CN118121631A

CN118121631A - 一种氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用

Info

Publication number: CN118121631A
Application number: CN202311679290.2A
Authority: CN
Inventors: 宋洪元; 沈炜; 顾宁; 张昊瑞; 李青; 聂政; 沈玺; 毛宇; 汪梦竹; 周雯; 刘永瑄
Original assignee: First Affiliated Hospital of Naval Military Medical University of PLA
Current assignee: First Affiliated Hospital of Naval Military Medical University of PLA
Priority date: 2023-12-08
Filing date: 2023-12-08
Publication date: 2024-06-04

Abstract

本发明公开了一种氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。本发明研究结果表明，采用纯生物学方法设计的氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体具有良好的抑制病理性血管生成的作用，可以作为病理性血管生成治疗的生物相容性纳米平台，具有临床转化的潜力。

Description

一种氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

背景技术

纳米材料因其粒径极小，具有特殊结构和理化性质而在生物医药领域受到广泛关注。近年来的研究表明，氧化铁纳米颗粒(Iron oxide nanoparticles，IONPs)通过诱导巨噬细胞极化而激活免疫治疗，表现出抗肿瘤特性，同时INOPs可诱导癌细胞铁死亡，增强癌症免疫治疗[1.Canese,R.,et al.,Nanomaterials(Basel).11(2021).2.Zanganeh,S.,etal.,Nat Nanotechnol.11(2016)986.]。极小尺寸氧化铁纳米颗粒(Extremely smallsized iron oxide nanoparticles，ESIONPs)是一种粒径小于4nm的超顺磁性铁氧纳米颗粒，具有良好的生物相容性[3.Mao,Y.,et al.,Science ChinaMaterials.65(2022)1646.]。

外泌体(Exosomes，Exo)介导不同细胞间的交互作用，巨噬细胞来源的外泌体参与多种生物学过程的调控，在免疫治疗中发挥重要作用，M1型巨噬细胞来源的外泌体具有抗血管生成和抗肿瘤活性[4.Rao,L.,et al.,Adv Mater.32(2020)e2004853.5.Han,S.,etal.,Theranostics.11(2021)2892.]。工程化外泌体因其较强的靶向性和治疗活性已被深入研究。IONPs可刺激间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)表达治疗性生长因子，通过物理挤压产生含有IONPs的细胞外纳米囊泡，在磁引导的作用下减轻缺血性卒中，增强心脏修复[6.Lee,J.R.,et al.,SciAdv.6(2020)eaaz0952.]。然而，目前的工程技术通常会破坏外泌体膜或内在的生物活性分子，降低外泌体的作用效果。

血管连接所有组织以维持生命活动。血管生成是一个严格控制的过程，包括血管内皮细胞的生长、迁移和萌发，生理性的血管生成是生长发育中的重要过程[7.Dejana,E.,Circ Res.107(2010)943.8.Carmeliet,P.,and Jain,R.K.,Nature.473(2011)298.]。在感染、缺氧等多种因素的刺激下，视网膜血管内皮细胞功能发生紊乱，破坏氧和营养物质的输送，导致代谢供需失衡，血管出现渗漏、异常增殖引起病理性视网膜新生血管疾病，如早产儿视网膜病变(ROP)、糖尿病视网膜病变(DR)和新生血管年龄相关性黄斑变性(nAMD)等，严重影响视力[9.Al-Latayfeh,M.,et al.,Cold Spring Harb Perspect Med.2(2012)a006411.10.Crespo-Garcia,S.,etal.,Cell Metab.33(2021)818.11.He,C.,et al.,ProcNatl Acad Sci U S A.118(2021)]。视网膜新生血管疾病根治困难、复发率高，其治疗方案一直是近年来医药研究领域的难点和热点。目前，以血管内皮生长因子(VEGF)为靶点的抗血管生成治疗已成为视网膜新生血管性疾病的主要治疗手段，虽然该疗法对部分患者已经取得一定的疗效，但许多患者面临的耐药、重复治疗和全身不良反应等问题仍需解决，因此，亟需探索新的治疗方法。

新型工程化生物纳米治疗平台往往具有较强的生物相容性，靶向性和治疗活性，在多种疾病的治疗中取得一定的疗效。IONPs可刺激间充质干细胞表达治疗性生长因子，通过物理挤压产生含有IONPs的细胞外纳米囊泡，在磁引导的作用下减轻缺血性卒中，增强心脏修复。Saeid Zanganeh等发现IONPs可通过诱导巨噬细胞M1而激活免疫治疗，表现出抗肿瘤特性，增强肿瘤免疫治疗。目前，尚无有关氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在治疗视网膜新生血管性疾病中的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了一种氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

所述氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体(ESIONPs@EXO)是由极小尺寸氧化铁纳米颗粒(ESIONPs)和巨噬细胞外泌体组装获得，具有靶向抑制视网膜新生血管的药物作用。

所述视网膜新生血管是指在包括损伤、感染、缺氧等多种刺激的诱导下，血管内皮细胞功能发生紊乱，异常增殖形成新生血管，与血管内皮生长因子的生成和释放有关。

所述氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体可以制成药物制剂。

所述药物制剂的剂型为注射剂，给药方式为尾静脉注射。

所述氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体(ESIONPs@EXO)的制备方法包括以下步骤：

