CN118139637A - 包含肉毒杆菌衍生肽的用于改善脱发的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于改善脱发的组合物，其包含肉毒杆菌衍生肽(肉毒杆菌毒素重组蛋白)。根据本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白可以通过与细胞穿透性肽融合而容易地经皮递送，并可以通过促进真皮乳头细胞的增殖和增强前列腺素F_2α表达以促进脱发区域的毛发生长，从而改善脱发，因此所述组合物可以有效地用于化妆品和药物等领域的预防、改善或治疗脱发。

Description

包含肉毒杆菌衍生肽的用于改善脱发的组合物

技术领域

本发明涉及一种包含肉毒杆菌衍生肽(肉毒杆菌毒素重组蛋白)的用于改善脱发的组合物。

本发明要求基于2021年10月22日提交的韩国专利申请号10-2021-0141684和2022年6月28日提交的日本专利申请号10-2022-0079197的优先权，并且这些申请的说明书和附图中公开的所有内容都被并入本申请。

背景技术

人类的毛发在我们的生活中非常重要，不仅因为它保护我们的皮肤和头皮，还用于社交和性交流。毛发由角蛋白组成，生长于真皮中的毛囊。毛发生长表现出一定的周期，分为生长期(发育期)、衰退期(消退或过渡期)和休止期(休停期)。头皮毛囊由真皮乳头细胞、角质形成细胞、内外根鞘细胞和黑素细胞组成。人发毛囊真皮乳头细胞(HFDPC)是一种特殊的成纤维细胞，参与毛囊的形态发生。由于HFDPC与毛发生长有关，因此HFDPC转录因子和细胞因子的变化是重要的。角蛋白由人角质形成细胞组成，是毛发的主要组织。最近，各种分子分析系统揭示了头皮毛囊在生长期过程中细胞生长(增殖)、退化和凋亡的相关因素。已知细胞外信号调节激酶(ERK)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)途径参与头皮真皮乳头的细胞增殖。众所周知，ERK信号传导通路在有丝分裂或细胞生长中起着一定的作用，据报道，AKT在介导生存信号中起着重要作用。

正常人在发育期有很多毛发，而脱发患者在休停期有很多毛发，导致明显的脱发。随着脱发的发展，发育期变得更短，结果毛发变得越来越少。因此，为了治疗脱发，重要的是让处于休停期的毛囊迅速进入发育期，并延长缩短的发育期。

目前，FDA批准了两种类型的毛发生长促进剂：米诺地尔(经皮施用药物)和非那雄胺(口服药物)。米诺地尔曾被用作口服抗高血压药物，但观察到服用该药物的患者出现多毛症，因此其目前正用于头皮施用，以治疗雄激素性脱发。米诺地尔是一种嘧啶衍生物，其扩张头皮血管以局部增加血流量并激活毛发基质细胞来减缓脱发且促进毛发生长。因此，它目前被广泛用作脱发的治疗剂。非那雄胺是第一种口服给药的雄激素性脱发治疗药剂，通过抑制II型α-还原酶来预防脱发并促进毛发生长。自1997年获得FDA批准以来，非那雄胺目前在全球约有260万人使用。

然而，据报道，米诺地尔有副作用，如体重增加、水肿、心率加快、心绞痛、皮炎和瘙痒；据报道，在非那雄胺的情况下，临床病例中有副作用如男性性功能障碍的报道。因此，这些药物的使用是有限的，或者患者自己对这些药物表现出厌恶。因此，消费者对安全的脱发预防和毛发生长促进物质越来越感兴趣，对此的研究也在积极进行中。

同时，肉毒杆菌毒素是由肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)产生的一种神经毒素蛋白，据报道可抑制神经元中神经递质乙酰胆碱和儿茶酚胺的分泌。肉毒杆菌毒素有八种类型：A、B、C、D、E、F、G和H型，A和B型是商用的。

肉毒杆菌毒素是一种神经毒素蛋白，对人类的中位致死剂量在静脉注射或肌肉注射时为1.3至2.1ng/kg而在吸入时为10至13ng/kg，表明它是一种剧毒物质。然而，当调整到适当的量时，它可以用作治疗神经系统疾病、肌肉疾病、多汗症、方颌等的药物，并且它最常用于美容目的，如减少皱纹和小腿肌肉。

由于肉毒杆菌毒素是一种非常大的分子，分子量为150kDa，具有组合的轻链和重链，难以穿透皮肤，因此只能通过注射使用。毒素持续3到6个月，因此毒素需要定期治疗。因此，许多研究正在进行，以寻找另一种能够为用户提供便利的有效递送方式，但成果仍然不足。

发明内容

[技术问题]

本发明人证实了根据本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白(皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽)促进真皮乳头细胞的增殖和前列腺素F_2α的表达，并且当将其施用于脱发区域时脱发得到改善，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种用于改善脱发的药物组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分，其中在肉毒杆菌毒素重组蛋白中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。

本发明的另一个目的是提供一种用于改善脱发的准药物组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分。

本发明的又一个目的是提供一种用于改善脱发的皮肤外用组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分。

本发明的又一个目的是提供一种用于改善脱发的化妆品组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分。

然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本发明所属领域的技术人员可以通过以下描述清楚地理解未提及的其他问题。

[技术方案]

本发明的一个方面提供了一种用于改善脱发的药物组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分，其中在肉毒杆菌毒素重组蛋白中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。

本发明的另一个方面提供了一种用于改善脱发的准药物组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分。

本发明的又一方面提供了一种用于改善脱发的皮肤外用组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分。

本发明的又一方面提供了一种用于改善脱发的化妆品组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分。

在本发明的一个实施方案中，肉毒杆菌毒素重组蛋白可以由选自由SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:58组成的群组的一个或多个氨基酸序列组成。

在本发明的另一个实施方案中，肉毒杆菌毒素轻链可以由选自由SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:9组成的群组的一个或多个氨基酸序列组成，但不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，肉毒杆菌毒素轻链可以在一端进一步包括六组氨酸标签，但不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，肉毒杆菌毒素轻链可以选自由肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G组成的群组，但不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，细胞穿透性肽可以与肉毒杆菌毒素轻链的羧基末端、氨基末端或两者融合，但不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，融合可以通过肽键或共价键实现。

