CN118126099A - 一种d-核糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种D‑核糖的制备方法。本发明方法将D‑核糖的发酵液经絮凝剂絮凝而后快速的进行过滤，从而得到过滤母液，过滤母液经脱色、脱盐、净化以及浓缩后得到浓缩液，浓缩液与乙醚混合后去往结晶罐中，在共沸的条件下进行进一步的浓缩与结晶，结晶得到的结晶体经真空干燥即可得到产品，结晶过程中产生的乙醚‑水混合蒸汽经冷凝、分离，得到的乙醚经换热升温后进行循环利用。本发明方法能够实现连续的结晶过程，有效的提高了生产效率，并能够有效的保证产品的纯度，此外共沸浓缩产生的乙醚‑水蒸汽分离简单，能够有效的降低分离的能耗并便于实现乙醚的循环利用。

Description

一种D-核糖的制备方法

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种D-核糖的制备方法。

背景技术

D-核糖是生物体内遗传物质核酸的重要组成部分，在核苷类物质、蛋白质、脂肪代谢中处于枢纽位置，具有重要的生理功能及广阔的应用前景。D-核糖作为生物体内存在于所有细胞中的天然成份，与腺苷酸的形成和ATP的再生有密切关系，是生命代谢最基本的能量来源之一。在心脏和骨络肌代谢中起关键作用，能够促进局部缺血组织、局部缺氧组织的恢复。核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，D-核糖是许多核酸类药物的重要中间体，可用于三氮唑核苷、腺苷、胸苷、胞苷、氟腺嘧啶核苷、2-甲基腺苷、威他毒素、吡唑毒素、腺苷旦氨酸等许多药物的生产中。D-核糖用途广泛，与人们的生活息息相关，研究其不同的合成路径对医药，食品，农业等都有着非常重要的意义。

目前D-核糖的生产方法有三种：一种是从酵母核酸中分离提取；二是以葡萄糖、阿拉伯糖为原料通过化学合成的方法获得；三是使用葡萄糖为原料，并用转酮酶缺陷型菌株发酵后获得，并以第三种最为常见。但是，由于发酵液中含有多种离子、色素、和五碳糖、六碳糖和其磷酸酯、以及蛋白等大分子杂质，致使D-核糖的分离、提纯异常困难。现有的制备提纯一般采用如下的步骤：发酵液离心除去菌体，用活性炭脱色，再通过离子交换去除发酵液中的阴阳离子，经减压浓缩，用四倍体积的乙醇沉淀结晶获得产品。

但是，在上述的工艺中，采用乙醇对D-核糖进行结晶，过程中为批次间歇操作，不利于生产效率的提高；单批次的操作，这就导致了结晶母液中会有产品的残留，导致了产品的收率明显的降低；同时结晶时乙醇和水混溶，对于结晶母液的处理也较为复杂，乙醇的回收困难；于是，整个制备提纯的过程生产效率低，不利于企业生产效率的提高以及生产成本的降低；因此，一种更加高效且能够有效降低企业生产成本的D-核糖的制备方法，则是现有亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种D-核糖的制备方法，以解决的现有的制备提纯方法在实际应用中存在的生产效率低、结晶母液分离困难以及D-核糖部分流失导致的产品收率降低的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种D-核糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、向D-核糖的发酵液中添加絮凝剂并过滤，得到过滤母液；

