天然基因的每个密码子相对于高度表达的植物基因的密码子使用的平方比例偏差，然后计算平均方差来计算。使用的公式是：1SDCU＝n＝1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn是指在高度表达的植物基因中密码子n的使用频率，其中Yn是目标基因中密码子n的使用频率，并且N是指目标基因中密码子的总数。使用Murray等人的数据汇编了来自双子叶植物的高表达基因的密码子使用表(1989,Nuc Acids Res.17:477-498)。

根据特定植物细胞类型的优选密码子使用优化核酸序列的一种方法是基于密码子优化表的直接使用而不进行任何额外的统计计算，所述密码子优化表例如通过日本的NIAS(国家农业生物科学研究所)DNA库在线提供在密码子使用数据库中的那些(HypertextTransfer Protocol://World Wide Web(dot)kazusa(dot)or(dot)jp/codon/)。密码子使用数据库包含许多不同物种的密码子使用表，其中每个密码子使用表是基于Genbank中存在的数据统计确定的。

通过使用这样的密码子优化表来确定特定物种(例如水稻)中每个氨基酸的最优选或最有利的密码子，编码目标蛋白的天然存在的核苷酸序列可以针对该特定植物物种进行密码子优化。这可以通过用统计学上更有利的对于氨基酸的相应密码子替换在特定物种基因组中可能具有低统计学发生率的密码子来实现。然而，可以选择一个或多个不太有利的密码子以删除现有的限制性位点，以在潜在有用的连接处产生新的限制性位点(5'和3'末端以添加信号肽或终止盒，可以用于将片段切割并拼接在一起以产生正确的全长序列的内部位点)，或以消除可能不利地影响mRNA稳定性或表达的核苷酸序列。

在任何修饰之前，所需的编码核苷酸序列可能已经含有许多与特定植物物种中统计学上有利的密码子相对应的密码子。因此，天然核苷酸序列的密码子优化可包括确定所需核苷酸序列中的哪些密码子对于特定植物不是统计上有利的，并根据特定植物的密码子使用表修饰这些密码子以产生密码子优化的衍生物。经修饰的核苷酸序列可针对植物密码子使用进行完全或部分优化，条件是由经修饰的核苷酸序列编码的蛋白以比相应天然存在或天然基因编码的蛋白更高的水平产生。例如在PCT专利申请93/07278中描述了通过改变密码子使用来构建合成基因。

编码目标核酸分子通常插入核酸构建体或载体，通常是表达载体，作为构建体的一部分，所述构建体具有可操作地连接于基因表达元件的所述核酸分子，所述基因表达元件在植物中起作用以影响由所述核酸分子编码的蛋白的表达。构建核酸构建体和典型载体的方法是本领域熟知的。

根据本发明的核酸构建体的表达盒的组分通常包括可操作地连接至可转录核酸(通常为DNA)序列的一个或多个基因表达元件，例如以下：用于表达可操作地连接的DNA、可操作地连接的编码蛋白的核酸分子和3'非翻译区(或其部分)的启动子。可用于实施本发明的其它基因表达元件包括但不限于一种或多种以下类型的元件：5'非翻译区或元件、增强子、前导序列、顺式作用元件、内含子、聚腺苷酸化序列、信号序列和/或转录终止子。

可用于实施本发明的启动子包括在植物细胞中发挥功能以表达可操作连接的多核苷酸的启动子。通常启动子是异源启动子。如本文在DNA构建体的情况中使用的，是指：i)来源于不同于可操作地连接的结构编码序列的来源的启动子，或ii)来源于与可操作地连接的结构基因相同来源的启动子，其中启动子的序列从其原始形式被修饰。在一些实施方案中，使用化学合成的而不是生物衍生的合成启动子。通常合成启动子掺入优化RNA聚合酶起始效率的序列变化。启动子(如35S启动子)可作为单拷贝或多拷贝使用以提高基因转录效率。在Makhzoum A,Benyammi R,Moustafa K,Trémouillaux-Guiller J.Recentadvances on host plants and expression cassettes'structure and function inplant molecular pharming.BioDrugs.2014；28(2):145-159中也描述了用于植物中重组蛋白表达的有用启动子。

在一些实施方案中，在某些植物组织中有活性的启动子(即组织特异性启动子)也可用于驱动靶蛋白和肽的表达。有用的组织特异性发育调节启动子的实例包括但不限于β-伴大豆球蛋白7S启动子(Doyle et al.,1986)、种子特异性启动子(Lam and Chua,1991)和与油菜籽蛋白、菜豆蛋白、玉米蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、ACP、硬脂酰-ACP去饱和酶或油质蛋白基因相关的启动子。根特异性启动子的实例包括但不限于分别描述于美国专利5,459,252和5,837,876中的RB7和RD2启动子。

植物启动子是不同的并且是本领域熟知的，并且包括可诱导的、病毒的、合成的、组成型的、可诱导的、时间调控的、空间调控的和/或时空调控的那些。例如，启动子可以是病毒启动子，如花椰菜花叶病毒(CAM)35S和19S启动子(描述于Odell JT,Nagy F,ChuaNH.Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflowermosaic virus 35S promoter.Nature.1985；313(6005):810-812和Seternes T,TonheimTC,Myhr AI,Dalmo RA.A plant 35S CaMV promoter induces long-term expression ofluciferase in Atlantic salmon.Sci Rep.2016；6:25096.Published 2016Apr 26)，和FMV(玄参花叶病毒)35S启动子。CaMV35S和FMV35S启动子在多种转化的植物组织和大多数植物器官(例如愈伤组织、叶、种子和根)中具有活性。也可以使用CaMV35S和FMV35S启动子的增强或复制形式。其它有用的启动子包括胭脂碱合酶(NOS)和章鱼碱合酶(OCS)启动子(携带在根癌农杆菌的肿瘤诱导质粒上)，花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子，玉米泛素启动子，水稻Act1启动子和玄参花叶病毒(FMV)35S启动子(参见，例如，美国专利号5,463,175)。

在一些实施方案中，诱导型启动子可能是有利的。诱导型启动子包括但不限于由热诱导的启动子(例如，热激启动子如Hsp70)、由光诱导的启动子(例如，来自核酮糖1,5-二磷酸羧化酶的小亚基的光诱导型启动子，ssRUBISCO，一种非常丰富的植物多肽)、由冷诱导的启动子(例如，COR启动子)、由氧化应激诱导的启动子(例如过氧化氢酶启动子)、由干旱诱导的启动子(例如，小麦Em和水稻rab16A启动子)和由多种环境信号诱导的启动子(例如，rd29A启动子，谷胱甘肽-s-转移酶(GST)启动子)。由真菌感染诱导的有用启动子包括与参与苯丙素代谢的基因相关的那些启动子(例如苯丙氨酸氨裂解酶，查耳酮合酶启动子)、修饰植物细胞壁的基因(例如富含羟脯氨酸的糖蛋白，富含甘氨酸的蛋白和过氧化物酶启动子)、编码降解真菌细胞壁的酶的基因(例如几丁质酶或葡聚糖酶启动子)、编码类甜蛋白启动子的基因或编码在真菌感染后显示显著诱导的未知功能的蛋白的基因。分别命名为Mis1和Fis1的玉米和亚麻启动子也由植物中的真菌感染诱导并可使用(美国专利申请20020115849)。

时间调控的启动子是其中在发育期间的特定时间调节RNA聚合酶结合和起始的速率的启动子。时间调控的启动子实例在Benfey PN,Chua NH.Regulated genes intransgenic plants.Science.1989；244(4901):174-181中给出。空间调控的启动子是其中在生物体的特定结构如叶、茎或根中调节RNA聚合酶结合和起始的速率的启动子。空间调节启动子的实例在Benfey&Chua,1989中给出。时空调控的启动子是其中在发育期间的特定时间在生物体的特定结构中调节RNA聚合酶结合和起始的速率的启动子。典型的时空调控启动子包括Benfey&Chua,1989描述的EPSP合酶-35S启动子和脱乙酰基二氢吲哚4-O-乙酰基转移酶基因启动子。

