JP2024079632A - クライオ荷電粒子顕微鏡における分析のためのラメラを作成するために生体試料を微細加工する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】クライオラメラ試料調製の上述の欠点を改善する方法及び／又はデバイスを提供すること。【解決手段】 本開示は、クライオ荷電粒子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ＣＰＭ）における分析のためのラメラを作成するために生体試料を微細加工する方法に関する。試料担体上に生体試料を提供するステップと、試料担体上に試料エリアを位置特定するステップであって、当該試料領域は、ラメラが作成され得る生体材料を有する関心領域を含む、位置特定するステップと、関心領域における生体材料とその周囲との間の視覚的コントラストを増大させるために、関心領域を取り囲む試料エリアの一部における材料を除去するように、生体試料の少なくとも一部を微細加工するステップと、を含む、方法。視覚コントラストの増加により、潜在的なラメラの場所を識別することができる。【選択図】図２ｃ

Description

本発明は、クライオ荷電粒子顕微鏡における分析のためのラメラを作成するために生体試料を微細加工する方法及びシステムに関する。

荷電粒子顕微鏡法は、周知であり、特に電子顕微鏡法の形態で微視的対象物を画像化するために、ますます重要になっている技術である。歴史的に、電子顕微鏡の基本的な種類は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、及び走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）などの多くの周知の装置種に、並びに、例えば、イオンビームミリング又はイオンビーム誘起蒸着（ＩＢＩＤ）などの支援活動を可能にする、「機械加工」集束イオンビーム（ＦＩＢ）を更に使用するいわゆる「二重ビーム」装置（例えば、ＦＩＢ－ＳＥＭ）などの様々な副種に進化している。より具体的には、
ＳＥＭでは、走査電子ビームによる試料の照射は、例えば二次電子、後方散乱電子、Ｘ線、並びにフォトルミネセンス（赤外光子、可視光子、及び／又は紫外光子）の形態の「補助」放射線を試料から放出させ、次いで、この放出される放射線束の１つ以上の成分が、画像を蓄積する目的で検出されて、使用される。

ＴＥＭでは、試料に照射するために使用される電子ビームは、試料を貫通するのに十分高いエネルギーであるように選択され（この目的のために、試料は、一般に、ＳＥＭ試料の場合よりも薄くなる）、次いで、試料から放出される透過電子束を使用して、画像を作成することができる。このようなＴＥＭが走査モードで動作される（したがって、ＳＴＥＭになる）と、照射電子ビームの走査運動中にその画像が蓄積される。

照射ビームとしての電子の使用の代替として、荷電粒子顕微鏡法は、荷電粒子の他の種を使用して実行することもできる。この点に関して、「荷電粒子」という語句は、例えば電子、正イオン（例えばＧａイオン又はＨｅイオン）、負イオン、陽子、及び陽電子を包含するものとしてとして広く解釈されるべきである。

撮像、及び（局所的な）表面改質（例えば、ミリング、エッチング、蒸着など）の実行に加えて、荷電粒子顕微鏡はまた、分光法の実行、回折図の検査など他の機能を有し得ることに留意されたい。

以下では、本発明は、例により、電子顕微鏡（electron
microscopy、ＥＭ）の具体的な状況でたびたび説明される。しかしながら、このような簡略化は、単に明確さ／例示を目的とすることを意図しており、限定するものと解釈されるべきではない。

電子顕微鏡の画像化用のサンプルは、透過光又は電子放射下で観察するための特定の調製が必要である。例えば、サンプルの薄いスライス（又はセクション）は、通常、グリッド又はチューブ内のバルクサンプルからカット又はミリングされる。カット又はミリングは、集束イオンビーム（ＦＩＢ）システムによって、又はＦＩＢと電子顕微鏡の両方を含む二重ビームシステム内で実行できる。このような二重ビームシステムの例には、ＦＥＩ社（米国オレゴン州ヒルズボロ）のＱｕａｎｔａ ３Ｄ ＤｕａｌＢｅａｍシステムが含まれる。ＦＩＢを使用して薄いスライスを調製した後、試料を画像化に適したプラットフォームに移送する必要がある。