在本发明的又一个实施方案中，该组合物可以促进真皮乳头细胞的增殖，但不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，该组合物可以促进前列腺素F_2α表达，但不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，该组合物可以促进毛发生长并减少脱发，但不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，该组合物可以满足以下特征中的一个或多个，但不限于此：(a)毛发厚度增加；(b)毛发密度增加(毛发脱落数量减少)；(c)抑制头皮的皮脂分泌；(d)改善头皮卫生；以及(e)减少毛发扁塌。

在本发明的又一个实施方案中，用于改善脱发的组合物可以用于经皮给药，但不限于此。

此外，本发明提供了一种脱发预防或治疗方法，其包括将包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物给药至有需要的受试者。

此外，本发明提供了包含肉毒杆菌毒素重组蛋白的组合物作为活性成分用于预防或治疗脱发的用途。

此外，本发明提供肉毒杆菌毒素重组蛋白用于制备治疗脱发的药物的用途。

此外，本发明提供了一种改善脱发的方法，其包括将包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物给药至有需要的受试者。

此外，本发明提供了包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物用于改善脱发的用途。

此外，本发明提供肉毒杆菌毒素重组蛋白在制备用于改善脱发的药物中的用途。

此外，本发明提供了一种用于促进毛发生长的药物组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于促进毛发生长的方法，该方法包括将包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物给药至有需要的受试者。

此外，本发明提供了包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物用于促进毛发生长的用途。

此外，本发明提供肉毒杆菌毒素重组蛋白用于制备促进毛发生长的药物的用途。

[有利效果]

由于根据本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白可以通过与细胞穿透性肽融合而容易地经皮递送，并促进真皮乳头细胞的增殖且增强前列腺素F2α表达以减少脱发且促进毛发生长，从而改善脱发，因此它可以有效地用于化妆品和药物等领域的预防、改善或治疗脱发。

附图说明

图1是显示用肉毒杆菌毒素重组蛋白处理人乳头细胞后的吸光度测定结果的图。

图2是显示用作为肉毒杆菌毒素重组蛋白阳性对照的胎牛血清(FBS)处理人乳头细胞后的吸光度测定结果的图。

图3是显示用肉毒杆菌毒素重组蛋白处理人乳头细胞后测量细胞活力的结果的图。

图4是显示用FBS作为肉毒杆菌毒素重组蛋白阳性对照处理人乳头细胞后测量细胞活力的结果的图。

图5是显示通过根据分析角质形成细胞中前列腺素F_2α表达水平的量施用标准前列腺素F_2α而获得的标准曲线的图。

图6是显示角质形成细胞中测定的前列腺素F_2α表达的吸光度值的分析结果的图。

图7是显示在将根据本发明的组合物给药至各种脱发患者之后，受试者和评估者随时间评估脱发改善效果的评估结果的图。

图8至图11是显示在将根据本发明的组合物给药至各种脱发患者之后随着时间的推移证实脱发改善效果的结果的图。

具体实施方式

[最佳方式]

本发明人证实，通过将肉毒杆菌毒素轻链与细胞穿透性肽融合而获得的肉毒杆菌毒素重组蛋白(皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽)促进真皮乳头细胞的增殖，并增强前列腺素F_2α的表达以改善脱发，从而减少脱发并促进毛发生长，从而完成了本发明。

由于根据本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白可以通过与细胞穿透性肽融合而容易地经皮递送，并促进真皮乳头细胞的增殖且增强前列腺素F_2α表达以减少脱发并促进毛发生长，从而改善脱发，因此它可以有效地用于化妆品和药物等领域的预防、改善或治疗脱发。

在下文中，将详细描述本发明。

肉毒杆菌毒素作为单一多肽表达，但在表达后，通过重组过程，它被分为约100kDa的重链(H链)和约50kDa的轻链(L链)，并且H链和L链通过二硫键连接。H链与神经元上的受体结合，使肉毒杆菌毒素通过内吞作用进入内部。肉毒杆菌毒素的L链进入细胞后，离开内体，进入细胞质，并在细胞质中裂解可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)蛋白，抑制乙酰胆碱分泌，从而表现出肌肉麻痹作用。因此，仅用L链就可抑制神经元的乙酰胆碱分泌，并且H链和L链可以独立发挥作用。

然而，分子量为50kDa的分离的肉毒杆菌毒素轻链不能穿透细胞膜，因此不能独立发挥作用。通常，为了使肉毒杆菌毒素轻链被递送到神经元的细胞质以表现出肉毒杆菌毒素特异性活性，约100kDa的肉毒杆菌毒素重链的帮助是必不可少的。

因此，本发明提供了一种用于改善脱发的药物组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分，其通过将细胞穿透性肽融合到肉毒杆菌毒素轻链来赋予细胞穿透特性，使得不容易引入细胞的肉毒杆菌毒素轻链能够高效地递送到细胞中，以及

在肉毒杆菌毒素重组蛋白中，将由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。

在本说明书中，“脱发”是指毛发从头皮脱落的现象或毛发变得稀疏或稀薄的状态，并且可以包括本领域中被分类为脱发的所有类型的脱发，但瘢痕性(疤痕性)脱发除外。例如，脱发可以是选自由以下组成的群组的一种或多种：斑秃、雄激素性脱发、头癣、少毛症、遗传性单纯性少毛症、局限性脱发、先天性脱发、耻骨脱发、脂溢性脱发、老年性脱发、全秃、普遍性脱发和休止期脱发中的，但不限于此。

术语“毛发生长”是指毛发发育。根据本发明的组合物的效果可以包括促进毛发生长的效果。

根据本发明的一个实施方案，证实了根据本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白可以促进真皮乳头细胞的增殖，促进角质形成细胞中前列腺素F_2α表达，促进毛发生长，并减少脱发(实施例1至3)。