多腺苷酸化序列通常可以选自由CaMV35S、胭脂碱合酶多腺苷酸化信号(NOS)、水稻乳酸脱氢酶和小麦Hsp17多腺苷酸化序列组成的组。

本发明的核酸构建体还可以包含一个或多个编码信号肽的序列，所述信号肽可操作地连接于编码靶蛋白的序列。用于本发明构建体的信号肽选自单子叶植物信号肽、双子叶植物信号肽、细菌信号肽和合成信号肽。这些肽可被宿主系统识别，并可通过将分泌途径中的重组蛋白靶向特定细胞器而增加具有增强的稳定性和抗蛋白酶降解的保护作用的重组蛋白的转录和翻译水平。有用的肽序列包括谷物α-淀粉酶信号肽、来自2S2种子贮藏蛋白的信号肽、AP24酶蛋白、来自大肠杆菌的细节LT-B，编码内质网(ER)滞留信号的序列KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)、ER SEKDEL肽、HDEL(His-Asp-Glu-Leu)滞留肽、醇溶谷蛋白信号肽、菜豆蛋白信号肽(sp)和菜豆蛋白液泡分选信号(AFVY)。用于实施本发明的有用的肽通常在Makhzoum A,Benyammi R,Moustafa K,Trémouillaux-Guiller J.Recent advances onhost plants and expression cassettes'structure and function in plantmolecular pharming.BioDrugs.2014；28(2):145-159中描述(特别参见表4)。

有利地，在一些实施方案中，核酸构建体且特别是表达盒包含编码Kozak共有肽的核酸序列。Kozak共有肽在真核基因表达系统中起重要作用(特别参见参考文献Amani J,Mousavi SL,Rafati S,Salmanian AH.Immunogenicity of a plant-derived ediblechimeric EspA,Intimin and Tir of Escherichia coli O157:H7 in mice.PlantSci.2011；180(4):620–627)。Kozak和KDEL(液泡滞留肽)可用于增强重组蛋白的表达、稳定性和滞留。

在一些实施方案中，核酸构建体且特别是表达盒包含优选选自35CaMVS或NOS的组成型启动子，任选地随后是Kozak共有序列，和/或聚腺苷酸化序列，所述聚腺苷酸化序列优选是胭脂碱合酶聚腺苷酸化信号(NOS)。

在一些实施方案中，核酸构建体且特别是表达盒包含编码多聚体蛋白的DNA分子，其中编码多聚体蛋白不同链的核酸序列融合以形成单一合成核酸，任选地其中分子标签附着于编码多聚体蛋白不同链的每个序列。通常，分子标签附着于每个编码序列的3'端。优选地，分子标签是poly(His)标签。

在一些实施方案中，核酸构建体且特别是表达盒包含编码抗体的DNA分子，其中编码抗体的不同链的核酸序列融合以形成包含编码抗体轻链或其抗原结合片段的核酸序列和编码抗体重链或其抗原结合片段的核酸序列的单一合成核酸，任选地其中抗体是抗PD-1，任选地其中抗体是纳武单抗，任选地其中分子标签附着于编码抗体轻链和/或抗体重链或其抗原结合片段的每个序列。通常，分子标签附着于每个编码序列的3'端。优选地，分子标签是poly(His)标签，在一些实施方案中，核酸构建体且特别是表达盒包含：

-组成型启动子，优选选自35CaMVS或NOS，任选地随后是Kozak共有序列，和/或聚腺苷酸化序列，所述聚腺苷酸化序列优选是胭脂碱合酶聚腺苷酸化信号(NOS)，以及

-编码抗体的DNA分子，其中编码所述抗体的不同链的核酸序列融合以形成单一合成核酸，所述合成核酸包含编码抗体轻链或其抗原结合片段的核酸序列和编码抗体重链或其抗原结合片段的核酸序列，任选地其中所述抗体是抗PD-1，任选地其中所述抗体是纳武单抗，任选地其中分子标签附着于编码所述抗体轻链和/或所述抗体重链或其抗原结合片段的每个序列。通常，分子标签附着于每个编码序列的3'端。优选地，分子标签是poly(His)标签。

在一些实施方案中，核酸构建体且特别是表达盒包含内含子序列。该内含子序列可选自由水稻肌动蛋白内含子、玉米hsp70内含子、玉米小亚基RUBISCO内含子、玉米泛素内含子、玉米Adh1内含子、水稻苯丙氨酸解氨酶内含子、蔗糖合酶内含子、CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和超泛素内含子组成的组。

在一些实施方案中，核酸构建体包含，特别是在表达盒中，编码选择性标记的序列。该选择性标记通常用于选择含有DNA构建体的转基因植物。当引入表达盒以外的核酸构建体时，选择性标记可用于验证转化体(通常为细菌菌株)中核酸构建体的存在。在优选的实施方案中，将选择性标记引入表达盒中和表达盒外。选择性标记可选自由新霉素磷酸转移酶蛋白、氨基糖苷3'-磷酸转移酶(卡那霉素抗性蛋白)、膦丝菌素乙酰转移酶蛋白、草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)蛋白、潮霉素磷酸转移酶蛋白(潮霉素抗性蛋白)、二氢蝶酸合酶蛋白、磺酰脲不敏感的乙酰乳酸合酶蛋白、莠去津不敏感的Q蛋白、能够降解溴苯腈的腈水解酶蛋白、能够降解茅草枯的脱卤素酶蛋白、2,4-二氯-苯氧基乙酸酯单加氧酶蛋白、甲氨蝶呤不敏感的二氢叶酸还原酶蛋白和氨乙基半胱氨酸不敏感的章鱼碱合酶蛋白组成的组。

在一些实施方案中，核酸构建体可包括，特别是在表达盒中，一个或多个编码肽接头的序列。接头是由相邻结构域之间的柔性残基如甘氨酸和丝氨酸组成的短肽序列，以确保这些结构域不会在空间上相互干扰。接头是将少量蛋白、ORF或肽组装在一起而不干扰融合单元结构的重要元件。接头对新结构中组装部分的活性和稳定性没有负面影响。

上述植物表达盒通常包含在各种载体中，特别是质粒表达载体。

表达载体含有在宿主细胞中提供载体复制功能的序列(也参见上文)和共价连接的序列。例如，细菌载体将含有允许载体在一种或多种细菌宿主中复制的复制起点，以及在一些实施方案中，含有自主复制序列和/或着丝粒序列。通常，表达载体还包含提供DNA转移和/或整合功能的序列(例如，T-DNA边界序列，位点特异性重组酶识别位点和/或整合酶识别位点)。

有利地，本发明的表达载体还包括提供选择性功能的序列(选择性标记如抗生素抗性标记、生物合成基因)、提供标记功能的序列(例如报道基因)、促进所述序列体外或体内操作的序列(例如多接头序列，位点特异性重组序列)。评分性标记通常用于鉴定含有所述DNA构建体的转基因植物。评分性标记可选自由β-葡糖醛酸糖苷酶蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶蛋白、衍生自luc基因的荧光素酶蛋白、衍生自lux基因的荧光素酶蛋白、唾液酸酶蛋白、链霉素磷酸转移酶蛋白、胭脂碱合酶蛋白、章鱼碱合酶蛋白和氯霉素乙酰转移酶蛋白组成的组。

在一些实施方案中，目标合成核酸包含与SEQ ID NO:4至10中任一项具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％同一性的核酸序列。