S2、将S1得到的过滤母液进行脱色、脱盐、净化以及浓缩，得到浓缩液；

S3、将S2得到的浓缩液与乙醚按照一定的比例通入到结晶罐中；

S4、维持结晶罐中的料液的量稳定并处于共沸状态，在共沸状态下进行连续的浓缩与结晶，得到核糖结晶体；

S5、将S4得到的核糖结晶体进行真空干燥即可得到D-核糖产品。

进一步地，所述的S1中，D-核糖的发酵液是以葡萄糖为原料，以枯草芽孢杆菌的转酮酶缺陷突变株为生产菌株，生产发酵所得。

进一步地，所述的S1中，絮凝剂为聚丙烯酰胺、壳聚糖、壳聚糖-聚丙烯酰胺共聚物中的一种。

进一步地，所述的S2中，脱色采用活性炭或大孔吸附树脂；脱盐采用阴阳离子交换树脂；净化采用纳滤膜。

进一步地，所述的纳滤膜的截留分子量为400～600。

进一步地，所述的纳滤膜过滤后得到的净余液部分回流至纳滤膜前端，回流与外排的比例为3～5:1。

进一步地，所述的S3中，浓缩液与乙醚的体积比为1:99～100，乙醚的温度控制在25～30℃。

进一步地，所述的S4中，共沸状态下蒸出的乙醚-水混合气体经冷凝后分离出乙醚和水，分离出的乙醚经换热后返回到S3中循环利用。

进一步地，所述的S5中，真空干燥的温度为40～60℃。

进一步地，所述的S5中，真空干燥得到的混合气体与乙醚-水混合气体进行混合，而后进行冷凝与分离。

本发明的有益效果：

1、向发酵液中添加絮凝剂，过程中能够使得发酵液中的悬浮物快速的沉淀，从而通过简单的过滤即可得到相对比较纯净的过滤母液，操作过程中效率更高，成本更低；

2、过滤母液通过脱色-脱盐-净化-浓缩，得到浓缩液，其中脱色可采用大孔吸附树脂，脱盐采用阴阳离子交换树脂，净化采用截留分子量为400～600的纳滤膜，使得得到的净化液更加的纯净，有效的保证了产品的纯度；

3、对纳滤膜的净余液以一定的回流比进行回流，从而减少产品的流失，保证产品的收率；

4、在结晶罐中采用乙醚-水的共沸体系对料液进行浓缩与结晶，过程中保证料液的添加量与体系的蒸发量一致，于是即可实现连续的浓缩与结晶过程，从而有效的提高生产效率；

5、由于乙醚与水的不相容，因此共沸浓缩以及后续的真空干燥过程中得到的蒸汽经冷凝后会出现分层，此时即可实现乙醚与水的分离，过程中效率更高，成本更低，并便于回收后乙醚的循环利用。

附图说明

图1是本发明制备方法工艺流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

如图1所示，本发明方法工艺涉及的原理为：

本发明工艺基于现有较为成熟的D-核糖发酵液，其中采用葡萄糖为原料，采用枯草芽孢杆菌的转酮酶缺陷突变株为生产菌株，由于发酵工艺较为成熟，在此就不再赘述。

D-核糖发酵液中由于存在细菌细胞、大颗粒杂质、培养基离子以及蛋白质等，因此需要进行净化处理；采用添加絮凝剂的方式，能够使得细菌细胞以及大颗粒杂质、蛋白质等发生絮凝，从而能够将其快速高效的去除，过程中絮凝剂可选用有机絮凝剂以及天然高分子絮凝剂，并以聚丙烯酰胺、壳聚糖以及壳聚糖-聚丙烯酰胺共聚物为宜，一方面能够保证絮凝沉淀的效果，另一方面不会引入大量的离子，增加后续脱盐处理的负荷。

经过絮凝过滤得到的过滤母液，其中的大颗粒杂质以及绝大多数的细菌细胞等都会被去除，但其中的分子基团，如色素基团则并不会被去除，因此需要进一步的脱色处理；脱色处理传统的多采用活性炭，但会产生大量的固废，现有的多采用大孔吸附树脂进行吸附脱色，后续可以再生，经济与环保；其中，大孔吸附树脂可选用中等极性与极性大孔吸附树脂，使用一段时间后采用80％乙醇进行洗脱再生，控制乙醇洗脱剂的pH在9～11即可。

经过脱色后的过滤母液，其中的色素基团则会被去除，但其中的阴阳离子则依然存在，因此需要进行脱盐，脱盐采用阴阳离子交换树脂，工业生产中将脱色液依次流经阳离子交换塔与阴离子交换塔，其中阳离子交换塔中装填H⁺型强酸性阳离子交换树脂，阴离子交换塔中装填OH^-型弱碱性阴离子交换树脂，即可实现脱盐操作；使用一段时间后，阳离子交换塔采用盐酸溶液进行反冲洗再生，而后水洗至中性；而阴离子交换塔采用氢氧化钠溶液进行反冲洗再生，而后水洗至中性即可。

