CN118119401A - 用于治疗a型血友病的改性胶体颗粒 - Google Patents
用于治疗a型血友病的改性胶体颗粒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及胶体颗粒用于治疗先前未治疗患者或用因子VIII(FVIII)最低限度治疗的患者的A型血友病的用途。本发明还涉及包含胶体颗粒的组合物、方法、试剂盒和剂型，其用于治疗先前未治疗患者或用因子VIII(FVIII)最低限度治疗的患者的A型血友病。
Description
本发明涉及胶体颗粒用于治疗先前未治疗患者或用因子VIII(FVIII)最低限度治疗的患者的A型血友病的用途。胶体颗粒包含第一两亲脂质和第二两亲脂质，其中第二两亲脂质可以是用生物相容性亲水聚合物例如聚乙二醇(PEG)衍生化的磷脂部分。本发明还涉及包含胶体颗粒的组合物、方法、试剂盒和剂型。
导致血液凝固的凝血级联是多步骤过程，涉及许多不同的蛋白质和因子，再加上调节反馈机制，使受伤时能够安全形成血凝块。在血友病等血液疾病中，这些因素中的一种或多种可能有缺陷或不存在，从而导致有缺陷或质量差的凝块。
A型血友病中，凝血因子VIII(FVIII)不存在(重度血友病)或水平低(中度和轻度血友病)。
FVIII是凝血级联的“内在”途径中的关键蛋白，当被活化为FVIIIa时，它与FIXa结合形成内在“tenase”复合物，其加速FX向FXa的转化，FXa参与凝血酶原向凝血酶的转化，凝血酶将纤维蛋白原转化为形成血凝块的纤维蛋白。
FX向FXa的转化也可以通过“外在”起始途径来介导。组织因子(TF)和FVIIa的外在tenase复合物(TF-FVIIa)的形成启动凝血级联，导致也催化FVIII活化为FVIIIa的凝血酶的产生。然而，外在途径的效率低于内在途径。
在缺乏FVIII的情况下，凝血级联的进展要慢得多，因为级联必须仅依赖于外在途径来催化FX向FXa的转化。
在缺乏内源性FVIII的情况下，通常的做法是向患者施用血浆来源的或重组的替代FVIII，以恢复其凝血能力。患者可能会产生针对外源性FVIII(先天性A型血友病–cHA)或其自身FVIII(获得性A型血友病–aHA)的抗体(抑制剂)。抑制剂的存在降低了用外源性FVIII治疗患者的有效性，因为蛋白质被抑制剂抗体结合、中和并迅速从循环中清除，使得用替代人FVIII进行预防性治疗非常困难或通常不可能。FVIII数量未达到最佳水平意味着即使能够完全形成凝块，其形成速度也很慢，或者一旦形成则质量较差而会迅速分解。
目前应对抑制剂的产生有两种主要方法：使用抑制剂耐受诱导(ITI)或使用旁路疗法。ITI在几个月内使用大剂量、重复剂量的FVIII来诱导免疫系统对FVIII的耐受性，目的是使患者能够恢复到正常的给药方案。该疗法并不总是有效，几个月内重复大剂量注射FVIII不仅会让患者感到不适，而且成本极高，代表了巨大的医疗保健系统成本。
旁路疗法通过完全“绕过”放大阶段来避免抑制剂的问题。这些疗法可能只是通过提供额外的FVIIa(例如，NovoSeven)来增强外在途径，也可能提供活性因子和失活因子的混合物，例如FEIBA(FVIIa、FIX、FIXa、FX、FXa、凝血酶原和凝血酶的混合物)，在缺乏FVIII的情况下增强级联。最近的发展尝试通过使用双特异性抗体来取代FVIIIa将FIXa和FX结合在一起的作用。
使用替代FVIII治疗先天性A型血友病或获得性A型血友病在临床实践中已得到广泛认可。然而，由于一些患者体内存在抑制性抗体，降低了外源递送的因子VIII的有效性，因此此类产品的功效受到限制。25-35％的先天性A型血友病患病者(“抑制剂患者”)会产生抑制剂，作为对他们所接受的外源性FVIII的反应；在获得性A型血友病中，这种疾病就是在患者由于自身免疫而对其自身的FVIII产生抑制剂时产生的。
野生型FVIII分子包含2332个氨基酸，分为6个结构域：A1-A2-B-A3-C1-C2。A1-A2-B结构域一起构成“重链”(HC)，A3-C1-C2结构域一起构成“轻链”(LC)，并且这些链非共价连接。在生命周期中，FVIII通常会与循环中的冯维勒布兰德因子(VWF)缔合。VWF促进FVIII的转运并保护其免于过早失活和清除(Mannucci,P.M.et al.(2014)Novel investigationson the protective role of the FVIII/VWF complex in inhibitordevelopment.Haemophilia.20(suppl.6),2-16.)。与VWF的缔合还与免疫原性降低、抑制剂存在下的功效以及免疫耐受治疗的实用性相关。在SIPPET试验中，使用含有VWF的血浆衍生FVIII(pdFVIII)商业浓缩物显示出免疫原性低于FVIII重组浓缩物(rFVIII)(Peyvandi,F.et al.(2016)A randomized trial of Factor VIII and neutralizing antibodiesin Hemophilia A,N Engl J Med.374,2054-64)。pdFVIII浓缩物的免疫原性降低与VWF伴侣有关，人们认为VWF伴侣掩蔽FVIII分子上的关键表位，和/或阻止树突状细胞对其进行内吞作用(Astermark,J.(2015)FVIII inhibitors:pathogenesis andavoidance.Blood.125(13),2045-51)。重组FVIII分子还具有额外的复杂性，即大多数这些分子不是人源化的，而是在非人细胞系中产生的，从而导致非人聚糖表位的存在，这可能增强其免疫原性。
针对FVIII中这些表位的抑制剂的产生仍然是血友病治疗最常见的副作用(Vanden Berg et al.(2020).ITI treatment is not a first-choice in children withhaemophilia A and low-responding inhibitors:Evidence from a PedNetstudy.Coagulation and Fibrinolysis.120,1166-1172)。先前未治疗患者(Previouslyuntreated patient，PUP)的风险很高，总体发生率高达40％(出处同上)，这导致FVIII活性失活，需要采取替代且昂贵的措施来保护这些患者。在一些患者中，使用免疫耐受诱导疗法(一种长期且昂贵的技术)可以根除抑制剂，但该技术并不适用于所有患者，从而阻止他们使用替代FVIII疗法。在替代FVIII的前20个暴露日(ED)中，抑制剂产生的风险最高，并且持续长达75个ED(Liesner,R.J.et al.(2021)Simoctocog alfa(NuwiqTM)in previouslyuntreated patients with severe haemophilia A:final results of the NuProtectstudy.Thromb Haemost.online)。在此期间必须监测患者的抑制剂的产生。
显然，如果这些先前未治疗患者能够用从一开始就不太可能具有免疫原性的FVIII疗法治疗，以减少产生抑制剂的机会，那就更好了。
因此，需要一种减少产生抑制剂的机会的非免疫原性FVIII替代疗法。
因此，本发明提供了用于治疗A型血友病的PEG化胶体颗粒，以通过表位屏蔽和半衰期延长的组合来降低先前未治疗患者或FVIII治疗时的最低限度治疗患者中产生抑制剂的风险。
已发现PEG化脂质体似乎防止了易产生抑制剂模型中抗FVIII抗体的产生，并能够降低剂量/给药间隔。
这提供了一种更安全的方法来治疗先前未治疗患者(PUP)和最低限度治疗患者(Minimally treated patient，MTP–对因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数(ED)少于50天)。
发明内容
本发明提供了包含胶体颗粒的组合物、方法、试剂盒和剂型，用于治疗缺乏FVIII且不具有FVIII抑制剂的血友病患者。该组合物、方法、试剂盒和剂型还可以可选地包含非离子表面活性剂和/或FVIII。
在本发明第一方面，提供了一种用于治疗对象的A型血友病的包含胶体颗粒的组合物，所述胶体颗粒包含：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，其中所述第二两亲脂质包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。该对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。
生物相容性亲水聚合物可以选自由聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸组成的组，优选地，生物相容性亲水聚合物是聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇可具有约500至约5000道尔顿的分子量，优选约2000道尔顿或约5000道尔顿。
第二两亲脂质可以是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG)，例如N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG2000)或N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG5000)。
磷脂酰胆碱(PC)可以是1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)。
第一两亲脂质与第二两亲脂质的摩尔比可以为90-110:10:1或90-99:10:1，例如100:3或97:3。
胶体颗粒还可以包含(iii)非离子表面活性剂。非离子表面活性剂可以选自由聚氧乙烯山梨醇酐、聚羟基乙烯硬脂酸酯和聚羟基乙烯月桂基醚组成的组。非离子表面活性剂可以是聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯。胶体颗粒可以包含的第一两亲脂质和第二两亲脂质与非离子表面活性剂的比例为30:1至2:1w/w({第一两亲脂质+第二两亲脂质}:{非离子表面活性剂})。
第一两亲脂质与第二两亲脂质与非离子表面活性剂的比例可以为10-40:1:0-4w/w({第一两亲脂质}:{第二两亲脂质}:{非离子表面活性剂})。
该组合物还可以包含因子VIII(FVIII)分子。胶体颗粒和因子VIII(FVIII)分子的化学计量比可以为1-90:1，例如10-20:1或5-10:1。
A型血友病可以是先天性A型血友病(cHA)或获得性A型血友病(aHA)。
该组合物还可以包含治疗活性化合物。该组合物还可以进一步包含赋形剂、稀释剂和/或佐剂。
对象可以是儿科患者。对象也可以未接受过FVIII治疗。
本发明的组合物可以配制为即用型水悬浮液，或者可以将组合物制备为冻干制剂。本发明的冻干制剂可以作为单独的剂型与还提供的合适的稀释剂、佐剂或赋形剂例如生理学上可接受的缓冲剂一起提供。如本文所述，此类组合物可另外包含因子VIII作为单独的剂型，或与如本文所述的胶体颗粒一起配制。
在本发明的第二方面，提供了治疗对象的A型血友病的方法，包括施用包含胶体颗粒的组合物的步骤。该胶体颗粒包含：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，第二两亲脂质包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。该对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。
生物相容性亲水聚合物可以选自由聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸组成的组，优选地，生物相容性亲水聚合物是聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇可具有约500至约5000道尔顿的分子量，优选约2000道尔顿或约5000道尔顿。