此外，根据本发明的一个实施方案，证实了包括根据本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白的组合物满足以下特征中的一个或多个，从而改善脱发的前期症状并预防、改善或治疗脱发(参见实施例3)：

(a)毛发厚度增加；

(b)毛发密度增加(毛发脱落数量减少)；

(c)抑制头皮皮脂分泌；

(d)改善头皮卫生；以及

(e)减少毛发扁塌。

本发明中肉毒杆菌毒素重组蛋白(皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽)的组合物与韩国专利号10-1882461相同，并且上述文献中公开的所有内容通过引用结合到本申请中。

在本发明中，“肉毒杆菌毒素重组蛋白”包括细胞穿透性肽和肉毒杆菌毒素轻链，是指由肽键或共价键等化学键形成的复合物。具体地，根据本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白能够通过将细胞穿透性肽融合到肉毒杆菌毒素轻链(其是不容易引入细胞的大分子)来赋予细胞穿透特性，从而高效地将肉毒杆菌毒素轻链递送到细胞中，并且此时，细胞穿透性肽可以融合到肉毒毒素轻链的羧基末端、氨基末端或两者。

根据本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白可以通过肉毒杆菌毒素轻链和细胞穿透性肽的融合高效地递送到细胞中，并且肉毒杆菌毒素轻链的活性和稳定性得到改善，以使肉毒杆菌毒素在体内的固有功效最大化。

在本发明中，“肉毒杆菌毒素”是指任何已知类型的肉毒杆菌毒素，无论随后是否发现，包括由细菌产生或通过重组技术改造的变体或融合蛋白。

在本发明中，肉毒杆菌毒素轻链可选自由肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G组成的群组，此时，肉毒杆菌毒素轻链可以由选自由SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:9组成的群组的一个或多个氨基酸序列组成。此外，肉毒杆菌毒素轻链可以由选自由SEQ ID NO:3至SEQID NO:9组成的群组的一个氨基酸序列组成。此时，肉毒杆菌毒素轻链可以由多核苷酸编码，该多核苷酸由选自由SEQ ID NO:10至16组成的群组的碱基序列组成，但不限于此。

此外，肉毒杆菌毒素轻链还可以在一端包括六组氨酸标签。在本发明中，在肉毒杆菌毒素轻链的一端进一步包括六组氨酸标签的形式可以由选自由SEQ ID NO:17至SEQ IDNO:23组成的群组的氨基酸序列组成，并且它可以由选自由SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:30组成的群组的碱基序列编码，但不限于此。

在本发明中，替代地，肉毒杆菌毒素轻链可以是肉毒杆菌毒素衍生物，即具有肉毒杆菌毒素活性但任选在部分或序列中具有一个或多个修饰的化合物。例如，与肉毒杆菌毒素轻链蛋白的七种血清型相比，它可以是以一种方式修饰的形式，该方法维持轻链内肽酶活性，同时通过对氨基酸序列进行缺失、修饰、替换和嵌合融合等方法来增强其特性或减少其副作用。替代地，可以使用通过重组或化学合成产生的肉毒杆菌毒素轻链或肉毒杆菌毒素轻链的一部分。

在本发明中，肉毒杆菌毒素重组蛋白可以由选自由SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:58组成的群组的一个或多个氨基酸序列组成，并且编码该氨基酸序列的多核苷酸可以选自由SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:86组成的群组，但不限于此。

此外，在本发明中，肉毒杆菌毒素重组蛋白可以由选自由SEQ ID NO:31至SEQ IDNO:58组成的群组的一个氨基酸序列组成。

根据本发明的一个实施方案，肉毒杆菌毒素重组蛋白可以优选由SEQ ID NO:45表示的氨基酸序列组成，并且编码该氨基酸序列的多核苷酸可以是由SEQ ID NO:73表示的核苷酸序列，但不限于此。

SEQ ID NO:45：

SEQ ID NO:73：

在本发明中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽(大分子转导结构域；MTD)可以是可介导生物活性分子细胞内转运的肽，并且可以对人皮肤角质形成细胞和神经元都具有渗透性，但不限于此。

细胞穿透性肽优选不具有确定的酶活性或治疗性生物活性，但用作允许细胞内运输穿过细胞膜的载体。它可以附着到要转移到细胞中的货物的N末端或C末端以及两个末端，并且它可以在每个末端沿正向或反向附着。此外，根据本发明的肽优选作为单体施用，但不限于此，并且它也可以以二聚体或聚合物的形式使用。此外，根据本发明的肽可以是包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列作为最小单元的肽。

在本发明中，细胞穿透性肽可以由SEQ ID NO:2的碱基序列组成的多核苷酸编码，但不限于此。

SEQ ID NO:1：KAMININKFLNQC

SEQ ID NO:2：aaggcgatga taaacataaa caagttcctg aaccagtgc

在本说明书中，“活性成分”是指可单独或与本身无活性的载体组合显示所需活性的成分。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的组合物表现出脱发改善效果的最合适的给药途径是通过皮肤吸收，因此，根据本发明的组合物可以优选用于经皮给药，并且可以通过诸如直接施用或分散到毛发或头皮的方法给药。

施用本发明组合物的“毛发”包括头部的发根和毛囊、头上的毛发、睫毛、眉毛、胡须、腋毛、阴毛以及身体的具有发根和毛囊的所有部位。

在本发明中，根据本发明的组合物可以进一步包括经皮吸收促进剂，但不限于此。

“经皮吸收促进剂”是乳化剂中影响皮肤渗透并常用于经皮贴剂的一种成分。在本发明中，它增强肉毒杆菌毒素重组蛋白的皮肤穿透性和细胞穿透性，并且可以是卵磷脂、月桂基吡咯烷酮、甘油单油酸酯、甘油单月桂酸酯、丙二醇单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯、山梨糖醇单油酸酯、山梨糖醇单硬脂酸酯，或山梨糖醇单月桂酸酯，但不限于此。