試料調製は、特に、生体試料（細胞、細胞成分、単細胞生物など）にとって難題である。これらの生体試料は、水性液体（例えば、水、電解質、細胞流体、血漿など）の本体内で保存及び観察される必要があるため、以下のことから、荷電粒子顕微鏡（charged particle microscope、ＣＰＭ）での検査に対して重大な課題を提示することがある。
－ＣＰＭの（擬似）真空環境に導入された水性液体は、ガスの発散／沸騰を開始し、したがって試料を劣化させる傾向がある。
－これを防止するために、試料は、試料担体上に提供されることができ、その後、当該真空に導入される前に、極低温液体を使用して凍結されることができる。このような凍結は、著しい氷結晶化なしにサンプルガラス化（非晶質、ガラス様相への凝固）を達成する目的で、一般に非常に急速に行われなければならない。この後、試料は、極低温、すなわち－１５０℃以下に保たれる必要がある。

生物学的バルク試料が作成されると、クライオ集束イオンビーム（クライオＦＩＢ）を使用した薄化を使用して、１つ以上の薄いラメラを作成することができ、次いで、それを例えばＴＥＭ又はＳＥＭで研究することができる。クライオＦＩＢによる薄化は、最適なアーチファクトのない調製方法であることが証明されている。

細胞クライオＥＴのための試料調製は、薄い細胞周辺部上で直接実行されるか、又はＦＩＢ微細加工後に実行されるかにかかわらず、通常、接着細胞をＥＭグリッド上に直接播種（seeding）することを含む。標準的なＥＭグリッドは、繊細な穿孔薄膜で覆われた直径３ｍｍの金属メッシュである。細胞は、典型的には、拡散され、遺伝的又は分子的摂動に供されて、分子的詳細において試験されるべき異なる生理学的設定を表し、次いで、ガラス化によって停止される。次いで、ラメラ作成のために、細胞の関心部分を選択することができる。

様々な細胞株及び試料品質の高い変動は、ラメラ調製（例えば、凍結断層撮影ワークフローのための）を複雑なプロセスにし、ユーザ入力がいくつかの段階で必要とされる。現在、既知のミリング手法は、ラメラミリングのための正確なスポットを評価するために、手動のユーザ入力を必要とする。ユーザは、関心領域を識別し、パターンを適切に配置する必要があり、これは多くの知識及び経験を必要とする。熟練していないユーザは、正確なスポットの評価をおそらく誤り得、その結果、使用不能なラメラを有するワークフローの失敗につながる。

上記を考慮して、本開示の目的は、クライオラメラ試料調製の上述の欠点を改善する方法及び／又はデバイスを提供することである。

この目的のために、本発明は、請求項１に記載の方法、及び請求項１３に記載の荷電粒子ビームシステムを提供する。

本明細書に開示されるのは、クライオ荷電粒子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ＣＰＭ）における分析のためのラメラを作成するために生体試料を微細加工する方法である。

方法は、試料担体上に生体試料を提供するステップを含む。次に、試料エリアが、試料担体上に位置する。この試料エリアは、ラメラが作成され得る生体材料を有する関心領域を含む。換言すれば、試料担体は、試料担体の上部に提供される生体細胞などの生体材料を含む。これらの細胞から、薄いスライス（ラメラとも呼ばれる）が、過剰な生体材料を除去することによって作成され得る。ラメラを含む生体材料は、関心領域と呼ばれる。関心領域は、試料担体材料（追加の生体材料を含んでも含まなくてもよい）によって取り囲まれている。本明細書で定義されるように、試料エリアは、関心領域自体と一緒に関心領域を取り囲む材料である。

本明細書に開示される方法によれば、生体試料の少なくとも一部は、関心領域を取り囲む試料エリアの一部の材料を除去するように微細加工される。このステップでは、除去された材料が関心領域に残っている生体材料と良好に対比するので、関心領域の生体材料とその周囲との間の視覚的コントラストが増大される。したがって、この微細加工ステップは、コントラスト強調ステップと呼ぶことができる。いずれにしても、このコントラスト強調ステップは、生体材料自体（の一部）を実際に除去することなく、ラメラが作製される生体材料を取り囲む材料を除去することを含む。従って、このコントラスト強調ステップにおいて、ラメラが作製され得る生体材料は、実質的にそのままであるか又は無傷のままである。

生体材料は、特定の体積を含み、したがって、試料担体によって画定された平面に対して直交する方向に試料担体から延びる。生体材料のこの特徴は、体積の上部、すなわち試料担体から最も離れた生体材料の部分を識別するために使用することができる。体積の上部の場所が識別されると、ラメラを作成するために微細加工される必要がある生体材料の部分を正確に識別することが可能である。本明細書に開示されるようなコントラスト強調ステップは、上部などの生体材料のエッジがより容易かつより正確に識別されることを可能にし、それは、ラメラ作成がより正確かつより容易であることも可能にする。