在宿主植物中引入表达载体

存在多种将外源核酸(即，目标核酸)引入单子叶植物和双子叶植物的方法(Potrykus,I.,Annu.Rev.Plant.Physiol.,Plant.Mol.Biol.(1991)42:205-225；Shimamoto et al.,Nature(1989)338:274-276)。使外源DNA稳定整合到植物基因组DNA中的核心方法包括两种主要方法：农杆菌介导的转化、根癌菌介导的转化和直接DNA摄取，例如颗粒介导的转化(通常包括使用阳离子聚合物或基于脂质的纳米颗粒的化学转染，例如脂质转染，包括使用特定的转染试剂，例如j的lipofectamine试剂)、生物弹道方法、DNA转染、DNA电穿孔。

(i)农杆菌介导的基因转移(Klee et al.(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38:467-486；Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,Vol.6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,eds.Schell,J.,and Vasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.2-25；Gatenby,in PlantBiotechnology,eds.Kung,S.and Arntzen,C.J.,Butterworth Publishers,Boston,Mass.(1989)p.93-112)；以及

(ii)直接DNA摄取包括(参见参考文献Paszkowski et al.,in Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants,Vol.6,Molecular Biology of Plant NuclearGenes eds.Schell,J.,and Vasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.52-68)将DNA直接摄入原生质体的方法(Toriyama,K.et al.(1988)Bio/Technology 6:1072-1074)；通过植物细胞的短暂电击诱导的DNA摄取(Zhang et al.Plant Cell Rep.(1988)7:379-384.Fromm et al.Nature(1986)319:791-793)；通过粒子轰击将DNA注射到植物细胞或组织中(Klein et al.Bio/Technology(1988)6:559-563；McCabe et al.Bio/Technology(1988)6:923-926；Sanford,Physiol.Plant.(1990)79:206-209)；使用微量移液管系统(Neuhaus et al.,Theor.Appl.Genet.(1987)75:30-36；Neuhaus andSpangenberg,Physiol.Plant.(1990)79:213-217)；细胞培养、胚或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化(美国专利号5,464,765)或通过将DNA与发芽的花粉一起直接孵育(DeWetet al.in Experimental Manipulation of Ovule Tissue,eds.Chapman,G.P.andMantell,S.H.and Daniels,W.Longman,London,(1985)p.197-209；and Ohta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715-719)。

-农杆菌属(根癌菌科)是能够在若干种植物物种中诱导冠瘿(根癌农杆菌和葡萄农杆菌)、毛状根病(发根农杆菌)、茎秆瘿(悬钩子农杆菌)的革兰氏阴性菌。农杆菌的感染性菌株(包括根癌农杆菌、葡萄农杆菌、悬钩子农杆菌和发根农杆菌)含有大约200kb的质粒(Ti或Ri质粒)。这些质粒编码与以下相关的功能：i)质粒复制和维持，ii)接合转移，iii)毒力，iv)冠瘿碱利用，和v)植物宿主和感染部位邻近农杆菌细胞释放的外源信号的感官知觉。编码这些功能中每一种的基因通常聚集在质粒上，除了两个空间上不同的区域，植物感染所需的毒力或vir区域和转移DNA或T-DNA，以及接合质粒转移所需的tra和trb区域。农杆菌的T-DNA长度约为15-20kbp，并在其转移后通过称为重组的方法整合到宿主植物基因组中。该方法利用宿主植物细胞基因组中预先存在的缺口，使T-DNA与基因组中的短序列配对，引发DNA连接的过程，其中T-DNA与植物基因组永久连接。T-DNA区在两端侧接24bp序列，也称为边界序列。因为T-DNA转移所需的唯一顺式作用元件是左和右边界序列，所以这种T-DNA边界序列可用于侧接任何所需的目标序列(通常是如前所述的表达盒)并将其引入宿主。因此，T-DNA可以被解构并用作天然的基因工程系统，这是通过卸甲Ti质粒(去除产生肿瘤的激素/冠瘿碱基因)实现的。

农杆菌介导的植物转化载体特别适用于本发明。在一些实施方案中，可根据本发明使用的农杆菌介导的植物转化载体是卸甲的Ti质粒，并且通常包含(i)允许在农杆菌中，但也在其它表达系统如细菌宿主细胞中，特别是在大肠杆菌中复制的序列，以及(ii)被定位以允许表达盒整合到植物染色体中的一个或多个“边界”序列。这些序列区分待转移到植物基因组中的DNA片段(T-DNA，特别是前述的合成表达盒)。这种农杆菌载体可以适用于分别使用肿瘤(Ti)-或根(Ri)-诱导质粒的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。

在一些其它实施方案中，可通过将T-DNA区(通常为侧接有边界序列的表达盒)引入质粒以形成转移DNA(T-DNA)二元系统来进一步解构Ti质粒。为了便于克隆，因此将T-DNA移至穿梭载体，该穿梭载体在各种系统中有效复制，特别是在细菌宿主细胞如大肠杆菌中有效复制，但也含有低拷贝数的复制起点以维持在根癌农杆菌中。T-DNA和vir基因位于分开的复制子(载体)上的系统称为T-DNA二元系统。T-DNA位于二元载体上。如果vir辅助质粒不含有可转移至植物的致癌基因，则认为其卸甲。

因此，根据本发明可用的农杆菌介导的植物转化载体也包括二元载体。二元载体的T-DNA部分，通常是如前定义的合成表达盒，通常侧接左和右边界序列，并包括转基因(通常是如上定义的表达盒)以及优选植物选择性标记(详见上文)。在T-DNA之外，二元载体通常还含有细菌选择性标记和细菌复制起点(ori)。二元载体的实例包括pBIN19、pPZP、pCB、pCAMBIA、pGreen、pLSU和pLX。

vir辅助质粒含有源自农杆菌Ti质粒的vir基因。这些基因编码一系列蛋白，所述蛋白在左和右边界序列处切割二元载体并分别促进T-DNA向植物细胞和基因组的转移和整合。已经报道了几种vir辅助质粒，并且包含vir辅助质粒的常见农杆菌菌株包括例如EHA101、EHA105、AGL-1、LBA4404和GV2260。可以通过使用具有不同程度毒力的细菌菌株来增强转化效率(例如GV3101、C58C1、EHA105、LBA4404和AGL1是一些最常用于植物转化的根癌菌菌株)，其对顽固性组织具有更高耐受性或对所需植物物种具有更好适应性。EHA105、AGL1和LBA4404被认为是高毒力菌株，最可能是由于vir基因的诱导增加。这些菌株被推荐用于顽固性或单子叶植物的转化，而更温和的菌株最经常被推荐用于非顽固性双子叶植物。在一些实施方案中，可以通过向农杆菌生长培养基(例如YEB或LB)和液体或固体共接种培养基中直接添加乙酰丁香酮(天然或合成来源的酚类)来活化或增强T4SS。另一个预处理步骤可以通过在补充有乙酰丁香酮的农杆菌(AB)基本培养基中温和地孵育(在黑暗中在22℃下12-16h)农杆菌细胞来进行。(参见Basso MF,Arraes FBM,Grossi-de-Sa M,MoreiraVJV,Alves-Ferreira M,Grossi-de-Sa MF.Insights Into Genetic and MolecularElements for Transgenic Crop Development.Front Plant Sci.2020；11:509；以及特别是WO2015099674A1和Basso M.F.,da Cunha B.A.D.B.,Ribeiro A.P.,Martins P.K.,deSouza W.R.,de Oliveira N.G.,et al.(2017).Improved genetic transformation ofsugarcane(Saccharum spp.)embryogenic callus mediated by Agrobacteriumtumefaciens.Curr.Protoc.Plant Biol.2 221–239.)。

