CN118126876A - 一株人型葡萄球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，特别涉及一株人型葡萄球菌及其在制备抑制病原体感染、抗EB病毒感染及调节黏膜免疫应答药物中的应用。将该人型葡萄球菌命名为人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏号为GDMCC No：64349，保藏时间为2024年1月31日。本发明的人型葡萄球菌来源于健康人鼻咽部，具有抑制病原体感染、抗EB病毒感染及调节黏膜免疫应答的活性，可显著的协助上皮细胞抵抗EB病毒感染，抑制多种病原菌，有望开发成为抵御病原体感染、调节黏膜免疫的药物或益生菌制剂。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一株人型葡萄球菌及其在制备抑制病原体感染、抗EB病毒感染及调节黏膜免疫应答药物中的应用。
背景技术
鼻咽部是上呼吸道的重要组成部分，在解剖结构上通过鼻腔和口腔与外界相通，其温暖潮湿的环境有利于微生物的定殖生长。在生命早期，鼻咽部微生物来源于母亲的皮肤、阴道和母乳，而后逐渐发展为一个独特的生态位。在健康成人中，鼻咽部定殖的优势共生菌包括葡萄球菌属(Staphylococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丙酸杆菌属(Cutibacterium)及狡诈球菌属(Dolosigranulum)等。这些鼻咽部原驻菌群能以多种途径捍卫人类呼吸道健康，例如黏膜表面的共生菌可以通过定殖抵抗，有效阻止致病菌在其表面定殖。这些共生菌还可以通过调节黏膜的炎症、免疫状态，或与人体免疫系统配合，共同抵抗病原微生物的入侵。
在生理情况下，与鼻咽部菌群共进化的鼻咽黏膜免疫，对多种病原体感染具有较强的抵抗能力，能够通过产生多种免疫调节因子启动对病原体的清除。然而，当鼻咽部共生菌群发生紊乱、鼻咽黏膜免疫功能失调时，可能造成鼻咽对致病病原体更加易感或清除能力下降，从而导致鼻咽部急慢性疾病的发生发展。因此，调节鼻咽部共生菌群、诱导鼻咽黏膜产生高水平的黏膜免疫应答能力，在鼻咽部抗感染及相关疾病的防治中具有前景。
葡萄球菌是人体重要的共生菌，广泛定殖于人鼻咽、皮肤等多部位。其中，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)被报道可以协助鼻咽上皮细胞抵御流感病毒入侵，并抑制金黄色葡萄球菌引发的感染性疾病。鉴于共生菌群对鼻咽部疾病的保护效应，共生于健康成人鼻咽部的葡萄球菌属细菌，可能具有协助鼻咽上皮细胞抵御EB病毒感染等病原体感染、调节黏膜免疫应答的有益作用，是鼻咽部急慢性疾病及鼻咽癌防治的候选益生菌。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株人型葡萄球菌。本发明的人型葡萄球菌具有良好的抗病毒、抗细菌和调节黏膜免疫应答的能力，可作为新型的呼吸道益生菌制剂。
本发明的另一目的在于提供一种基于上述人型葡萄球菌的生物制剂。
本发明的再一目的在于提供上述人型葡萄球菌在制备抑制病原体感染、抗EB病毒感染及调节黏膜免疫应答药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一株人型葡萄球菌，将其命名为人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏号为GDMCC No：64349，保藏时间为2024年1月31日。
所述人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)在CBA血平板上菌落呈乳白色、类圆形，表面湿润、光滑、边缘整齐，无色素沉着，有明显突起。
一种生物制剂，基于上述的人型葡萄球菌制备得到。
进一步的，所述生物制剂可通过将上述的人型葡萄球菌培养于BHI培养基中得到。
本发明还提供上述人型葡萄球菌在制备抗病原微生物的药物或益生菌制剂中的应用。
本发明还提供上述生物制剂在制备抗病原微生物的药物或益生菌制剂中的应用。
进一步的，所述的病原微生物可包括EB病毒、金黄色葡萄球菌、具核梭杆菌和中间普雷沃氏菌等。
本发明还提供上述人型葡萄球菌在制备抑制病原体感染或调节黏膜免疫应答的药物或益生菌制剂中的应用。
本发明还提供上述人型葡萄球菌在制备抗EB病毒感染的药物或益生菌制剂中的应用。
本发明还提供上述生物制剂在制备抑制病原体感染或调节黏膜免疫应答的药物或益生菌制剂中的应用。
本发明还提供上述生物制剂在制备抗EB病毒感染的药物或益生菌制剂中的应用。
进一步的，所述的病原体是指可造成人或动植物感染疾病的微生物(包括细菌、病毒、立克次氏体、真菌)、寄生虫或其他媒介(微生物重组体包括杂交体或突变体)。具体可包括EB病毒、金黄色葡萄球菌、具核梭杆菌和中间普雷沃氏菌等。
进一步的，所述药物或益生菌制剂中，含有所述的人型葡萄球菌菌株、或其培养的产物、或其发酵培养液、或其发酵培养液的过滤液。