したがって、方法は、増大された視覚的コントラストを使用して、ラメラが作成され得る対象領域における生体材料内の場所を識別するステップを可能にする。次に、試料を微細加工して当該ラメラを作成することができる。

本明細書に開示される方法は、極低温で（少なくとも部分的に）実行される。試料担体上の生体試料は、ガラス化プロセスによって事前に調製され得る。

したがって、方法は、生体試料上の潜在的なラメラを位置特定し、微細加工を使用してラメラを調製する、迅速、容易、かつ正確な方法を可能にする。したがって、本明細書で定義されるような目的が達成される。

有利な実施形態を以下に説明する。

一実施形態では、方法は、当該微細加工ステップのうちの少なくとも１つにおいて、微細加工ツールを使用するステップを含む。

一実施形態では、方法は、実行されるステップのうちの少なくとも１つ以上の間に、試料を撮像するために荷電粒子顕微鏡を使用するステップを含む。

一実施形態では、方法は、処理ユニットによって、関心領域と周囲との間の分離エッジを識別するステップを含む。

一実施形態では、当該識別するステップは、荷電粒子顕微鏡によって得られた画像状で実行される。

一実施形態では、方法は、１つの微細加工ステップから次の微細加工ステップへと試料担体の向きを変更するステップを含む。

一実施形態では、方法は、微細加工ステップのうちの少なくとも１つのために、ビーム、特に集束イオンビーム（ＦＩＢ）を提供するステップを含む。

一実施形態では、方法は、当該ラメラを作成する当該ステップにおいて、当該試料担体によって画定された平面に対してある角度で当該ビームを位置決めするステップを含む。

一実施形態では、方法は、当該ビームを、試料エリアにおいて材料を除去する当該ステップにおいて、当該試料担体によって画定され、関心領域を部分的に取り囲む平面に実質的に直交するように位置決めするステップを含む。

一実施形態では、方法は、
－ビーム、特に集束イオンビーム（ＦＩＢ）を提供するステップと、
－荷電粒子顕微鏡法を使用して、当該試料エリアを位置特定するステップと、
－関心領域における生体材料とその周囲との間の視覚的コントラストを増大させるために、関心エリアにおける、かつ関心領域を部分的に取り囲む材料を除去するように、当該試料担体を、ビームに対して実質的に直交するように位置決めし、当該ビームを使用して、生体試料の少なくとも一部を微細加工するステップと、
－ビームに対する試料担体の相対位置を変化させるステップと、
－荷電粒子顕微鏡法及び当該増大された視覚的コントラストを使用して、ラメラが作成され得る関心領域における生体材料内の当該場所を識別するステップと、
－当該ビームを使用して、当該ラメラを作成するために試料を微細加工するステップと、を含む。

一実施形態では、方法は、当該関心領域の画像を取得し、処理ユニットによって、当該場所を識別するステップを含む。

一実施形態では、方法は、当該処理ユニットを使用して、関心領域と周囲との間の分離エッジを識別するステップを含む。

方法は、試料表面上の氷粒子汚染を評価し、氷粒子汚染に基づいて、ラメラを選択するステップを含んでもよい。特に、ラメラ部位は、ラメラ上の氷汚染を最小化又は低減するように選択される。

方法は、ＲＯＩ位置に基づいて、ミリング角度を選択するステップを含んでもよい。ＲＯＩ位置は、蛍光顕微鏡技術から得ることができる。ＲＯＩ位置は、ラメラを作成するための最適なミリング角度を自動的に計算するために使用され得る。これは、最適なミリング角度を得るためにステージ及び／又はビームを移動させることを含んでもよい。

一態様によれば、本明細書に開示される方法を実行することができる荷電粒子ビームシステムが提供される。本明細書で開示される荷電粒子ビームシステムは、
－試料担体上に生体試料を保持するための試料ホルダと、
－イオン軸に沿って当該生体試料上に伝播して、当該試料内にラメラを作成する集束イオンビーム（ＦＩＢ）を作成するためのイオンビームカラムと、
－荷電粒子ビーム軸に沿って、当該生体試料上に伝播する荷電粒子ビームを作成するための荷電粒子ビームカラムと、
－当該イオンビーム及び／又は当該荷電粒子ビームによる照射に応答して、当該生体試料から放射される放射線を検出するための検出器と、
－当該顕微鏡の動作を少なくとも部分的に制御するための処理ユニットと、を備える。

