CN118112029A - 对生物样本进行显微机械加工以产生用于在低温带电粒子显微镜中进行分析的片层的方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种对生物样本进行显微机械加工以产生用于在低温带电粒子显微镜中进行分析的片层的方法。该方法包括以下步骤：在样本载体上提供生物样本；在该样本载体上定位样本区域，该样本区域包括感兴趣区，该感兴趣区具有可以从其产生片层的生物材料；以及对该生物样本的至少一部分进行显微机械加工，以便移除该样本区域的一部分中包围该感兴趣区的材料，从而增加该感兴趣区中的该生物材料与该生物材料的周围环境之间的视觉对比。利用增加的视觉对比，可以识别潜在片层的位置。

Description

对生物样本进行显微机械加工以产生用于在低温带电粒子显 微镜中进行分析的片层的方法

说明书

本发明涉及一种用于对生物样本进行显微机械加工以产生用于在低温带电粒子显微镜中进行分析的片层的方法和系统。

带电粒子显微镜法是一种用于对微观物体进行成像的公知且越来越重要的技术，特别是以电子显微镜的形式。从历史上看，电子显微镜的基本类已演变成许多众所周知的设备种类，诸如透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和扫描透射电子显微镜(STEM)，并且还演变成各种亚种，诸如所谓的“双束”设备(例如FIB-SEM)，其附加地采用“加工”聚焦离子束(FIB)，允许支持活动，例如离子束研磨或离子束诱导沉积(IBID)。更具体来说：

-在SEM中，通过扫描电子束的对样本的照射促进“辅助”辐射例如以二次电子、背散射电子、X射线和光致发光(红外、可见光和/或紫外光子)的形式从样本发散；然后检测该发出辐射通量的一个或多个分量，并将其用于图像累积目的。

-在TEM中，用于照射样本的电子束被选择为具有足够高的能量以穿透样本(为此目的，样本通常将比在SEM样本的情况中更薄)；然后，可使用从样品中发出的透射电子的通量来创建图像。当这种TEM以扫描模式操作(因此成为STEM)时，所讨论的图像将在照射电子束的扫描运动期间累积。

作为使用电子作为照射束的替代性方案，也可以使用其它种类的带电粒子来执行带电粒子显微镜法。在这方面，短语“带电粒子”应该广义地解释为包括例如电子、正离子(例如Ga或He离子)、负离子、质子和正电子。

应当指出的是，除了成像和执行(局部)表面改性(例如，研磨、蚀刻、沉积等)之外，带电粒子显微镜还可以具有其它功能，诸如执行光谱分析、检查衍射图等。

在下文中，本发明将以举例的方式通常在电子显微镜法(EM)的特定背景中阐述。然而，这类简化仅用于清楚/说明目的，且不应解释为限制。

用于电子显微镜成像的样本需要进行某些制备以供在透射光或电子辐射下观察。例如，样本的薄片(或切片)通常在格栅或管中从整体样本切割或研磨。切割或研磨可以通过聚焦离子束(FIB)系统执行，或者在包含FIB和电子显微镜两者的双束系统中执行。此类双束系统的示例包含来自FEI公司(美国俄勒冈州希尔斯伯勒(Hillsboro,OR,USA))的Quanta 3D双束系统。在使用FIB制备薄片之后，必须将样本转移到适合于成像的平台。

样本制备尤其是对生物样本(诸如细胞、细胞组分、单细胞生物体等)的挑战。由于这些生物样本需要在含水液体(诸如水、电解质、细胞流体、血浆等)中储存和研究，因此这些生物样本在带电粒子显微镜(CPM)中进行检查时会面临巨大的挑战，因为：

-引入到CPM的(准)真空环境中的含水液体将开始除气/沸腾，从而倾向于使样本劣化；

-为了防止这种情况，可以将样本提供在样本载体上，在此之后，可以在将该样本引入到所述真空之前使用低温液体来将该样本冷冻。此类冷冻一般必须非常快速地执行，目的是实现样本玻璃化(凝固成无定形的玻璃样相)，而不具有显著的冰结晶。在此之后，需要将样本保持在低温下，即处于或低于-150℃。

一旦产生生物块样本，使用低温聚焦离子束(低温FIB)薄化就可以用于产生一个或多个薄片层，然后可以例如在TEM或SEM中研究该一个或多个薄片层。通过低温FIB进行薄化已被证明是一种最优的、无伪影的制备方法。