第二两亲脂质可以是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG)，例如N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG2000)或N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG5000)。
磷脂酰胆碱(PC)可以是1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)。
胶体颗粒还可以包含(iii)非离子表面活性剂。
该方法的组合物还可以包含因子VIII(FVIII)分子。可替代地，该方法可以包括单独或随后施用包含因子VIII(FVIII)分子的组合物的额外步骤。
A型血友病可以是先天性A型血友病(cHA)或获得性A型血友病(aHA)。
对象可以是儿科患者。对象也可以未接受过FVIII治疗。
在本发明的第三方面，提供了一种用于治疗对象的A型血友病的试剂盒，该试剂盒包括：(i)包含胶体颗粒的组合物，和(ii)包含因子VIII(FVIII)分子的组合物，该对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。该胶体颗粒包含：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，第二两亲脂质包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。
胶体颗粒还可以包含(iii)非离子表面活性剂。
在本发明的第四方面，提供了一种用于治疗对象的血友病的试剂盒，该试剂盒包括用于单独、同时或随后使用的(i)包含胶体颗粒的组合物，和(ii)包含因子VIII(FVIII)分子的组合物，该对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。该胶体颗粒包含：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，第二两亲脂质包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。
胶体颗粒还可以包含(iii)非离子表面活性剂。
在本发明的第五方面，提供了一种用于治疗对象的A型血友病的包含胶体颗粒的药物组合物的剂型，所述胶体颗粒包含：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，其中所述第二两亲脂质包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。该对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。
胶体颗粒还可以包含(iii)非离子表面活性剂。
本发明适合缺乏FVIII且不具有FVIII抑制剂的血友病患者。
在实施方式中，该方法用于治疗患有轻度、中度或重度A型血友病的先前未治疗患者(PUP)或最低限度治疗患者(MTP)，以最小化先前未治疗患者产生抑制剂的机会。
在另一个实施方式中，该方法用于治疗先前已显示易产生抑制剂但目前无抑制剂的患者，以防止抑制剂复发。
在实施方式中，该方法用于治疗先前已产生抑制剂但在免疫耐受诱导治疗过程后现在无抑制剂的患者，以防止抑制剂复发。
在另一个实施方式中，该方法用于治疗正在接受免疫耐受诱导治疗的患者，以防止进一步刺激免疫系统。
在实施方式中，该方法用于治疗尚未产生抑制剂且希望降低其产生针对FVIII替代疗法的抑制剂的风险的轻度、中度或重度A型血友病患者。
具体实施方式
本发明提供了用于治疗对象的A型血友病的包含胶体颗粒的组合物、方法、试剂盒和剂型，其中对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。
因子VIII(FVIII)治疗可以是因子VIII(FVIII)替代治疗，例如血浆衍生的或重组的FVIII，用于使患者/对象恢复其凝血能力。在患者/对象已经产生抑制剂的情况下，患者/对象可以接受治疗，例如“旁路”治疗或抑制剂耐受诱导(ITI)治疗。旁路治疗包括FVIIa(例如，NovoSeven)或活性和失活因子的混合物，例如FEIBA(FVIIa、FIX、FIXa、FX、FXa、凝血酶原和凝血酶的混合物)。抑制剂耐受诱导(ITI)在几个月内使用大剂量、重复剂量的FVIII来诱导免疫系统对FVIII的耐受性。
FVIII的抑制剂或抗体抑制剂是指FVIII的抗体，也可互换地称为FVIII抗体抑制剂或FVIII中和抗体。抗体可以是针对内源性FVIII的自身抗体或针对外源性FVIII的抗体。
根据上述第一方面，胶体颗粒包含(i)第一两亲脂质和(ii)第二两亲脂质。第一种两亲脂质是磷脂酰胆碱(PC)部分。磷脂酰胆碱(PC)部分的合适实例可以是1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)。第二两亲脂质是选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)组成的组的磷脂部分。磷脂酰乙醇胺(PE)的合适实例可以是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇-35胺(DSPE)。氨基丙二醇二硬脂酰(DS)脂质是一种氨基甲酸酯连接的不带电荷的脂质聚合物，也是一种两亲脂质。磷脂酰乙醇胺(PE)的其他实例包括DPPE、DMPE和DOPE。
本发明的胶体颗粒通常为脂质囊泡或脂质体的形式并且是本领域众所周知的。除非上下文另有说明，否则本说明书中提及的胶体颗粒包括脂质体和脂质囊泡。
第二两亲脂质是用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。
生物相容性亲水聚合物的目的是使胶体颗粒空间稳定，从而防止胶体颗粒在体外融合，并使胶体颗粒在体内逃脱网状内皮系统的吸附。生物相容性亲水聚合物可以选自由聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸组成的组。生物相容性亲水聚合物可以是聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇可以是支化或非支化的。生物相容性聚合物的分子量可以为约100至约10,000Da，合适地为约2000至约5000Da，优选值为约100Da、250Da、350Da、550Da、750Da、1000Da、1500Da、2000Da、2500Da、3000Da、3500Da、4000Da、4500Da、5000Da、5500Da、6000Da、6500Da、7000Da、7500Da、8000Da、8500Da、9500Da和10,000Da。用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂的合适实例可以是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG)，例如N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG(2000))和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG5000)。
可以按以下摩尔比提供第一两亲脂质与第二两亲脂质：90-110:10-1、90-100:10-1、90-99:10-1、93-99:7-1、95-99:5-1，合适地为100:3、100:3、99:3、98:3、97:3、96:3或95:3。97.3的摩尔比也可以表示为32.4:1的摩尔比，同样，100:3的摩尔比可以表示为33.2:1的摩尔比。第一两亲脂质和第二两亲脂质的比例还可以表示为重量/重量比，例如1:1至20:1w/w，合适地2:1至12:1w/w或4:1至9:1w/w，例如4:1、5:1、6:1、9:1或12:1w/w。合适地，组合物可包含由90-99:10-1、93-99:7-1、95-99:5-1、适当地97:3的摩尔比(POPC:DSPE)的棕榈酰-油酰磷脂酰胆碱(POPC)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇-胺(DSPE)的混合物组成的胶体颗粒。以重量/重量比表示，其可以是例如1:1至20:1w/w，合适地2:1至12:1w/w，例如4:1、5:1、6:1、9:1或12:1w/w。
在一种情况下，胶体颗粒可由摩尔比为97:3或重量比为9:1的1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG(2000))组成。
胶体颗粒可具有0.05至0.0.3μm直径范围内的均值粒度(平均粒度)，合适地为约0.1、0.15、0.2或0.25微米(μm)。平均粒度(均值粒度)可以为100至130纳米(nm)，合适地为110至120nm、112至118nm、150至170nm、155至165nm，更合适地为110、112、114、116、118、120、160、162、164、166、168或170nm。
平均颗粒尺寸可使用Malvern Zetasizer Ultra ZSU 5700进行测量。该仪器通过光散射确定粒度，借此以173°的角度检测激光照射到样品中并撞击颗粒的反向散射(173°为几乎回到自身，因此称为反向散射)。粒子的布朗运动导致光以不同强度散射。由于布朗运动的速度与粒度有关，因此可以通过Stokes-Einstein关系推断粒度。
平均粒度对应于胶体颗粒的平均直径。与粒度测量相关的多分散指数(PDI)对应于胶体颗粒的平均直径周围分布的量度。例如，在本发明中，多分散指数最大可为0.2，合适地为0.15、0.12、0.1或0.5。
PDI计算为标准差/平均值的平方，即PDI＝(s/m)2。
根据平均粒度和多分散指数，可以计算标准偏差。两倍的标准偏差有利于计算粒度周围的95％置信区间，即样品中95％的胶体颗粒所在的范围。
合适地，95％平均粒度可以为50至500nm、合适地为50至290nm、50至285nm、65至265nm、65至260nm、65至180nm、65至175nm、65至170nm、65至165nm、65至160nm，更合适地为65至173nm、64至161nm、65至263nm或54至282nm。
胶体颗粒还可以包含(iii)表面活性剂，例如非离子表面活性剂。非离子表面活性剂可以选自由聚氧乙烯山梨醇酐、聚羟基乙烯硬脂酸酯和聚羟基乙烯月桂基醚组成的组。非离子表面活性剂可以是聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯(也称为聚山梨醇酯80或Tween80)。第一两亲脂质和第二两亲脂质与非离子表面活性剂的比例可以提供为30:1至2:1w/w，合适地为25:1、20:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1或5:1w/w({第一两亲脂质+第二两亲脂质}:{非离子表面活性剂})。以摩尔比表示，这可以是例如10-20:1、12-18:1、14-16:1，合适地为14:1、15:1或16:1。表面活性剂浓度可以为0.25wt％至5wt％，例如1wt％至3wt％、1wt％至2wt％，一些示例性值可为0.47wt％、0.85wt％或3.5wt％。
非离子表面活性剂也可以是PEG化的。PEG化非离子表面活性剂可以是聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯(也称为聚山梨醇酯80或Tween 80)。聚乙二醇可以是支化或非支化的。生物相容性聚合物的分子量可以为约100至约10,000Da，合适地为约2000至约5000Da，优选值为约100Da、250Da、350Da、550Da、750Da、1000Da、1500Da、2000Da、2500Da、3000Da、3500Da、4000Da、4500Da、5000Da、5500Da、6000Da、6500Da、7000Da、7500Da、8000Da、8500Da、9500Da和10,000Da。