本明細書で定義される荷電粒子ビームシステムは、当該処理ユニットによって、ラメラが作成され得る関心領域における生体材料内の場所を識別するように配置されている。増大された視覚的コントラストは、処理ユニットが、例えば、関心領域を含む画像を処理することを可能にし得る。次に、処理ユニットは、生体材料の輪郭を識別することができ、それによって潜在的なラメラの場所を設定することができる。

処理ユニットは、潜在的ラメラの場所を設定するように配置されてもよい。これにより、ユーザ相互作用は必要とされず、ラメラ識別を自動的に行うことができる。

一実施形態では、処理ユニットは、当該ラメラを作成するために試料を微細加工するための当該集束イオンビームを制御するように配置され、当該処理ユニットによって識別される当該ラメラの場所が使用される。これは、半自動ラメラ作成プロセスが実行されることを可能にし、最小限のユーザ対話を必要とする。

ここで、本明細書の方法及び装置が、例示的な実施形態及び添付の概略図面に基づいてより詳細に説明される。

二重ビーム荷電粒子ビームシステムの一実施形態の長手方向断面立面図である。 一実施形態によるミリング手順を示す。 一実施形態によるミリング手順を示す。 一実施形態によるミリング手順を示す。 一実施形態によるミリング手順を示す。 一実施形態によるミリング手順を示す。 一実施形態によるミリング手順を示す。 一実施形態による試料に対するミリング手順の電子顕微鏡画像を示す。 一実施形態による試料に対するミリング手順の電子顕微鏡画像を示す。 一実施形態による試料に対するミリング手順の電子顕微鏡画像を示す。 試料上の汚染の一実施形態を示す。 試料上のラメラ配置の一実施形態を示す。 ラメラ角度配置の一実施形態を示す。 ラメラ角度配置の一実施形態を示す。 ラメラ角度配置の一実施形態を示す。

図１は、荷電粒子ビームシステムの一実施形態の非常に概略的な図を示す。ここでは、二重ビーム荷電粒子顕微鏡（ＣＰＭ）が示されている。より具体的には、ＦＩＢ－ＳＥＭの一実施形態を示す。顕微鏡Ｍは、粒子光学軸３’に沿って伝播する荷電粒子のビーム３（この場合、電子ビーム）を作り出す粒子光学カラム１を備える。カラム１は、試料６を保持／位置決めするための試料ホルダ７及び関連付けられたアクチュエータ７を備える真空チャンバ５に取り付けられている。真空チャンバ５は、真空ポンプ（図示せず）を使用して排気される。電圧源１７を用いて、試料ホルダ７、又は少なくとも試料６は、必要に応じて、地面に対して所定電位にバイアス（浮遊）され得る。また、真空ポート５’も図示されており、これは、用品（部品、試料）の、真空チャンバ５の内部への／からの導入／取り出しのために開放され得る。顕微鏡Ｍは、必要に応じて、複数のそのようなポート５’を備えてもよい。

カラム１（この場合）は、電子源９（例えば、ショットキーガン）及び照明器２を備える。この照明器２は、（とりわけ）電子ビーム３を試料６に集束させるためのレンズ１１及び１３と、偏向ユニット１５（ビーム３のビームステアリング／走査を実行するため）と、を備える。顕微鏡Ｍは、とりわけ、偏向ユニット１５、レンズ１１、１３、及び検出器１９、２１を制御し、検出器１９、２１から収集された情報を表示ユニット２７上に表示するための処理ユニット２５を更に備える。

検出器１９、２１は、（入射する）ビーム３による照射に応答して試料６から放射される異なるタイプの「誘導された」放射線を検査するために使用することができる様々な潜在的な検出器タイプから選択される。ここに描かれた装置では、以下の（制限しない）検出器の選択がなされた、
検出器１９は、試料６から放射されるカソードルミネッセンスを検出するために使用される固体検出器（フォトダイオードなど）である。代替的に、例えば、シリコンドリフト検出器（Silicon Drift Detector、ＳＤＤ）又はシリコンリチウム（Silicon
Lithium、Ｓｉ（Ｌｉ））検出器などのＸ線検出器であり得る。