第一步：采用超速离心法去除胎牛血清中的外泌体，去除沉淀，获得无外泌体血清，使用无外泌体血清配制DMEM完全培养液获得无外泌体DMEM完全培养液；

第二步：将分离出来的小鼠骨髓源性巨噬细胞在无外泌体DMEM完全培养液中培养至成熟；

第三步，使用含有ESIONPs、并含有重组小鼠集落刺激因子(M-CSF)的DMEM完全培养液处理，去除原培养液，再使用含有重组小鼠集落刺激因子(M-CSF)的DMEM完全培养液处理，收集细胞上清，获得含有ESIONPs@EXO的细胞上清；

第四步：将含有ESIONPs@EXO的细胞上清依次通过离心、过滤、超速离心后，获得所述氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体(ESIONPs@EXO)。

所有步骤均在4℃下进行。

所述第一步中，采用超速离心法去除胎牛血清中的外泌体的条件：100000g，4℃，4h。

所述第三步：使用含有200～300μg/ml(优选为250μg/ml)ESIONPs、并含有重组小鼠集落刺激因子(M-CSF)20～30ng/ml(优选为25ng/ml)的DMEM完全培养液处理1～48小时(优选为24小时)，去除原培养液，再使用含有重组小鼠集落刺激因子(M-CSF)20～30ng/ml(优选为25ng/ml)的DMEM完全培养液处理1～48小时(优选为24小时)，收集细胞上清，获得含有ESIONPs@EXO的细胞上清。

所述第四步：将含有ESIONPs@EXO的细胞上清依次通过第一次离心以去除细胞，第二次离心，第三次离心去除细胞碎片，过滤上清液，将预处理后的上清液超速离心，获得所述氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体(ESIONPs@EXO)。

所述第四步：将含有ESIONPs@EXO的细胞上清依次通过300g离心5min以去除细胞，2000g离心20min，10000g离心30min去除细胞碎片，随后用0.22μm滤镜过滤上清液，将预处理后的上清液150000g超速离心2小时，获得所述氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体(ESIONPs@EXO)。

所述小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMMs)的分离方法包括以下步骤：

第一步：4-6周龄的C57/BL6小鼠被安乐死并在75％的乙醇中浸泡20min；随后用无菌镊子和剪刀完整分离股骨；

第二步：PBS冲洗一遍后，用无菌剪刀去除骨头的两端，用23号针头和装有10mlDMEM的注射器(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)冲洗股骨骨髓，用1ml移液枪吹打60-100次重悬；

第三步：将40μm无菌过滤器(Falcon brand,BD Biosciences)放在50ml离心管上过滤骨髓悬浮液中不溶性杂质；

第四步：随后将细胞悬浮液转移至10cm培养皿中，在37℃、5％CO₂条件下培养；

第五步：12h后，收集上清，600×g离心5min，剩余细胞重悬于含25ng/μl重组小鼠集落刺激因子(M-CSF)(Peprotech，NJ，USA)的DMEM完全培养液中(含10％去外泌体FBS，1％青霉素-链霉素)，在37℃、5％CO₂培养箱中培养3天后换液，至6天，形成增殖性非活化细胞，即成熟BMMs。

本发明的第二方面，提供了一种氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。

视网膜新生血管性疾病是眼科最常见的眼底病之一，在多种因素的介导下，视网膜血管内皮细胞代谢及功能紊乱，血管生成失调会破坏氧和营养物质的输送，导致代谢供需失衡，最终导致病理性视网膜新生血管。

所述药物制剂的剂型为注射剂，给药方式为尾静脉注射。

所述视网膜新生血管性疾病选自早产儿视网膜病变(ROP)、糖尿病视网膜病变(DR)、新生血管年龄相关性黄斑变性(nAMD)等。

所有步骤均在4℃下进行。

所述小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMMs)的分离方法包括以下步骤：

本发明通过细胞功能实验，发现ESIONPs@EXO能显著诱导小鼠血管内皮细胞细胞功能。通过体内动物实验，发现ESIONPs@EXO可以抑制OIR小鼠视网膜新生血管。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明经体内外药理实验证明，ESIONPs@EXO在100μg/ml剂量下，体外能显著抑制小鼠血管内皮细胞的增殖、迁移、成管及出芽能力，体内能靶向抑制氧诱导视网膜病变小鼠模型的视网膜新生血管形成，可用于相关视网膜新生血管性疾病的治疗，具有良好的应用前景。

本发明研究结果表明，采用纯生物学方法设计的氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体具有良好的抑制病理性血管生成的作用，可以作为病理性血管生成治疗的生物相容性纳米平台，具有临床转化的潜力。

目前的外泌体工程方法通常会导致外泌体的损伤，无法满足复杂的疾病治疗需求。本发明提供了一种氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体(ESIONPs@EXO)，这是一个纯天然的生物过程，对工程外泌体没有任何损伤，可以显著提高纳米颗粒的治疗效率。