进一步的，所述药物或益生菌制剂，其剂型可为口服液、喷剂或粉剂中的一种。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明的人型葡萄球菌菌株来源于健康人鼻咽部，可定殖于人鼻咽部，具有抑制病原体感染、抗EB病毒感染及调节黏膜免疫应答的活性，可显著的协助上皮抵抗EB病毒感染，抑制多种病原菌，有望开发成为抵御病原体感染、调节黏膜免疫的药物或益生菌制剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1的菌落形态。
图2为人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1的革兰染色结果。
图3为293T细胞系中筛选具备抑制上皮细胞感染EB病毒效率功能的人型葡萄球菌。
图4为人型葡萄球菌CT1对EB病毒抑制作用的荧光成像图。
图5为人型葡萄球菌CT1对EB病毒抑制作用的统计图。
图6为人型葡萄球菌CT1对细胞活力的影响。
图7为人型葡萄球菌CT1对病原菌的抑菌能力。A：人型葡萄球菌CT1对金黄色葡萄球菌生长的影响；B：人型葡萄球菌CT1对中间普雷沃氏菌生长的影响；C：人型葡萄球菌CT1对具核梭杆菌生长的影响。
图8为人型葡萄球菌CT1对先天免疫水平的影响。
其中，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的物料若无特殊说明均可从商业渠道获得。所述方法若无特别说明均为常规方法。
实施例1：葡萄球菌的分离、纯化和保藏
1.1样品采集与葡萄球菌分离
鼻咽拭子样品采集自6例健康成年志愿者的鼻咽部，共分离416个细菌单克隆，来自6个葡萄球菌菌属，其中149个属于表皮葡萄球菌，2个属于人型葡萄球菌，最终筛选出保护效应最强的1株人型链球菌。鼻咽拭子采集方法如下：将无菌鼻咽拭子经鼻腔伸入健康志愿者的鼻咽部，反复转动，均匀擦拭鼻咽各壁及咽隐窝，待拭子充分吸收所擦拭的组织后取出，放入无菌采集管中。在超净台中打开鼻咽拭子采集管，加入500μL无菌PBS溶液，反复吹打混匀，依次进行10倍梯度稀释。分别取10-3、10-4、10-5的梯度稀释液50μL均匀涂布于CBA血平板上，放于37℃恒温培养箱中，倒置培养24h。待单菌落长成后，挑取100个克隆涂布到新的CBA血平板上，进行亚分离纯化培养24h。对于亚分离纯化后的菌落，采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法进行物种鉴定。
1.2人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1的分子鉴定
挑取单菌落，用细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，中国)提取基因组DNA，以16SrRNA基因通用引物27F(5‘-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3’)和1492R(5‘-RGYTACCTTGTTACGACTT-3’)为上下游引物进行PCR扩增。将PCR扩增产物送北京睿博兴科生物技术有限公司进行Sanger测序。所得的序列经NCBI Blast比对后，与多株人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)经典菌株的序列相似性超过99％，证实其分类命名为人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)，命名为人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1。16S rRNA基因序列片段如下：
AGTCGAGCGAACAGACGAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTCGAACCGCATGGTTCGATAGTGAAAGATGGCTCTGCTATCACTTATAGATGGACCTGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAACTGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCCTTCTAGAGATAGAAGTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTTGGAG
人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1在CBA血平板上菌落呈乳白色、类圆形，表面湿润、光滑、边缘整齐，无色素沉着，有明显突起。人型葡萄球菌CT1的菌落形态见图1，光学显微镜下细菌呈球状，单个、成双或呈葡萄串状排列，无鞭毛、无芽孢，革兰氏染色为阳性，见图2。
1.2人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1的生化鉴定结果见表1：
表1
| 试验 | 结果 | 试验 | 结果 |
| 厌氧生长 | + | ONPG | - |
| 需氧生长 | + | 尿素 | + |
| 动力 | + | 水杨苷 | - |
| 氧化酶 | - | 七叶苷 | - |
| 甘油 | + | 甘露醇 | - |