検出器２１は、例えば、固体光電子増倍管（Solid State
Photomultiplier、ＳＳＰＭ）又は真空光電子増倍管（Photomultiplier Tube、ＰＭＴ）の［例えば、Ｅｖｅｒｈａｒｔ－Ｔｈｏｒｎｌｅｙ検出器］形態の電子検出器である。これは、試料６から放射される後方散乱及び／又は二次電子を検出するために使用され得る。

当業者は、例えば、環状／セグメント化された検出器を含む、図示されたような設定において多くの異なるタイプの検出器を選択することができることを理解するであろう。

試料６上でビーム３をスキャンすることにより、例えば、Ｘ線、赤外線／可視／紫外線、二次電子（ＳＥ）及び／又は後方散乱電子（ＢＳＥ）を含む誘導放射が、試料６から放射される。そのような誘導放射は、（該走査運動のために）位置に敏感であるため、検出器１９、２１から得られる情報も、位置に依存するであろう。この事実は、（例えば）検出器２１からの信号を使用して、試料６（の一部）のＢＳＥ画像を作成することを可能にし、この画像は、基本的に、試料６上の走査経路位置の関数としての該信号のマップである。

検出器１９、２１からの信号は制御ライン（バス）２５’に沿って通過し、処理ユニット２５によって処理され、表示ユニット２７上に表示される。そのような処理は、結合、積分、減算、偽色付け、エッジ強調、及び当業者に知られている他の処理などの操作を含み得る。更に、自動認識プロセス（例えば、粒子分析に使用されるような）は、そのような処理に含まれてもよい。

上述の電子カラム１に加えて、顕微鏡Ｍはまた、イオン光学カラム３１も備える。これは、イオン源３９及び照明器３２を備え、これらは、イオン光軸３３’に沿ってイオンビーム３３を生成／指向する。ホルダ７上の試料６への容易なアクセスを容易にするために、イオン軸３３は、電子軸３に対して傾斜している。上述したように、このようなイオン（ＦＩＢ）カラム３１は、例えば、イオンカラム３１を使用して、試料６に対して、切開、ミリング、エッチング、堆積などの、処理／機械加工操作を実行することができる。更に、イオンカラム３１を使用して、試料６の画像を生成することができる。イオンカラム３１は、例えば、イオン源３９がいわゆるＮＡＩＳ源として構成されている場合、様々な異なるイオン種を随意に生成することが可能であり得ることに留意されたい。したがって、イオンビーム３３への言及は、必ずしも、任意の所与の時間に当該ビーム内の特定の種を指定するものとしてみなされるわけではなく、－言い換えると、ビーム３３は、動作Ａ（ミリングなど）のためのイオン種Ａ、及び動作Ｂ（注入など）のためのイオン種Ｂを含む可能性があり、この場合、種Ａ及びＢは、種々の可能な選択肢から選択され得る。

同様に、図示されているのは、気体圧入システム（Gas
Injection System、ＧＩＳ）４３であり、そのシステムを使用して、気体アシストエッチング又は堆積を実行する目的で、エッチング気体又は前駆体気体などの気体の局所注入を行うことができる。そのような気体は、リザーバ４３’内に貯蔵／緩衝され得、細いノズル４３’’を通して投与され得、その結果、例えば、軸３及び軸３３’の交点付近に出現する。

荷電粒子ビームシステムは、極低温で生体試料を扱うように配置されている。

例えば、顕微鏡Ｍ（比較的大きな体積の）内部の制御された環境の使用、例えば、数ミリバールの背景圧力（環境ＳＥＭ又は低圧力ＳＥＭ内で使用されるような）を維持することなどの、そのような設定の多くの改良点及び代替案が、当業者にとって既知であることに留意されたい。

いずれにしても、図１に開示される荷電粒子ビームシステムは、
－試料担体６上に提供される生体試料を保持するための試料ホルダ７と、
－イオン軸３３’に沿って当該生体試料上に伝播して、当該試料内にラメラを作成する集束イオンビーム（ＦＩＢ）を作成するためのイオンビームカラム３１と、
－荷電粒子ビーム軸３’に沿って、当該生体試料上に伝播する荷電粒子ビームを作成するための荷電粒子ビームカラム１と、
－当該イオンビーム及び／又は当該荷電粒子ビームによる照射に応答して、当該生体試料から放射される放射線を検出するための検出器２１と、
－当該顕微鏡の動作を少なくとも部分的に制御するための処理ユニット２５と、を備える。