关于可用于农杆菌转化方法的二元载体的详细参考文献，参见Lee LY,Gelvin SB(February 2008)."T-DNA binary vectors and systems".Plant Physiology.146(2):325–32；Hoekema A,Hirsch PR,Hooykaas PJ,Schilperoort RA(May 1983)."A binaryplant vector strategy based on separation of vir-and T-region of theAgrobacterium tumefaciens Ti-plasmid".Nature.303(5913):179–180；Slater A,ScottN,Fowler M(2008).Plant Biotechnology the genetic manipulation of plants.NewYork:Oxford University Press Inc；Bevan M(November 1984)."Binary Agrobacteriumvectors for plant transformation".Nucleic Acids Research.12(22):8711–21.；Hajdukiewicz P,Svab Z,Maliga P(September 1994)."The small,versatile pPZPfamily of Agrobacterium binary vectors for plant transformation".PlantMolecular Biology.25(6):989–94；Xiang C,Han P,Lutziger I,Wang K,Oliver DJ(July1999)."A mini binary vector series for plant transformation".Plant MolecularBiology.40(4):711–7.doi:10.1023/a:1006201910593.PMID 10480394。

植物组织的接种方法根据植物种类和农杆菌递送系统而变化。

在第一种方法中，来自待转化植物的种子可以与含有T-RNA的根癌农杆菌菌株(如前定义的表达载体)一起温育。该方法允许种子的感染，这也在结果章节中详述。然后从种子再生表达目标核酸的转化植物。然后通常在植物叶和根中表达目标重组蛋白。

在第二种方法中，可以将下胚轴和子叶浸入根癌农杆菌溶液中，其中根癌农杆菌菌株含有T-DNA(如前定义的表达载体)。农杆菌与下胚轴和子叶结合并感染它们。在这种方法中，叶细胞被转化。然后可以切割转化的叶并在组织培养物中生长以产生GMO植物。

使用农杆菌系统转化植物的第三种方法是原生质体转染。在该方法中，使用消化和剥离植物细胞的细胞壁的特异性酶，分离细胞并分散它们，从而产生来自叶的原生质体。分离的原生质体形成圆环形，其相对于叶的其余部分自由漂浮。这些自由漂浮的细胞可以使用直接DNA摄取方法用T-DNA质粒转化，例如以非限制性方式，电穿孔或化学转染，使用例如阳离子聚合物转染或基于脂质的纳米颗粒(例如脂质体，任选地用聚乙二醇包被)或包括特定转染试剂如lipofectamine试剂(Thermofischer)或(Polyplus)(参见例如综述Zhao Y,Huang L.Lipid nanoparticles for gene delivery.Adv Genet.2014；88:13-36.doi:10.1016/B978-0-12-800148-6.00002-X)。在一些实施方案中，还可以使用病毒方法(也参见下文)。然后培养原生质体以产生完全生长的稳定的经遗传修饰(GMO)植物。

产生表达重组靶蛋白的转基因植物的第四种方法是农杆菌渗入法。该方法使用注射器将根癌农杆菌注射到叶中。感染后，细菌将携带合成基因的T-DNA质粒插入叶。然后使用叶细胞的细胞培养物，转化的叶可以生长成完全稳定的GMO植物。

一种补充的方法是叶盘方法，其可以用任何组织外植体进行，所述组织外植体提供了引发全植物分化的良好来源。通常表面消毒的叶盘与含有Ti质粒的农杆菌菌株一起温育。然后将叶盘转移到仅有转化细胞(因此表达选择性标记)生长的选择性平板上。详见例如Horsch et al.in Plant Molecular Biology Manual A5,Kluwer AcademicPublishers,Dordrecht(1988)p.1-9。

另一种补充方法采用与真空渗透结合的农杆菌递送系统。农杆菌系统在产生转基因双子叶植物中特别可行。

因此，在一些实施方案中，本发明包括用于产生经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过实施以下步骤将提供靶蛋白或多肽的稳定表达的合成植物核酸构建体引入植物、植物细胞、原生质体或植物组织中：

a1)通过将合成的核酸构建体引入细菌菌株来制备转化体；以及

a2)使用所述转化体转化植物、植物细胞、原生质体或植物组织；

a’)或者，所述合成植物核酸构建体也可以使用任何合适的直接DNA摄取方法引入，例如本文所述的方法(例如电穿孔，或使用特异性转染试剂)。

其中：

所述植物选自菠菜属，莴苣属和芸苔属，优选所述植物是来自芸苔属的可食用植物。

所述核酸构建体是单一合成构建体，其包含在植物中对于可操作地连接的DNA、可操作地连接的编码多肽或蛋白的DNA分子，和3'非翻译区的表达有活性的调节序列；

在优选的实施方案中，菌株通常是农杆菌菌株，特别是根癌农杆菌菌株。该细菌菌株通常包含(i)Ti质粒，其包含TDNA区，该TDNA区包含如前定义的合成表达盒或由其组成，或(ii)二元载体系统，其中二元载体包含T-DNA/RNA区，该T-DNA/RNA区包含如前定义的合成表达盒或由其组成。在一些实施方案中，TDNA区包含与SEQ ID NO:4至8具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％的同一性的核酸序列。

有多种将DNA直接转移到植物细胞中的方法，包括化学方法的物理方法(如电穿孔)。

在电穿孔中，将原生质体短暂暴露于强电场。在显微注射中，使用非常小的微量移液管将DNA直接机械注射到细胞中。在微粒轰击中，DNA被吸附在微粒如硫酸镁晶体或钨颗粒上，并且微粒被物理加速进入细胞或植物组织。

生物弹道转化方法(粒子轰击或基因枪)允许将任何DNA序列直接引入植物基因组。为此，将目标核酸(通常为如上所述的二元载体)脱水并与金或钨小(直径0.6至1μM)颗粒(微载体)复合。然后，将微载体沉积在膜上，使用PDS-1000/hetm或类似系统用氦气加速至高速，并轰击全能植物组织。在细胞内，如果DNA没有到达细胞核，它被分解并被引入细胞核，在那里它将随机整合到核基因组中。推荐金颗粒，因为它们的尺寸更均匀且对植物细胞没有毒性(惰性)。

农杆枪方法利用了根癌农杆菌与用生物弹道实现的高效DNA递送相结合的优点，允许提高转化效率。在一些实施方案中，使用不含DNA的微载体颗粒的生物弹道可用于引起轻微和表面损伤。然后，损伤的组织可以与所需的根癌农杆菌菌株共培养。例如，在与根癌农杆菌共培养之前的微粒轰击可用于提高转化效率。

化学转染通常包括使用阳离子聚合物或脂质体(脂质转染)。阳离子聚合物通常包括DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺(PEI)。带负电荷的DNA结合聚阳离子，并且复合物通过内吞作用被细胞吸收。脂质转染(或脂质体转染)是用于通过脂质体将遗传物质注入细胞中的技术，脂质体是可以容易地与细胞膜融合的囊泡，因为它们都由磷脂双层制成。[13]脂质转染通常使用带正电荷的(阳离子)脂质(阳离子脂质体或混合物)以与带负电荷的(阴离子)遗传物质形成聚集体。

在一些实施方案中，根据本申请的将外源核酸引入植物也可以在一些实施方案中使用已显示可用于转化植物宿主的病毒来实现，所述病毒包括花椰菜花叶病毒科或CaMV的成员。在Gluzman,Y.et al.,Communications in Molecular Biology:Viral Vectors,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,pp.172-189(1988)中描述了使用植物病毒转化植物，也可参见HARPER,G.,HULL,R.,LOCKHART,B.AND N.OLSZEWSKI.2002.Viralsequences integrated into plant genomes.Annu.Rev.Phytopathol..40:119-136d.doi:10.1016/j.tplants.2006.08.008。用于在许多宿主(包括植物)中表达外源DNA的假病毒颗粒描述于WO87/06261中。根据本发明的一些实施方案，用于瞬时转化的病毒是无毒的，因此不能引起严重的症状，例如降低的生长速率、镶嵌、环斑、卷叶、黄化、条纹、痘形成、肿瘤形成和点蚀。合适的无毒病毒可以是天然存在的无毒病毒或人工减毒病毒。病毒减毒可通过使用本领域熟知的方法实现，包括但不限于亚致死加热、化学处理或通过定向诱变技术，例如Kurihara and Watanabe(Molecular Plant Pathology4:259-269,2003),Gal-on et al.(1992),Atreya et al.(1992)and Huet etal.(1994)所描述的。用于在植物中引入和表达非病毒核酸序列的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及Dawson,W.O.et al.,Virology(1989)172:285-292；Takamatsu et al.EMBO J.(1987)6:307-311；French et al.Science(1986)231:1294-1297；Takamatsu et al.FEBS Letters(1990)269:73-76；and U.S.Pat.No.5,316,931；和美国专利号5,316,931所证实。