| 靛基质 | - | 棉子糖 | - |
| 鸟氨酸 | - | 葡萄糖铵 | + |
| 粘液酸 | - | 柠檬酸盐 | - |
“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。
1.4人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1的保藏：将该菌株于2024年1月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏号为GDMCC No：64349。
实施例2：人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1的抗EB病毒作用
2.1游离EB病毒的制备
使用Akata(EBV-eGFP)细胞系进行游离EB病毒的制备。选择培养状态良好且GFP阳性率较高的rEBV+ Akata细胞(购买于广州吉妮欧生物科技有限公司)，在含有700μg/mLG418及10％胎牛血清的1640培养基中培养3天进行药物抗性筛选，以增高EB病毒阳性细胞的比例。将筛选后的Akata EBV+细胞扩大体系培养至2000mL，使用无血清培养基将细胞浓度调整至2×106/mL，并加入sIgG(0.8％抗人IgG抗体)诱导6h，期间每隔2h，将细胞摇匀，防止细胞聚集成团，完成诱导后，收集细胞并离心(1500rpm，10min)。去掉上清，加入含有3.5％胎牛血清的1640培养基继续培养72h，使细胞充分裂解释放病毒。完成培养后，4℃，4000rpm离心，收集细胞上清，随后使用0.45μm的滤膜过滤残余细胞及其碎片。对过滤后的上清进行超高速离心(50000g，2h)富集上清中的病毒颗粒。最后使用无血清1640重悬病毒颗粒，按100倍体积浓缩病毒液，即使用1mL无血清1640重悬100mL上清液离心下来的病毒颗粒，按500μL-1mL/管进行分装，保存于-80℃冰箱中。
2.2人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1对EB病毒感染上皮细胞的抑制
实验前一天将鼻咽癌上皮细胞HNE1(Nat Microbiol.2018Feb；3(2):1-8.)和人胚肾细胞293T(购自ATCC，CRL-3216)以2×104个细胞的密度接种至48孔板，37℃培养箱中培养24h；并将人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1单克隆接种至10mLBHI培养基中，37℃220rpm需氧培养12h，3000rpm离心5min，去上清，并用1640培养基重悬，测量OD600计数。以MOI＝10的感染复数，即细菌：细胞的个数比＝10:1，分别加入到HNE1和293T细胞株中，对照组为不加细菌的组，37℃培养箱中共培养4h。随后去掉共培养上清，用PBS洗3遍，并更换含有终浓度为250μg/mL万古霉素的培养基培养24h，再加入游离的EB病毒与细胞共培养。24h后，使用胰酶消化细胞，4％多聚甲醛固定细胞，通过流式细胞术检测GFP阳性细胞的比例，即感染EB病毒的细胞比例。
人型葡萄球菌在健康人群鼻咽部的检出率为28％，鼻咽癌患者中检出率仅为4％。在分离416个细菌单克隆中仅有2个属于人型葡萄球菌，来自同一健康供体。从2个克隆中选择生长状态更好的人型葡萄球菌CT1开展上述实验。结果发现，本发明的人型葡萄球菌CT1(即Staphylococcus hominis-38)可显著抑制293T细胞对EB病毒感染的效率。同期分离出的鼻咽共生菌Staphylococcus ureilyticus则未观察到抑制EB病毒感染的效应，Staphylococcus haemolyticus甚至显著促进了EB病毒感染上皮细胞的效率(图3)；进一步在HNE1细胞系中验证出人型葡萄球菌CT1抑制EB病毒感染上皮细胞的作用(图4和图5)。由图可见，给予人型葡萄球菌菌株处理后，明显的降低了EB病毒感染上皮细胞的比例。
实施例3：人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1的细胞毒性评价
实验前一天将鼻咽癌上皮细胞HNE1和胃癌上皮细胞AGS(购自ATCC，CRL1739)以4×104个细胞的密度接种至24孔板，37℃培养箱中培养24h；并将人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1单克隆接种至10mLBHI培养基中，37℃220rpm需氧培养12h，3000rpm离心5min，去上清，并用1640培养基重悬，测量OD600计数，以MOI＝10的感染复数，即细菌：细胞的个数比＝10:1，分别加入到HNE1和AGS细胞株中，对照组为不加细菌的组，37℃共孵育4h，去掉培养上清，PBS清洗三遍，胰酶消化细胞，使用含有终浓度为250μg/mL万古霉素的培养基重悬细胞，计数仪计数，并将细胞重新铺回到96孔板中(1.5×103/孔)，分别于24h、48h、72h和96h后加入CCK8试剂，每孔10μL CCK8，37℃烘箱孵育2h，测量OD450，检测给予人型葡萄球菌刺激后，对鼻咽癌上皮细胞和胃癌上皮细胞的增殖能力的影响。结果如图6显示，以MOI＝10对人型葡萄球菌CT1和上皮细胞进行4h共孵育均不影响细胞的增殖，即本发明人型葡萄球菌CT1对上皮细胞没有明显的毒性作用。
