CN118126351A - 一种纳米胶体水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于高分子水凝胶技术领域，提供了一种纳米胶体水凝胶及其制备方法。本发明采用纳米工程化策略将天然线性高分子制备成纳米粒子，提高了天然高分子溶解度，拓宽了天然高分子聚合物的使用浓度，有效降低了天然高分子的粘度，解决了天然线性高分子在应用过程中溶解度低、粘度大的问题。本发明实现了不溶胀的纳米胶体水凝胶的制备。本发明制得的纳米胶体水凝胶的溶胀不受温度和交联程度的影响，应用场景广泛，溶胀前后力学性能长期稳定。本发明显著提高了天然高分子基水凝胶的体内外抗降解能力，实现了体内外长期的不降解。本发明实现了具有低摩擦性质的纳米胶体水凝胶的制备。
Description
技术领域
本发明属于高分子水凝胶技术领域，尤其涉及一种纳米胶体水凝胶及其制备方法。
背景技术
水凝胶是一种新型功能高分子材料，其已经被广泛应用到创伤敷料、药物释放载体、组织填充材料、组织工程支架和美容材料等生物医学领域。天然高分子水凝胶因其良好的生物相容性和可降解性、材料简单易得等优点受到了研究者的广泛关注。纳米胶体水凝胶是一种新型的软物质，利用具有不同形状、大小和成分的纳米胶体作为构筑基元，通过纳米胶体之间的物理或化学相互作用，制备出纳米胶体水凝胶。与传统的由线性高分子制备的水凝胶相比，纳米胶体水凝胶具有非线性的力学性能、多尺度的结构和增强的运输性能等优点。
由于渗透压的不匹配，水凝胶在水介质中不可避免地溶胀。高的溶胀度会损害水凝胶的结构稳定性和降低水凝胶的力学性质并显著改变水凝胶的渗透性能，同时溶胀引起的体积增大会引起水凝胶填充部位组织和神经的压迫，从而导致一些不良的生理和病理反应。为了应对这些挑战，人们开发了多种策略来制备不溶胀的水凝胶，包括调节交联密度，使用疏水聚合物链，或在水凝胶网络中加入具有低临界温度的热响应单元。然而，水凝胶网络中的亲水-疏水平衡通常是改变组分浓度或原料组成来调节的，以达到适当的非溶胀特性。此外，这些水凝胶的抗膨胀性能通常依赖于温度，这限制了他们的使用范围。并且在静电相互作用的驱动下，纳米胶体水凝胶的形成需要相对高浓度的纳米颗粒。这种情况往往导致水凝胶不透明，限制了其在三维细胞培养和其他需要透明水凝胶的领域的进一步应用。此外，通过直接混合互相吸引的纳米胶体构筑基元形成的纳米胶体水凝胶往往会出现不可控的聚集和相分离，影响其结构均匀性和力学性能。为此我们提出一种纳米胶体水凝胶及其制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米胶体水凝胶及其制备方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、HAMA NPs的制备：将HA在去离子水中充分溶解后，在冰水浴条件下，按一定的比例向溶液中滴加MA，充分反应，在透明质酸钠表面接枝一定比例的碳碳双键，得到HAMA溶液；反应后的HAMA溶液经渗析冻干后，重新溶解在去离子水中，用EDC对聚合物链上的羧基进行活化，向溶液中加入丙酮对聚合物进行去溶剂化作用，后续投入交联剂使聚合物链交联并获得具有一定尺寸的纳米粒子溶液，溶液再次经过渗析，浓缩得到HAMA NPs溶液；
步骤S2、纳米胶体水凝胶的制备：将步骤S1获得的HAMA NPs溶液重新分散在含有0.05w/v％光引发剂的PBS溶液中，配制成具有不同浓度的水凝胶前驱体溶液；之后将一定体积的前驱体溶液装入聚四氟乙烯的模具中，随后用紫外灯光源照射，制备得到纳米胶体水凝胶。
进一步的，所述步骤S1中，冰水浴的温度控制在0-4℃。
进一步的，所述步骤S1中，交联剂为ADH、亚精胺或精胺。
进一步的，所述步骤S2中，光引发剂为Irgacure 2959或2,4,6-三甲基二苯甲酮或苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂(LAP)。
进一步的，所述步骤S2中，紫外灯光源的波长为365nm；紫外灯光源的光强大于10mW/cm2。