本发明研究结果表明，ESIONPs诱导M1巨噬细胞极化，这些巨噬细胞分泌的外泌体中含有ESIONPs。ESIONPs@EXO具有生物相容性、稳定性和M1巨噬细胞衍生外泌体的免疫治疗能力。同时ESIONPs@EXO表现出氧化铁纳米颗粒诱导内皮细胞铁死亡功能。

本发明研究结果表明，采用氧诱导视网膜新生血模型评价ESIONPs@EXO的靶向能力或通透性。静脉注射ESIONPs@EXO避免了反复玻璃体内注射的不良反应。本发明采用4种体外血管生成模型和1种体内病理血管生成模型来评价ESIONPs@EXO的抗血管生成功能。

附图说明

图1是ESIONPs@EXO制备的模式示意图。

图2是ESIONPs@EXO透射电子显微镜(TEM)及生物标志物鉴定图。

图3是小鼠血管内皮细胞内吞ESIONPs@EXO示意图。

图4是ESIONPs@EXO在体外抑制小鼠血管内皮细胞(C166)增殖的示意图。

图5是ESIONPs@EXO在体外抑制小鼠血管内皮细胞(C166)迁移的示意图。

图6是ESIONPs@EXO在体外抑制小鼠血管内皮细胞(C166)成管的示意图。

图7是ESIONPs@EXO在体外抑制小鼠血管内皮细胞(C166)出芽的示意图。

图8是ESIONPs@EXO在体内抑制小鼠血管内皮细胞(C166)小鼠模型的视网膜新生血管形成的示意图。

图9是ESIONPs不影响BMMs细胞和C166细胞的增殖活性及诱导BMMs细胞向M1方向极化的示意图。

图10是ESIONPs@EXO诱导C166细胞铁死亡的示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

ESIONPS@EXO的分离、制备及鉴定

1.实验方法

1.1实验动物：4-6周龄的C57/BL6小鼠。

1.2试验药物与试剂

小鼠集落刺激因子M-CSF。超顺磁性氧化铁纳米颗粒(ESIONPs)：由东南大学生物科学与医学工程学院提供。

1.3处理及纯化方法

M-CSF诱导小鼠骨髓细胞分化为BMMs，超速离心法获得巨噬细胞外泌体，ESIONPs工作液处理BMMs细胞。

1.4实验步骤

1.4.1BMMs的分离与培养

小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMMs)的分离按照标准方案进行。具体如下：

第一步：4-6周龄的C57/BL6小鼠被安乐死并在75％的乙醇中浸泡20min。随后用无菌镊子和剪刀完整分离股骨；

第二步：PBS冲洗一遍后，用无菌剪刀去除骨头的两端，用23号针头和装有10mLDMEM的注射器(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)冲洗股骨骨髓。用1ml移液枪吹打60-100次重悬；

第三步：将40μm无菌过滤器(Falcon brand，BD Biosciences)放在50ml离心管上过滤骨髓悬浮液中不溶性杂质；

1.5EXO和ESIONPs@EXO的分离制备及表征鉴定：

1.5.1外泌体(EXO)分离制备

第一步：无外泌体DMEM完全培养液制备：采用超速离心法(100000g，4℃，4h)去除胎牛血清(FBS)中的外泌体，去除沉淀，获得无外泌体血清，再使用无外泌体血清配制DMEM完全培养液获得无外泌体DMEM完全培养液。

第二步：将分离出来的小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMMs)在无外泌体DMEM完全培养液中培养至成熟。

第三步：将成熟后的BMMs继续处理24小时，去除原培养液，再使用DMEM完全培养液(含M-CSF 25ng/ml)10mL处理24小时，此时收集细胞上清，即为含有EXO的细胞上清。

第四步：将50ml收获的含有EXO的细胞上清依次通过300g离心5min以去除细胞，2000g离心20min，10000g离心30min去除细胞碎片，随后用0.22μm滤镜过滤上清液，将预处理后的上清液150000g超速离心2小时(L-90K，Beckman Coulter，USA)，所有步骤均在4℃下进行；将超速离心获得的EXO沉淀用1×PBS重悬(200μl)，立即使用或在-80℃保存直至使用。

1.5.2ESIONPs@EXO分离制备

第三步：使用含有250μg/ml ESIONPs的DMEM完全培养液(含M-CSF，25ng/ml)10ml处理24小时，去除原培养液，再使用DMEM完全培养液(含M-CSF 25ng/ml)10mL处理24小时，此时收集细胞上清，即为含有ESIONPs@EXO的细胞上清。

第四步：将50ml收获的含有ESIONPs@EXO的细胞上清依次通过300g离心5min以去除细胞，2000g离心20min，10000g离心30min去除细胞碎片，随后用0.22μm滤镜过滤上清液，将预处理后的上清液150000g超速离心2小时(L-90K，Beckman Coulter，USA)，所有步骤均在4℃下进行；流程如图1所示，图1是ESIONPs@EXO制备的模式示意图。将超速离心获得的ESIONPs@EXO沉淀用1×PBS重悬(200μL)，立即使用或在-80℃保存直至使用。