实施例4：人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1的抑菌作用
将人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1单克隆接种至10mL BHI培养基中，37℃220rpm需氧培养12h及厌氧培养系统中厌氧培养12h。随后3000rpm离心5min收集细菌培养上清，使用0.22μm滤器过滤，去掉细菌及碎片。以不同比例将需氧培养的菌液上清添加到机会性致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC_12600)的培养体系中；将厌氧培养的菌液上清添加到机会性致病菌具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatumsubsp.Nucleatum，ATCC_25586)和中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia，ATCC_25611)的培养体系中。具体操作为：基于总培养体系一致，即对照组加入10mL BHI培养基，实验组作梯度稀释，分别加入5、2.5、1.25、0.625mL的人型葡萄球菌菌株的培养上清，剩余体积用BHI补足到10mL。需氧上清组中，每管中加入等量的金黄色葡萄球菌，37℃需氧培养，分别于0h、4h、6h和9h测OD600绘制细菌生长曲线，检测金黄色葡萄球菌的生长速度；厌氧上清组中，每管中加入等量的中间普雷沃氏菌，37℃厌氧培养，分别于0h、24h、48h和72h测OD600绘制细菌生长曲线，检测中间普雷沃氏菌的生长速度；厌氧上清组中，每管中加入等量的具核梭杆菌，37℃厌氧培养，分别于0h、12h、15h和18h测OD600绘制细菌生长曲线，检测具核梭杆菌的生长速度；比较不同浓度的人型葡萄球菌菌株培养上清的抑菌效果。结果如图7显示，由图可见人型葡萄球菌CT1培养上清能够显著抑制机会性致病菌的生长。
实施例5：人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)CT1对上皮细胞先天免疫水平的影响
实验前一天将鼻咽癌上皮细胞HNE1以4×105个细胞的密度接种至6孔板，37℃培养箱中培养24h；并将人型葡萄球菌CT1单克隆接种至10mL BHI培养基中，37℃220rpm需氧培养12h，3000rpm离心5min，去上清，并用1640培养基重悬，测量OD600计数，以MOI＝10的感染复数，即细菌：细胞的个数比＝10:1，加入到HNE1细胞株中，对照组为不加细菌的组，37℃培养箱中共培养4h。随后去掉共培养上清，用PBS洗3遍，并更换含有终浓度为250μg/mL万古霉素的培养基培养24h。完成培养后，收集细胞培养上清，4℃1500rpm离心10min，取上清过0.22μm的滤膜后，使用27因子Luminex液相悬浮芯片进行细胞培养上清共各细胞因子的检测，结果见图8。
结果显示，经人型葡萄球菌CT1处理的HNE1细胞培养上清中IL-12及IL-17水平分别是未处理组的3.2倍及3.5倍，表达水平显著上调，表明人型葡萄球菌CT1可显著提高上皮细胞先天免疫细胞因子表达。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一株人型葡萄球菌，其特征在于将其命名为人型葡萄球菌(Staphylococcushominis)CT1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏号为GDMCC No：64349，保藏时间为2024年1月31日。
2.一种生物制剂，其特征在于基于权利要求1所述的人型葡萄球菌制备得到。
3.权利要求1所述的人型葡萄球菌、或权利要求2所述的生物制剂在制备抗病原微生物的药物或益生菌制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的病原微生物包括EB病毒、金黄色葡萄球菌、具核梭杆菌和中间普雷沃氏菌中的至少一种。
5.权利要求1所述的人型葡萄球菌在制备抑制病原体感染或调节黏膜免疫应答的药物或益生菌制剂中的应用。
6.权利要求1所述的人型葡萄球菌在制备抗EB病毒感染的药物或益生菌制剂中的应用。
7.权利要求2所述的生物制剂在制备抑制病原体感染或调节黏膜免疫应答的药物或益生菌制剂中的应用。
8.权利要求2所述的生物制剂在制备抗EB病毒感染的药物或益生菌制剂中的应用。
9.根据权利要求3-8任一项所述的应用，其特征在于所述药物或益生菌制剂中，含有所述的人型葡萄球菌菌株、或其培养的产物、或其发酵培养液、或其发酵培养液的过滤液。
10.根据权利要求3-8任一项所述的应用，其特征在于所述药物或益生菌制剂，其剂型为口服液、喷剂或粉剂中的一种。
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