一种如上述所述的制备方法制得的纳米胶体水凝胶。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明采用纳米工程化策略将天然线性高分子制备成纳米粒子，提高了天然高分子溶解度，拓宽了天然高分子聚合物的使用浓度，有效降低了天然高分子的粘度，解决了天然线性高分子在应用过程中溶解度低、粘度大的问题。
2、本发明实现了不溶胀的纳米胶体水凝胶的制备。
3、本发明制得的纳米胶体水凝胶的溶胀不受温度和交联程度的影响，应用场景广泛，溶胀前后力学性能长期稳定。
4、本发明显著提高了天然高分子基水凝胶的体内外抗降解能力，实现了体内外长期的不降解。
5、本发明实现了具有低摩擦性质的纳米胶体水凝胶的制备。
附图说明
图1为本发明中纳米胶体水凝胶的合成结构示意图。
图2为本发明中28％-HAMA NPs的透射电子显微镜照片。
图3为本发明中28％-HAMA NPs的尺寸分布图。
图4为本发明中25mg/mL 28％-HAMA NPs制备的纳米胶体水凝胶的宏观照片。
图5为本发明中25mg/mL 28％-HAMA NPs制备的纳米胶体水凝胶的冷冻扫描电子显微镜照片。
图6为本发明中25mg/mL 28％-HAMA NPs制备的纳米胶体水凝胶在90天内的降解情况。
图7为本发明不同取代度的纳米胶体水凝胶的细胞生物相容性。
图8为本发明中25mg/mL 28％-HAMA NPs制备的纳米胶体水凝胶在小鼠体内的皮下降解情况。
图9为本发明中25mg/mL不同取代度的纳米胶体水凝胶的摩擦系数测试。
图10为本发明中25mg/mL 22％-HAMA NPs制备的纳米胶体水凝胶的模量。
图11为本发明中25mg/mL 22％-HAMA NPs制备的纳米胶体水凝胶在25℃下的体积溶胀情况。
图12为本发明中25mg/mL 22％-HAMA NPs制备的纳米胶体水凝胶在25℃下的质量溶胀情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
如图1所示，为本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、甲基丙烯酰化的透明质酸纳米粒子(HAMA NPs)的制备：将透明质酸钠(HA)在去离子水中充分溶解后，在0-4℃冰水浴条件下，按一定的比例向溶液中滴加甲基丙烯酸酐(MA)，充分反应，在透明质酸钠表面接枝一定比例的碳碳双键，得到甲基丙烯酰化的透明质酸(HAMA)溶液。反应后的HAMA溶液经渗析冻干后，重新溶解在去离子水中，用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)对聚合物链上的大量羧基进行活化，向溶液中加入丙酮对聚合物进行去溶剂化作用，后续投入交联剂己二酸二酰肼(ADH)使聚合物链交联并获得具有一定尺寸的纳米粒子溶液，溶液再次经过渗析，浓缩得到甲基丙烯酰化的透明质酸纳米粒子(HAMA NPs)溶液。
步骤S2、纳米胶体水凝胶的制备：将步骤S1获得的HAMA NPs溶液重新分散在含有0.05w/v％光引发剂Irgacure 2959的磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液中，配制成具有不同浓度的水凝胶前驱体溶液。之后将一定体积的前驱体溶液装入聚四氟乙烯的模具中，随后用365nm的紫外灯光源照射制备得到纳米胶体水凝胶。
在本发明实施例中，还可以制备明胶纳米粒子或壳聚糖纳米粒子，利用上述HAMANPs和明胶纳米粒子或壳聚糖纳米粒子共混，制备复合型纳米胶体水凝胶。
明胶纳米粒子的制备方法为：利用明胶的氨基和戊二醛交联，丙酮去溶剂化制备明胶纳米粒子；
壳聚糖纳米粒子的制备方法为：利用壳聚糖链的氨基和戊二醛交联，丙酮去溶剂化制备壳聚糖纳米粒子。