1.5.3EXO和ESIONPs@EXO的表征鉴定

通过透射电镜(TEM)观察ESIONPs@EXO的形态。结果如图2所示，图2是ESIONPs@EXO透射电子显微镜(TEM)及生物标志物鉴定图。结果表明，ESIONPs@EXO具有与EXO相似的形态特征，外泌体均呈现出双凹圆盘状结构(图2A)。由纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定EXO和ESIONPs@EXO的大小、分布和浓度；如图2B，数据表明，EXO和ESIONPs@EXO的平均粒径分别为130.8nm和124.9nm，无显著差异。利用外泌体的表面标志物对所获得的ESIONPs@EXO进行鉴定，如图2C，ESIONPs@EXO具有和EXO相似的表面蛋白特征，且二者均未检测到钙连蛋白的表达。以上结果表明，与EXO相比，ESIONPs@EXO同样具有显著的外泌体特征及较高的纯度，是一种生物性的工程化细胞外泌体。

采用ICP-MS(Agilent Technologies，7800ICP-MS)定量测定ESIONPs@EXO中的铁含量，ICP-MS结果显示，1μg ESIONPs@EXO中铁元素的含量为54.37ng。

实施例2：小鼠血管内皮细胞对ESIONPs@EXO的内吞作用鉴定

1.实验方法

1.1实验材料：EXO(实施例1中1.5.1获得)，ESIONPs@EXO(实施例1中1.5.2获得)。

1.2试验药物与试剂

DID细胞膜红色荧光探针。

1.3处理及纯化方法

DID细胞膜红色荧光探针标记外泌体，共聚焦显微镜观察内皮细胞内吞效果。

1.4实验步骤

1.4.1DID细胞膜红色荧光探针标记外泌体

将实施例1中1.5.1获得的EXO和实施例1中1.5.2获得ESIONPs@EXO，用DID细胞膜红色荧光探针分别与EXO和ESIONPs@EXO在37℃下共孵育30分钟，DID终工作浓度为5μM/l，剩余未结合的DID通过100000g离心2h去除。

1.4.2小鼠血管内皮细胞(C166)内吞外泌体鉴定

将DID细胞膜红色荧光探针标记外泌体与预处理在共聚焦小皿中的C166共孵育8小时，用多聚甲醛固定30分钟，使用F-actin骨架蛋白抗体1:1000四度过夜摇床孵育，PBS清洗3遍×5分钟，使用DAPI(1:2000)在室温下孵育20分钟以标记细胞核，PBS清洗3遍×5分钟，使用Leica TCS SP5-II共聚焦显微镜(Leica，Wetzlar,Germany)进行拍照分析。

结果如图3所示，图3是小鼠血管内皮细胞内吞ESIONPs@EXO示意图。从图中可以看出，与EXO相比，ESIONPs@EXO处理后C166中DID荧光强度更强，说明与EXO相比，ESIONPs@EXO靶向血管内皮细胞的作用更强。

实施例3

1.实验方法

1.1受试细胞：小鼠血管内皮细胞(C166)(WheLab上海盈湾生物科技公司)。

1.2试验药物与试剂

实施例1中1.5.1获得EXO和实施例1中1.5.2获得ESIONPs@EXO，EDU试剂盒购自锐博生物(C10310-2)。

1.3分组与造模

对照组：DMEM完全培养基；

ESIONPs处理组(250μg/ml)：将ESIONPs储存液溶解稀释于DMEM完全培养基配置成250μg/ml的ESIONPs工作液；

EXO处理组(100μg/ml)：将2mg/ml EXO稀释于DMEM完全培养基配置成100μg/ml的EXO工作液；

ESIONPs@EXO处理组(100μg/ml)：将2mg/ml ESIONPs@EXO稀释于DMEM完全培养基配置成100μg/ml的ESIONPs@EXO工作液；

1.4治疗方法

ESIONPs@EXO工作液处理细胞。

1.5实验步骤

细胞增殖实验(EDU assay)

第一步，细胞种孔：将密度约为80％～90％的C166细胞进行消化并计数，每孔取约2×10⁴个细胞均匀加入96孔板中，于37℃，5％CO₂敷箱中培养，待细胞贴壁后，吸除原培养液。对照组加入DMEM完全培养基，ESIONPs处理组加入250μg/ml的ESIONPs工作液，EXO处理组加入100μg/ml的EXO工作液，ESIONPs@EXO处理组加入100μg/ml的ESIONPs@EXO工作液；放置于37℃，5％CO₂敷箱中培养24～48小时；

第二步，Edu标记：将Cell-Light^TM EduApollo567试剂盒中试剂A与DMEM完全培养基按照1:1000的比例稀释；将96孔板中原细胞培养基弃掉，PBS清晰2遍，并换为上述稀释液，每孔100μl，放置于37℃，5％CO₂敷箱中孵育约1小时；

第三步，细胞固定：将96孔板中培养基吸除，PBS溶液清洗细胞，5分钟×3次。随后每孔加入100μl 4％多聚甲醛溶液，室温下固定30分钟，弃细胞固定液；细胞固定完成后每孔加入2mg/ml甘氨酸溶液100μl，室温下脱色摇床10分钟，弃甘氨酸溶液；每孔加入100μlPBS溶液清洗细胞；随后每孔加入100μl 0.5％TritonX-100渗透液，室温摇床10分钟；每孔加入100μl PBS清洗细胞，室温脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；