非离子表面活性剂可以与胶体颗粒缔合、掺入胶体颗粒的脂质双层膜中、掺入胶体颗粒的脂质双层膜的外层或掺入胶体颗粒的内层脂质双层膜中。
因此，第一两亲脂质与第二两亲脂质与非离子表面活性剂的比例可以为2-10:1:0-2、3-9:1:0.5-1.5、4-9:1:0.5-1w/w，适当地为9:1:0、9:1:1、4:1:0或4:1:0.5w/w({第一两亲脂质}:{第二两亲脂质}:{非离子表面活性剂})。以摩尔比表示，其可以为例如30-40:1:0-5、30-35:1:0-2.5、30-35:1:0-2.5、适当地为33:1:0、33:1:2或32:1:3。
该组合物还可包含因子VIII(FVIII)分子或其片段。当组合物包含因子VIII的片段时，因子VIII片段可以适当地是活性片段，其中该片段保留生物活性，或与天然因子VIII分子基本上相同的生物活性。例如，一个这样的活性片段是B结构域截短的因子VIII。还可能的是，组合物还可以包含天然血液因子及其片段。胶体颗粒和因子VIII(FVIII)分子可以按以下化学计量比提供：1-90:1，合适地2-90:1，5-85:1，6-10:1，7-8:1，7.5-20:1，10-80:1，10-15:1，10-16:1，10-20:1，13-19:1，15-16:1，15-75:1，20-70:1，25-65:1，30-60:1，35-55:1，40-50:1，例如10-20:1和5-10:1。换句话说，胶体颗粒和因子VIII(FVIII)分子可以按以下化学计量比提供：1:1，2:1，5:1，7.5:1，10:1，15:1，16:1，17:1，18:1，19:1，20:1，22:1，25:1，26:1，27:1，28:1，29:1，30:1，35:1，40:1，45:1，50:1，55:1，60:1，65:1，70:1，75:1，80:1，85:1，86:1，90:1，例如15.5:1，13:1，8:1，7.7:1，7:1。更具体地，对于全长FVIII分子，化学计量比可以为10:1至19:1并且最佳为10-15:1或5-10:1并且最佳为7.5:1。对于β结构域缺失或β结构域截短的FVIII分子，该范围可以为13-19:1并且最佳为10-16:1或6-10:1并且最佳为8:1。
不希望受理论束缚，推测组合物中存在的过量胶体颗粒的量足以允许游离胶体颗粒可逆地结合其他核心血液因子(例如在A型血友病的情况下的FVII和FIX)，其与一定量的颗粒相关因子VIII(FVIII)可以在施用后被捕获并可逆地结合到血小板上，以将因子集中在血小板上并加强外在凝血途径。
因子VIII可以来自任何合适的来源，并且可以是使用分子生物学技术通过重组DNA技术产生的、或化学合成的、或在哺乳动物乳汁中转基因产生的重组蛋白，或者因子VIII可以从天然来源中分离(例如从血浆中纯化)。适当地，因子VIII是哺乳动物因子VIII，例如人因子VIII。
血液因子，例如因子VIII，其特征在于表面粘附的特性。这是凝血级联的必要特征，它要求酶和辅助因子粘附到级联中的其他参与者、血小板表面和损伤部位的组织上。尤其重要的是血凝块保留在受伤部位并且不会漂移导致危险的血栓形成。这种特性对药品配方提出了挑战，因为诸如因子VIII之类的血液因子会过度粘附在任何玻璃和塑料表面上。实际上，通过广泛使用非离子表面活性剂(例如聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯聚山梨酯)可以缓解这一问题。
为了确定胶体颗粒与因子VIII(FVIII)分子的化学计量比，应进行以下计算。首先应确定每IU FVIII的FVIII分子。请注意，FVIII的质量根据FVIII的变体而变化(例如全长与β结构域缺失)。其次，应测定每克胶体颗粒的颗粒数。最后，可以相应地确定化学计量比。使用35IU/kg FVIII(β结构域缺失和全长)和22mg/kg PEGLip的示例计算如下：计算示例1，β结构域缺失的rFVIII
计算示例2，全长rFVIII
该组合物可以包含另外的治疗活性化合物或分子，例如抗炎药、镇痛剂或抗生素、或可以促进或增强因子VIII的活性的其他药物活性剂。
该组合物还可包含任何合适的赋形剂、稀释剂和/或佐剂。合适的稀释剂例如缓冲剂可以用碱金属或碱土金属的水溶性盐以及合适的酸来配制。合适的缓冲溶液可以包括但不限于：氨基酸(例如组氨酸)、无机酸(例如选自由柠檬酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸和磷酸组成的组的酸)和碱金属或碱土金属的盐(例如钠盐、镁盐、钾盐、锂盐或钙盐—例如氯化钠、磷酸钠或柠檬酸钠)。此类赋形剂、缓冲剂和/或佐剂的实例包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)、磷酸钾、磷酸钠和/或柠檬酸钠。其他生物缓冲液包括PIPES、MOPS等。
合适的水性柠檬酸盐缓冲液可以是柠檬酸钠缓冲液或柠檬酸钾缓冲液，例如50mM柠檬酸钠缓冲液。合适的磷酸盐缓冲液可以是磷酸钠缓冲液，例如25mM磷酸钠缓冲液。
组合物的合适pH值包括用于体内施用的任何通常可接受的pH值，例如pH5.0至pH9.0，合适地为pH6.7至pH7.4，或pH6.8、pH6.9、pH7.0、pH7.2。可以用合适的酸或碱例如盐酸调节pH。
本发明的组合物可以配制为即用型水悬浮液，或者可以将组合物制备为冻干制剂。本发明的冻干制剂可以作为单独的剂型与还提供的合适的稀释剂、佐剂或赋形剂例如生理学上可接受的缓冲剂一起提供。如本文所述，此类组合物可另外包含因子VIII作为单独的剂型，或与如本文所述的胶体颗粒一起配制。通常，将提供一瓶冻干因子VIII(FVIII)和另一瓶用于重构的胶体颗粒(PEGLip)溶液。
胶体颗粒可以作为9％(w/v)总脂质的水性柠檬酸盐缓冲液悬浮液储存，适当地，颗粒可以作为7％、6％、5％、4％(w/v)总脂质的悬浮液储存。一旦知道患者所需的外源性因子VIII(FVIII)的浓度，如有必要，可以用50mM柠檬酸钠溶液稀释本体溶液，以调节胶体颗粒的浓度，以便在添加因子VIII(FVIII)时获得所需的胶体颗粒与因子VIII(FVIII)分子的比例。
因子VIII可以完全是外源性的并且在注射前用本发明配制，例如在具有抑制剂的重度血友病患者的情况下，对于这种用途，因子VIII可以衍生自血浆浓缩物或重组产生。可选择地，如果患者保留一定的自制因子VIII的能力(例如轻度或中度血友病患者，或患有获得性血友病的患者)，则将施用较少量的外源性因子VIII或不施用外源性因子VIII。
不希望受理论束缚，推测组合物中存在的过量胶体颗粒的量足以允许游离胶体颗粒可逆地结合其他核心血液因子(例如在A型血友病的情况下的FVII和FIX)，其与一定量的颗粒相关因子VIII(FVIII)可以在施用后被捕获并可逆地结合到血小板上，以将因子集中在血小板上并加强外在凝血途径。
注射后，胶体颗粒将可逆地结合到血小板表面并与其他血小板的膜融合。当胶体颗粒已经与外源性因子VIII结合时，这将使因子VIII集中在血小板表面，其中一些可能被吞噬到血小板中或与所产生的携带TF的促凝血微粒缔合或在所产生的携带TF的促凝血微粒内，从而保护蛋白质免受抑制剂和正常清除机制(例如LRP-1)的影响，赋予蛋白质更长的半衰期。在患有中度或轻度血友病的患者中，胶体颗粒还将捕获任何循环因子VIII，将其集中在血小板处或血小板内或产生的携带TF的促凝血微粒内。注射时不与因子VIII缔合的胶体颗粒将开始将FVII以及其他内源性血液因子(例如FIX)捕获并集中在血小板表面，并使它们与产生的任何携带TF的促凝微粒缔合；也可行的是，在凝血级联漩涡期间，没有附着因子的颗粒也将结合并融合到血小板表面，均形成携带TF的促凝血微粒，并充当机遇性陷阱(opportunistic traps)将更多因子(包括活化形式FVIIa和FIXa)捕获和集中在血小板反应表面。
通常，在内皮损伤时，组织因子将FVII转化为FVIIa并与其结合。然后，TF-FVIIa复合物朝向活化血小板的表面迁移并与其结合，并开始将FX转化为FXa，以裂解凝血酶原，生成凝血酶，该过程在FXa与FVIIa(从活化血小板中释放)复合形成凝血酶原酶复合物时得到优化，该凝血酶原酶复合物也在活化血小板和衍生自活化血小板的携带TF的促凝血微粒的暴露膜表面上组装。本发明将FVII放置在非常靠近该反应表面的位置，该反应表面可能已破碎成许多携带TF的促凝血微粒。因此，FVIIa的转化(其仍然与胶体颗粒结合，从而与血小板和微粒结合)和TF-FVIIa复合物的形成发生在血小板及其微粒的反应表面上，这具有两个重要且直接的影响：
1)FX局部转化为FXa(其与FV结合(“凝血酶原酶复合物”))，也发生在这些血小板和携带TF的促凝血微粒表面上，以产生高度局部的凝血酶爆发，这将启动纤维蛋白的产生，催化放大阶段；并且同时
2)FIX局部转化为FIXa，FIXa然后与FVIII缔合(FVIII已通过胶体颗粒共定位)以在相同的膜表面上形成tenase复合物，从而供给和优化已由来自上述(1)中当前增强的起始阶段的凝血酶催化的放大阶段。可选择地且另外地，胶体颗粒膜可以形成替代tenase复合物，吸引FX并将其转化为FXa。
一旦凝血级联启动并产生纤维蛋白，血小板通常会凝固以填充纤维蛋白网。胶体颗粒与血小板结合和融合的能力在增强血小板在网中的粘附以稳定凝块方面发挥着最终作用。
本发明可以多种方式起作用以在有限量的FVIII以及FVIII抑制剂存在下改善FX向FXa的转化。首先，通过保护、增强和最大化有限量的FVIII能够与FIXa形成tenase复合物而催化FX向FXa的转化的潜力；其次，通过模仿FVIIIa的作用和结合FIXa，提供替代tenase复合物，以催化FX向FXa的转化；再者，通过产生携带TF的促凝血微粒和通过集中FVII/FVIIa来上调外在途径，以刺激FX通过外在tenase复合物向FXa的转化；最后，通过上调的外在途径，增强FIX向FIXa的转化，以促进内在tenase复合物的形成。通过这些作用，本发明具有多种作用模式，即通过保护、保留和最大化内在途径的tenase复合物中的FVIII的活性，同时模拟tenase复合物中FVIIIa的功能性，并且同时通过上调外在途径绕过该途径。。
胶体颗粒具有双重作用，既作为旁路剂通过外在途径增强FX向FXa的转化，又通过保护FVIII和集中FIX/FIXa加速tenase复合物的形成或与FIXa形成不依赖于FVIII的tenase复合物，来放大内在途径。增强的起始(外在)和放大(内在)阶段共同实现了凝血的更快开始和纤维蛋白的更快生成，与通常因子VIII量减少(尤其是在存在抑制性抗体的情况下)相比，纤维蛋白可以结合成更坚硬的凝块，导致更快地解决患者的出血问题。
因此，本发明依赖于胶体颗粒的能力，特别是其胶体颗粒与因子VIII的具体配比，以将正确量的内源性和外源性因子VIII集中在血小板表面和血小板内部，以及刺激携带TF的促凝血微粒的产生，从而既优化凝血级联的以TF-FVIIa为中心的起始阶段和放大阶段，同时还具有在A型血友病的情况下在因子VIII抑制剂存在时用有限量的因子VIII加速凝血酶生成开始的协同效应。
由于注射的外源性因子VIII被保护而免遭抑制剂和正常清除机制导致的降解，以及由于通过将因子集中在血小板上以及携带TF的促凝微粒的加速作用而更快地形成质量更好的凝块，本发明将比提供因子VIII的其他方法更节约因子VIII，如通过基因治疗在血小板中产生异位FVIII所见。这种好处将体现在患者注射次数较少或频率较低，提高了对处方治疗的依从性，并降低了意外和可能致命的出血的可能性。
虽然本发明将外源性因子VIII和内源性因子(FVII/FVIIa和FIX/FIXa)集中在血小板处和血小板内，但与通过基因疗法在血小板中异位产生FVIII的成功尝试不同，本发明不需要长期开发计划、监管负担或病毒介导的转基因疗法的不可逆转性。