用于细胞低温ET的样本制备，无论是直接在薄细胞外周上执行还是在FIB显微机械加工之后执行，通常都涉及将粘附细胞直接接种在EM网格上。标准EM网格是覆盖有精细穿孔薄膜的直径3mm的金属网。细胞通常被允许扩散，经受基因或分子扰动，以表示要进行分子细节检查的不同的生理环境，然后这些通过玻璃化被阻止。然后可以选择细胞的感兴趣部分用于片层产生。

各种细胞系和样本质量的高度变化使得片层制备(例如对于低温断层扫描工作流程)成为复杂的过程，并且在若干个阶段中需要用户输入。目前，已知的研磨方法需要手动用户输入来评估用于片层研磨的精确点。用户需要充分识别感兴趣区和放置图案，这需要大量的知识和经验。不熟练的用户可能很容易对精确点进行错误评估，从而导致工作流程失败，结果片层无法使用。

考虑到上述内容，本公开的目的是提供一种改善低温片层样本制备的上述缺点的方法和/或装置。

为此，本公开提供了一种根据权利要求1所述的方法以及一种根据权利要求13所述的带电粒子束系统。

本文公开了一种对生物样本进行显微机械加工以产生用于在低温带电粒子显微镜(低温CPM)中进行分析的片层的方法。

该方法包括以下步骤：在样本载体上提供生物样本。然后，在样本载体上定位样本区域。该样本区域包括感兴趣区，该感兴趣区具有可以从其产生片层的生物材料。换句话讲，样本载体包括提供在样本载体的顶部上的生物材料，诸如生物细胞。通过移除过量的生物材料，可以从这些细胞产生薄片，也被称为片层。包括片层的生物材料被称为感兴趣区。感兴趣区被样本载体材料(其可以包含或不包含附加的生物材料)包围。如本文所定义的，样本区域是包围感兴趣区的材料以及感兴趣区本身。

根据如本文所公开的方法，生物样本的至少一部分被显微机械加工，以便移除样本区域的一部分中包围感兴趣区的材料。利用该步骤，增加了感兴趣区中的生物材料与其周围环境之间的视觉对比，因为被移除的材料与感兴趣区中剩余的生物材料形成良好对比。因此，该显微机械加工步骤可以被称为对比增强步骤。在任何情况下，该对比增强步骤包括移除包围将从其制成片层的生物材料的材料，而不会实际移除生物材料本身(的部分)。因此，在该对比增强步骤中，可以从其制成片层的生物材料基本上保持完整或未受损。

生物材料具有一定体积，并且因此，在相对于由样本载体限定的平面正交的方向上从样本载体延伸。生物材料的该特征可以用于识别体积的顶部部分，即生物材料最远离样本载体的部分。在体积的顶部的位置被识别的情况下，有可能精确地识别生物材料的需要被显微机械加工以产生片层的那些部分。如本文所公开的对比增强步骤使得能够更容易且更准确地识别生物材料的边缘(诸如顶部)，这也允许更准确且更容易地产生片层。

因此，该方法允许以下步骤：使用增加的视觉对比来识别感兴趣区中的生物材料内可以从其产生片层的位置。然后，样本可以被显微机械加工以产生所述片层。

如本文所公开的方法在低温下(至少部分地)执行。可以通过玻璃化过程预先制备样本载体上的生物样本。

因此，该方法允许以快速、容易和精确的方式在生物样本上定位潜在片层并且使用显微机械加工来制备该片层。由此，实现如本文所限定的目的。

下文将论述有利的实施方案。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在所述显微机械加工步骤中的至少一个显微机械加工步骤中使用显微机械加工工具。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在所执行的步骤中的至少一个或多个所执行的步骤期间使用带电粒子显微镜来对样本进行成像。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：通过处理单元识别感兴趣区与周围环境之间的分离边缘。

在一个实施方案中，所述识别步骤是对通过带电粒子显微镜获得的图像执行的。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：从一个显微机械加工步骤到下一个显微机械加工步骤改变样本载体的取向。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：为显微机械加工步骤中的至少一个显微机械加工步骤提供束，特别是聚焦离子束(FIB)。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在产生所述片层的所述步骤中，相对于由所述样本载体限定的平面以一定角度定位所述束。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在移除在样本区域中并且部分地包围感兴趣区的材料的所述步骤中，将所述束定位成基本上正交于由所述样本载体限定的平面。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