当病毒是DNA病毒时，可以对病毒本身进行合适的修饰。或者，可首先将病毒克隆入细菌质粒中，以便构建所需的具有外源DNA的病毒载体。然后可以从质粒上切除病毒。如果病毒是DNA病毒，细菌复制起点可以附着到病毒DNA上，然后由细菌复制。该DNA的转录和翻译将产生外壳蛋白，该外壳蛋白将包裹病毒DNA。如果病毒是RNA病毒，通常将病毒克隆为cDNA并插入质粒中。然后用质粒制备所有的构建体。然后通过转录质粒的病毒序列并翻译病毒基因以产生包裹病毒RNA的外壳蛋白来产生RNA病毒。

可以在Foster and Taylor,eds."Plant Virology Protocols:From VirusIsolation to Transgenic Resistance(Methods in Molecular Biology(Humana Pr),Vol 81)",Humana Press,1998；Maramorosh and Koprowski,eds."Methods in Virology"7vols,Academic Press,New York 1967-1984；Hill,S.A."Methods in Plant Virology",Blackwell,Oxford,1984；Walkey,D.G.A."Applied Plant Virology",Wiley,New York,1985；and Kado and Agrawa,eds."Principles and Techniques in Plant Virology",Van Nostrand-Reinhold,New York找到将病毒接种至植物的技术。

获得包含稳定表达靶蛋白或肽的DNA构建体的转基因植物

该步骤通常通过从接受核酸构建体的植物、植物细胞、原生质体或植物组织再生转基因植物来实现。

因此，本申请涵盖用于产生经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将提供靶蛋白或多肽的稳定表达的合成核酸构建体引入植物、植物细胞、原生质体或植物组织中；

其中：

所述植物选自菠菜属、莴苣属和芸苔属，优选所述植物是来自芸苔属的可食用植物。

所述核酸构建体是单一合成构建体，其包含在植物中对于可操作地连接的DNA、可操作地连接的编码多肽或蛋白的DNA分子和3'非翻译区的表达有活性的调节序列；以及

b)通过从接受核酸构建体的植物、植物细胞、原生质体或植物组织再生转基因植物，获得包含稳定表达靶蛋白或肽的DNA构建体的转基因植物。在优选的实施方案中，从种子或通过使用微繁殖再生转基因植物。

稳定转化后，通常进行植物繁殖。植物繁殖的最常见方法是通过种子。

然而，通过种子繁殖的再生具有缺陷，即由于杂合性，在作物中缺乏一致性，因为种子是根据由孟德尔法则控制的遗传变异由植物产生的。基本上，每种种子是遗传上不同的，并且每种将以其自身的特定性状生长。因此，优选产生转化的植物，使得再生的植物具有与亲本转基因植物相同的性状和特征。因此，优选通过微繁殖再生转化植物，所述微繁殖提供转化植物的快速、一致的繁殖。

微繁殖是由已从所选亲本植物或栽培品种切除的单片组织培育新一代植物的方法。该方法允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物大量繁殖。所产生的新一代植物在遗传上与原始植物相同，并且具有原始植物的所有特征。微繁殖允许在短时间内大量生产优质植物材料，并在保存原始转基因或转化植物的特征时提供所选栽培品种的快速增殖。克隆植物的优点是植物繁殖的速度和产生的植物的质量和均匀性。

微繁殖是需要在阶段之间改变培养基或生长条件的多阶段方法。因此，微繁殖方法包括四个基本阶段：阶段一，初始组织培养；阶段二，组织培养增殖；阶段三，分化和植物形成；和阶段四，温室栽培和硬化。在阶段一，初始组织培养期间，建立组织培养物并认证无污染物。在阶段二，增殖初始组织培养物，直到产生足够数量的组织样品以满足生产目标。在阶段三，将在第二阶段生长的组织样品分开并生长成单个小植株。在阶段四，将转化的小植株转移到温室中用于硬化，其中植物对光的耐受性逐渐增加，使得其可在自然环境中生长。

获得植物产生的重组蛋白的方法

本申请还涉及获得植物产生的重组蛋白的方法，其包括以下步骤：

-产生表达如前定义的目标重组蛋白的经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织，和

-从所述经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织分离和任选地纯化所述植物产生的蛋白。

表达目标重组蛋白的转基因植物生产的下游加工可分为两个阶段：初步回收和纯化，如Wilken LR,Nikolov ZL.Recovery and purification of plant-made recombinantproteins.Biotechnol Adv.2012；30(2):419-433中详述。

初步回收的目的特别是使提取物或细胞匀浆中的产物滴度和产量最大化。

叶和/或种子分泌蛋白的初步回收步骤可包括以下步骤：

-通过均化或水性提取从所述生物质中释放产物；和/或

-固液分离或分馏(通常用于种子分泌蛋白)。

对于培养基分泌的蛋白，通常在第一层析(捕获)步骤之前浓缩培养基。

在一些实施方案中，目标蛋白优选抗体，其以3至10mg，优选4至10mg，更优选4至7mg的产量表达，以每克新鲜叶重量的目标蛋白表示。

分馏和产物释放：使用已建立的加工方法级分种子，例如干磨、干分馏和湿磨，以减少总加工体积和固体含量，从而富集重组蛋白。

植物组织的有效匀浆和植物细胞壁的破坏是重组蛋白最大程度释放入提取缓冲液中的先决条件。根据本领域技术人员的经典方法，提取优化可能需要筛选和评价组织破碎技术、粒度分布、缓冲液组成、植物组织与缓冲液的比例和亚细胞区室表达。

通常可以保护待纯化的重组蛋白在提取期间免于降解。为了使初次回收期间蛋白的蛋白水解和苯酚氧化最小化，通常使用含有蛋白稳定剂的混合物(如蛋白酶抑制剂、金属螯合剂和抗氧化剂)的提取缓冲液。也可以使用缓冲添加剂，例如β-2-巯基乙醇(B-ME)、二硫苏糖醇(DTT)、聚乙烯基聚吡咯烷酮(PVPP)、抗坏血酸和焦亚硫酸钠。匀浆和澄清提取物中的植物蛋白酶活性可以通过控制pH、提取温度或通过加入蛋白酶抑制剂来避免。在一些实施方案中，可以添加洗涤剂。

固/液萃取：本领域技术人员通常使用离心来除去固体和/或澄清植物提取物和匀浆。

为了在萃取后进一步除去杂质，可以在纯化步骤之前增加进一步的澄清和预处理步骤，例如水性两相分配、吸附、沉淀和/或膜过滤。

通常可以通过使用离心或深度过滤来澄清种子提取物以除去蛋白和植酸沉淀。可以注意到，将提取物和细胞匀浆的pH调节至大约pH5.0会沉淀最丰富的植物蛋白(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶)、细胞碎片以及附着于蛋白和碎片的叶绿素色素。