本说明书中描述的由特定序列号表示的氨基酸序列不限于由该特定序列号表示的蛋白质(肽)，并且只要保持功能等同，氨基酸序列的变体就包括在本发明的范围内。具体而言，可以包括与特定序列号表示的氨基酸序列具有80％或更多、更优选90％或更多、甚至更优选95％或更多的序列同一性的氨基酸序列。例如，它可以包括序列同一性为70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的蛋白质(肽)。氨基酸的“序列同一性百分比”是通过将比较区域与最佳比对序列进行比较来确认的，并且在比较区域中，为了两个序列的最佳比对，与参考序列(不包括添加或缺失)相比，氨基酸序列的一部分可以包括添加或缺失(即间隙)。

由本说明书中描述的特定序列号表示的碱基序列组成的多核苷酸不限于相应的碱基序列，并且该碱基序列的变体包括在本发明的范围内。本发明的碱基序列的核酸分子是包括构成它的核酸分子的功能等同物的概念，例如由核酸分子形成的变体，其中一些碱基序列通过缺失、取代或插入而修饰，但仍然能够执行与核酸相同的功能。具体地，本发明中公开的多核苷酸可以包括与由特定序列号表示的碱基序列具有70％或更多、更优选80％或更多、甚至更优选90％或更多、最优选95％或更多的序列同一性的碱基序列。例如，它包括序列同一性为70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的多核苷酸。多核苷酸的“序列同一性百分比”是通过比较两个最佳比对序列之间的比较区域来确认的，并且为了两个序列的最佳比对，与参考序列(不包括添加或缺失)相比，比较区域中的多核苷酸序列的一部分可以包括添加或缺失(即间隙)。

在本发明中，“药物组合物”是指为预防或治疗疾病而制备的组合物，它可以按照常规方法以各种形式配制和使用。例如，它可以配制成口服剂型，如粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳液和糖浆，或者以外用制剂、栓剂和无菌注射溶液的形式配制和使用。

根据本发明的药物组合物可以进一步包括通常用于制备药物组合物的适当载体、赋形剂和稀释剂。赋形剂可以是例如选自由稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、吸附剂、保湿剂、膜包衣材料和控释添加剂组成的群组的一种或多种。

根据本发明的药物组合物可以通过常规方法以下列形式配制和使用：粉末、颗粒、缓释颗粒、肠溶包衣颗粒、溶液、滴眼液、酏剂、乳液、悬浮液、醑剂、锭剂、香料、柠檬水、片剂、缓释片、肠溶包衣片、舌下片、硬胶囊、软胶囊、缓释胶囊、肠溶包衣胶囊、丸剂、酊剂、软提取物、干提取物、液体提取物、注射剂、囊剂、灌注液、膏药、洗液、糊剂、喷雾剂、吸入剂、贴片、灭菌注射溶液，或外部制剂如气雾剂；并且外部制剂可配制为乳膏、凝胶、贴片、喷雾剂、软膏、膏药、洗液、搽剂、糊剂或巴布剂。

根据本发明的药物组合物中可以包含的载体、赋形剂和稀释剂包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、低聚糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯乙酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。

在制剂的情况下，根据本发明的组合物可以使用稀释剂或赋形剂来制备，例如常用的填料、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂。

作为根据本发明的片剂、粉末、颗粒、胶囊、丸剂和锭剂的添加剂，可以使用赋形剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、乳糖、白糖、葡萄糖、果糖、二甘露醇、沉淀碳酸钙、合成硅酸铝、磷酸氢钙、硫酸钙、氯化钠、碳酸氢钠、纯化羊毛脂、微晶纤维素、糊精、藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、高岭土、尿素、胶体硅胶、羟丙基淀粉、羟丙基甲基纤维素(HPMC)1928、HPMC 2208、HPMC 2906、HPMC 2910、丙二醇、酪蛋白、乳酸钙和Primogel；以及粘合剂，如明胶、阿拉伯胶、乙醇、琼脂粉末、乙酸邻苯二甲酸酯纤维、羧甲基纤维素、羧甲基纤维钙、葡萄糖、纯化水、酪蛋白酸钠、甘油、硬脂酸、羧甲基纤维酸钠、甲基纤维素钠、甲基纤维、微晶纤维素、糊精、羟基纤维素、羟丙基淀粉、羟甲基纤维素、精制紫胶、淀粉明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮；并且可以使用：崩解剂，如羟丙基甲基纤维素、玉米淀粉、琼脂粉、甲基纤维素、膨润土、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙、柠檬酸钙、十二烷基硫酸钠、硅酸酐、1-羟丙基纤维素、葡聚糖、离子交换树脂、聚乙酸乙烯酯、甲醛处理的酪蛋白和明胶、褐藻酸、直链淀粉、瓜尔胶、碳酸氢钠、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸钙、凝胶淀粉、阿拉伯胶、支链淀粉、果胶、多磷酸钠、乙基纤维素、白糖、硅酸镁铝、D-山梨醇溶液和轻质无水硅酸；以及润滑剂，如硬脂酸钙、硬脂酸镁、硬脂酸、氢化植物油、滑石、石松、高岭土、凡士林、硬脂酸钠、可可脂、水杨酸钠、水杨酸镁、聚乙二醇(PEG)4000、PEG 6000、液体石蜡、加氢大豆油(Lubri蜡)、硬脂酸铝、硬脂酸锌、十二烷基硫酸钠、氧化镁、聚乙二醇、合成硅酸铝、硅酸酐、高级脂肪酸、高级醇、硅油、石蜡油、聚乙二醇脂肪酸醚、氯化钠、乙酸钠、油酸钠、DL-亮氨酸和轻质无水硅酸。

作为根据本发明的液体制剂的添加剂，可以使用水、稀盐酸、稀硫酸、柠檬酸钠、蔗糖单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温酯)、聚氧乙烯单烷基醚、羊毛脂醚、羊毛脂酯、乙酸、盐酸、氨水、碳酸铵、氢氧化钾、氢氧化钠、脯氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠等。

在根据本发明的糖浆中可以使用白糖、其他糖或甜味剂等的溶液，并且可以根据需要使用调味剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、悬浮剂、乳化剂、增稠剂等。

根据本发明，纯化水可用于乳液中，并且可以根据需要使用乳化剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等。