第四步，Apollo染色：首先将试剂B、试剂C、试剂D、试剂E及ddH₂O按试剂盒说明书配制成1XApollo染液，细胞固定及清洗结束后每孔加入100μl上述染液，室温避光，摇床富裕30分钟，弃染液；每孔加入0.5％TritonX-100渗透剂100μl，室温摇床清洗3次，每次10分钟；

第五步，DAPI染色：将DAPI原液与PBS溶液按照1:10000稀释，每孔加入稀释后DAPI染液100μl，室温避光，摇床染色20分钟，弃染液；每孔加入100μl PBS溶液，室温摇床清洗3次×10分钟，最后一遍不弃PBS。

第六步，观察：使用荧光显微镜，观察并拍摄图像，计算增值期细胞核染色数量与全部细胞核数量及其比值。

结果如图4所示，图4是ESIONPs@EXO在体外抑制小鼠血管内皮细胞(C166)增殖的示意图。图4中，A是不同处理组C166细胞EDU荧光图，B是不同处理组EDU数据统计图，从图中可以看出，相比于未加药对照组(Ctrl)、ESIONPs处理组和EXO处理组，ESIONPs@EXO处理组增殖期细胞比例显著降低，说明ESIONPs@EXO在体外能显著抑制C166的增殖能力。

实施例4

1.实验方法

1.2试验药物与试剂

实施例1中1.5.1获得EXO和实施例1中1.5.2获得ESIONPs@EXO。

1.3分组与造模

对照组：DMEM完全培养基；

1.4治疗方法

ESIONPs@EXO工作液处理细胞。

1.5实验步骤

细胞迁移实验(Migration assay)

第一步，细胞种孔：将ibidi Culture-insert 2Well放置于干燥的6孔细胞培养板表面，C166细胞密度约为90％时，消化细胞，将100μl细胞悬液种于Culture-insert孔中，放置于37℃，5％CO₂敷箱培养12小时。

第二步，划痕形成：轻柔去除Culture-insert后，对照组加入DMEM完全培养基，ESIONPs处理组加入250μg/ml的ESIONPs工作液，EXO处理组加入100μg/ml的EXO工作液，ESIONPs@EXO处理组加入100μg/ml的ESIONPs@EXO工作液；放置于37℃，5％CO₂敷箱中培养18小时。

第三步，观察：分别在第0，18小时显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。

结果如图5所示，图5是ESIONPs@EXO在体外抑制小鼠血管内皮细胞(C166)迁移的示意图。图5中，A是C166细胞在第18小时的迁移状态，B是细胞迁移率统计图，从图中可以看出，相比于未加药对照组(Ctrl)、ESIONPs处理组和EXO处理组，ESIONPs@EXO处理组细胞的迁移距离最小，说明ESIONPs@EXO在体外能显著抑制HUVEC的迁移能力。

实施例5

1.实验方法

1.2试验药物与试剂

实施例1中1.5.1获得EXO和实施例1中1.5.2获得ESIONPs@EXO。

1.3分组与造模

对照组：DMEM完全培养基；

1.4治疗方法

ESIONPs@EXO工作液处理细胞。

1.5实验步骤

细胞成管实验(Tube Formation assay)

第一步，细胞准备，C166细胞消化后，向6孔板中每孔分别加入1×10⁵细胞，待细胞贴壁后，对照组加入DMEM完全培养基，ESIONPs处理组加入250μg/ml的ESIONPs工作液，EXO处理组加入100μg/ml的EXO工作液，ESIONPs@EXO处理组加入100μg/ml的ESIONPs@EXO工作液；放置于37℃，5％CO₂敷箱中培养24小时。

第二步，铺胶：将96孔板置于冰上，每孔中加入80μl Matrigel胶，放入4℃冷却沉淀10分钟；将96孔板放入37℃5％CO₂敷箱中敷育20分钟。

第二步，细胞种孔：将本实施例第一步中各组提前药物处理好的细胞消化重悬并进行细胞计数，每孔50μl细胞悬液接种于上述预先铺好基质胶的96孔板种，每孔数量为1×10⁴个细胞；将96孔板放置于37℃ 5％CO₂敷箱中敷育2～4小时。

第三步，观察：利用荧光显微镜观察各组细胞形态及其成管情况。

结果如图6所示，图6是ESIONPs@EXO在体外抑制小鼠血管内皮细胞(C166)成管的示意图。A是C166细胞成管显微图像，B是C166细胞成管统计图，从图中可以看出，相比于未加药对照组(Ctrl)、ESIONPs处理组和EXO处理组，ESIONPs@EXO处理组细胞的成管数量最少，说明ESIONPs@EXO在体外能显著抑制C166的成管能力。

实施例6

1.实验方法

1.2试验药物与试剂

实施例1中1.5.1获得EXO和实施例1中1.5.2获得ESIONPs@EXO。

1.3分组与造模

对照组：DMEM完全培养基；

1.4治疗方法

ESIONPs@EXO工作液处理细胞。

1.5实验步骤

细胞出芽实验(Sprouting assay)