通过集中和放大在待治疗疾病中处于低于正常水平的有限量的因子VIII(例如在A型血友病(HA)的情况下的FVIII)的作用，预计本发明将节约因子VIII，能够降低血友病患者、特别是通常不能注射因子VIII(因为他们的抑制性抗体会破坏蛋白质并使它们不受保护)的抑制剂患者实现止血通常所需的注射剂量和/或减少注射次数。
与创建新的工程化因子VIII分子或这些分子或其活化形式的模拟物的方法不同，本发明可以与任何现有血浆衍生的因子VIII或重组因子VIII一起使用，而不需要将外来序列工程化到分子中，例如重组人FVIII(rhFVIII)。这降低了对新的、未被识别的蛋白质产生免疫调节反应的危险。
与这两种方法(即在血小板中产生FVIII或使用模拟物)不同，本发明具有新颖且非常必要的双重作用，不仅集中外在加速途径的外源性应用成分，而且还集中内源性因子并刺激携带TF的促凝血微粒的产生，以放大内在途径至快速凝血酶爆发以及外在途径的其他主要成分(FIXa)的局部生成，当因子VIII水平再次下降时，这可能会继续推动凝血酶产生的共同途径。
本发明的使用比游离因子VIII节约因子VIII。这意味着为患者带来更多便利(注射量更小)、更好的依从性(更少错过的预防性注射)和更好的医疗保健经济效益(因子VIII的成本更低，血友病患者已不依从并发生出血时的紧急输注更少)。
通过能够使用标准的血浆衍生形式的或重组产生形式的因子VIII，最终目标是本发明将使一种经济有效的解决方案能为可能，以能够在具有抑制剂的A型血友病患者中使用FVIII进行预防性治疗。
与在具有抑制剂的血友病患者中使用外源性FVIIa作为旁路剂相比，使用本发明是节约的。本发明不仅使用患者自身的FVII，而且将其集中在血小板上并刺激携带TF的促凝血微粒的产生，以最大限度地发挥FVII的有效性，从而避免了外源性FVIIa的成本和任何因过量给予该蛋白而引起血栓反应的顾虑。
该组合物可以通过注射或输注施用，优选静脉内、皮下、皮内或肌内施用。注射包括施用单剂量的组合物。输注包括在延长的时间内施用组合物。
本发明的组合物可以施用至少每天一次、至少每天两次、约每周一次、约每周两次、约每两周一次或约每月一次。组合物还可以间隔施用和/或重新给药，以允许FVIII的血液浓度维持在一致的水平，从而提供持续的、恒定的且可预测的治疗效果，而不需要等待重新给药直至患者血液中的FVIII浓度达到亚治疗水平或与治疗无关水平。在传统实践中，当血流中仍存在“健康水平”或治疗有效/相关水平的FVIII时，通常不会向对象施用后续剂量的FVIII。因此，本发明提供了血流中更一致的FVIII治疗水平，其更理想地适合于预防。
对象血液中FVIII的亚治疗水平或治疗无关水平可以表征为当患者不能维持20分钟或更少、15分钟或更少、或12分钟或更少的全血凝固时间时的水平。
本发明提供了一种组合物，其中患者能够维持不超过20分钟、不超过15分钟或不超过12分钟的全血凝固时间。
令人惊讶地发现，与用生物相容性聚合物衍生化的胶体颗粒(脂质体)缔合的血液因子制剂可以成功地皮下施用至患有血友病的对象，并对患有血友病的对象实现治疗有效剂量的血液因子。
在本发明的实施例中，在与血液因子缔合之前，在囊泡形成期间将PEG掺入胶体颗粒中。据信，血液因子上的特定氨基酸序列可以非共价结合至脂质体外部的PEG分子的氨基甲酸酯功能区。
胶体颗粒不包封血液因子。血液因子与脂质体外表面上的聚合物链非共价相互作用，并且不发生化学反应来活化聚合物链。血液因子和用生物相容性亲水聚合物衍生化的脂质体之间相互作用的性质可以是通过任何非共价机制例如离子相互作用、疏水性相互作用、氢键和范德华吸引力实现的(Arakawa,T.and Timasheff,S.N.,Biochemistry 24:6756-6762(1985)；Lee,J.C.and Lee,L.L.Y.,J.Biol.Chem.226:625-631(1981))。这种聚合物的一个例子是聚乙二醇(PEG)。
各种已知的偶联反应可用于制备用亲水聚合物衍生化的囊泡形成脂质。例如，可以通过三聚氯氰基团将聚合物(例如PEG)衍生化为脂质，例如磷脂酰乙醇胺(PE)。或者，可以用羰基二咪唑偶联剂活化封端的PEG，以形成活化的咪唑化合物。氨基甲酸酯连接的化合物可以通过以下来制备：将MPEG(甲氧基PEG)的末端羟基与对硝基苯基氯甲酸酯反应，以得到对硝基苯基碳酸酯。然后将该产物与1-氨基-2,3-丙二醇反应，得到中间物氨基甲酸酯。将二醇的羟基基团酰化以得到最终产物。如WO 01/05873中所述，使用甘油代替1-氨基-2,3-丙二醇进行类似合成，可用于生产碳酸酯连接的产物。其他反应也是熟知的并在例如US5,013,556中进行了描述。
可根据各种参数对胶体颗粒(脂质体)进行分类。例如，当使用薄片的尺寸和数量(结构参数)作为参数时，可以描述三种主要类型的脂质体：多层囊泡(MLV)、小单层囊泡(SUV)和大单层囊泡(LW)。
MLV是干磷脂在其凝胶至液晶相变温度(Tm)以上水合时自发形成的物种。MLV的尺寸是不均匀的，并且其结构类似于交替的同心水层和脂质层的洋葱皮。
SUV是从MLV通过声处理或其他方法例如挤出、高压均化或高剪切混合形成的，并且是单层的。它们是具有高的表面积-体积比值的最小物种，因此具有最低的储水空隙捕获体积-脂质重量的比。
第三类脂质体LUV具有大的含水隔室和单个(单层)或仅少数(寡层)脂质层。在D.Lichtenberg和Y.Barenholz的“Liposomes:Preparation,Characterization,andPreservation,in Methods of Biochemical Analysis”,Vol.33,pp.337–462(1988)中公开了进一步细节。
如本文所用，术语“装载”意指生物聚合物质被装载的任何类型的相互作用，例如，诸如包封、粘附(至囊泡的内壁或外壁)或嵌入壁中(伴随或不伴随生物聚合物质的挤出)的相互作用。
如本文所用和上文所指出的，术语“脂质体”是指胶体颗粒，并且意在包括任何可以自发或非自发发泡的两亲性化合物的全部球体或囊泡，例如至少一个酰基基团被复合磷酸酯取代的磷脂。脂质体可以在玻璃态到液晶的任何物理状态中存在。大多数三酰甘油酯是合适的，并且适用于本发明的最常见的磷脂是卵磷脂(也称为磷脂酰胆碱(PC))，其是连接至磷酸胆碱酯的硬脂酸、棕榈酸和油酸的甘油二酯的混合物。卵磷脂存在于所有动物和植物中，例如鸡蛋、大豆和动物组织(脑、心脏等)，也可以合成生产。磷脂的来源或其合成方法不是至关重要的，可以使用任何天然存在的或合成的磷脂。
具体的磷脂的例子为：L-a-(二硬脂酰)卵磷脂、L-a-(二棕榈酰)卵磷脂、L-a-磷脂酸、L-a-(二月桂酰)磷脂酸、L-a(二肉豆蔻酰)磷脂酸、L-a(二油酰)磷脂酸、DL-a-(二棕榈酰)磷脂酸、L-a(二硬脂酰)磷脂酸和从脑、肝脏、蛋黄、心脏、大豆等制备或合成制备的各种类型的L-a-磷脂酰胆碱及其盐。其他合适的修饰包括磷脂酰胆碱(PC)和两性离子两亲物中的脂肪酰基残基交联剂的受控过氧化，两性离子两亲物自身或与诸如PC的烷基类似物的PC混合时形成胶束。
磷脂的纯度可以变化，也可以完全或部分氢化。氢化降低不需要的过氧化的水平，并且修饰和控制凝胶至液相/结晶相转变温度(Tm)，该温度影响包装和渗漏。
脂质体可以根据包括各种生物流体在内的任何特定储液囊的要求进行“调整”，维持其稳定性而不发生聚集或色谱分离，并在注入流体中保持良好分散和悬浮。原位流动性由于组成、温度、盐度、二价离子以及蛋白质的存在而改变。脂质体可以与或不与任意其他溶剂或表面活性剂一起使用。
一般合适的脂质可具有特有的酰基链组合物，至少对于鸡蛋或大豆PC中酰基链组分的转变温度(Tm)而言，即一条饱和链和一条不饱和链或两条不饱和链。但是，不排除使用两条饱和链的可能性。
脂质体可以含有其他脂质组分，只要它们不会引起不稳定性和/或聚集和/或色谱分离。这可以通过常规实验确定。
PEG化磷脂可以物理地附着于胶体颗粒的表面或插入到胶体颗粒的膜中。因此，聚合物可以共价结合至胶体颗粒。
用于生产单层或多层的修饰胶体颗粒的各种方法是已知的且可获得的(参见Lichtenberg and Barenholz,(1988))：
1、将磷脂薄膜与水介质水合，随后通过合适的过滤器进行机械振荡和/或超声波照射和/或挤压；
2、将磷脂溶解在合适的有机溶剂中，与水介质混合，然后除去溶剂；
3、使用临界点以上的气体(即，氟利昂和其他气体，例如CO2或CO2和其他气态烃的混合物)或
4、制备脂质洗涤剂混合胶束，然后将洗涤剂的浓度降低至低于脂质体形成的临界浓度的水平。
通常，这些方法产生不均匀尺寸为约0.02至10μm或更大的胶体颗粒。由于本发明优选使用尺寸较小且尺寸明确定义的胶体颗粒，因此定义为“胶体颗粒尺寸减小”的第二加工步骤可以用于减小胶体颗粒悬浮液的尺寸和尺寸不均匀性。
可以调整胶体颗粒悬浮液的尺寸以实现尺寸范围小于约5μm，例如＜0.4μm的囊泡的选择性尺寸分布。在本发明的一个实施例中，胶体颗粒的平均粒度为约0.03至0.4或0.05至0.15微米(μm)，合适地约0.1微米(μm)。
通过合适的过滤器过滤可以容易地对在这个范围内的胶体颗粒进行杀菌。储存时较小的囊泡也显示出较小的聚集趋势，从而当静脉或皮下注射脂质体时潜在地减少严重的阻塞或堵塞问题。最后，尺寸降至亚微米范围的脂质体显示出更均匀的分布。
有几种技术可用于以适合于本发明的方式减小胶体颗粒的尺寸和尺寸不均匀性。通过标准浴或探针超声处理对胶体颗粒悬浮液进行超声波照射，使尺寸逐渐减小至尺寸为0.02和0.08μm之间的小单层囊泡(SUV)。
均化是另一种依赖于剪切能将大胶体颗粒破碎为较小胶体颗粒的方法。在一个典型的均化过程中，通过标准乳液均化器将胶体颗粒悬浮液再循环，直至观察到选择的脂质体尺寸(通常在约0.1和0.5μm之间)。在两种方法中，可以通过传统的激光束粒度测定来监测粒度分布。
通过小孔聚碳酸酯过滤器或等效膜来挤压胶体颗粒也是降低胶体颗粒尺寸的一种有效方法，将其尺寸降低至相对明确的尺寸分布，其平均范围在约0.02和5μm之间(取决于膜的孔径)。
通常，使悬浮液循环通过一层或两层堆叠的膜几次，直到获得期望的胶体颗粒尺寸分布。可以挤压胶体颗粒使其通过孔依次减小的膜以实现脂质体尺寸的逐渐减小。
离心和分子筛色谱法是可用于生产颗粒尺寸低于选择阈值(小于1μm)的脂质体悬浮液的其他方法。这两种方法都涉及优先除去大脂质体，而不是将大颗粒转化为较小的颗粒。相应地降低了胶体颗粒产量。
将经尺寸加工的胶体颗粒悬浮液通过颗粒分辨尺寸为约0.4μm的杀菌膜，例如常规的0.45μm深度的膜过滤器，可容易地对其进行杀菌。脂质体在冻干形式下是稳定的，并且可以在使用前不久通过放入水中而重构。
上面描述了用于形成胶体颗粒的合适的脂质。合适的例子包括但不限于，例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和/或二肉豆蔻酰-磷脂酰甘油(DMPG)的磷脂，以及在部分或完全纯化后直接或随后进行部分或完全氢化后获得的鸡蛋和大豆衍生化的磷脂。
WO 95/04524中描述了以下四种方法，并且一般适用于制备根据本发明使用的胶体颗粒(脂质体)。
方法A
a)混合两亲性物质，例如适合在与水不混溶的有机溶剂中形成囊泡的脂质；
b)在固体载体存在的情况下除去溶剂，或者可以以任何形式(粉末、粒状等)直接使用干燥的两亲性物质或其混合物；
c)将步骤b)的产物放入生物聚合物质在生理相容性溶液中的溶液中；
d添加具有增溶或分散性能的有机溶剂；以及
e)在保持生物聚合物质的功能的条件下干燥步骤d)中获得的部分。
根据方法A的步骤a)，将如上所述的适于形成囊泡的两亲性物质在与水不混溶的有机溶剂中混合。与水不混溶的有机溶剂可以是极性质子溶剂，例如氟化烃、氯化烃等。
在本发明方法的步骤b)中，在固体载体存在的情况下下除去溶剂。固体载体可以是具有珠状结构的惰性有机或无机材料。无机载体材料的材料可以是玻璃，有机材料可以是TeflonTM或其他类似的聚合物。
本发明的方法A的步骤c)用于将步骤b)的产物放入待包封的物质在生理相容性溶液中的溶液中。
生理相容性溶液可以等同于重量高达约1.5的氯化钠溶液。也可以使用其他盐例如作为冷冻保护剂，例如糖和/或氨基酸，只要它们是生理上相容的即可。例如，乳糖、蔗糖或海藻糖可以用作冷冻保护剂。