-提供束，特别是聚焦离子束(FIB)；

-使用带电粒子显微镜法来定位所述样本区域；

-将所述样本载体定位成相对于所述束基本上正交，并且使用所述束来对所述生物样本的至少一部分进行显微机械加工，以便移除在所述样本区域中并且部分地包围所述感兴趣区的材料，从而增加所述感兴趣区中的所述生物材料与所述生物材料的周围环境之间的视觉对比；

-改变所述样本载体相对于所述束的相对位置；

-使用带电粒子显微镜法和所述增加的视觉对比来识别所述感兴趣区中的所述生物材料内能够从其产生片层的所述位置；以及

-使用所述束来对所述样本进行显微机械加工以产生所述片层。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：获得所述感兴趣区的图像并且通过处理单元识别所述位置。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：使用所述处理单元来识别感兴趣区与周围环境之间的分离边缘。

该方法可以包括以下步骤：评估样本表面上的冰晶粒子污染并且基于冰晶粒子污染来选择片层。具体地，选择片层位点以最小化或减少片层上的冰污染。

该方法可以包括以下步骤：基于ROI位置来选择研磨角度。可以从荧光显微镜法技术获得ROI位置。ROI位置可以用于自动计算用于产生片层的最优研磨角度。这可以包括移动工作台和/或束以用于获得最优研磨角度。

根据一个方面，提供了一种带电粒子束系统，利用该带电粒子束系统可以执行如本文所公开的方法。如本文所公开的带电粒子束系统包括：

--样本保持器，所述样本保持器用于将生物样本保持在样本载体上；

-离子束柱，所述离子束柱用于产生聚焦离子束(FIB)，所述聚焦离子束沿着离子轴传播到所述生物样本上以用于在所述样本中产生片层；

-带电粒子束柱，所述带电粒子束柱用于产生带电粒子束，所述带电粒子束沿着带电粒子束轴传播到所述生物样本上；

--检测器，所述检测器用于检测响应于所述离子束和/或所述带电粒子束的照射而从所述生物样本发散的辐射；

-处理单元，所述处理单元用于至少部分地控制所述显微镜的操作。

如本文所定义的带电粒子束系统被布置用于通过所述处理单元识别感兴趣区中的生物材料内可以从其产生片层的位置。增加的视觉对比可以使得处理单元能够处理例如包含感兴趣区的图像。处理单元然后可以识别生物材料的轮廓，利用该轮廓可以设置潜在片层的位置。

处理单元可以被布置用于设置潜在片层的位置。这样，就不需要用户交互，并且可以自动完成片层识别。

在一个实施方案中，处理单元被布置用于控制所述聚焦离子束以对样本进行显微机械加工，从而产生所述片层，其中利用如由所述处理单元识别的所述片层的位置。这允许执行半自动片层产生过程，需要最少的用户交互。

现将基于示例性实施方案和所附示意图更详细地阐明本公开的方法和设备，在附图中：

图1–呈现了双束带电粒子束系统的一个实施方案的纵截面正视图；

图2a至图2f–示出了根据一个实施方案的样本上的研磨过程；

图3a至图3c–示出了根据一个实施方案的样本上的研磨过程的电子显微镜图像；

图4–示出了样本上的污染的一个实施方案；

图5–示出了样本上的片层放置的一个实施方案；

图6a至图6c–示出了片层角度放置的一个实施方案。

图1示出了带电粒子束系统的一个实施方案的高度示意性描绘。此处，示出了双束带电粒子显微镜(CPM)；更具体地说，其示出FIB-SEM的实施方案。显微镜M包括粒子光柱1，该粒子光柱产生沿着粒子光轴3’传播的带电粒子束3(在这种情况下为电子束)。柱1被安装在真空室5上，该真空室包括样本保持器7以及用于保持/定位样本6的相关联致动器7’。使用真空泵(未示出)抽空真空室5。借助于电压电源17，如果需要，可以将样本保持器7或至少样本6偏置(浮置)到相对于地面的电位。还示出了真空端口5’，其可打开以便将物品(组分、样本)引入到真空室5的内部/从该内部移除。如果需要，显微镜M可以包括多个此类端口5’。

柱1(在本发明的情况下)包括电子源9(例如，诸如肖特基枪)以及照明器2。此照明器2包括(尤其)用于将电子束3聚焦到样本6上的透镜11、13，以及偏转单元15(用于执行束3的束导引/扫描)。显微镜M还包括处理单元25以用于尤其控制偏转单元15、透镜11、13和检测器19、21并且将从检测器19、21收集的信息显示在显示单元27上。