第一步，制备C166细胞球：常规消化C166细胞，并进行细胞计数，吸取8×10^4个C166细胞转移至15ml离心管中，加入DMEM基础培养基定容至4ml，随后加入1ml甲基纤维素，充分吹打混匀，依次吸取25μl细胞悬液加入10cm培养皿中并倒扣培养皿，放入细胞培养箱中孵育24小时。

第二步，转移C166细胞球：使用10ml PBS缓冲液轻轻冲下细胞培养皿中的液滴，将其转移至15ml离心管中，200×g，室温离心5分钟，小心弃除上清，向离心管中加入2ml含20％FBS的甲基纤维素混匀备用；吸取2ml一型胶原置于5ml离心管中，依次加入0.5ml10×M199培养液与0.5ml 0.2N NaOH溶液，充分混匀备用。将配置好的一型胶原溶液加入含细胞团块的甲基纤维素溶液中，充分混匀并避免气泡。将混合液按每孔800μl加入至24孔板中，随后将24孔板放入细胞培养箱中孵育30分钟，待胶体凝固后，向对照组加入DMEM完全培养基，向ESIONPs处理组加入250μg/ml的ESIONPs工作液，向EXO处理组加入100μg/ml的EXO工作液，向ESIONPs@EXO处理组加入100μg/ml的ESIONPs@EXO工作液；细胞培养箱孵育24小时。

第三步，观察与图像采集：待孵育结束后，吸除各个孔中的培养液，向24孔板中每孔加入4％多聚甲醛溶液，固定10分钟，置于倒置显微镜下采集图像，利用Image J软件统计出芽长度，通过GraphPad软件，统计分析不同处理组间的差异。

结果如图7所示，图7是ESIONPs@EXO在体外抑制小鼠血管内皮细胞(C166)出芽的示意图。图7中，A是不同处理组细胞出芽代表图，B是不同处理组细胞出芽统计图，从图中可以看出，相比于未加药对照组(Ctrl)、ESIONPs处理组和EXO处理组，ESIONPs@EXO处理组细胞的出芽长度最小，说明ESIONPs@EXO在体外能显著抑制C166的出芽能力。

实施例7

1.实验方法

1.1受试动物：出生后7天的健康C57BL/6J小鼠与母鼠购自上海吉辉实验动物饲养有限公司。动物饲养于海军军医大学SPF级动物房，自由饮水饮食，室温23-25℃，相对湿度(44±10)％，维持12h交替光照。

1.2试验药物与试剂

实施例1中1.5.1获得EXO和实施例1中1.5.2获得ESIONPs@EXO。

1.3分组与造模

对照组：PBS(100μl)；

ESIONPs处理组：10.8μg溶解于100μl PBS中；

EXO处理组：200μg溶解于100μl PBS中；

ESIONPs@EXO处理组：200μg溶解于100μl PBS中。

1.4治疗方法

尾静脉注射。

1.5实验步骤

OIR小鼠模型研究

第一步，OIR小鼠模型构建：将出生后第7天的健康C57 BL/6J小鼠与哺乳鼠同时放置于密闭氧箱中持续哺乳5天，氧箱浓度维持在75±0.5％，箱内温度控制在25±0.5℃，定时添加水和饲料，每隔12小时更换哺乳母鼠以保证哺乳母鼠的身体精神行为正常；氧箱内饲养5天后(即小鼠出生后第12天)，将小鼠及哺乳母鼠放置室内标准环境下饲养，正常空气环境氧浓度为21±2％，以实现相对缺氧环境诱导小鼠视网膜新生血管生成。同时，将小鼠分为4组(每组10只)，对照组静脉注射PBS(100μl)，每2d一次；ESIONPs处理组静脉注射ESIONPs(10.8μg溶解于100μl PBS中)，每2d一次；EXO处理组静脉注射EXO(200μg溶解于100μl PBS中)，每2d一次；ESIONPs@EXO处理组静脉注射ESIONPs@EXO(200μg溶解于100μl PBS中)，每2d一次。在第17天颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠眼球进行视网膜荧光染色铺片。

第二步，视网膜荧光染色铺片制作：

1)视网膜固定：将上述对照组、ESIONPs处理组、EXO处理组和ESIONPs@EXO处理组小鼠眼球取下，放入4％多聚甲醛中固定30分钟。

2)视网膜分离：在显微镜下，将固定好的小鼠视网膜放入PBS溶液中，用眼科剪沿眼球角巩膜缘处剪开，取出晶状体和玻璃体，用无齿镊小心剥离巩膜，脉络膜，最后夹出残留玻璃体纤维，即可分离出视网膜组织。