实施例1、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：将1g透明质酸钠粉末(HA，Mw＝150-250KDa)加入100mL去离子水中充分溶解，将溶液转移到0-4℃的冰水浴上，向溶液中滴加4mL的甲基丙烯酸酐溶液(MA)，用5M氢氧化钠溶液调节溶液的PH为8-9，0-4℃条件下反应24h，得到甲基丙烯酰化的透明质酸(HAMA)溶液。将得到的HAMA溶液在乙醇中反沉淀，离心，弃掉上清液，沉淀重新溶解在去离子水中，经渗析72h后，冷冻干燥，获得0.8g HAMA粉末。称取冻干粉末溶解在氘水溶剂中，达到5mg/mL的浓度，通过核磁共振谱仪对HA表面接枝的双键进行定量，HA表面接枝的双键比例为28％，表示为28％-HAMA。
S2：将80mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)溶于2mL去离子水中，配置成EDC溶液；将40mg己二酸二酰肼(ADH)溶于2mL去离子水中，配置成ADH溶液。
S3：称取0.2g 28％-HAMA粉末溶解在80mL去离子水中，充分溶解后，加入132mL丙酮，室温下充分搅拌30min，将EDC溶液、ADH溶液，先后滴加在28％-HAMA溶液中，充分搅拌30min后，再次向溶液中加入130mL丙酮，交联3-5h后，获得28％-HAMA纳米粒子(28％-HAMANPs)溶液。将得到的28％-HAMA NPs溶液在水中充分渗析，旋蒸浓缩。取200μL浓缩的28％-HAMA NPs溶液，真空烘箱60℃烘干，确定浓缩液的浓度，用不同浓度的PBS溶液对浓缩液进行稀释，获得30mg/mL 28％-HAMA NPs的PBS溶液。
通过透射电子显微镜(TEM)对28％-HAMA NPs的形貌进行表征，如图2所示，并通过对透射电子显微镜获得的纳米粒子进行测量，确定纳米粒子的直径为25±5nm，如图3所示。
S4：将光引发剂Irgacure 2959配置成0.3w/v％的水溶液。将500μL 30mg/mL28％-HAMA NPs溶液与100μL 0.3w/v％的光引发剂溶液共混，制备水凝胶前驱体溶液。将前驱体溶液铺满在直径为2cm的聚四氟乙烯模具里，用365nm的紫外光源以10mW/cm2的光强照射120s，引发前驱体溶液光交联制备纳米胶体水凝胶。
在本发明实施例中，用相机对实施例1获得的纳米胶体水凝胶进行拍照，如图4，可见纳米胶体水凝胶的宏观形貌。
S5：将制备好的纳米胶体水凝胶切割成1cm长，2mm宽的样条，通过高压冷冻仪冷冻固定，真空冷冻传输到冷冻扫描电镜内部，对纳米胶体水凝胶进行测试，得到纳米胶体水凝胶的内部结构，如图5所示。
S6：将制备好的纳米胶体水凝胶小心地转移到流变仪平台上，在25℃、0.1％～100％应变振幅、0.1Hz恒定频率下进行应变测试实验。
测得纳米胶体水凝胶的存储模量G’为7005.4Pa和损耗模量G”为883.798Pa。
S7：监测纳米胶体水凝胶的溶胀行为。
质量溶胀：对制备的纳米胶体水凝胶进行称重，作为纳米胶体水凝胶的初始质量W0。之后将纳米胶体水凝胶转移到含有5mL PBS溶液的聚苯乙烯培养皿中，充分浸泡纳米胶体水凝胶，每隔一定时间(24h)，将纳米胶体水凝胶样品从培养皿中取出，用滤纸仔细去除纳米胶体水凝胶表面的PBS溶液，再次称重，作为纳米胶体水凝胶在不同时刻的质量Wt。溶胀比(SR)由下式计算：
体积溶胀：对内径为0.9-1.1mm的玻璃毛细管进行疏水处理，然后在毛细管中制备圆柱形纳米胶体水凝胶。将纳米胶体水凝胶样品从毛细管中取出转移到直径3.5cm的聚苯乙烯培养皿中。使用光学显微镜测量圆柱形纳米胶体水凝胶的初始直径d0，之后将纳米胶体水凝胶样条放置在PBS溶液中浸泡，每隔一定时间后，用光学显微镜再次测量圆柱形纳米胶体水凝胶的直径dt。溶胀比(SR)由下式计算：：
计算纳米胶体水凝胶的质量溶胀率为99.98±2.47％。
计算纳米胶体水凝胶的体积溶胀率为100.8±0.95％。
S8：将不同组分的纳米胶体水凝胶分别浸泡在PBS溶液中7天、15天、和30天后，从溶液中取出纳米胶体水凝胶样品，用滤纸吸干表面水分，之后将纳米胶体水凝胶转移到流变仪平台上，在25℃、0.1％～100％应变振幅、0.1Hz恒定频率下进行应变测试实验，确定溶胀对纳米胶体水凝胶力学性能的影响。