根据本发明，在悬浮液中可以使用悬浮剂，例如阿拉伯胶、黄芪胶(tragacanth)、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠、微晶纤维素、藻酸钠、HPMC、HPMC 1828、HPMC 2906、HPMC 2910等，并且可以根据需要使用表面活性剂、防腐剂、稳定剂、着色剂和调味剂。

根据本发明的注射剂可以包括溶剂，例如注射用蒸馏水、0.9％注射用氯化钠、林格氏溶液、注射用葡萄糖、注射用葡萄糖+氯化钠、PEG、乳酸林格氏溶液、乙醇、丙二醇、非挥发性油芝麻油、棉子油、花生油、大豆油、玉米油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、苯甲酸苄酯；增溶剂，如苯甲酸钠、水杨酸钠、乙酸钠、尿素、氨基甲酸酯、单乙基乙酰胺、丁唑胺、丙二醇、吐温、烟酰胺、六胺和二甲基乙酰胺；缓冲剂，如弱酸及其盐(乙酸和乙酸钠)、弱碱及其盐(氨和乙酸铵)、有机化合物、蛋白质、白蛋白、蛋白胨和树胶；等渗剂，如氯化钠；稳定剂，如亚硫酸氢钠(NaHSO₃)二氧化碳气体、偏亚硫酸氢钠(Na₂S₂O₅)、亚硫酸钠(Na₂SO₃)、氮气(N₂)和乙二胺四乙酸；抗氧化剂，如0.1％硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、硫脲、乙二胺四乙酸二钠和丙酮亚硫酸氢钠；止痛剂，如苄醇、氯丁醇、盐酸普鲁卡因、葡萄糖和葡萄糖酸钙；以及悬浮剂，如羧甲基(CM)钠、海藻酸钠、吐温80和单硬脂酸铝。

对于根据本发明的栓剂，可以使用基质，如可可油、羊毛脂、Witepsol、聚乙二醇、甘油、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸和油酸的混合物、Subanal、棉籽油、花生油、棕榈油、可可脂+胆固醇、卵磷脂、Lanette蜡、甘油单硬脂酸酯、吐温或Span、Imhausen、单烯(丙二醇单硬脂酸酯)、甘油、Adeps solidus、Buytyrum Tego-G、Cebes Pharma 16、六环内酯碱95、Cotomar、Hydrocote SP、S-70-XXA、S-70-XX75(S-70-XX95)、Hydrokete 25、Hydrokoe711、Idropostal、Massa estrarium(A,AS,B,C,D,E,I,T)、Mass-MF、Massaupol、Masupol-15、新栓剂-N、Paramount-B、Suposiro(OSI、OSIX、A、B、C、D、H、L)、IV型栓剂基质(AB、B、A、BC、BBG、E、BGF、C、D、299)、Supostal(N、Es)、Wecobi(W、R、S、M、Fs)、Tegestor甘油三酯基质(TG-95、MA、57)。

口服固体制剂包含片剂、丸剂、散剂、颗粒剂和胶囊剂。这些固体制剂通过将提取物与至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖)、乳糖或明胶等混合来制备。除了简单的赋形剂之外，还使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石。

悬浮液、口服溶液、乳液、糖浆等对应于口服给药的液体制剂，并且除了常用的简单稀释剂如水和液体石蜡之外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、调味剂和防腐剂。用于胃肠外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳液、冻干制剂和栓剂。可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的酯如油酸乙酯作为非水溶剂和悬浮液。

根据本发明的药物组合物以药学有效量给药。在本发明中，“药物有效量”是指足以以适用于医疗的合理获益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可以基于包括患者疾病类型和严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径和排泄率、治疗持续时间和同时使用的药物等因素及医学领域中众所周知的其他因素来确定。

根据本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂或与另一种治疗剂同时给药，并且它可以顺序地或与常规治疗剂同时给药，并且它可以给药一次或多次。重要的是，通过考虑所有上述因素，给药的量可以以最小的量达到最大效果而没有副作用，这可以由本发明所属领域的技术人员容易地确定。

本发明的药物组合物可以通过各种途径给药至受试者。考虑了所有的给药方式，并且它可以通过例如口服给药、皮下注射、腹膜内给药、静脉注射、肌内注射、椎旁间隙(鞘内)注射、舌下给药、口腔给药、直肠内注射、阴道注射、眼部给药、耳部给药、鼻腔给药、吸入、通过口或鼻喷雾、皮肤给药、经皮给药等给药。

本发明的药物组合物是根据作为活性成分的药物的类型以及各种相关因素来确定的，所述因素例如是要治疗的疾病、给药途径、患者的年龄、性别和体重以及疾病的严重程度。

此外，本发明提供了一种脱发预防或治疗方法，其包括将包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物给药至有需要的受试者。

此外，本发明提供了包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物用于预防或治疗脱发的用途。

此外，本发明提供肉毒杆菌毒素重组蛋白用于制备治疗脱发的药物的用途。

此外，本发明提供了一种改善脱发的方法，其包括将包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物给药至有需要的受试者。

此外，本发明提供了包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物用于改善脱发的用途。

此外，本发明提供肉毒杆菌毒素重组蛋白在制备用于改善脱发的药物中的用途。

此外，本发明提供了一种促进毛发生长的方法，其包括将包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物给药至有需要的受试者。

此外，本发明提供了包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物用于促进毛发生长的用途。

此外，本发明提供肉毒杆菌毒素重组蛋白用于制备促进毛发生长的药物的用途。

在本发明中，“受试者”是指需要治疗疾病的受试者，更具体是指人类或非人灵长类动物，以及哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。

在本发明中，“给药”是指通过任何适当的方法向受试者提供预定量的本发明组合物。

在本发明中，“改善”可指通过根据本发明的组合物的给药使脱发症状更好或有益地改变的任何作用，并且还可包括预防或治疗作用。

在本发明中，“预防”是指抑制或延迟目标疾病发作的所有作用，并且“治疗”是指通过根据本发明的药物组合物的给药而更好或有益地改变目标疾病及其相关代谢异常的所有作用。

在本发明中，“治疗”可包括但不限于将肉毒杆菌毒素重组蛋白给药至受试者并允许受试者与之接触的任何行为。

此外，作为本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于改善脱发的准药物组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分，并且在肉毒杆菌毒素重组蛋白中，由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。肉毒杆菌毒素重组蛋白的具体细节如上所述。