纯化阶段通常包括捕获步骤，其浓缩重组蛋白并除去可能对蛋白产量、质量和/或纯化效率有害的植物杂质。

捕获色谱树脂具有两个主要功能：浓缩和部分纯化，并且应该是廉价的，对树脂再生所需的化学品有抗性的，并且能够在多个循环中保持能力和选择性。树脂选择由重组蛋白性质如电荷、疏水性和生物特异性决定。通常可以使用蛋白A和/或G柱捕获抗体(即，IgG或基于IgG的产物)，并且使用为细胞培养衍生的抗体开发的树脂和工艺序列用至少一个额外的层析步骤进一步纯化(参见例如Fishman JB,Berg EA.Protein A and Protein GPurification of Antibodies.Cold Spring Harb Protoc.2019；2019(1):10.1101/pdb.prot099143中的经典方案)。进一步的纯化步骤可以包括多种方法，例如离子交换、IMAC、HIC或陶瓷羟基磷灰石。技术人员将通常基于靶蛋白的性质选择纯化方法。

各种生物特异性(亲和性)标签也非常适合于从根据本发明的植物提取物中纯化蛋白，并且例如在Chen Q.in“Expression and purification of pharmaceuticalproteins in plants”.(Biol Eng2008；2:291–321)所综述的。

本发明的其它目的

本申请的范围还涵盖任选地呈组合物的形式的本文定义的核酸构建体。特别地，本申请的范围涵盖编码目标蛋白的合成核酸，以及其中所述编码核酸与各种调节序列可操作地连接的合成表达盒。本申请的范围还涵盖表达载体，通常如本文所述的表达质粒，例如特别是其中T-DNA区包含如前定义的表达盒的Ti质粒，或可用于二元农杆菌系统中的二元载体，其中所述二元载体包含T-DNA区，其包含如前定义的表达盒。

本发明还提供了任选地呈组合物形式的细菌菌株，其包含如本文所定义的核酸构建体。通常细菌菌株是农杆菌菌株，特别是根癌农杆菌菌株。

本发明还提供了表达本文定义的核酸构建体的来自芸苔属的经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织。特别是表达前定义的Ti质粒或二元载体。

本发明的核酸构建体、细菌菌株和植物通常根据本文所述的方法获得。

最后，本发明涵盖在本文所述的方法中获得的植物产生的蛋白或多肽，其任选地呈组合物的形式，特别是呈药物组合物的形式。

药物组合物

本发明的重组植物产生的蛋白可以与药学上可接受的载体一起配制。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。载体应适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。在一个实施方案中，所述载体应适合于皮下途径或肿瘤内注射。根据给药途径，活性化合物即抗体、免疫偶联物或双特异性分子，可以用材料包被以保护化合物免受酸和其它可以使化合物失活的天然条件的作用。

无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载体的一个实例。其它合适的载体是本领域技术人员公知的。(Remington and Gennaro,1995)制剂可以进一步包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白以防止小瓶表面上的蛋白损失等。

药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。

本公开的药物组合物可以配制用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下或眼内施用等。

优选地，药物组合物含有载体，其对于能够注射的制剂是药学上可接受的。这些可以特别是等渗的、无菌的盐水溶液(磷酸一钠或二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的，特别是冻干的组合物，根据情况添加无菌水或生理盐水后，可以构成可注射溶液。

用于施用的剂量可作为各种参数的函数，特别是作为所用施用方式、相关病理学或所需治疗持续时间的函数进行调整。

为了制备药物组合物，可以将有效量的重组蛋白溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。

本发明的重组植物产生的蛋白可以配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

本发明的用途

本发明的植物产生的蛋白通常用于治疗。治疗用途自然取决于靶蛋白的类型。优选地，植物产生的重组蛋白是抗体，特别是抗免疫检查点分子(特别是抗PD1)。更特别地，本发明对于纳武单抗是生物类似的。因此，这种蛋白，特别是重组植物产生的抗体旨在用于癌症疗法，任选地与任何其他癌症疗法组合。如本申请所提到的，必须理解本申请不仅涵盖经典的IgG分子，还涵盖任何抗原结合片段，任选地其衍生的多特异性形式。

在其它实施方案中，当目标蛋白是抗体时，所述重组抗体可有利地用作生物标志物和/或用于诊断方法中，特别是用作诊断工具。诊断方法包括体内、离体和体外诊断方法。

具体实施方式

结果

材料和方法：

合成基因设计

纳武单抗的抗体序列取自专利(US8779105B2，doi.org/10.4155/ppa-2017-0015.Doi:10.1080/19420862.2015.1107688)(蛋白Seq 1)。使用Benchling软件将人源化单克隆抗体序列图示可视化。添加起始密码子，将HIS和HA两个分子标签插入到单克隆抗体中(参见图1)。使用Benchling软件根据原始的人DNA序列对拟南芥(Arabidopsisthaliana)进行密码子优化(图1)。

构建体的从头合成

通过VectorBuilder GmbH合成抗体的DNA序列(SEQ ID NO:4-5)。总共合成了4个质粒(图2)。

农杆菌中克隆

将含有合成基因的质粒克隆入根癌农杆菌LBA4404(VectorBuilder GmbH)中(图2)。质粒的所有部分已进一步详细描述(表1)。

测序

通过VectorBuilder GmbH进行测序。简言之，用桑格测序法对合成的基因构建体和质粒进行测序。该步骤证实了合成的构建体和质粒是否具有任何点突变，并验证了新合成的序列。

限制性消化

为了验证合成插入物是否在合适位置、方向和合适大小，进行限制性消化。将1μg质粒与限制性酶(New England Biolabs)、1X缓冲液、1X BSA和水定容至15ul反应一起孵育。将样品在适当的温度下孵育1小时。然后将溶液在1％琼脂糖凝胶和1X TAE(ThermoFisher)上在100V下电泳40分钟。用Sybr Safe(ThermoFisher)可视化凝胶条带(图3)。

农杆菌培养物

将农杆菌在补充有50ug/mL卡那霉素(Sigma)的高压灭菌的Luria-Bertani培养基(Sigma)上培养。将细菌在25℃下在黑暗中培养两天。

组织裂解：

将叶冲杆在液氮中快速冷冻并在研钵和研杵中压碎。将粉末化的叶放入eppendorf管中，并加入RIPA缓冲液(150mM氯化钠、1.0％NP-40或Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)和50mM Tris，pH8.0)以裂解组织。将样品在4℃孵育1小时。将样品以16g离心20分钟。除去上清液，向样品中加入含laemmli的1X DTT。在冰上孵育30分钟后，向样品中加入1X上样缓冲液(NuPage Thermofisher)。在斑点印迹之前，将样品在95℃煮沸10分钟。

原生质体：农杆菌渗入

在分光计上测量两日龄的农杆菌培养物。将培养物在新鲜LB中稀释至光密度(OD)为0.5。将200μl细菌培养物加样到1mL注射器上注射到甘蓝的叶中。在检测单克隆抗体之前使细菌渗入叶细胞4-8天。

斑点印迹：

这些通过在用于蛋白免疫检测的PVDF膜上点样表达的重组蛋白来制备。简言之：封闭(5％脱脂牛奶1h)；一抗(1:1000HIS，HA 1hRTP)；洗涤(在TBST(Tris缓冲盐水；0.1％Tween20)中3×5min)；二抗(驴抗小鼠1:1000-1h RTP)；洗涤(在TBST中3×5min)，并使用WestFemto ECL试剂盒(ThermoFisher)检测。通过GE ImageQuant LAS 500对印迹进行成像(图4)。

植物培养和生长

将甘蓝植物盆栽在具有新鲜土壤的小花盆中。使植物在25℃和16小时光照和8小时黑暗循环下生长(图5)。

信号量化

将来自GMO甘蓝植物的新鲜叶样品称重(0.10g)。将叶样品研磨并如上进行斑点印迹。使用ImageJ测量两种抗原之间的化学发光强度。通过下式计算6XHIS和肌动蛋白之间的强度差异：