纳米胶体水凝胶的储能模量和损耗模量分别变化到6265.77Pa和682.10Pa，5721.7Pa和554.85Pa，5351.97Pa和765.83Pa。通过比较，纳米胶体水凝胶的力学性能在测试的30天时间内稳定，未见明显的模量下降。
S9：体外降解：对内径为0.9-1.1mm的玻璃毛细管进行疏水处理，然后在毛细血管中制备圆柱形纳米胶体水凝胶。将纳米胶体水凝胶样品从毛细管中取出转移到直径3.5cm的聚苯乙烯培养皿中，并浸没在5mL含有200-500units/mL透明质酸酶的PBS溶液中，每隔48h更换酶溶液。
在监测的90天内，未见明显的降解，如图6所示。
S10：将30mg/mL的28％-HAMA NPs和0.1％的RGD-peptide共混得到纳米胶体水凝胶的前驱体溶液，并按照3×104个L929细胞和400μL前驱体溶液的比例混合均匀，接种到24孔板上，并通过紫外光聚合制备纳米胶体水凝胶，使L929细胞三维包封在纳米胶体水凝胶内，在孔板内加入适量体积的完全培养基。三天后，取出培养基，每孔加入250μL Calcein-AM/PI试剂，37℃孵育20min，并用荧光显微镜对细胞状态进行观察。
如图7所示，细胞活力良好，未见明显细胞死亡，说明纳米胶体水凝胶具有良好的细胞生物相容性。
S11：体内降解：用异氟烷(2-2.5％)麻醉小鼠，并皮下给予丁丙诺啡(0.5mg kg-1)以缓解疼痛。用剪刀和脱毛膏去除小鼠背部的毛发，在小鼠背部垂直于中线的皮肤上做一个1cm的小切口，用剪刀分离筋膜，然后皮下植入4个独立的纳米胶体凝胶(直径5mm，厚度1.5mm)，并用4-0Vicryl线缝合皮肤。定时对小鼠进行监测，分别在1月、2月、4月和6月后牺牲小鼠，从背部取出植入纳米胶体水凝胶，并通过对纳米胶体水凝胶直径的测量，未见纳米胶体水凝胶在小鼠体内出现明显的降解，如图8所示。
S12：纳米胶体水凝胶的体内生物相容性通过溶血实验进一步验证了纳米胶体水凝胶的血液相容性。
以Triton X-100作为阳性对照，测定溶血率<1％。其次，通过观察纳米胶体水凝胶植入后与皮肤、心、肝、脾、肺、肾组织的组织学变化，可见纳米胶体水凝胶具有良好的体内生物相容性。
S13：纳米胶体水凝胶的润滑性能：将纳米胶体水凝胶转移到流变仪平台上，在25℃、0.1s-1的恒定剪切速率下，0.1N的轴向力下，进行扭矩测试实验。
计算得到纳米胶体水凝胶的摩擦系数为：0.002，如图9所示。
实施例2、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：与实施例1的步骤S1中不同的是向溶液中滴加2mL的甲基丙烯酸酐溶液(MA)，HA表面接枝的双键比例为15％，表示为15％-HAMA，其他同实施例1的步骤S1。
S2：同实施例1的步骤S2。
S3：与实施例1的步骤S3中不同的是，将28％-HAMA替换为15％-HAMA，获得30mg/mL15％-HAMA NPs的PBS溶液，其他同实施例1的步骤S3。
通过透射电子显微镜(TEM)对15％-HAMA NPs的形貌进行表征，并通过对透射电子显微镜获得的纳米粒子进行测量，确定纳米粒子的直径为28±5nm。
S4：与实施例1的步骤S4中不同的是，将30mg/mL 28％-HAMA NPs溶液替换为30mg/mL 15％-HAMA NPs溶液，其他同实施例1的步骤S4。
S5：同实施例1的步骤S6。
测得水凝胶的存储模量G’为2041.8Pa和损耗模量G”为194.57Pa。
S6：同实施例1的步骤S7。
计算纳米胶体水凝胶的质量溶胀率为102.25±5.3％。
计算纳米胶体水凝胶的体积溶胀率为101.71±0.65％。
S7：同实施例1的步骤S8。
纳米胶体水凝胶的储能模量和损耗模量分别变化到2425.3Pa和231.32Pa，1816.88Pa和121.72Pa，1626.76Pa和148.15Pa。通过比较，纳米胶体水凝胶的力学性能在测试的30天时间内稳定，未见明显的模量下降。
S8：同实施例1的步骤S9。