本发明的术语“准药物”是指用于诊断、治疗、改善、减轻、治疗或预防人类或动物疾病的目的的物品中效果比药物温和的物品。例如，根据《药物事务法》(thePharmaceutical Affairs Act)，准药物不包括用于医药用途的物品，包括用于治疗或预防人类/动物疾病的产品以及对人体有轻微或没有直接影响的产品。

当根据本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白用作准药物添加剂时，该组合物可以按原样添加或与另一种准药物或准药物组分一起使用，并且可以根据常规方法适当使用。活性成分的混合量可以根据使用目的适当地确定。

本发明的用于改善脱发的准药物组合物的剂型没有特别限制，并且可以以各种形式配制为本领域已知的准药物，以表现出改善脱发的效果。上述配制的准药物包括护发剂、发乳、发膏、喷发剂、发摩丝、发胶、护发素、洗发水、染发剂、发膜、毛发护理剂、眉毛生长剂、睫毛生长剂、眼睫毛营养剂、宠物洗发水、宠物冲洗液、洗手液、清洁皂、肥皂、消毒剂、湿巾、口罩、软膏、贴片或过滤填充物，并包括传统意义上的所有准药物。

此外，在每种制剂中，根据其他准药物的制剂或使用目的，可以任选地选择其他成分并将其与用于改善脱发的准药物组合物混合。活性成分的混合量可以根据使用目的适当确定，并且可以包括例如常规佐剂，例如增稠剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和香料以及载体。包括本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的准药物组合物对细胞几乎没有毒性或副作用，因此可以有效地用作准药物材料。

此外，作为本发明的又一方面，本发明提供了一种用于改善脱发的皮肤外用组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分，并且在肉毒杆菌毒素重组蛋白中，将由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。肉毒杆菌毒素重组蛋白的具体细节如上所述。

本发明的皮肤外用组合物包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分，并且可以包括药学上可接受的载体。此外，本发明的皮肤外用组合物可以进一步包括皮肤科领域中常用的佐剂，例如脂肪物质、有机溶剂、增溶剂、增稠剂和胶凝剂、柔软剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂、调味剂、表面活性剂、水、离子或非离子乳化剂、填料、掩蔽剂和螯合剂、防腐剂、维生素、阻断剂、润湿剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲脂性活性剂、脂质囊泡或任何其他常用于皮肤外用制剂的成分。此外，所述成分可以以皮肤科领域中常用的量引入。

本发明的皮肤外用组合物中的药学上可接受的载体根据剂型而变化，但它们可以包括烃类，如凡士林、液体石蜡和胶凝烃类(Plastibase)；动物和植物油，如中链脂肪酸甘油三酯、猪肉脂肪、硬脂肪和可可脂；高级脂肪醇和脂肪酸，以及它们的酯，如十六醇、硬脂醇、硬脂酸和棕榈酸异丙酯；水溶性基质，如聚乙二醇、1,3-丁二醇、甘油、明胶、白糖和糖醇；乳化剂，如甘油脂肪酸酯、聚氧化硬脂酸酯和聚氧乙烯氢化蓖麻油；粘合剂，如丙烯酸酯和海藻酸钠；推进剂，如液化石油气和二氧化碳；以及防腐剂，如对羟基苯甲酸酯。此外，除此之外，可以根据需要添加稳定剂、香料、着色剂、pH调节剂、稀释剂、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂等。当使用根据本发明的皮肤外用组合物时，优选通过常规方法将其施用于脱发区域的皮肤。

根据本发明的皮肤外用组合物可以配制成包括美容或皮肤科可接受的介质或基质。这是一种适合经皮给药的制剂，皮肤外用组合物可以以溶液、凝胶、固体、糊状无水产品、通过将油相分散在水相中获得的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微粒或离子(脂质体)和非离子泡状分散剂的形式，或者以乳膏、爽肤水、乳剂、粉末、软膏、喷雾、发膜、遮瑕棒、护发素、护发乳剂、毛发护理剂、染发剂、洗发水、发乳等的形式提供。皮肤外用组合物也可以以泡沫的形式或还包含压缩推进剂的气溶胶组合物的形式使用。这些组合物可以根据本领域的常规方法制备。

皮肤外用组合物的剂量可以根据待给药的受试者的体重、年龄、性别和健康状况、给药时间、清除率、疾病的严重程度等而变化。

此外，作为本发明的又一方面，本发明提供了一种用于改善脱发的化妆品组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分，并且在肉毒杆菌毒素重组蛋白中，由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。肉毒杆菌毒素重组蛋白的具体细节如上所述。

同时，包括在本发明的化妆品组合物中的成分除了作为活性成分的本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白之外，还可以包括化妆品组合物中常用的成分，例如，它们可以包括常规佐剂，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和香料以及载体。

本发明的化妆品组合物可以以本领域中通常制备的任何制剂制备，例如溶液、悬浮液、乳液、糊剂、发胶、发霜、发乳、发粉、肥皂、含有表面活性剂的洗发水、不含表面活性剂的洗发水、发油、发膜、发精华、喷雾剂，但不限于此。

当本发明的化妆品组合物的制剂是糊状物、乳膏或凝胶时，动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等可以用作载体成分。

当本发明的化妆品组合物的制剂是溶液或乳液时，使用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体成分，并且其可以包括例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂族酯、聚乙二醇或山梨糖醇的脂肪酸酯。

当本发明的化妆品组合物的制剂是悬浮液时，可以使用液体稀释剂如水、乙醇和丙二醇，悬浮剂如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶作为载体成分。

当本发明的化妆品组合物的制剂是粉末或喷雾时，乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末可以用作载体成分，并且特别地，当制剂是喷雾时，其可以进一步包括推进剂，如氯氟烃、丙烷/丁烷和二甲醚。