X＝6XHIS强度/肌动蛋白强度。

GMO植物中抗体生产的定量和估计：

估计植物细胞中的总肌动蛋白浓度为约50-200μM(参见Henty-Ridilla JL,Li J,Blanchoin L,Staiger CJ.Actin dynamics in the cortical array of plantcells.Curr Opin Plant Biol.2013；16(6):678-687.doi:10.1016/j.pbi.2013.10.012)。基于该估计值，计算存在的6XHIS的估计量。然后，使用以下公式从摩尔浓度进一步估计产生的抗体的重量：

m[g]＝Q[mol]x Mw[kDa]x 10^3

c[M]x V[L]＝Q[mol]

其中：m[g]-蛋白重量[克]；

Mw[kDa]-蛋白的分子量[千道尔顿]；

Q[mol]：蛋白的数量[mole]；

c[M]：蛋白的摩尔浓度[Mole]＝[mole/升]；

V[L]：稀释体积[升]；

对于这些计算，所用肌动蛋白的分子量为42KDa，并且纳武单抗为146KDa。新鲜叶的最终重量为0.10g，而组织裂解物为50μl。

附加结果

免疫沉淀(IP)

将Dynabeads(Thermofischer)旋转3分钟。取出50μl储备蛋白A或蛋白G的dynabeads并置于1.5ml eppendorf管中。通过将管放置在磁体上使磁珠与溶液分离。将100μl含有产生的抗体(此后称为PiB001)的叶裂解物在室温下轻轻摇动10分钟加入到dynabead中。

通过将Dynabead-PiB001复合物置于磁体附近将其从叶组织裂解物中分离。用1XPBS洗涤样品三次。

人重组抗原

人重组PD-1蛋白购自Thermofischer。简言之，在HEK293细胞中产生人重组PD-1，对应于登录号NP_005009.2。蛋白的C-末端具有与其融合的HIS标签。按照制造商的指南重构蛋白。将1ul重组PD-1溶解在100ul蒸馏水中并用于Dynabead-PiB001结合(图7)。

人肺肿瘤裂解物

将1μl人肺肿瘤裂解物(Genetex)稀释到50μl的1X PBS中，并加入到含有Dynabeads-PiB001复合物的eppendorf管中。与PD-1的交联在4℃下旋转过夜进行(图8)。

通过将管置于磁体上，将Dynabeads-PiB001-PD-1复合物与上清液分离。将上清液转移到干净的管中。用200μl洗涤缓冲液将dynabeads洗涤3次。对于每次洗涤，通过将磁珠置于磁体上从溶液中分离磁珠。将磁珠悬浮在100μl洗涤缓冲液中并转移到干净的eppendorf管中。

通过将磁珠放置在磁体上从溶液中分离磁珠。将20μl洗脱缓冲液加入管中，用移液管轻轻混合。

蛋白质印迹(WB)：

将1X Nupage LDS样品缓冲液(4X)(Thermofischer)加入到IP样品中。为了使蛋白变性，将管在95℃加热10分钟。将变性样品在12％SDS Page凝胶上电泳。将凝胶在tris-甘氨酸电泳缓冲液(Biorad)中于200V电泳60分钟。在甲醇活化的PVDF膜(Thermofischer)上进行膜转移。将膜封闭(5％脱脂奶1h)；一抗(1:1000小鼠抗人PD-1(Thermofischer)，1:1000小鼠抗人Fc(Genetex)4℃过夜)；洗涤(在TBST(Tris缓冲盐水；0.1％Tween20)中3×5min)；二抗(驴抗小鼠1:1000-1h RTP)；洗涤(在TBST中3×5min)，并使用WestFemto ECL试剂盒(Thermofisher)检测。通过GE ImageQuant LAS 500(图7和图8)对印迹进行成像。

结果总结：

免疫沉淀结果证明产生的抗体PiB001结合其抗原，人PD-1。用哺乳动物细胞培养物(HEK293)产生的重组PD-1蛋白处理Dynabeads-PiB001复合物导致PD-1结合PiB001。在洗涤步骤中，洗去未结合的重组PD-1，并且形成Dynabead-PiB001-PD-1的新复合物。使用抗人PD-1的抗体通过蛋白质印迹分析证实PD-1的存在(图7)。类似地，也证明用蛋白G免疫沉淀也是可能的。

进一步假设重组PD-1和原发性肿瘤PD-1之间可能存在结构差异。为了证明PiB001也能结合原发性人PD-1，使用原发性人肺肿瘤裂解物进行免疫沉淀。用原发性人肺肿瘤(Genetex)裂解物处理Dynabeads-PiB001，并洗去未结合的蛋白。蛋白质印迹分析证实了来自肺肿瘤的PD-1的免疫沉淀以及通过人Fc抗体证实PiB001的存在(图8)。值得注意的是，样品磁珠+rPD1泄漏到旁侧泳道中，导致重复的泳道(图8A，右)。

表1：

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结果

本发明人提供了表达免疫治疗活性分子如抗体和重组蛋白的经遗传修饰的多叶植物。这些抗体可用于各种目的，包括研究和开发、临床和医学目的。这些植物包括但不限于菠菜属、莴苣属、芸苔属和包含在这些提到的属内的所有种。

更具体地，本发明人遗传修饰了植物(GMO)以表达人源化单克隆抗体序列。使用遗传方法如合成生物学和分子克隆，我们编辑、插入、修饰和转化了植物的基因组。将植物基因工程技术与合成生物学和分子生物学相结合，产生了在根和芽系统内的全部或一些器官中有效地表达人源化抗体的新型GMO植物。

将从头产生的合成DNA插入遗传载体(载体ID)以在植物中表达抗体或重组蛋白(如上所述)。另外，我们遗传修饰了含有单克隆抗体的DNA序列的合成DNA的末端，以允许所表达的抗体或重组蛋白的易检测、增强表达、三维结构折叠和稳定性。

修饰抗体的DNA序列以使全长抗体的检测变得容易。为此，我们将两种不同类型的遗传/分子标签插入序列中。一个标签插入Fab端的末端，而另一个标签插入抗体Fc片段的3'末端(SEQ ID NO:4-5)。

合成的抗体序列由两个组成型启动子驱动，35CaMVS或NOS，随后是Kozak共有序列。将胭脂碱合酶聚腺苷酸化信号插入抗体序列的3'末端，以允许RNA聚合酶II转录终止和mRNA聚腺苷酸化。

遗传载体(VB210429)含有在CaMV35S表达下的潮霉素抗性基因作为选择性标记。该选择性标记允许发明人筛选和鉴定用遗传载体转染后的转移细胞。

为了制备GMO植物，我们使用农杆菌二元载体系统。该系统来源于农杆菌中发现的天然肿瘤诱导(Ti)质粒。细菌将称为转移DNA(T-DNA)的Ti质粒区域转移入植物宿主的细胞核中。这些Ti质粒与宿主基因组整合。在本申请，所有肿瘤形成基因已经从T-DNA和载体中除去。只有侧接并指导宿主整合的T-DNA边界重复序列存在。

将合成的抗体序列插入DNA序列包围的T-DNA二元载体中，该载体被插入植物宿主中。

通过共转化或共电穿孔将该载体与称为vir辅助质粒的第二质粒一起引入根癌农杆菌。这些vir辅助编码将侧接于T-DNA重复序列的区域整合到植物细胞基因组中所必需的组件。

这种遗传系统的优点是它允许将大的DNA插入具有高水平表达的植物基因组中。此外，由于T-DNA区整合入宿主基因组中，它将抗体序列永久整合入宿主植物细胞中。

通过使用农杆菌的四种不同方法产生表达单克隆抗体的稳定GMO融合蛋白。

在第一种方法中，将甘蓝种子浸泡在水中。当种子吸水，膨胀并显示胚根和下胚轴形成的迹象时，用含有携带单克隆抗体的T-DNA的根癌农杆菌处理种子。农杆菌感染种子的生长和发芽部分，并用表达单克隆抗体的质粒感染它。然后使种子生长成植物。被细菌感染的植物叶和根表达抗体。