在监测的30天内，纳米胶体水凝胶逐步降解完全。
S9：与实施例1的步骤S10中不同的是，将30mg/mL的28％-HAMA NPs溶液替换为30mg/mL的15％-HAMA NPs溶液，其他同实施例1的步骤S10。
如图7所示，细胞活力良好，未见明显细胞死亡，说明纳米胶体水凝胶具有良好的细胞生物相容性。
S10：同实施例1的步骤S12。
以Triton X-100作为阳性对照，测定溶血率<1％。
S11：同实施例1的步骤S13。
计算得到纳米胶体水凝胶的摩擦系数为：0.0017，如图9所示。
实施例3、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：与实施例1的步骤S1中不同的是向溶液中滴加3mL的甲基丙烯酸酐溶液(MA)，HA表面接枝的双键比例为22％，表示为22％-HAMA，其他同实施例1的步骤S1。
S2：同实施例1的步骤S2。
S3：与实施例1的步骤S3中不同的是，将28％-HAMA替换为22％-HAMA，获得30mg/mL22％-HAMA NPs的PBS溶液，其他同实施例1的步骤S3。
通过透射电子显微镜(TEM)对22％-HAMA NPs的形貌进行表征，并通过对透射电子显微镜获得的纳米粒子进行测量，确定纳米粒子的直径为22±4nm。
S4：与实施例1的步骤S4中不同的是，将30mg/mL 28％-HAMA NPs溶液替换为30mg/mL 22％-HAMA NPs溶液，其他同实施例1的步骤S4。
S5：同实施例1的步骤S6。
测得水凝胶的存储模量G’为5443.063Pa和损耗模量G”为558.43Pa，如图10所示。
S6：同实施例1的步骤S7。
计算纳米胶体水凝胶的质量溶胀率为100.05±2.92％，如图11所示。
计算纳米胶体水凝胶的体积溶胀率为102.77±1.09％，如图12所示。
S7：同实施例1的步骤S8。
纳米胶体水凝胶的储能模量和损耗模量分别变化到5075.04Pa和758.35Pa，4530.34Pa和686.92Pa，3815.4Pa和772.16Pa。通过比较，纳米胶体水凝胶的力学性能在测试的30天时间内稳定，未见明显的模量下降。
S8：同实施例1的步骤S9。
在监测的60天内，纳米胶体水凝胶逐步降解完全。
S9：与实施例1的步骤S10中不同的是，将30mg/mL的28％-HAMA NPs溶液替换为30mg/mL的22％-HAMA NPs溶液，其他同实施例1的步骤S10。
如图7所示，细胞活力良好，未见明显细胞死亡，说明纳米胶体水凝胶具有良好的细胞生物相容性。
S10：同实施例1的步骤S12。
以Triton X-100作为阳性对照，测定溶血率<1％。
S11：同实施例1的步骤S13。
计算得到纳米胶体水凝胶的摩擦系数为：0.00147，如图9所示。
实施例4、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：与实施例1的步骤S1中不同的是向溶液中滴加5mL的甲基丙烯酸酐溶液(MA)，HA表面接枝的双键比例为35％，表示为35％-HAMA，其他同实施例1的步骤S1。
S2：同实施例1的步骤S2。
S3：与实施例1的步骤S3中不同的是，将28％-HAMA替换为35％-HAMA，获得30mg/mL35％-HAMA NPs的PBS溶液，其他同实施例1的步骤S3。
通过透射电子显微镜(TEM)对35％-HAMA NPs的形貌进行表征，并通过对透射电子显微镜获得的纳米粒子进行测量，确定纳米粒子的直径为34±10nm。
S4：与实施例1的步骤S4中不同的是，将30mg/mL 28％-HAMA NPs溶液替换为30mg/mL 35％-HAMA NPs溶液，其他同实施例1的步骤S4。
S5：同实施例1的步骤S6。
测得水凝胶的存储模量G’为7950.11Pa和损耗模量G”为1553.36Pa。
S6：同实施例1的步骤S7。
计算纳米胶体水凝胶的质量溶胀率为101.48±1.37％。
计算纳米胶体水凝胶的体积溶胀率为101.71±1.72％。
S7：同实施例1的步骤S8。