当本发明的化妆品组合物的制剂是含有表面活性剂的洗发水时，脂族醇硫酸盐、脂族醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺基甜菜碱、脂族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯可以用作载体成分。

当本发明的化妆品组合物是肥皂、含表面活性剂的洗发水或无表面活性剂的洗发水制剂的形式时，它可以施用于皮肤，然后擦拭、去除或用水洗涤。作为具体实例，肥皂包括液体皂、粉末皂、固体皂和油皂，但不限于此。

在下文中，提供优选的实施例以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例只是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。

实施例

实施例1.人毛囊真皮乳头细胞(HFDPC)的细胞毒性评价

1-1.细胞系选择和细胞培养

为了评估根据韩国专利号10-1882461制备的皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽(肉毒杆菌毒素重组蛋白)的细胞活力，购买并使用HFDPC(德国PromoCell)。在加入含有青霉素(100IU/ml)、链霉素(100g/ml)和补充剂的人真皮乳头生长培养基后，将HFDPC以1×10⁶个细胞/皿接种到每个100mm²培养皿中，并在37℃下在含有5％二氧化碳的培养箱(日本三洋)中培养。

1-2.细胞活力评估方法

噻唑蓝溴化四唑鎓(MTT)分析法是用于测量线粒体通过细胞脱氢酶作用将MTT四唑鎓(一种黄色水溶性底物)还原为红紫色甲臜(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓)的能力的测试方法。由于MTT减少发生在代谢活性细胞中，因此它被广泛用于评估培养细胞中的细胞毒性和细胞活力。

将实施例1-1中传代培养的HFDPC细胞以1×10⁴个细胞/孔分配到96孔板中，并于37℃在含有5％二氧化碳的培养箱中培养24小时。接下来，用最终浓度为0.0005、0.005、0.05和0.5ppm的皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽处理HFDPC细胞，并且在阳性对照组(FBS)中，细胞用稀释至最终浓度为15％、20％、25％和30％的胎牛血清(FBS)处理并在细胞培养条件下培养24小时。

培养后，将MTT溶液加入每个孔中，并允许在遮光条件下反应两小时。然后，除去上清液，用二甲基亚砜(DMSO)完全溶解所得到的甲臜，并用酶标仪(美国Biotek Synergy-HT)在540nm处测量吸光度。

细胞活力测试重复三次，使用方程1计算结果值，并将其表示为与未处理组相比的细胞活力，并表示为三个实验的平均值±标准差。

[方程1]

实验结果分析如下：

(1)试验重复三次，结果用平均值±标准差表示。

(2)使用Kruskal-Wallis试验，然后用Mann-Whitney U试验分析作为细胞毒性试验结果测量的值，然后进行Bonferroni校正(p<0.0125)。

(3)使用IBM SPSS统计软件21.0版证实了测试中测量值的显著性，假设平均差异为5％(p<0.05)。

1-3.结果

分别用0.0005、0.005、0.05和0.5ppm的皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽和15％、20％、25％和30％的FBS作为阳性对照处理HFDPC细胞，并如表1和表2及图1至4所示测量吸光度和细胞活力。

作为测试的结果，与未处理组相比，用皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽处理的组在0.0005ppm浓度时显示出103.96％的细胞活力，在0.005ppm浓度时显示出105.18％的细胞活力、在0.05ppm浓度时显示出107.83％的细胞活力，以及在0.5ppm浓度时显示出103.69％的细胞活力。在用作阳性对照的FBS处理组中，与未处理组相比，细胞活力在15％浓度时为104.43％，在20％浓度时为107.38％，在25％浓度时为110.68％，在30％浓度时为115.02％。

换言之，皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽在所有浓度下都不影响细胞毒性，并且在0.05ppm浓度的皮肤穿透性肉毒衍生成分肽下，与未处理组相比，细胞活力显著增加，表明HFDPC的活力增加。

[表1]

[表2]

实施例2.前列腺素F_2α表达的评价

迄今为止，已知约有30种前列腺素亚型。特别地，已知前列腺素E2和前列腺素F_2α主要分布在皮肤中。当研究将含有其衍生物作为主要成分的拉坦前列素(latanoprost)滴眼液用作青光眼的治疗剂时，延长睫毛、睫毛数量增加和周边区域色素沉着过多的副作用时，前列腺素F_2α受到了关注。之后，通过许多研究，前列腺素F_2α被认为是诱导毛发生长的因素，并通过检查前列腺素F_2α的表达是否根据样本的处理而增加或减少，将其用作确定控制毛发生长和控制色素沉着的可能性的数据。

因此，为了评估和研究皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽是否可以诱导前列腺素F_2α的定量变化，根据样品的处理分析角质形成细胞分泌的前列腺素F_2α表达水平的变化。

2-1.样品的制备

将浓度为成品(0.005ppm)2000倍的皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽和/或浓度为成品(烟酰胺(0.1％)和右苯甲醇(0.2％))200倍的脱发改善功能成分(烟酰胺+右苯甲醇)在纯化水中稀释，并在最终细胞培养基中以成品浓度的0.2、0.5、1和2倍的浓度进行处理，对照组用与样品处理量相同量的纯化水进行处理。

2-2.实验方法

1)以3×10⁵/6孔接种角质形成细胞并培养2天。

2)将细胞在饥饿状态下培养一天。

3)用样品处理细胞并培养一天。

-处理的样品：

a)皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽

b)皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽+脱发改善功能成分

c)阴性对照(COX-2抑制剂，NS-398)

4)离心细胞培养基后，使用前列腺素F_2α测定试剂盒测定前列腺素F_2α的表达水平。具体地，前列腺F_2α测试方法是一种比色方法，其中使用分光光度计测量吸光度并分析结果。由于前列腺素F_2α的表达对细胞条件和处理方法高度敏感，因此适当的细胞培养和样品处理方法是重要的，并且在每次测试中应测量标准前列腺素F_2α并通过浓度进行比较分析。