检测器19、21选自可用于检查响应于(冲击)束3的照射而从样品6发出的不同类型的“受激”辐射的多种可能的检测器类型。在此处所描绘的设备中，已进行了以下(非限制性)检测器选择：

-检测器19是用于检测从样本6发散的阴极发光的固态检测器(诸如光电二极管)。例如，其可以替代地为X射线检测器，诸如硅漂移检测器(SDD)或硅锂(Si(Li))检测器；

-例如，检测器21是呈固态光电倍增器(SSPM)或抽空光电倍增管(PMT)形式的电子检测器[例如埃弗哈特-索利恩(Everhart-Thornley)检测器]。这可以用于检测从样本6发散的后向散射和/或二次电子。

本领域的技术人员应理解，可以在诸如所描绘的设置中选择许多不同类型的检测器，包括例如环形/分段检测器。

通过在样本6之上扫描束3，包括例如X射线、红外光/可见光/紫外光、二次电子(SE)和/或后向散射电子(BSE)的经刺激辐射从样本6发散。因为此类受激辐射是位置敏感的(归因于所述扫描运动)，所以从检测器19、21获得的信息也将是位置相依的。这一事实允许(例如)来自检测器21的信号用于产生样本6(的一部分)的BSE图像，该图像基本上为所述信号随样本6上的扫描路径位置而变的图。

来自检测器19、21的信号沿着控制线(总线)25’传递；由处理单元25处理；并且被显示在显示单元27上。这种处理可以包含如组合、整合、减法、伪着色、边缘增强和本领域技术人员已知的其它处理等操作。此外，自动识别过程(例如，如用于粒子分析)可以包含在这种处理中。

除了上文所描述的电子柱1之外，显微镜M还包括离子光柱31。这包括离子源39和照明器32，并且这些沿着离子光轴33’产生/导引离子束33。为了促进对保持器7上的样本6的接近，离子轴33’相对于电子轴3’倾斜。如上文所描述，此类离子(FIB)柱31可以例如用于对样本6执行处理/机械加工操作，诸如切割、研磨、蚀刻、沉积等。替代地，离子柱31可以用于产生样本6的成像。应当指出的是，离子柱31能够随意地产生各种不同种类的离子，例如，如果离子源39被实施为所谓的NAIS源；因此，对离子束33的参考不必被视为在任何给定时间指定所述束中的特定种类——换句话说，束33可包含用于操作A(诸如铣削)的离子种类A和用于操作B(诸如注入)的离子种类B，其中种类A和B可选自各种可能的选项。

还示出了注气系统(GIS)43，出于执行气体辅助蚀刻或沉积的目的，其可以用于进行诸如蚀刻或前驱气体等气体的局部注入。例如，此类气体可以被存储/缓存在储集器43’中，并且可以通过狭窄的喷嘴43”被施用，以便在轴3’和33’的相交点附近射出。

带电粒子束系统被布置用于在低温下与生物样本一起工作。

应当指出的是，此类设置的许多改进和替代方案对于本领域的技术人员而言将是已知的，诸如在(相对大体积的)显微镜M内的受控环境的使用，例如维持若干毫巴的背景压力(如在环境SEM或低压SEM中所使用的)。

在任何情况下，如图1所公开的带电粒子束系统包括：

–样本保持器7，其用于保持生物样本，该生物样本被提供在样本载体6上；

–离子束柱31，其用于产生聚焦离子束(FIB)，该聚焦离子束沿着离子轴33’传播到所述生物样本上以用于在所述样本中产生片层；

–带电粒子束柱1，其用于产生带电粒子束，该带电粒子束沿着带电粒子束轴3’传播到所述生物样本上；

–检测器21，其用于检测响应于所述离子束和/或所述带电粒子束的照射而从所述生物样本发散的辐射；

–处理单元25，其用于至少部分地控制所述显微镜的操作。

如将在下面更详细地描述的，处理单元25被布置用于使用通过对样本进行显微机械加工而获得的增加的视觉对比来识别感兴趣区中的生物材料内可以从其产生片层的位置。

图2a至图2f示意性地示出了如本文所公开的方法的一个实施例。接下来将描述该实施方案和其变型。在所示步骤中，带电粒子显微镜(诸如电子显微镜)可以用于在所执行的步骤中的至少一个或多个所执行的步骤期间对样本进行成像。在所示实施方案中，附图示意性地表示可以由显微镜获得的此类图像。