可选地，在步骤a)和b)之间可以设置病毒灭活、杀菌、除热原、过滤步骤a)的部分等的步骤。为了在制备的早期阶段获得药学上可接受的溶液，这可能是有利的。
方法A的步骤d)是添加具有增溶或分散性能的有机溶剂。
有机溶剂可以是与水混溶的有机极性质子溶剂。也可以使用烷基链中具有1至5个碳原子的低级脂肪醇，例如叔丁醇(tert-butanol)。与水混溶的有机极性质子溶剂的量很大程度上取决于其对装载至脂质体的物质的干扰。例如，如果要装载蛋白质，则上限由蛋白质活性受到影响的溶剂量设定。这可能会因待装载物质的性质而有很大差异。例如，如果凝血因子包含因子IX，则叔丁醇的量约为30％，而对于因子VIII，叔丁醇的量小于10％是合适的(因子VIII对叔丁醇的影响更敏感)。这些实施例中叔丁醇的百分比是基于针对最终浓度计算的体积百分比。
可选地，在步骤d)之后，可以对步骤d)之后得到的部分进行病毒灭活、杀菌和/或分份。
本发明的步骤e)是在保持待装载物质的功能的条件下干燥步骤d)中获得的部分。一种干燥混合物的方法是冻干。冻干可以在冷冻保护剂(例如乳糖或其他糖类或氨基酸)存在的情况下进行。或者，可以使用蒸发或喷雾干燥。
然后可以在使用前将干燥的剩余物放入水介质中。在放入固体后，其形成各个脂质体的分散体。水介质可以含有盐水溶液，并且所形成的分散体可以任选地通过合适的过滤器，以便在需要时减小脂质体的尺寸。合适地，脂质体可以具有0.02至5μm的尺寸，例如在＜0.4μm的范围内。
通过方法A可获得的脂质体显示出高的血液因子装载量。
本发明的组合物也可以是通过分离方法A的步骤c)或步骤d)的部分可获得的中间产物。因此，本发明的制剂还包含将方法A的步骤e)的产物放入到分散体形式的水中之后可获得的水分散体(水介质中的脂质体)。
或者，本发明的药物组合物也可以通过称为方法B、C、D和E的以下方法获得。
方法B
该方法也包括方法A的步骤a)、b)和c)。然而，省略方法A的步骤d)和e)。
方法C
在方法C中，用必须重复至少两次的冷冻和解冻循环取代方法A的步骤d)。该步骤是现有技术中公知的制备脂质体的步骤。
方法D
方法D不包括使用任何渗透组分。在方法D中，涉及囊泡的制备，混合待装载物质的基本上不含盐的溶液并且将如此获得的部分进行共干燥的步骤。
方法E
方法E比上述方法A-D简单。它需要将用于脂质体制备的化合物(脂质抗氧化剂等)溶解在与水混溶的极性质子溶剂(例如叔丁醇)中。然后将该溶液与含有血液因子的水溶液或水分散体混合。以维持药剂的生物和药理活性所需的最佳体积比进行混合。
然后在存在或不存在冷冻保护剂的情况下，冻干混合物。在使用脂质体制剂之前需要进行再水合。这些脂质体是多层的，其尺寸减小可以通过WO 95/04524中描述的方法之一来实现。
本发明第一方面的用于治疗对象的A型血友病的组合物可以用于已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天的对象。例如，对象可以从未接受过因子VIII(FVIII)治疗，这样的患者被称为先前未治疗患者(PUP)。例如，对象可以已经每隔一天接受因子VIII(FVIII)治疗总共98天，因此已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数为49天。
先前未治疗患者(PUP)被定义为从未接受过因子VIII(FVIII)治疗的对象。PUP产生针对外源性FVIII的中和抗体的风险最高。这种先前未治疗患者也称为未治疗患者或未接受过(to)因子VIII(FVIII)治疗的患者。
最低限度治疗患者(MTP)被定义为已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天的对象。MTP也面临产生针对外源FVIII的中和抗体的风险。
先前已治疗患者(Previously treated patient，PTP)被定义为已接受大于或等于50天暴露天数的因子VIII(FVIII)治疗的对象。PTP不太可能产生针对外源性FVIII的中和抗体。
本发明第一方面的用于治疗对象的A型血友病的组合物可以用于儿科对象。欧盟(EU)将儿科患者定义为人群中从出生至18岁的部分。儿科人群包含几个子集。儿科患者的应用年龄分类是：
·0至27天的早产儿和足月新生儿；
·1个月至23个月的婴儿(或幼儿)；
·2岁至11岁的儿童；和
·12岁至低于18岁的青少年。
(参见http://ec.europa.eu/health/sites/health/files/files/eudralex/ vol-1/2014_c338_01/2014_c338_01_en.pdf)。
A型血友病可以是先天性A型血友病(cHA)或获得性A型血友病(aHA)。先天性血友病是一种遗传性出血性疾病，其特征是凝血因子VIII缺失或水平降低。获得性血友病是一种自身免疫性疾病，其在没有任何个人或家族出血史的个体中突然产生自身抗体抑制剂。身体会产生针对A型血友病因子VIII的自身抗体。
PUP或MTP还可具有少于5Bethesda单位的FVIII抑制剂(抗体)活性，即患者可已检测出FVIII抑制剂(抗体)存在呈阳性。因此，根据本发明，可以测试患者的FVIII抑制剂(FVIII抗体)的存在。使用Bethesda方法对患者血液中的抗体抑制剂进行定量，在谈论患者体内的抑制剂(抗体)水平时，常见的说法是使用“Bethesda单位”。FVIII抑制剂值大于5Bethesda单位被认为是高滴度抑制剂(参见：https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-clinical-investigation-recombinant-human-plasma-derived-factor-viii-products-revision-2_en.pdf)。
本发明第一方面的用于治疗对象的A型血友病的组合物还可用于治疗具有小于5Bethesda单位的FVIII抑制剂(抗体)活性的对象。
Bethesda单位(BU)是凝血抑制剂活性的量度。根据“Practical Haemostasis”：“1Bethesda单位(Bu)定义为血浆样品中，在37℃下孵育2小时后将中和正常血浆中1个单位的因子VIII:C的50％的抑制剂的量。”(Schumacher,Harold Robert(2000).Handbook ofHematologic Pathology.Informa Health Care,p.583)。1个单位的因子VIII等于1IU/mL因子VIII。
Bethesda测定基于测量测试血浆稀释后剩余的残余FVIII活性。该测定需要对在37℃下孵育2小时的测试血浆和正常血浆的测试混合物与正常血浆和缓冲液的对照混合物进行比较。将测试混合物中的残余活性百分比转换为Bethesda单位(BU)。
Bethesda测定按如下方式进行：
1、在咪唑缓冲盐水中对测试(患者)血浆进行双倍稀释[通常为1/2-1/1024]，并与等体积的正常血浆池一起在37℃下孵育。在Nijmegen改良中，患者血浆的稀释是在因子VIII缺乏血浆中进行的。
2、制备对照混合物，其由等体积的正常血浆与咪唑缓冲盐水(或在Nijmegen改良的情况下，免疫耗尽的因子VIII缺乏血浆)混合组成。正常血浆池将含有约100％[100IU/dL]的因子VIII。该混合物实际上具有50％[50IU/dL]因子VIII的起始浓度(因为您已使用缓冲液进行了50:50稀释)，但这并不重要，因为所有孵育混合物中都添加了相同的源和体积。使用对照补偿孵育期中因子VIII和V的劣化。
3、孵育期结束时，使用基于标准1阶段APTT的测定法，用孵育对照作为100％[100IU/dL]标准品，对残留因子VIII进行测定。
4、抑制剂浓度根据残余因子VIII活性与抑制剂单位的关系图计算。选择残留因子VIII最接近50％但在30-60％范围内的测试血浆稀释度来计算抑制剂。还可以计算每个稀释度的抑制剂滴度并取平均值。任何＜25％[25IU/dL]或＞75％[75IU/dL]的残余因子VIII不应被用于计算抑制剂水平。
5、如果残余因子VIII活性在80-100％[80-100IU/dL]之间，则样品不含抑制剂。
6、从图中得出抑制剂滴度并乘以稀释度得到最终滴度。应包括已知抑制剂滴度的阳性对照血浆。
凝血级联中的活性水平可以通过任何合适的测定来测量，例如全血凝血时间(WBCT)测试、活化部分凝血活酶时间(APTT)或ROTEM。在一级和二级/显色测定中，必须通过离心来制备血液样品以去除细胞碎片，主要是因为测定方法涉及分光光度法，因此样品需要是澄清的。下面的整体凝血测定评估了凝块物理形成的时间进程，因此更接近“现实生活”，因为包括了促成凝块的所有成分，例如血小板。
全血凝血时间(WBCT)测试测量全血在外部环境(通常是玻璃管或皿)中形成凝块所花费的时间。WBCT可以通过采集后立即取出2ml全血并分入两个玻璃管来评估。然后将这两个管放入37℃水浴中，大约每20-30秒轻轻倾斜检查一次。当试管可以水平翻转并且没有血浆流出且保留固体凝块时，就确定有凝块。
活化部分凝血活酶时间(APTT)测试测量凝血途径的部分的参数。它在血友病中异常升高(通过静脉注射肝素治疗)。APTT需要从静脉取几毫升血液。APTT时间是称为“内在途径”的凝血系统的一部分的量度。APTT值是在实验室测试中发生特定凝血过程的时间，以秒为单位。常常将该结果与正常血液的“对照”样品相比较。如果测试样品比对照样品需要更长的时间，则表明内在途径中的凝血功能降低。一般医学疗法通常针对45至70秒量级的APTT范围，但是该值也可以表示为测试与正常的比值，例如正常的1.5倍。不存在肝素治疗的情况下的高APTT可能是由于血友病，这可能需要进一步的测试。
ROTEM(旋转血栓弹力测定法)使用ROTEM Delta 2.7.2系统通过NATEM测定(仅通过再钙化活化)评估血液样品的凝固性。为了测量，将20uL CaCl2和340uL柠檬酸盐全血样品放置在装置中。该测定在采集新鲜血液样品后15分钟内进行。该测定提供了凝块形成过程中的一系列统计数据，包括凝血时间(CT—血液开始凝固的时间)、凝块形成时间(CFT—达到最大凝块硬度的时间)等。
本发明提供了一种组合物，其能够使对象维持小于20分钟、少于15分钟、或者适当地少于12分钟的全血凝固时间。
下面描述了用于评估FVIII浓度的显色测定(有时称为“两阶段测定”)。
FVIII血浆活性可使用Chromogenix Coamatic因子VIII显色测定(Diapharma，K822585)来确定，其中对所提供的方法进行了如下修改：
i.在FVIII标准制剂中包含一定量的初始血浆，以实现与血浆样品稀释液的可比性，
ii.使用特定于各测试物品的FVIII标准(NuwiqTM或FactaneTM)，
iii.在两个标准曲线范围内包含额外的FVIII活性值。
NuwiqTM和FactaneTM FVIII标准储备液的制备：
一小瓶各测试物品可以用纯化水重构为100IU/ml，以小等分试样在-70℃下冷冻保存，并在测定当天将等分试样在37℃下解冻。适合研究测试品的储备溶液用于分析相应的血浆样品。
大概测定方法如下：
1、一小瓶Technoclone因子VIII缺乏血浆(天然；Diapharma 5154007)用1ml纯净水新鲜重构；
2、通过将0.010mL适当的FVIII标准储备溶液(100IU/ml)添加到0.990mL FVIII缺乏血浆中来新鲜制备FVIII标准工作储备溶液(1IU/mL)；
3、Coamatic试剂盒Factor试剂、S-2765+I-2581底物和缓冲工作液按照试剂盒说明书配制并预热至37℃；
4、配制20％乙酸终止液；
5、使用适合于研究样品的FVIII范围(参见表1和2)，由FVIII工作储备液(1IU/ml)制备标准曲线；
6、将各测试血浆样品的一个等分试样在37℃下快速解冻；
7、25μl解冻的测试血浆样品用2000μl缓冲工作溶液稀释；
8、根据板图(plate map)将50μl稀释的FVIII标准品和稀释的测试血浆样品添加到96孔板的孔中，并在37℃下孵育4分钟；