5)使用MTT法测量细胞活性，并校正和分析前列腺素F_2α值。

2-3.细胞毒性试验结果

在细胞毒性试验中，通过MTT法进行测量。细胞毒性的测定基于细胞活性与对照组相比下降超过20％的时间。

每个样品用最终浓度为0.2×、0.5×、1×、2×和4×的细胞培养基处理。在单独使用皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽治疗的组中，在高达4×下未观察到毒性，而在使用皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽+脱发改善功能成分治疗的组中，从2×浓度开始观察到强烈的毒性，因此该组被排除在试验组之外。细胞毒性试验结果如表3所示。

[表3]

2-4.使用分光光度计分析前列腺素F_2α的结果

使用分光光度计的前列腺素F_2α分析是一种测试方法，其特征在于前列腺素F_2α的表达水平越高，吸光度值越低，如在标准前列腺素F_2α每个浓度下测量的吸光度所示。具体地，如表4和图5所示，通过根据量施用标准前列腺素F_2α来获得标准曲线，并且使用该标准曲线来分析前列腺素F_2α的量。将该吸光度值重新校准为细胞活性值以进行最终分析，结果如表5和表6以及图6所示。

[表4]

作为分析的结果，考虑到对照组中前列腺素F_2α的表达水平为100％，在单独用皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽治疗的组中，证实了在0.2×治疗浓度下表达增加25.2％，在0.5×时增加25.8％，在1×时增加33.3％，在2×时增加40.2％。然而，在4×时，观察到表达水平下降到对照组的水平。在皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽和脱发改善功能成分的联合治疗中，在0.2×治疗浓度下表达增加25.1％，在0.5×时增加43.4％并且在1×时增加44.3％。

此时，试验中n＝4，作为使用学生t检验作为统计技术的分析的结果，证实在前列腺素F_2α表达水平增加的所有切片中都发现了显著性。

[表5]

SD：标准偏差

[表6]

SD：标准偏差

从上述结果可以证实，在单独用皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽治疗的组和与脱发改善功能成分联合治疗的组中，角质形成细胞中前列腺素F_2α的表达和分泌都被诱导。

由于前列腺素F_2α表达的增加与毛发生长有关，因此确定将皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽施用于皮肤可以诱导毛发生长。

实施例3.脱发改善效果评估

3-1.实验材料和方法

要求总共4名有脱发症状的男性(42至52岁)每天早上将2.5cc含有皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽(肉毒杆菌毒素重组蛋白)的溶液直接涂抹在脱发区域，并通过在使用前、使用8周后和使用16周后拍照来确认受试者头皮的状况。受试者被要求将脱发症状的改善评估为无效果(0)/良好(1)/满意(2)/非常满意(3)。

此外，为了使实验结果客观化，两名评估者被要求将脱发症状的改善评估为无改善(0)/轻微改善(1)/改善(2)/极好改善(3)。

此外，在使用16周后，对受试者进行了一项关于毛发厚度变化、脱发数量、头皮油性减少、发根周围清洁度(皮脂减少等)和下午毛发扁塌的调查。

3-2.结果

如表7和图7所示，作为受试者和评估者评估皮肤穿透性肉毒杆菌衍生成分肽的脱发改善效果的结果，受试者的满意度随着使用时间的增加而增加，并且两个评估者评估道受试者的脱发症状显著改善。在16周的实验期间，没有发现任何受试者有特别的副作用。图8至图11示出了受试者头皮的变化。

[表7]

*受试者的满意度：0(无效果)/1(良好)/2(满意)/3(非常满意)。

**评估者照片评估：0(无改善)/1(轻微改善)/2(改善)/3(极好改善)。

此外，如表8所示，在使用16周后对受试者进行的调查中，发现受试者的毛发厚度、脱发数量、头皮油性减少、发根周围的清洁度(皮脂减少等)以及下午毛发扁塌都有总体改善。

[表8]

上述对本发明的描述是为了说明的目的，本领域技术人员将理解，在不改变本发明的技术思想或基本特征的情况下，本发明可以容易地修改为其他特定形式。因此，上文所描述的实例应在所有方面被理解为说明性的而非限制性的。

工业适用性

由于根据本发明的肉毒杆菌毒素重组蛋白可以通过与细胞穿透性肽融合而容易地经皮递送，并促进真皮乳头细胞的增殖且增强前列腺素F_2α表达以减少脱发和促进毛发生长，从而改善脱发，因此它可以有效地用于化妆品和药物等领域的预防、改善或治疗脱发。因此，本发明具有工业实用性。

Claims (17)

1.用于改善脱发的药物组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分，

其中在所述肉毒杆菌毒素重组蛋白中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肉毒杆菌毒素重组蛋白由一个或多个氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:58组成的群组。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肉毒杆菌毒素轻链由一个或多个氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:9组成的群组。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肉毒杆菌毒素轻链在一端还包括六组氨酸标签。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肉毒杆菌毒素轻链选自由肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G组成的群组。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述细胞穿透性肽与所述肉毒杆菌毒素轻链的羧基末端、氨基末端或两者融合。

7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述融合通过肽键或共价键实现。

8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物促进真皮乳头细胞的增殖。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物促进前列腺素F_2α的表达。

10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物促进毛发生长并减少脱发。

11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物用于经皮给药。

12.用于改善脱发的准药物组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分，

其中在所述肉毒杆菌毒素重组蛋白中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。

13.用于改善脱发的皮肤外用的组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分，

其中在所述肉毒杆菌毒素重组蛋白中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。

14.用于改善脱发的化妆品组合物，其包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分，

其中在所述肉毒杆菌毒素重组蛋白中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。

15.脱发预防或治疗方法，其包括将包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物给药至有需要的受试者，其中在所述肉毒杆菌毒素重组蛋白中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。

16.包含肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分的组合物用于预防或治疗脱发的用途，其中在所述肉毒杆菌毒素重组蛋白中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。

17.肉毒杆菌毒素重组蛋白用于制备治疗脱发的药物的用途，其中在所述肉毒杆菌毒素重组蛋白中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透性肽与肉毒杆菌毒素轻链的一端或两端融合。