脱盐后的料液还需要进一步的净化，以除去料液中的核苷酸、氨基酸以及低聚糖等小分子杂质，净化采用纳滤膜，截留分子量为400～600，操作压力为1.5～2MPa，透析水量为进液量的50～60％，净余液部分回流至纳滤膜的前端，回流比为3～5:1。

上述的净化操作后，即可得到纯净的净化液，对该净化液进行减压浓缩，过程中控制温度为50～60℃，真空度为-90～-80KPa，将净化液浓缩至粘稠状，而后定量输送至结晶罐中，如蠕动泵、计量泵等，与此同时向结晶罐中泵入乙醚，其中浓缩液与乙醚的体积比为1:99～100，乙醚的温度控制在25～30℃。

在结晶罐中对混合料液进行升温，过程中升温至34℃，在此温度下乙醚与水发生共沸(体系中乙醚是过量的，初始时，将物料加热到35℃，此温度为乙醚沸点，过量的乙醚会快速蒸发出去，当乙醚与水的比例达到共沸比例时，共沸自然发生)，并源源不断的被蒸出，由于水的带出使得核糖结晶析出，过程中控制蒸发量与料液的添加量保持一致，于是能够实现连续的共沸浓缩与结晶过程，从而大大的提高生产效率。

在共沸浓缩结晶的过程中，产生的乙醚-水混合蒸汽经冷凝后被收集在冷凝器中，并且乙醚、水出现分层，于是能够便捷的实现乙醚、水的分离(乙醚的比重小于水，在冷凝容器中采用溢流的形式即可便捷的实现对乙醚的回收)；回收的乙醚温度较低，过程中通过换热器升温至25～30℃，而后循环利用即可。

而对于结晶罐中产生的结晶体，过程中可以采用连续出料装置进行出料，现有的关于结晶罐的连续出料装置有很多，排出结晶罐的物料为湿物料，过程中在40～60℃真空干燥即可，抽真空产生的乙醚、水的混合气体通往冷凝器中进行冷凝即可。

实施例1

一种D-核糖的制备方法，包括以下步骤：

S1、发酵液的制备

将枯草芽孢杆菌接种在含有葡萄糖的底物的发酵培养基中，葡萄糖添加量200Kg(180～200g/L)通入空气，进行有氧发酵，得到发酵液；

发酵条件为：接种量10.0％；罐温36.0℃；通风量：0.5vvm；罐压：0.05MPa；培养时间：40～50h；

向上述发酵液中添加聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺添加量为0.001％，充分絮凝后进行板框压滤，过滤稳定后收取滤液，初始滤液循环过滤，得到过滤母液；

S2、将S1得到的过滤母液进行大孔吸附树脂(BJ7514，江苏金杉新材料有限公司)脱色、阴阳离子交换树脂脱盐、纳滤膜净化以及减压浓缩，纳滤膜截留分子量为500，操作压力为2MPa；减压浓缩温度为60℃，真空度为-80KPa；将净化液浓缩至粘稠状；