纳米胶体水凝胶的储能模量和损耗模量分别变化到7674.66Pa和1104.26Pa，7219.86Pa和448.68Pa，6034.81Pa和1185.53Pa。通过比较，纳米胶体水凝胶的力学性能在测试的30天时间内稳定，未见明显的模量下降。
S8：同实施例1的步骤S9。
在监测的180天内，未见明显的降解。
S9：与实施例1的步骤S10中不同的是，将30mg/mL的28％-HAMA NPs溶液替换为32mg/mL的35％-HAMA NPs溶液，其他同实施例1的步骤S10。
如图7所示，细胞活力良好，未见明显细胞死亡，说明纳米胶体水凝胶具有良好的细胞生物相容性。
S10：同实施例1的步骤S12。
以Triton X-100作为阳性对照，测定溶血率<1％。
S11：同实施例1的步骤S13。
计算得到纳米胶体水凝胶的摩擦系数为：0.00157，如图9所示。
在本发明实施例中，纳米粒子的最高浓度范围可以达到160mg/mL，而35％HAMANPs制备纳米胶体水凝胶的最低浓度只需要2mg/mL。
实施例5、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：将1g透明质酸钠粉末(HA，Mw＝150-250KDa)加入100mL去离子水中充分溶解，将溶液转移到0-4℃的冰水浴上，向溶液中滴加4mL的甲基丙烯酸酐溶液(MA)，用5M氢氧化钠溶液调节溶液的PH为8-9，0-4℃条件下反应24h，得到甲基丙烯酰化的透明质酸(HAMA)溶液。将得到的HAMA溶液在乙醇中反沉淀，离心，弃掉上清液，沉淀重新溶解在去离子水中，经渗析72h后，冷冻干燥，获得0.8g HAMA粉末。称取冻干粉末溶解在氘水溶剂中，达到5mg/mL的浓度，通过核磁共振谱仪对HA表面接枝的双键进行定量，HA表面接枝的双键比例为28％，表示为28％-HAMA。
S2：将80mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)溶于2mL去离子水中，配置成EDC溶液；将40mg己二酸二酰肼(ADH)溶于2mL去离子水中，配置成ADH溶液。
S3：称取0.2g 28％-HAMA 粉末溶解在80mL去离子水中，充分溶解后，加入132mL丙酮，室温下充分搅拌30min，将EDC溶液、ADH溶液，先后滴加在28％-HAMA溶液中，充分搅拌30min后，再次向溶液中加入130mL丙酮，交联3-5h后，获得28％-HAMA纳米粒子(28％-HAMANPs)溶液。将得到的28％-HAMA NPs溶液在水中充分渗析，旋蒸浓缩。取200μL浓缩的28％-HAMA NPs溶液，真空烘箱60℃烘干，确定浓缩液的浓度，用不同浓度的PBS溶液对浓缩液进行稀释，获得5mg/mL 28％-HAMA NPs的PBS溶液。
通过透射电子显微镜(TEM)对28％-HAMA NPs的形貌进行表征，并通过对透射电子显微镜获得的纳米粒子进行测量，确定纳米粒子的直径为20±5nm。
S4：将光引发剂Irgacure 2959配置成0.3w/v％的水溶液。将500μL 5mg/mL 28％-HAMA NPs溶液与100μL 0.3w/v％的光引发剂溶液共混，制备水凝胶前驱体溶液。将前驱体溶液铺满在直径为2cm的聚四氟乙烯模具里，用365nm的紫外光源以10mW/cm2的光强照射120s，引发前驱体溶液光交联制备纳米胶体水凝胶。
S5：将制备好的纳米胶体水凝胶小心地转移到流变仪平台上，在25℃、0.1％～100％应变振幅、0.1Hz恒定频率下进行应变测试实验。
测得水凝胶的存储模量G’为13.78Pa和损耗模量G”为2.16Pa。
实施例6、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1-S3：同实施例5的步骤S1-S3。
S4：与实施例5的步骤S4中不同的是，将5mg/mL 28％-HAMA NPs溶液替换为100mg/mL 28％-HAMA NPs溶液，其他同实施例5的步骤S4。
S5：同实施例5的步骤S5。