9、将50μl Factor试剂添加到各孔中，并在37℃下孵育2分钟(高范围标准曲线)或在37℃下孵育4分钟(低范围标准曲线)；
10、将50μl S-2765+I-2581底物添加到各孔中，并在37℃下孵育2分钟(高范围标准曲线)或在37℃下孵育10分钟(低范围标准曲线)；
11、每孔加入50μl 20％乙酸终止液。孔中的颜色变成黄色，并通过酶标仪在405nm的吸光度处测量光密度；
12、使用最佳拟合线性曲线根据405nm处吸光度绘制FVIII标准活性(IU/ml)；
13、根据标准曲线读取测试血浆样品吸光度并以IU/ml报告FVIII活性；
14、由每个时间点的3个小鼠测试血浆样品计算出平均(和中位数，在个别研究中指出)FVIII活性结果并对数据进行药代动力学分析。
评估FVIII浓度的进一步测试包括：
FVIII显色活性测定
使用Biophen FVIII:C Assay Kit Ref#221406与在测定缓冲液中按1:10稀释的血浆样品，并相对于NuwiqTM和人血浆参考标准曲线运行。每条曲线都是通过在犬FVIII缺乏血浆中连续稀释FVIII，然后在测定缓冲液中进行1:10稀释来生成的。两条曲线的标准范围均为0.003-0.4U/mL，线性范围为0.13-1.00U/mL。按照试剂盒方案进行测定。
一阶段因子VIII测定–Siemens BCS-XP系统
根据犬FVIII参考曲线测量样品，该曲线是使用在含有2.5％犬FVIII缺乏血浆的Owren's Veronal缓冲液中稀释的正常犬混合血浆生成的。曲线的范围是5-200％。将血浆样品在Owren's Veronal缓冲液中按1:10稀释，与FVIII缺乏血浆混合，然后添加肌动蛋白FS。孵育3分钟后，开始用CaCl2活化，并在405nm处测量凝血时间。
根据上述第二方面，治疗对象的A型血友病的方法包括施用包含胶体颗粒的组合物的步骤。该胶体颗粒包含：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组。第二两亲脂质包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。该对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。
生物相容性亲水聚合物可以选自由聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸组成的组，优选地，生物相容性亲水聚合物是聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇可具有约500至约5000道尔顿的分子量，优选约2000道尔顿或5000道尔顿。
磷脂酰胆碱(PC)可以是1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)。
第二两亲脂质可以是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG)，例如N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG2000)或N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG5000)。
胶体颗粒还可以包含(iii)非离子表面活性剂。
该组合物还可以包含因子VIII(FVIII)分子。可替代地，该方法可以包括单独或随后施用包含因子VIII(FVIII)分子的组合物的额外步骤。
包含胶体颗粒的组合物和包含因子VIII的组合物可以作为治疗方案的一部分施用。合适地，可以将包含因子VIII的组合物施用于患者，并且15、30、45、60、90、120、15至120、15至60、15至30分钟后，将包含胶体颗粒的组合物施用于患者。包含胶体颗粒的组合物和包含因子VIII的组合物可以间隔施用和/或重新给药，以允许FVIII的血液浓度维持在一致的水平，从而提供持续的、恒定的且可预测的治疗效果，而不需要等待重新给药直至患者血液中的FVIII浓度达到亚治疗水平或与治疗无关水平，适当地每2、3、4、5、6、7、14、21天，例如2天至21天、4至14天、4至7天进行。例如，可以在向患者施用包含胶体颗粒的组合物之前15分钟向患者施用包含因子VIII的组合物，每4至5天重复两个施用步骤。
可选择地，包含胶体颗粒和因子VIII的组合物可以间隔施用和/或重新给药，以允许FVIII的血液浓度维持在一致的水平，从而提供持续的、恒定的且可预测的治疗效果，而不需要等待重新给药直至患者血液中的FVIII浓度达到亚治疗水平或与治疗无关水平，适当地每2、3、4、5、6、7、14、21天，例如2天至21天、4至14天、4至7天进行。
这样的治疗方案减少了治疗患有A型血友病的患者所需的FVIII的量。
A型血友病可以是先天性A型血友病(cHA)或获得性A型血友病(aHA)。
对象可以是儿科患者。对象也可以未接受过FVIII治疗。
本发明还包括包含胶体颗粒的组合物在制造用于治疗对象的A型血友病的药物中的用途，其中对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。
根据上述第三方面，用于治疗对象的A型血友病的试剂盒包括：(i)包含胶体颗粒的组合物，和(ii)包含因子VIII(FVIII)分子的组合物。该对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。该胶体颗粒包括：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组。第二两亲脂质包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。
本发明的冻干制剂可以作为单独的剂型与还提供的合适的稀释剂、佐剂或赋形剂例如生理学上可接受的缓冲剂一起提供。试剂盒的胶体颗粒和/或因子VIII(FVIII)可以以冻干制剂的形式提供。或者，试剂盒的因子VIII(FVIII)可以冻干制剂的形式提供，而胶体颗粒可以作为用于重构因子VIII(FVIII)的溶液提供。如本文所述，此类组合物可另外包含因子VIII作为单独剂型，或与如本文所述的胶体颗粒一起配制。FVIII的冻干形式可以以500IU小瓶的形式提供。试剂盒的胶体颗粒和/或因子VIII(FVIII)可以以即用型水性形式提供。
胶体颗粒还可以包含非离子表面活性剂。
该试剂盒还可选地包括使用说明书。
根据上述第四方面，用于治疗对象的血友病的试剂盒包括用于单独、同时或随后使用的(i)包含胶体颗粒的组合物，和(ii)包含因子VIII(FVIII)分子的组合物。该对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。该胶体颗粒包括：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组。第二两亲脂质包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。
本发明的冻干制剂可以作为单独的剂型与还提供的合适的稀释剂、佐剂或赋形剂例如生理学上可接受的缓冲剂一起提供。试剂盒的胶体颗粒和/或因子VIII(FVIII)可以以冻干制剂的形式提供。或者，试剂盒的因子VIII(FVIII)可以冻干制剂的形式提供，而胶体颗粒可以作为用于重构因子VIII(FVIII)的溶液提供。如本文所述，此类组合物可另外包含因子VIII作为单独剂型，或与如本文所述的胶体颗粒一起配制。FVIII的冻干形式可以以500IU小瓶的形式提供。试剂盒的胶体颗粒和/或因子VIII(FVIII)可以以即用型水性形式提供。
胶体颗粒还可以包含非离子表面活性剂。
该试剂盒还可选地包括使用说明书。
根据上述第五方面，用于治疗对象的血友病的药物组合物的剂型包含胶体颗粒，所述胶体颗粒包含：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，其中所述第二两亲脂质包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。该对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。
胶体颗粒还可以包含非离子表面活性剂。
剂型可以作为含有适合患者的剂量的合适容器或小瓶提供，例如提供为250IU、500IU、750IU或1000IU小瓶。该剂型还可以提供为片剂或液体形式。该剂型还可以是冻干形式。
本发明所证明的令人惊奇的技术效果是通过掩蔽通常会引发免疫反应并随后产生抗FVIII抗体的FVIII表位来实现的。
不希望受理论束缚，认为这些益处源自PEGLip与FVIII的A3结构域的非共价缔合，从而遮蔽FVIII的轻链结构域中的表位不被身体的免疫系统识别；和/或阻止树突状细胞对FVIII的内吞作用。额外PEG的引入提供了额外的结合位点，可能将FVIII集中在脂质体上。
额外的PEG提供了更大的水合球，从而为缔合的FVIII提供更大的遮蔽，使其免受正常清除机制的影响，从而通过增加FVIII的循环半衰期来延长止血控制的时间。更大的遮蔽还可以更好地遮蔽FVIII上的表位免受抗体抑制剂的影响，从而促进该产品在具有FVIII抑制剂(抗体)的患者中的使用。
脂质体与FVIII的A3结构域区域的结合使FVIII的C1和C2结构域自由结合VWF，从而提供了额外的保护。
据信，携带FVIII的PEG化脂质体的融合将与血小板融合或被血小板摄取，并且可能在血小板的活化中发挥作用，产生携带组织因子的促凝血微粒，该携带组织因子的促凝血微粒可以上调外在途径并加速凝块形成。向脂质体中引入额外的携带PEG的脂质或表面活性剂可能会破坏血小板膜的稳定性并进一步加速这种活化。
这种效应在重组FVIII分子中更为明显，这些分子通常不与会天然地保护野生型FVIII中的这些表位的VWF一起施用。
除了保护表位之外，与PEGLip的缔合还可以通过保护FVIII免受正常蛋白水解清除机制的影响、延长给药间隔并减少患者随时间推移对FVIII的总暴露来延长FVIII的半衰期。
令人惊讶的观察结果描述如下：
设计了一项临床试验来检查PEGLip+FVIII在具有抑制剂的患者中的使用情况，希望该组合能够阻止现有抗体攻击FVIII。除了具有现有抗体的患者外，还包括一些在接受FVIII时有产生抗体史但目前未表现出抗体的患者。
令人惊讶地发现，当给予胶体颗粒与FVIII分子比例为15:1至16:1的PEGLip+FVIII组合时，这些患者没有产生新的抗体，这意味着PEGLip能够遮挡表位免受树突/B细胞的影响和/或阻止FVIII的内吞作用。
还在A型血友病狗中进行了一项实验，其中涉及静脉内注射PEGLip+人FVIII作为对照，其中胶体颗粒与FVIII分子的比例为15:1至16:1。此类实验通常很困难，因为动物的免疫系统会通过产生抗体来自然地对外源(人)蛋白质做出反应。令人惊讶的是，在这种情况下，当在PEGLip存在的情况下施用至动物时，动物并没有产生针对人蛋白质的抗体。
因此，使用PEGLip与FVIII组合防止在以下对象中产生抗体：
·具有抗体产生史且应已产生针对所应用的rFVIII的抗体的对象；
·当将外源蛋白(rFVIII)与PEGLip结合使用时的非人对象。
因此，如果PEGLip+FVIII不能在从病史上看容易表现出这种反应的患者/对象中激发抗体反应，则在从未产生过FVIII抗体的先前未治疗对象(几乎全部是儿科对象)中使用PEGLip+FVIII应预防抑制物患者的发生率。
根据本发明制备并测试以下样品：
1.一系列胶体颗粒(PEGLip)，其包含较高比例的DSPE-PEG比POPC，其中PEG是PEG-2000。
2.一系列胶体颗粒(PEGLip)，其包含一定比例的DSPE-PEG与POPC，其中PEG是PEG-5000。
3.根据第1点和第2点的胶体颗粒，还包含聚山梨醇酯80。
4.一系列胶体颗粒(F-PEGLip)，其包含较高比例的DSPE-PEG比POPC和/或高分子量PEG。
在某些实施方式中，提供以下制剂：
15-16:1制剂