3)封闭：PBS溶液清洗视网膜3次，每次10分钟；加入5％BSA溶液，封闭1小时，以阻断非特异性染色，小心吸除BSA溶液，使用PBS溶液清洗3次，每次10分钟。

4)染色：弃PBS溶液，加入100μl PBS稀释的IB4荧光染料，室温孵育2小时，PBS摇床清洗3次，每次10分钟。

5)铺片：在显微镜下以视乳头为中心，用显微剪刀做4个放射状切口，在载玻片上铺平视网膜，最终呈四叶草状，滴上封片液并盖上盖玻片。

6)观察：在荧光显微镜下观察并拍摄图像。

结果如图8所示，图8是ESIONPs@EXO在体内抑制小鼠血管内皮细胞(C166)小鼠模型的视网膜新生血管形成的示意图。

图8中，A是不同处理组小鼠视网膜血管荧光染色代表性图片，B是不同处理组小鼠视网膜新生血管统计图，C是不同处理组小鼠视网膜无关注区统计图。从图中A可以看出，对照组(Ctrl)、ESIONPs处理组和EXO处理组可见大片无灌注区及新生血管簇，ESIONPs@EXO处理组无灌注区面积及新生血管显著减少。说明ESIONPs@EXO在体内能显著抑制视网膜新生血管的生成。从图中B可以看出，相比于对照组(Ctrl)、ESIONPs处理组和EXO处理组，ESIONPs@EXO处理组视网膜新生血管面积明显减少。从图中C可以看出，相比于对照组(Ctrl)、ESIONPs处理组和EXO处理组，ESIONPs@EXO处理组视网膜血管无灌注区相对面积明显减少。

实施例8

1.实验方法

1.1受试细胞：实施例1中1.4获得BMMs细胞，小鼠血管内皮细胞(C166)(WheLab上海盈湾生物科技公司)。

1.2试验药物与试剂

极小尺寸氧化铁纳米颗粒(ESIONPs)：由东南大学生物科学与医学工程学院提供。CCK8试剂盒(Beyotime，China)；RNA提取试剂盒(Tiangen，China)；III 1st StrandCDNA Synthesis SuperMix，Hieff/>Power qPCR SYBR Green Master Mix(Yeasen，China)。

1.3处理及纯化方法

M-CSF诱导小鼠骨髓细胞分化为BMMs，ESIONPs工作液处理BMMs细胞和C166细胞。

1.4分组与造模

对照组：DMEM完全培养基；

ESIONPs处理组(0-1000μg/ml)：将ESIONPs储存液溶解稀释于DMEM完全培养基配置成0-1000μg/ml的ESIONPs工作液；

1.5治疗方法

ESIONPs工作液(0-1000μg/ml)处理BMMs细胞和C166细胞。ESIONPs工作液(250μg/ml)处理BMMs细胞。

1.6实验步骤

细胞活性检测实验

第一步，细胞种孔：将密度约为80％～90％的BMMs和C166细胞进行消化并计数，每孔取约2×10⁴个细胞均匀加入96孔板中，于37℃，5％CO₂敷箱中培养，待细胞贴壁后，吸除原培养液。对照组加入DMEM完全培养基，ESIONPs处理组加入0-1000μg/ml的ESIONPs工作液，放置于37℃，5％CO₂敷箱中培养24～48小时；

第二步，将10μl CCK8试剂加入到每个孔中，并在37℃温育2小时。然后用紫外分光光度计在450nm波长读取吸光度。

巨噬细胞极化标志物检测实验

第一步，总RNA提取：根据制造商说明，使用总RNA提取试剂盒从细胞中分离总RNA。

第二步：逆转录：根据制造商说明，使用III 1st Strand CDNA SynthesisSuperMix获得CDNA，并在-80℃保存。

第三步：定量聚合酶链反应(qRT-PCR)：采用HieffPower qPCR SYBRGreen Master Mix对第二步获得的CDNA进行扩增。所有实验完全独立重复三次。

结果如图9所示，图9是ESIONPs不影响BMMs细胞和C166细胞的增殖活性及诱导BMMs细胞向M1方向极化的示意图。其中：A是不同浓度ESIONPs对BMMs增殖活性的影响示意图，B是不同浓度ESIONPs对C166增殖活性的影响示意图，C是ESIONPs影响BMMs细胞极化状态的示意图。A中结果表明，ESIONPs(0-1000μg/ml)不影响BMMs增殖活性。B中结果表明，ESIONPs(0-1000μg/ml)不影响C166增殖活性。C中结果表明，250μg/ml ESIONPs处理BMMs后，M1型标志物TNFα、iNOS和IL-6表达明显上调，而M2型标志物IL-10和Arg 1表达明显下调，表明250μg/ml ESIONPs诱导BMMs向M1方向分化。

实施例9

1.实验方法

1.2试验药物与试剂

实施例1中1.5.1获得EXO和实施例1中1.5.2获得ESIONPs@EXO。蛋白酶和磷酸酶抑制剂，RIPA裂解缓冲液，BCA测定试剂盒(Beyotime，China)，Antibody to CD71，COX2，NOX1，GPX4和Actin(Proteintech，China)。ECL Western blotting检测试剂(Merck-Millipore，Germany)。

1.3分组与造模

对照组：DMEM完全培养基；

1.4治疗方法

ESIONPs@EXO工作液处理细胞。

1.5实验步骤

Western Blot检测实验

第一步，细胞准备，C166细胞消化后，向6孔板中每孔分别加入1×10⁵细胞，待细胞贴壁后，对照组加入DMEM完全培养基，EXO处理组加入100μg/ml的EXO工作液，ESIONPs@EXO处理组加入100μg/ml的ESIONPs@EXO工作液；放置于37℃，5％CO₂敷箱中培养24小时。