S3、将S2得到的浓缩液与乙醚按照1:100的比例通入到结晶罐中，控制乙醚的温度在25～30℃；

S4、维持结晶罐中的温度为34℃，并维持料液的量稳定且处于共沸状态，在共沸状态下进行连续的浓缩与结晶，浓缩过程中得到乙醚-水的混合蒸汽以及核糖的结晶体；

S5、将S4得到的核糖结晶体在60℃下真空干燥8～10h，得到D-核糖产品139.3Kg。

上述制备的D-核糖产品，相对于原料葡萄糖的收率为83.6％，经液相色谱检测，纯度为99.3％。

对比例1

将实施例1制备方法与现有成熟的方法进行对比。

S1、取实施例1相同条件下的发酵液，离心过滤后通过大孔吸附树脂进行脱色(BJ7514，江苏金杉新材料有限公司)；

S2、取S1脱色液经过阴阳离子交换树脂进行脱盐；

S3、温度为60℃，真空度为-80KPa，将S2脱盐后料液浓缩至粘稠状；

S4、向S3浓缩液中添加四倍体积的无水乙醇，4℃析晶过夜，得到核糖结晶体；

S5、将S4得到的核糖结晶体在60℃下真空干燥8～10h，得到D-核糖产品108.7Kg。

上述制备的D-核糖产品，相对于原料葡萄糖的收率为65.2％，经液相色谱检测，纯度为98.6％。

经对比可以发现，本发明制备方法所得的产品在收率以及纯度上均优于现有常规方法所制得的产品，对提高产品的质量具有积极的作用。

除此之外，对本发明实施例1的制备方法与对比例1的制备方法在制备效率以及结晶母液的处理方面进行对比。

对于制备效率，本发明方法为连续的共沸浓缩结晶过程，实施例1中一个发酵罐物料的处理时间约为6～8h，而采用对比例1的方法，即使不考虑结晶罐的清理、闲置等时间，但结晶步骤即需要8～12h，可以看出，本发明的方法在制备效率上明显的得到提高。

此外，对于结晶母液的处理，对于本发明方法，没有结晶母液的产生，料液中的乙醚与水在共沸的条件下同时被蒸出，被蒸出的乙醇与水的混合蒸汽在冷凝器中进行冷凝分层，而后进行分离，整个过程中工艺更加的简单；而对于对比例1的方法，结晶母液为乙醇和水的混合液，由于乙醇和水互溶，同时还溶解有产品，在后续的分离时需要需要精馏的操作，整个工艺复杂，相比之下，本发明方法操作更加的简单，明显优于现有成熟的方法。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其它各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种D-核糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、向D-核糖的发酵液中添加絮凝剂并过滤，得到过滤母液；

S2、将S1得到的过滤母液进行脱色、脱盐、净化以及浓缩，得到浓缩液；

S3、将S2得到的浓缩液与乙醚按照一定的比例通入到结晶罐中；

S4、维持结晶罐中的料液的量稳定并处于共沸状态，在共沸状态下进行连续的浓缩与结晶，得到核糖结晶体；

S5、将S4得到的核糖结晶体进行真空干燥即可得到D-核糖产品。

2.根据权利要求1所述的一种D-核糖的制备方法，其特征在于：所述的S1中，D-核糖的发酵液是以葡萄糖为原料，以枯草芽孢杆菌的转酮酶缺陷突变株为生产菌株，生产发酵所得。

3.根据权利要求1所述的一种D-核糖的制备方法，其特征在于：所述的S1中，絮凝剂为聚丙烯酰胺、壳聚糖、壳聚糖-聚丙烯酰胺共聚物中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种D-核糖的制备方法，其特征在于：所述的S2中，脱色采用大孔吸附树脂；脱盐采用阴阳离子交换树脂；净化采用纳滤膜。

5.根据权利要求4所述的一种D-核糖的制备方法，其特征在于：所述的纳滤膜的截留分子量为400～600。

6.根据权利要求4所述的一种D-核糖的制备方法，其特征在于：所述的纳滤膜过滤后得到的净余液部分回流至纳滤膜前端，回流与外排的比例为3～5:1。

7.根据权利要求1所述的一种D-核糖的制备方法，其特征在于：所述的S3中，浓缩液与乙醚的体积比为1:99～100，乙醚的温度控制在25～30℃。

8.根据权利要求1所述的一种D-核糖的制备方法，其特征在于：所述的S4中，共沸状态下蒸出的乙醚-水混合气体经冷凝后分离出乙醚和水，分离出的乙醚经换热后返回到S3中循环利用。

9.根据权利要求1所述的一种D-核糖的制备方法，其特征在于：所述的S5中，真空干燥的温度为40～60℃。

10.根据权利要求8所述的一种D-核糖的制备方法，其特征在于：所述的S5中，真空干燥得到的混合气体与乙醚-水混合气体进行混合，而后进行冷凝与分离。