在第二种方法中，将下胚轴和子叶浸入根癌农杆菌溶液中。农杆菌与感染它们的下胚轴和子叶结合。叶和根生长的感染细胞表达单克隆抗体。

生产表达单克隆的植物的第三种方法是转染甘蓝原生质体。在这种方法中，使用酶产生来自幼叶的原生质体。酶消化并剥离植物细胞的细胞壁，分离细胞并分散它们。分离的原生质体形成圆环形，其相对于叶片的其余部分自由漂浮。使用电穿孔、聚乙二醇、lipofectamine(Thermofischer)和病毒方法用T-RNA质粒转化这些自由漂浮的细胞。这也产生稳定的GMO植物。

生产表达单克隆纳武单抗的甘蓝的第四种方法是农杆菌渗入法。该方法使用注射器将根癌农杆菌注射到幼叶中。将根癌农杆菌的稀释溶液装载到注射器上，然后使用注射器的钝端注射根癌农杆菌，而不是叶。使根癌农杆菌感染叶细胞若干天。感染后，细菌将携带合成基因的T-RNA质粒插入宿主细胞。处理后两天，叶表达单克隆抗体。

其它方法如弹道和病毒感染也可用于产生GMO甘蓝。

弹道方法或“基因枪”也可用于开发表达纳武单抗的GMO甘蓝。将Ti质粒附着到纳米颗粒上，并用携带合成基因构建体的纳米颗粒轰击叶。合成构建体进入细胞核并整合入宿主植物细胞中。

最后，在病毒方法中，使用病毒载体将合成的纳武单抗基因引入宿主细胞。在该方法中，将编码纳武单抗基因的Ti质粒或RNA包装入一种或多种植物感染病毒，例如烟草花叶病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、花椰菜花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、李属痘病毒、雀麦花叶病毒和马铃薯X病毒。用这些感染病毒处理甘蓝植物以将抗体引入植物细胞。一旦引入，感染细胞表达纳武单抗。

从GMO甘蓝的任何部分或从转染的叶、细胞或原生质体产生的种子、愈伤组织和原生质体表达纳武单抗。这些可用于繁殖、生长和培养GMO植物品系，或者培养GMO种子，或者通过体外细胞和组织培养。GMO甘蓝可以无性繁殖。

可以使用任何一种或多种方法(上文所述)产生表达单克隆抗体，特别是纳武单抗的甘蓝植物。

本发明人因此遗传修饰了甘蓝以表达编码纳武单抗单克隆抗体的合成构建的质粒。该单克隆抗体的合成基因借助于Ti根癌农杆菌质粒整合入宿主植物甘蓝中。当前结果表明，通过种子萌发，感染下胚轴和子叶以及原生质体转化产生全长单克隆纳武单抗。此外，重组纳武单抗也通过叶的农杆菌渗入而产生。

这些结果证明纳武单抗在甘蓝植物的叶中高表达。由这些植物产生的种子也是GMO。

将两个分子标签添加到原始单克隆抗体序列中。在Fab区之后的3'位添加HIS标签，而在Fc区的3'添加HA标签。这些标签具有两个关键功能。首先利用这些标签检测抗体。使用特异于这些标签的抗体，可以验证单克隆抗体的表达水平。其次，这些标签可用于帮助纯化抗体。这些标签可用于螯合柱以结合树脂并允许抗体的纯化。具有两个标签是有利的，因为样品可以针对HIS标签和HA标签依次纯化两次。这导致更大的纯化产量和更少的浪费。

通常，本发明人例如能够根据本发明产生4.84mg/g单克隆抗体(即本文所述的纳武单抗)。在同一样品中，确实观察到6XHIS标签以比管家基因如肌动蛋白高1.15至1.31倍的范围过表达。

表2：序列

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Claims (15)

1.一种用于产生表达目标重组蛋白的经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织的方法，其包括以下步骤：

a)将提供目标蛋白的稳定表达的植物核酸构建体引入植物、植物细胞、原生质体或植物组织中；

其中：

-所述植物选自菠菜属、莴苣属和芸苔属，优选地，所述植物是来自芸苔属的可食用植物，以及

-所述核酸构建体是单一合成构建体，其包含在植物中对于可操作地连接的DNA、可操作地连接的编码蛋白的DNA分子和3'非翻译区的表达有活性的调节序列。

2.根据权利要求1所述的用于产生经遗传修饰的植物的方法，其进一步包括以下步骤：

b)通过从接受所述核酸构建体的植物、植物细胞、原生质体或植物组织再生转基因植物来获得包含稳定表达目标蛋白的DNA构建体的转基因植物。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的用于产生经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织的方法，其中所述核酸构建体进一步包含以下序列中的一个或多个：5'非翻译序列、信号序列、增强子序列、顺式作用元件、内含子序列、转录终止子序列(TTS)和一个或多个选择性标记编码序列。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白是多聚体蛋白，任选地其中所述目标蛋白是抗体。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述目标蛋白是抗体并且所述编码蛋白的DNA分子是单一合成分子，其包含编码抗体轻链或其抗原结合片段的核酸序列和编码抗体重链或其抗原结合片段的核酸序列，任选地其中所述抗体是抗PD-1，任选地其中所述抗体是纳武单抗。

6.根据权利要求4至5中任一项所述的方法，其中所述编码多聚体蛋白的核酸合成分子包含位于每个单体编码序列的3'端的2个标签序列，任选地其中所述编码抗体的DNA合成分子包含位于轻链编码序列的3'端的标签序列和位于重链编码序列的3'端的标签序列，任选地其中所述编码蛋白的核酸分子编码与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％同一性的蛋白，或与SEQ ID NO:4或5的核酸序列具有至少60％同一性。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中使用以下将所述核酸构建体引入所述植物或植物细胞中：

(i)直接DNA摄取方法或

(ii)农杆菌介导的植物转化，通常其中所述核酸构建体插入农杆菌介导的植物转化二元载体(T/DNA二元载体)的DNA边界重复序列之间。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：

a1)通过将所述核酸构建体引入细菌菌株来制备转化体；以及

a2)使用所述转化体转化所述植物、植物细胞、原生质体或植物组织。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述菌株是农杆菌菌株，特别是根癌农杆菌菌株。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤a1)中，使用二元载体系统获得所述细菌菌株，其中所述细菌菌株与如权利要求7中所定义的T DNA二元载体和vic辅助质粒共转染，或其中与权利要求7中所定义的T/DNA二元载体转染卸甲T DNA根癌农杆菌菌株。

11.一种获得植物产生的蛋白的方法，其包括：

-根据权利要求1-10中任一项所述的方法产生表达目标重组蛋白的经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织，

-从所述经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织分离和任选地纯化所述植物产生的蛋白。

12.一种根据权利要求1-7中任一项所定义的核酸构建体，优选根据权利要求7所定义的二元质粒载体，任选地其中所述二元质粒载体包含T-DNA区域中的选择性标记和T-DNA区域外的选择性标记。

13.一种包含根据权利要求12所述的核酸构建体的细菌菌株。

14.一种来自芸苔属的经遗传修饰的植物、植物细胞、原生质体或植物组织，其表达根据权利要求12所述的核酸构建体，或用根据权利要求13所述的细菌菌株转化，或根据权利要求1-11中任一项所述的方法获得。

15.一种根据权利要求11所述的方法获得的植物产生的蛋白或多肽，其用于治疗，任选地用于免疫治疗，任选地其中所述植物产生的蛋白是药物组合物的形式。