第二步，用含有2％蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白。根据制造商的说明，使用BCA定量试剂盒测定蛋白质浓度。使用5×SDS-PAGE上样缓冲液中制备蛋白样品，95℃加热10分钟后上样。

第三步，将蛋白质样品和蛋白质标记物(20μl)加入12.5％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)孔中，在120伏下电泳50min分离，然后在100V下转移到PVDF膜上，电泳110min。

第四步，在室温下，用5％脱脂牛奶在TBST(Tris缓冲盐水，含0.1％Tween-20)中封闭2小时。然后在TBST中短暂冲洗PVDF膜，并与特异性一抗在4℃下孵育过夜。

第五步，在TBST中洗涤4次后，将膜在辣根过氧化物酶偶联的二抗IgG抗体(5％脱脂干牛奶)中室温孵育1.5h。在TBST中洗涤4次后，使用ECLWestern blotting检测试剂检测化学发光。使用Gelview 6000Plus图像采集系统采集图像，并使用ImageJ软件进行定量。

结果如图10所示，图10是ESIONPs@EXO诱导C166细胞铁死亡的示意图。图10中，A、B分别是ESIONPs@EXO对C166细胞CD71，COX2，NOX1和GPX4表达水平影响的蛋白免疫印记图和统计图，结果表明，100μg/ml ESIONPs@EXO处理C166细胞后，CD71，COX2和NOX1表达水平显著上调，GPX4表达水平显著下调，表明100μg/ml ESIONPs@EXO可以诱导C166细胞铁死亡。

以上结果说明，ESIONPs能诱导巨噬细胞M1极化，ESIONPs@EXO处理后，小鼠血管内皮细胞C166中的GPX4表达明显降低，NOX1，CD71及COX2表达明显上调，表明ESIONPs@EXO通过诱导小鼠血管内皮细胞铁死亡抑制其细胞功能。

以上实验表明，ESIONPs@EXO在体内外均能显著抑制病理性新生血管的形成，对视网膜新生血管性疾病有良好的治疗效果，具有良好的药物应用前景。

早产儿视网膜病变(retinopathy ofprematurity，ROP)是一类特发于早产儿和低体重儿的眼部疾病，是全球新生儿中致盲的主要原因。世界卫生组织“视觉2020行动”早已将ROP列为高收入国家儿童防盲治盲的主要目标之一。ROP主要表现为视网膜血管异常增生。其原理为：正常情况下眼部视网膜血管鼻侧在胎龄8月龄发育完全，颞侧在10月龄发育完全，而早产儿的视网膜血管未发育完全，吸氧后，血管收缩，停氧后，视网膜又缺血缺氧，导致血管发生增殖性病变，即病理性新生血管。因此，本发明的ESIONPs@EXO可以作为早产儿视网膜病变的治疗药物。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims

1.一种氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体ESIONPs@EXO是由极小尺寸氧化铁纳米颗粒ESIONPs和巨噬细胞外泌体组装获得，具有靶向抑制视网膜新生血管的药物作用。

3.根据权利要求1所述的氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述视网膜新生血管是指在包括损伤、感染、缺氧多种刺激的诱导下，血管内皮细胞功能发生紊乱，异常增殖形成新生血管，与血管内皮生长因子的生成和释放有关。

4.根据权利要求1所述的氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体ESIONPs@EXO的制备方法包括以下步骤：

第三步，使用含有ESIONPs、并含有重组小鼠集落刺激因子M-CSF的DMEM完全培养液处理，去除原培养液，再使用含有重组小鼠集落刺激因子M-CSF的DMEM完全培养液处理，收集细胞上清，获得含有ESIONPs@EXO的细胞上清；

第四步：将含有ESIONPs@EXO的细胞上清依次通过离心、过滤、超速离心后，获得所述氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体ESIONPs@EXO。

5.根据权利要求4所述的氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所有步骤均在4℃下进行；

所述第三步：使用含有200～300μg/mL ESIONPs、并含有重组小鼠集落刺激因子M-CSF20～30ng/ml的DMEM完全培养液处理1～48小时，去除原培养液，再使用含有重组小鼠集落刺激因子M-CSF 20～30ng/ml的DMEM完全培养液处理1～48小时，收集细胞上清，获得含有ESIONPs@EXO的细胞上清。

6.根据权利要求4所述的氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述第四步：将含有ESIONPs@EXO的细胞上清依次通过第一次离心以去除细胞，第二次离心，第三次离心去除细胞碎片，过滤上清液，将预处理后的上清液超速离心，获得所述氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体ESIONPs@EXO。

7.一种氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述视网膜新生血管是指在包括损伤、感染、缺氧多种刺激的诱导下，血管内皮细胞功能发生紊乱，异常增殖形成新生血管，与血管内皮生长因子的生成和释放有关。

9.根据权利要求7所述的氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述视网膜新生血管性疾病选自早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变、新生血管年龄相关性黄斑变性。

10.根据权利要求7所述的氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体在制备抑制视网膜新生血管性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述氧化铁纳米颗粒工程化的巨噬细胞外泌体ESIONPs@EXO的制备方法包括以下步骤：