测得水凝胶的存储模量G’为9358.23Pa和损耗模量G”为839.68Pa。
S6：监测纳米胶体水凝胶的溶胀行为。
体积溶胀：计算纳米胶体水凝胶的体积溶胀率为102.43±1.34％。
实施例7、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1-S3：同实施例5的步骤S1-S3。
S4：与实施例5的步骤S4中不同的是，将5mg/mL 28％-HAMA NPs溶液替换为160mg/mL 28％-HAMA NPs溶液，其他同实施例5的步骤S4。
S5：同实施例5的步骤S5。
测得水凝胶的存储模量G’为11128.07Pa和损耗模量G”为1145.93Pa。
S6：监测纳米胶体水凝胶的溶胀行为。
体积溶胀：计算纳米胶体水凝胶的体积溶胀率为101.56±1.90％。
实施例8、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：与实施例5的步骤S1中不同的是，将透明质酸钠粉末(HA，Mw＝150-250KDa)替换为透明质酸钠粉末(HA，Mw＝3500Da)，其他同实施例5的步骤S1。
S2-S3：同实施例5的步骤S2-S3。
S4：与实施例5的步骤S4中不同的是，将5mg/mL 28％-HAMA NPs溶液替换为30mg/mL 28％-HAMA NPs溶液，其他同实施例5的步骤S4。
实施例9、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：与实施例5的步骤S1中不同的是，将透明质酸钠粉末(HA，Mw＝150-250KDa)替换为透明质酸钠粉末(HA，Mw＝400KDa)，其他同实施例5的步骤S1。
S2：将80mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)溶于2mL去离子水中，配置成EDC溶液；将40mg己二酸二酰肼(ADH)溶于2mL去离子水中，配置成ADH溶液。
S3：与实施例5的步骤S3中不同的是，获得30mg/mL 28％-HAMA NPs的PBS溶液，其他同实施例5的步骤S3。
通过透射电子显微镜(TEM)对28％-HAMA NPs的形貌进行表征，并通过对透射电子显微镜获得的纳米粒子进行测量，确定纳米粒子的直径为60±10nm。
S4：与实施例5的步骤S4中不同的是，将5mg/mL 28％-HAMA NPs溶液替换为30mg/mL 28％-HAMA NPs溶液，其他同实施例5的步骤S4。
实施例10、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：同实施例5的步骤S1。
S2：将40mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)溶于2mL去离子水中，配置成EDC溶液；将20mg己二酸二酰肼(ADH)溶于2mL去离子水中，配置成ADH溶液。
S3：与实施例5的步骤S3中不同的是，获得30mg/mL 28％-HAMA NPs的PBS溶液，其他同实施例5的步骤S3。
通过透射电子显微镜(TEM)对28％-HAMA NPs的形貌进行表征，并通过对透射电子显微镜获得的纳米粒子进行测量，确定纳米粒子的直径为60±10nm。
S4：与实施例5的步骤S4中不同的是，将5mg/mL 28％-HAMA NPs溶液替换为30mg/mL 28％-HAMA NPs溶液，其他同实施例5的步骤S4。
实施例11、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：同实施例5的步骤S1。
S2：将8mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)溶于2mL去离子水中，配置成EDC溶液；将4mg己二酸二酰肼(ADH)溶于2mL去离子水中，配置成ADH溶液。
S3：与实施例5的步骤S3中不同的是，获得30mg/mL 28％-HAMA NPs的PBS溶液，其他同实施例5的步骤S3。