PEGLip颗粒由以下组成：在具有FVIII(NuwiqTM，Octapharma AG)的9％悬浮液中，在50mM柠檬酸钠缓冲液中1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG(2000))的摩尔比为97:3，其中PEGLip颗粒与FVIII分子的比例为15-16:1。
7-8:1制剂
PEGLip颗粒由以下组成：在具有FVIII(NuwiqTM，Octapharma AG)的9％悬浮液中，在50mM柠檬酸钠缓冲液中1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG(2000))的摩尔比为97:3，其中PEGLip颗粒与FVIII分子的比例为7-8:1。
在替代实施方式中，提供以下制剂：
15-16:1制剂
PEGLip颗粒由以下组成：在用FVIII(NuwiqTM，Octapharma AG)配制的9％悬浮液中，在50mM柠檬酸钠缓冲液中1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG(2000))的摩尔比为97:3，POPC和DSPE-PEG(2000)与聚山梨醇酯80的比例(POPC+DSPE-PEG(2000):聚山梨醇酯80)为9:1w/w聚山梨醇酯聚山梨醇酯，其中PEGLip颗粒与FVIII分子的比例为15-16:1。
7-8:1制剂
PEGLip颗粒由以下组成：在具有FVIII(NuwiqTM，Octapharma AG)的9％悬浮液中，在50mM柠檬酸钠缓冲液中1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG(2000))的摩尔比为97:3，POPC和DSPE-PEG(2000)与聚山梨醇酯80的比例(POPC+DSPE-PEG(2000):聚山梨醇酯80)为9:1w/w聚山梨醇酯聚山梨醇酯，其中PEGLip颗粒与FVIII分子的比例为7-8:1。
在本发明的一个具体实施方式中，提供了一种用于治疗对象的A型血友病的组合物，其中该对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天，组合物如下：
·由以下组成的胶体颗粒：包含磷脂酰胆碱部分的第一两亲脂质，和包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，第一两亲脂质和第二两亲脂质的比例为97:3摩尔比(9:1w/w)，例如，97:3摩尔比的1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG2000)，或重量校正比例(如果使用较重的PEG化脂质的当量摩尔比)，例如重量比为4:1和5:1的1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG5000)。
·稀释剂，例如缓冲液(适当地处于生理学可接受的pH，例如pH6.5至7.2)，例如柠檬酸盐缓冲液，可选地浓度为50mM。
在替代实施方式中，提供了一种用于治疗对象的A型血友病的组合物，其中该对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天，组合物如下：
·由以下组成的胶体颗粒：包含磷脂酰胆碱部分的第一两亲脂质，和包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，第一两亲脂质和第二两亲脂质的比例为97:3摩尔比(9:1w/w)，例如，97:3摩尔比的1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG2000)，或重量校正比例(如果使用较重的PEG化脂质的当量摩尔比)，例如重量比为4:1和5:1的1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG5000)。胶体颗粒还包含选自由聚氧乙烯山梨醇酐、聚羟基乙烯硬脂酸酯和聚羟基乙烯月桂基醚组成的组的非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯。
·稀释剂，例如缓冲液(适当地处于生理学可接受的pH，例如pH6.5至7.2)，例如柠檬酸盐缓冲液，可选地浓度为50mM。
本发明的第二方面和后续方面的优选特征与第一方面相同，并加以必要的修改。
现在将参考以下实施例描述本发明，这些实施例仅用于说明的目的并且不应被解释为对本发明的限制。还参考以下附图，其中：
图1示出了半衰期延长的FVIII的静脉内给药相比于皮下施用的FVIII。半衰期延长的FVIII的静脉内给药会浪费FVIII(10％线以上的阴影区域)，或使患者处于FVII亚治疗水平(10％线以下的阴影区域)。使用皮下递送的储库(depot)可以使循环FVIII达到更经济且更安全的平台期。需要半衰期和相对生物利用度来确定合适的SC给药方案(剂量大小和频率)。
实施例
实施例使用以下PEGLip制剂
| 成分(g/100g) | PEGLip(PLP-00) |
| POPC | 8.333 |
| mPEG-2000-DSPE | 0.926 |
| 聚山梨醇酯80 | 0 |
| 二水柠檬酸钠 | 1.47 |
| 水 | 89.271 |
| 总计 | 100 |
| pH | 6.5至7.2 |
实施例1：
血友病狗IV施用和SC施用PEGLip-FVIII的研究
测试物：
FVIII：NuwiqTM(Octapharma，500IU小瓶)；PEGLip：50mM柠檬酸盐缓冲液pH6.7中的9％PEG化脂质体(批次19-740)
SubcutAte(每500IU小瓶NuwiqTM FVIII中3.5ml 9％ PEGLip：143IU/ml PEGLip-FVIII)
方法：
静脉施用PEGLip-FVIII
将50IU/kg FVIII、31.5mg/kg PEGLip和50IU/kg FVIII的PEGLip-FVIII剂量(胶体颗粒:FVIII分子比例为16:1))通过缓慢头静脉输注施用于A型血友病狗(加拿大金斯顿皇后大学)。在30分钟、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、32小时、48小时和56小时从头静脉抽取静脉血样品，用于全血凝固时间(WBCT)、旋转血栓弹力测定(ROTEM)分析、FVIII:C活性水平、全血细胞计数(CBC)和血液化学。还在治疗后1周和2周时收集血液用于Bethesda测定。
皮下施用
将200IU/kg FVIII、126mg/kg PEGLip和200IU/kg FVIII的PEGLip-FVIII剂量(胶体颗粒:FVIII分子比例为16:1))通过在颈背处皮下(SQ)注射于A型血友病狗(加拿大金斯顿皇后大学)。在1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、32小时、48小时和72小时从头静脉抽取静脉血样品，用于全血凝固时间(WBCT)、旋转血栓弹力测定(ROTEM)分析、FVIII:C活性水平、全血细胞计数(CBC)和血液化学。还在治疗后1周和2周时收集血液用于Bethesda测定。
结果：
凝血校正
单剂量静脉内注射PEGLip-FVIII从施用后30分钟开始显著减少凝血时间，并且这种效果在56小时后都未恢复到基线。通常预计皮下施用的FVIII的生物利用度最低，并且在缩短凝血时间方面无效。相比之下，令人惊讶的是，该实验中的皮下PEGLip-FVIII具有快速的生物利用度，并且从1小时的第一次评估时间开始缩短了凝血时间。
生物利用度和半衰期
通过观察给药后头48小时内凝血时间减少(CTR)的衰减来分析生物利用度和半衰期，通过全血凝固时间(WBCT)或通过ROTEM(凝血时间(CT)加凝块形成时间(CFT))进行测定。
经计算，皮下剂量的PEGLip-FVIII的生物利用度高达23％。除WBCT测量的SC剂量外，半衰期的估计值远远超过了文献估计的NuwiqTM半衰期(15.1–17.1小时)。参见表1。
生物利用度和半衰期的结合使我们能够得出一种潜在的皮下给药方案，包括剂量大小和给药间隔，这种方案将防止FVIII水平降低至危险水平(见图1)。
表1
抑制剂的产生
在IV注射人FVIII的一般实践中，该群体中的血友病狗总是会在FVIII给药后10天到4周之间产生不同滴度的抗人FVIII抗体。然而，在这项研究报告中，IV注射的对象没有产生抑制剂。对于给药人蛋白质的动物来说，这是令人惊讶且极不寻常的。
SC给药的动物确实产生了4BU至17BU的低水平抑制剂，但这低于静脉内给药(通常为50-100BU)和单次大体积递送至免疫原性组织的大剂量200IU/kg来自不同物种的蛋白质背景下的通常预期。这可能表明，即使SC施用单次高剂量的PEGLip-FVIII也比单独使用等效IV剂量的rhFVIII所预期的免疫原性更低。
这些令人惊讶的结果表明，在不损害FVIII活性且不修饰蛋白质上的表位的情况下，使用PEGLip作为与FVIII的共同施用剂能够防止或减少通常预期会出现免疫原性反应的对象中抑制剂的产生。这表明PEGLip与FVIII的共同施用降低了后者的免疫原性，使其成为先前未治疗患者或尚未产生抑制剂的最低限度治疗患者的更安全的替代方案。
实施例2：
SelectAteTM临床研究
正在进行的研究表明，确定比例的PEGLip-FVIII恢复了抑制剂患者的凝血。
易产生抑制剂的HA患者在注射PEGLip:FVIII时没有产生抑制剂，同时仍显示出凝血校正。
四名具有FVIII抗体抑制剂产生史的重度血友患者参加了该试验。由于其病史，这些患者无法接受替代FVIII作为预防性治疗，因为它们存在产生抑制剂的风险。在试验中，其中三名患者最初没有抑制剂，另一名患者滴度低(＜5BU)。所有患者均接受22mg/kgPEGLip和35IU/kg重组人源化FVIII的PEGLip-FVIII给药(囊泡:FVIII比例为15:1至16:1)。在评估的第一周，所有患者都经历了显著的凝血校正，使他们能够在接下来的6周内平均每6天(范围4–7天)给药一次。尽管在6周内每周重新给药一次，但三名不具有抑制剂的易产生抑制剂患者均没有针对治疗产生抑制剂。一位具有低滴度抑制剂的患者在第一阶段经历了临床上不显著的小幅上升，但在第二阶段重复给药期间实际上就下降了。提出，PEGLip-FVIII不能刺激易产生抑制剂个体中的抑制剂生成，这使得该产品特别适合于治疗先前未接受治疗的患者或最低限度治疗的患者，以防止这些易感个体中抑制剂的生成。
表2
实施例3：
PEGLiP+FVIII在易产生抑制剂和存在抑制剂患者中的临床研究
进行的一项2期临床研究表明，PEGLip-FVIII恢复了易产生抑制剂患者和存在抑制剂患者的凝血功能，而不刺激易产生抑制剂患者产生抑制剂或导致存在抑制剂患者的抑制剂滴度增加。该研究建立在实施例2中描述的发现的基础上。
在注射PEGLiP+FVIII(PLP-00+simoctocog alfa)时，筛选时具有抑制剂的重度HA患者或其临床记录显示他们在暴露于FVIII时易产生抑制剂的重度HA患者，分别不会增加其抑制剂滴度或产生抑制剂，同时仍显示凝血校正和出血频率减少。
13名具有FVIII抗体抑制剂产生史的重度血友患者参加了该试验。由于其病史，其中8名患者无法接受替代FVIII作为预防性治疗，因为它们存在产生抑制剂的风险。其他5名患者在筛选时表现出活性抑制剂滴度(平均2.4Bethesda单位)。所有患者均接受22mg/kgPEGLip和35IU/kg重组人源化FVIII的PEGLip+FVIII(simoctoctog alfa)给药(胶体颗粒：FVIII比例为15:1至16:1)。在评估的第一周，所有患者都经历了显著的凝血校正，使他们能够在接下来的6周内平均每5.5天(范围3.0–7.4天)给药一次，这意味着给药间隔显著延长(simoctoctog alfa的正常给药间隔是每隔一天或每周2-3次)。尽管给药频率更低，患者的出血事件也显著减少，平均每月出血率从平均每月1次(每年12.3次)降至每月0.3次(每年3.2次)。