图2a示出了样本载体100的相对小的部分(本领域的技术人员已知的)的顶视图，该样本载体具有提供在其顶部上的生物材料104。生物材料104包括例如生物细胞，从该生物细胞可以提取潜在片层140(此处用虚线指示)。

因此，图2a示出了样本载体100的样本区域101，并且该样本区域包括感兴趣区102(生物细胞)，可以从该感兴趣区产生片层140。该样本区域101可以由用户例如通过使用电子显微镜在视觉上定位。因此，图2a表示当使用显微镜时用户可以看到的图像的示意性概览，并且事实上是样本载体100上的自上而下视图。一旦用户识别出样本区域101中的潜在片层140，就可以执行下一个步骤。需注意，如图2a所示的感兴趣区与生物材料一致，并且是高度限定的。然而，在实践中，感兴趣区与生物材料之间的区分可能不太清楚，例如参见图3a。

图2b示出了如本文所公开的方法中的步骤，该步骤包括对样本载体100的一部分进行显微机械加工，使得样本区域101的一部分中包围感兴趣区102的材料被移除。在该步骤中可以使用聚焦离子束。样本载体100可以被定位成使得由样本载体100限定的平面被定位成相对于离子束轴33’基本上正交(或至少接近正交，例如以范围在75度至90度之间的角度)。在其它实施方案中，在使用的硬件限制使用较大研磨角度的情况下，可以使用约50度的角度。聚焦离子束用于移除前部部分111和后部部分112。通过移除感兴趣区102前方和后方的材料，增加了感兴趣区中的生物材料与该生物材料的周围环境之间的视觉对比。这可以在图2c中看到，该图提供了图2b中所获得的情形的透视图。可以看到，细胞102的边缘是清楚可见的，特别是通过移除后部部分112。

图2d示出了识别生物材料104的边界121的(任选的)步骤，从该生物材料可以制成片层。边界121的作用类似于感兴趣区102与样本区域101之间的分离边缘121。该边界的该识别有益于确定从何处挖掘片层的确切位置。增加的对比有益于执行该步骤。该步骤可以由用户手动执行，但也可以由处理单元(即自动地)执行。

图2e示出了可以使用诸如位置、视角、所检测的细胞边缘等若干参数来测量细胞104的高度。该步骤可以由用户手动执行，例如通过使用图形用户界面在屏幕上输入高度，在此之后，处理单元可以基于用户的输入来确定实际高度。另选地，该步骤可以由处理单元(即自动地)执行。

图2f示出了片层140的放置，即期望的片层140在生物材料104内的位置的识别。一旦被识别，可以使用显微机械加工，例如使用FIB来对样本进行显微机械加工以产生所述片层。此处，束将相对于由所述样本载体限定的平面以非正交角度定位。为此，可以使用所谓的研磨角度，该研磨角度可以是约10度至20度，如本领域的技术人员已知的。

可以看到，与在图2f中执行的显微机械加工相比，在图2b中执行的显微机械加工以不同的角度进行。这可以通过从一个显微机械加工步骤到下一个显微机械加工步骤改变样本载体相对于聚焦离子束的取向来完成。

从上面可以得出，增加的视觉对比有助于识别片层位置。

总之，图2a至图2f示出了如本文所公开的方法，该方法包括以下步骤：

-提供束，特别是聚焦离子束(FIB)；

-使用带电粒子显微镜法来定位所述样本区域101；

-将所述样本载体100相对于束基本上正交地定位，并且使用所述束来对生物样本的至少一部分进行显微机械加工，以便移除在样本区域100中并且部分地包围感兴趣区102的材料，从而增加感兴趣区中的生物材料104与该生物材料的周围环境100之间的视觉对比；

-改变样本载体100相对于束的相对位置；

-使用带电粒子显微镜法和所述增加的视觉对比来识别感兴趣区中的生物材料内可以从其产生片层140的所述位置；以及

-使用所述束来对样本进行显微机械加工以产生所述片层140。

图3a至图3c示出了如本文所公开的方法的部分的显微图像。此处，图3a以接近正交或基本上正交的视图示出了样本，示出了前部部分111(前部图案111)和后部部分112。可以看到，在实践中，感兴趣区102未被如此良好地限定，并且逐渐延伸到样本区域102(即感兴趣区的周围环境)中。因此，可以预期，如此处所看到的后部部分112实际上侵犯了感兴趣区102的一部分。这仍然是可以的，因为生物材料104的较大部分保持完整，并且可以挖掘片层140。图3a还示出了左侧沟槽和右侧沟槽113、114。这些沟槽通常用于减小材料应力，但它们也可以用作参考或对准图案，因为对比差异也是明显的。