通过透射电子显微镜(TEM)对28％-HAMA NPs的形貌进行表征，并通过对透射电子显微镜获得的纳米粒子进行测量，确定纳米粒子的直径为300±20nm。
S4：与实施例5的步骤S4中不同的是，将5mg/mL 28％-HAMA NPs溶液替换为30mg/mL 28％-HAMA NPs溶液，其他同实施例5的步骤S4。
实施例12、本发明一个实施例提供的一种纳米胶体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：同实施例5的步骤S2。
S2：称取0.2g透明质酸钠(HA，Mw＝150-250KDa)粉末溶解在80mL去离子水中，充分溶解后，加入132mL丙酮，室温下充分搅拌30min，将EDC溶液、ADH溶液，先后滴加在HA溶液中，充分搅拌30min后，再次向溶液中加入130mL丙酮，交联3-5h后，获得HA NPs溶液。将得到的HA NPs溶液在水中充分渗析，旋蒸浓缩。取200μL浓缩的HA NPs溶液，真空烘箱60℃烘干，确定浓缩液的浓度。
S3：将S2中获得的HA纳米粒子溶液置于0-4℃冰水浴中搅拌，待温度稳定后，向溶液中滴加1mL MA溶液，并用5M NaOH调节溶液的PH为8-9，充分反应24h后，获得HAMA NPs溶液，将HAMA NPs溶液渗析72h，进一步纯化。72h后，将纳米粒子溶液通过旋蒸浓缩，获得30mg/mL的HAMA NPs溶液。
S4：取1mL HAMA NPs溶液加入200-400unit/mL透明质酸酶，放入37℃恒温水浴锅中，每48h加入一次透明质酸酶，五天后冻干，称取冻干粉末溶解在氘水溶剂中，达到5mg/mL的浓度，通过核磁共振谱仪对HA纳米粒子表面接枝的双键进行定量，HA纳米粒子表面接枝的双键比例为15％。
S5：与实施例5的步骤S4中不同的是，将5mg/mL 28％-HAMA NPs溶液替换为30mg/mL 15％-HAMA NPs溶液，其他同实施例5的步骤S4。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (5)
1.一种纳米胶体水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、HAMA NPs的制备：将HA在去离子水中充分溶解后，在冰水浴条件下，按一定的比例向溶液中滴加MA，充分反应，在透明质酸钠表面接枝一定比例的碳碳双键，得到HAMA溶液；反应后的HAMA溶液经渗析冻干后，重新溶解在去离子水中，用EDC对聚合物链上的羧基进行活化，向溶液中加入丙酮对聚合物进行去溶剂化作用，后续投入交联剂使聚合物链交联并获得具有一定尺寸的纳米粒子溶液，溶液再次经过渗析，浓缩得到HAMA NPs溶液；
步骤S2、纳米胶体水凝胶的制备：将步骤S1获得的HAMA NPs溶液重新分散在含有0.05w/v％光引发剂的PBS溶液中，配制成具有不同浓度的水凝胶前驱体溶液；之后将一定体积的前驱体溶液装入聚四氟乙烯的模具中，随后用紫外灯光源照射，制备得到纳米胶体水凝胶。
2.根据权利要求1所述的纳米胶体水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，交联剂为ADH、亚精胺或精胺。
3.根据权利要求1所述的纳米胶体水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，光引发剂为Irgacure 2959或2,4,6-三甲基二苯甲酮或苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂。
4.根据权利要求1所述的纳米胶体水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，紫外灯光源的波长为365nm。
5.一种根据权利要求1-4任一所述的制备方法制得的纳米胶体水凝胶。
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