尽管在6周内每周重新给药一次，8名不具有抑制剂的易产生抑制剂患者也均没有针对治疗产生抑制剂。此外，在该试验的6周预防阶段，5名具有抑制剂的患者的抑制剂滴度没有经历显著升高。提出，除了对存在抑制剂和易产生抑制剂的患者进行治疗外，PEGLip-FVIII也不能刺激易产生抑制剂个体中的抑制剂生成，这将额外使得该产品特别适合于治疗先前未接受治疗的患者或最低限度治疗的患者，以防止这些易感个体中抑制剂的生成。
表3
结论：
PEGLiP与FVIII的比例在15:1至16:1之间降低了具有FVIII抑制剂的患者以及易产生FVIII抑制剂的患者发生出血事件的风险，而不刺激产生进一步的大量抑制剂。
实施例4：
PEGLip增强非抑制剂患者FVIII的临床研究
进行的一项2期临床研究表明，在预防性剂量的FVIII后注射PEGLip允许安全地延长预防性剂量的FVIII的给药间隔，同时仍然防止出血发作，从而减少患者对FVIII的暴露。
十四名不具有抑制剂的重度血友病患者。所有患者均以35IU/kg静脉内给药FVIII(simoctocog alfa)，15分钟后以22mg/kg单次静脉内输注PEGLip。
在评估的第一周，所有患者都经历了显著的凝血校正，使他们能够在接下来的6周内平均每4.9天(范围3.1–7.3天)给药一次，这意味着给药间隔显著延长(simoctocog alfa的正常给药间隔是每隔一天或每周2-3次)。
尽管给药频率更低，患者的出血事件也显著减少，平均每月出血率从平均每月1.10次(每年13.21次)降至每月0.18次(每年2.21次)。
经过6周的预防性治疗，没有患者产生FVIII抑制剂。
提出，当在正常护理标准FVIII后将PEGLip注射到患者中时，PEGLip延长FVIII的给药间隔的能力以这种方式可以将先前未治疗患者/最低限度治疗患者暴露于FVIII的次数减半，从而降低了产生免疫原性反应的可能性。
表4
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Claims (44)
1.一种用于治疗对象的A型血友病的包含胶体颗粒的组合物，所述胶体颗粒包含：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，
其中所述第二两亲脂质包括用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分，
其中所述对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。
2.根据权利要求1所述的用途的组合物，其中所述生物相容性亲水聚合物选自由聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的用途的组合物，其中所述生物相容性亲水聚合物为聚乙二醇(PEG)。
4.根据权利要求3所述的用途的组合物，其中所述聚乙二醇的分子量为约500道尔顿至约5000道尔顿。
5.根据权利要求4所述的用途的组合物，其中所述聚乙二醇的分子量为约2000道尔顿或约5000道尔顿。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途的组合物，其中磷脂是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途的组合物，其中磷脂是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG2000)或N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG5000)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途的组合物，其中所述磷脂酰胆碱(PC)是1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途的组合物，其中所述组合物包含的所述第一两亲脂质和所述第二两亲脂质的摩尔比为90-99:10-1。
10.根据权利要求9所述的用途的组合物，其中所述组合物包含的所述第一两亲脂质和所述第二两亲脂质的摩尔比为97:3。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用途的组合物，其中所述胶体颗粒还包含(iii)选自由聚氧乙烯山梨醇酐、聚羟基乙烯硬脂酸酯和聚羟基乙烯月桂基醚组成的组的非离子表面活性剂。
12.根据权利要求11所述的用途的组合物，其中所述非离子表面活性剂是聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯。
13.根据权利要求11或12所述的用途的组合物，其中胶体包含的所述第一两亲脂质和所述第二两亲脂质与所述非离子表面活性剂的比例为30:1至2:1w/w。
14.根据权利要求1所述的用途的组合物，其中所述组合物包含的所述第一两亲脂质与所述第二两亲脂质与所述非离子表面活性剂的比例为10-40:1:0-4w/w。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的用途的组合物，其中所述组合物还包含因子VIII(FVIII)分子。
16.根据权利要求15所述的用途的组合物，其中所述组合物包含化学计量比为1-90:1的所述胶体颗粒和所述因子VIII(FVIII)分子。
17.根据权利要求15或16所述的用途的组合物，其中所述组合物包含化学计量比为10-20:1或5-10:1的所述胶体颗粒和所述因子VIII(FVIII)分子。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的用途的组合物，其中所述A型血友病是先天性A型血友病(cHA)。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的用途的组合物，其中所述A型血友病是获得性A型血友病(aHA)。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的用途的组合物，其中所述组合物还包含治疗活性化合物。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的用途的组合物，其中所述组合物还包含赋形剂、稀释剂或佐剂。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的用途的组合物，其中所述对象是儿科对象。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的用途的组合物，其中所述对象没有接受过FVIII治疗。
24.一种治疗对象的A型血友病的方法，包括步骤：
施用包含胶体颗粒的组合物，所述胶体颗粒包含：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，
其中所述第二两亲脂质包括用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分，以及
其中所述对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物相容性亲水聚合物选自由聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸组成的组。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述生物相容性亲水聚合物为聚乙二醇(PEG)。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述聚乙二醇的分子量为约500道尔顿至约5000道尔顿。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述聚乙二醇的分子量为约2000道尔顿或约5000道尔顿。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中磷脂是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG)。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其中磷脂是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG2000)或N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG5000)。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的方法，其中所述磷脂酰胆碱(PC)是1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)。
32.根据权利要求24至31中任一项所述的方法，其中所述胶体颗粒还包含(iii)非离子表面活性剂。
33.根据权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含因子VIII(FVIII)分子。
34.根据权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述方法包括单独或随后施用包含因子VIII(FVIII)分子的组合物的额外步骤。
35.根据权利要求24至34中任一项所述的方法，其中所述A型血友病是先天性A型血友病(cHA)。
36.根据权利要求24至34中任一项所述的方法，其中所述A型血友病是获得性A型血友病(aHA)。
37.根据权利要求24至36中任一项所述的方法，其中所述对象是儿科对象。
38.根据权利要求24至37中任一项所述的方法，其中所述对象没有接受过FVIII治疗。
39.一种用于治疗对象的A型血友病的试剂盒，包括：(i)包含胶体颗粒的组合物，和(ii)包含因子VIII(FVIII)分子的组合物，其中所述对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天，其中所述胶体颗粒包含：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，
其中所述第二两亲脂质包括用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述胶体颗粒还包含(iii)非离子表面活性剂。
41.一种用于治疗对象的血友病的试剂盒，包括用于单独、同时或随后使用的(i)包含胶体颗粒的组合物，和(ii)包含因子VIII(FVIII)分子的组合物，其中所述对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天，
其中所述胶体颗粒包含：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，
其中所述第二两亲脂质包括用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述胶体颗粒还包含(iii)非离子表面活性剂。
43.一种用于治疗对象的A型血友病的包含胶体颗粒的药物组合物的剂型，所述胶体颗粒包括：(i)包含磷脂酰胆碱(PC)部分的第一两亲脂质，和(ii)包含磷脂部分的第二两亲脂质，所述磷脂部分选自由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)组成的组，其中所述第二两亲脂质包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的磷脂部分，
其中所述对象已接受因子VIII(FVIII)治疗的暴露天数少于50天。
44.根据权利要求43所述的剂型，其中所述胶体颗粒还包含(iii)非离子表面活性剂。
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