图3b示出了图3a的情形的斜视图，从中可以看到，后部部分112在细胞104与周围环境之间产生了增加的视觉对比。由此，细胞的顶部105清晰可见。

图3c示出了用于产生片层140的生物材料104的进一步显微机械加工。

图4示出了具有潜在片层240的低温EM样本。此处可以看到，样本上存在若干污染231、232。分布在样本表面上的各种冰晶粒子的污染使得用于低温电子断层扫描的低温片层制备易于破坏片层240的质量。到目前为止，样品制备或样品处理似乎总是会导致一定量的非均匀污染。

我们可以将非均匀污染分成两个部分：

1)斑点污染，即分布在整个样本表面上的大量非常小的冰晶粒子231。当在斑点污染之上进行研磨时，最终片层将具有垂落效应，这使得它不适合于断层扫描。

2)大的冰污染，即样品表面上某处有少量非常大的冰晶粒子232。当围绕大的冰污染进行研磨时，束受到冰晶粒子电荷的影响，并且因此，研磨以不可预测的方式受到影响(这可以在右沟槽214中看到一点)。

在常规自动化研磨过程中，在任何图案放置之前，可以使用漂移校正算法来校正与各种源相关联的漂移。在另选的实施方案中，机器学习和图像处理技术可以用于利用已获取的漂移校正图像。可以使用卷积神经网络或者经由冰晶粒子231、232中总是存在的低对比启发式地分割漂移校正图像。

分割可以用于通过以下方式来解决由存在于图像中的污染引起的问题：

1)提示用户将图案重新定位到另一位置(在斑点污染231的情况下)

2)将图案自动重新定位到另一位置(在斑点污染231的情况下)

3)从工作流程中移除片层240的研磨位点以节省时间(在大的冰晶污染232的情况下)

4)尝试自动移除冰晶(在大的冰晶污染232的情况下，存在能够移除冰晶污染的过程)。该程序允许在每个DCM再扫描间隔期间监测非均匀污染。

图5中示出了自动图案放置的示例，其中冰晶污染(小斑点331)包围潜在片层位点340。例如通过自动选择片层位点340(由灰色框指示)，可以使用上述过程来解决由污染引起的问题。

转到图6a和图6b，示出了在低温EM片层制备中优化期望的感兴趣区(ROI)的一个实施方案。期望具有在抛光片层内部包含尽可能多的期望的ROI的片层640(参见图6b)。用于片层研磨的离子束611、612、613与样本平面600之间的角度被称为研磨角度(通过改变工作台倾斜度来实现各种角度)。通常，一个目的在于尽可能最低的研磨角度(尽可能接近垂直于样本表面600)，以允许片层640的最大表面积。这是用于盲(强力)片层研磨过程的有效策略，对于较大的片层，包含期望的ROI的机会较大。然而，在知道ROI的位置(例如，从荧光显微镜)的情况下，此类方法是次优的。

图6a和图6b示出了可以如何使用自动方法来限定最佳优片层研磨角度，其中利用细胞601中所识别的ROI。靶向的结果是样本体积601内部的靶向结构(ROI)的3D位置。

ROI在细胞601中的位置可以用于计算可行的研磨角度611、612、613。此处可以使用硬件定义的限制、可实现的片层研磨的条件以及ROI的已知3D位置。这些ROI可以从识别技术获得，诸如从荧光显微镜法获得。可以在研磨过程开始之前计算最优可能结果，即存在于片层640中的大部分ROI(参见图6b)。该方法还可以利用目标ROI的体积信息(在与片层厚度相比更大的ROI的情况下)。该方法允许实验需要更少的片层，这显著减少了工具时间和用户的资源。

如图6c所示，该方法可以包括样本平面600的旋转/倾斜度β，以允许使用相对低的研磨角度α。通过使工作台绕工作台倾斜轴线倾斜角度β，离子束633可以被瞄准以产生期望的片层640。期望的保护由所附权利要求书确定。

Claims (16)

1.一种用于对生物样本进行显微机械加工以产生用于在低温带电粒子显微镜(低温CPM)中进行分析的片层的方法，所述方法包括以下步骤：

–在样本载体上提供生物样本；

–在所述样本载体上定位样本区域，所述样本区域包括感兴趣区，所述感兴趣区具有能够从其产生片层的生物材料；

–对所述生物样本的至少一部分进行显微机械加工，以便移除所述样本区域的一部分中包围所述感兴趣区的材料，从而增加所述感兴趣区中的所述生物材料与所述生物材料的周围环境之间的视觉对比；

–使用所增加的视觉对比来识别所述感兴趣区中的所述生物材料内能够从其产生片层的位置；以及

–对所述样本进行显微机械加工以产生所述片层。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括以下步骤：在所述显微机械加工步骤中的至少一个显微机械加工步骤中使用显微机械加工工具。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法包括以下步骤：在所执行的步骤中的至少一个或多个所执行的步骤期间使用带电粒子显微镜来对所述样本进行成像。

4.根据权利要求1-3所述的方法，所述方法包括以下步骤：通过处理单元识别所述感兴趣区与所述周围环境之间的分离边缘。

5.根据权利要求3和4所述的方法，其中所述识别步骤是对通过所述带电粒子显微镜获得的图像执行的。

6.根据权利要求1-5所述的方法，所述方法包括以下步骤：从一个显微机械加工步骤到下一个显微机械加工步骤改变所述样本载体的取向。

7.根据权利要求1-6所述的方法，所述方法包括以下步骤：为所述显微机械加工步骤中的至少一个显微机械加工步骤提供束，特别是聚焦离子束(FIB)。

8.根据权利要求7所述的方法，所述方法包括以下步骤：在产生所述片层的所述步骤中，相对于由所述样本载体限定的平面以一定角度定位所述束。

9.根据权利要求7或8所述的方法，所述方法包括以下步骤：在移除在所述样本区域中并且部分地包围所述感兴趣区的材料的所述步骤中，将所述束定位成基本上正交于由所述样本载体限定的平面。

10.根据权利要求1-9所述的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供束，特别是聚焦离子束(FIB)；

-使用带电粒子显微镜法来定位所述样本区域；

-将所述样本载体定位成相对于所述束基本上正交，并且使用所述束来对所述生物样本的至少一部分进行显微机械加工，以便移除在所述样本区域中并且部分地包围所述感兴趣区的材料，从而增加所述感兴趣区中的所述生物材料与所述生物材料的周围环境之间的视觉对比；

-改变所述样本载体相对于所述束的相对位置；

-使用带电粒子显微镜法和所述增加的视觉对比来识别所述感兴趣区中的所述生物材料内能够从其产生片层的所述位置；以及

-使用所述束来对所述样本进行显微机械加工以产生所述片层。

11.根据权利要求10所述的方法，所述方法包括以下步骤：获得所述感兴趣区的图像并且通过处理单元识别所述位置。

12.根据权利要求11所述的方法，所述方法包括以下步骤：使用所述处理单元来识别所述感兴趣区与所述周围环境之间的分离边缘。

13.根据权利要求1-12所述的方法，其中在选择所述片层时评估并考虑样本表面上的冰晶粒子污染。

14.根据权利要求1-13所述的方法，其中基于ROI位置来选择研磨角度。

15.一种用于执行根据权利要求1-14所述的方法的带电粒子束系统，所述带电粒子束系统包括：

--样本保持器，所述样本保持器用于将生物样本保持在样本载体上；

-离子束柱，所述离子束柱用于产生聚焦离子束(FIB)，所述聚焦离子束沿着离子轴传播到所述生物样本上以用于在所述样本中产生片层；

-带电粒子束柱，所述带电粒子束柱用于产生带电粒子束，所述带电粒子束沿着带电粒子束轴传播到所述生物样本上；

-检测器，所述检测器用于检测响应于所述离子束和/或所述带电粒子束的照射而从所述生物样本发散的辐射；

-处理单元，所述处理单元用于至少部分地控制所述显微镜的操作，

其中所述处理单元被布置用于使用增加的视觉对比来识别所述感兴趣区中的所述生物材料内能够从其产生片层的位置。

16.根据权利要求15所述的带电粒子束系统，其中所述处理单元被布置用于控制所述聚焦离子束以对所述样本进行显微机械加工，从而产生所述片层，其中利用如由所述处理单元识别的所述片层的所述位置。