以下でより詳細に説明するように、処理ユニット２５は、試料を機械加工することによって得られた、増大された視覚的コントラストを使用して、ラメラが作成され得る関心領域における生体材料内の場所を識別するように配置されている。

図２ａ～２ｆは、本明細書に開示されるような方法の一実施形態を概略的に示す。次に、実施形態及びその変形例について説明する。示されるステップでは、荷電粒子顕微鏡（電子顕微鏡など）が、実行されるステップのうちの少なくとも１つ以上の間に試料を撮像するために使用されることができる。示された実施形態において、図は、顕微鏡によって得ることができるそのような画像を概略的に表す。

図２ａは、その上に生体材料１０４が設けられている、試料担体１００（当業者に知られている）の比較的小さな部分の上面図を示している。生体材料１０４は、例えば、そこから潜在的ラメラ１４０（ここでは破線で示される）を抽出することができる生体細胞を含む。

したがって、図２ａは、試料担体１００の試料エリア１０１を示しており、試料エリア１０１は、ラメラ１４０が作成され得る関心領域１０２（生体細胞）を含む。この試料エリア１０１は、ユーザによって、例えば、電子顕微鏡を使用することによって視覚的に位置特定され得る。したがって、図２ａは、顕微鏡を使用するときにユーザが見ることができる画像の概略図を表しており、実際には、試料担体１００の上から見下ろした図である。ユーザが試料エリア１０１において潜在的なラメラ１４０を識別すると、次のステップが実行され得る。図２ａに示される関心領域は、生体材料と一致し、高度に画定されることに留意されたい。しかしながら、実際には、関心領域と生体材料との区別はあまり明確でない場合がある（例えば、図３ａ参照）。

図２ｂは、関心領域１０２を取り囲む試料エリア１０１の一部における材料が除去されるように、試料担体１００の一部を微細加工することを含む、本明細書に開示される方法におけるステップを示す。このステップでは、集束イオンビームが使用されてもよい。試料担体１００は、試料担体１００によって画定された平面がイオンビーム軸３３’に対して実質的に直交する（又は、例えば、７５～９０度の範囲の角度で、少なくともほぼ直交する）ように位置決めされてもよい。他の実施形態では、使用されるハードウェアがより大きなミリング角度の使用を制限する場合、約５０度の角度を使用することができる。集束イオンビームは、前部１１１及び後部１１２を除去するために使用される。関心領域１０２の前方及び後方の材料を除去することによって、関心領域における生体材料とその周囲との間の視覚的コントラストが増大される。これは、図２ｂで得られた状況の斜視図を提供する図２ｃで見ることができる。セル１０２のエッジが、特に後部１１２の除去によって明確に見えることが分かる。

図２ｄは、ラメラを作製することができる生体材料１０４の境界１２１を識別する（任意選択の）ステップを示す。境界１２１は、関心領域１０２と試料エリア１０１との間の分離エッジ１２１のように作用する。この境界のこの識別は、ラメラを掘削する（excavate；切り抜く）正確な場所を決定するのに有益である。コントラストの増大は、このステップを実行する際に有益である。このステップは、ユーザによって手動で実行することができるが、処理ユニットによって（すなわち、自動的に）実行することもできる。

図２ｅは、セル１０４の高さが、場所、視野角、セルの検出されたエッジなどのいくつかのパラメータを使用して測定され得ることを示す。このステップは、例えば、画面上で高さを入力するためにグラフィカルユーザインターフェースを使用することによって、ユーザによって手動で実行されることができ、その後、処理ユニットは、ユーザの入力に基づいて実際の高さを決定することができる。代替的に、このステップは、処理ユニットによって（すなわち自動的に）実行され得る。

図２ｆは、ラメラ１４０の配置、すなわち、生体材料１０４内の所望のラメラ１４０の位置の識別を示す。識別されると、試料を微細加工して当該ラメラを作成するために、例えば、ＦＩＢを使用して、微細加工を使用することができる。ここで、ビームは、当該試料担体によって画定された平面に対して直交しない角度で位置決めされる。このために、いわゆるミリング角度が使用されてもよく、このミリング角度は、当業者に知られているように、約１０～２０度であってもよい。

図２ｂで実行される微細加工は、図２ｆで実行される微細加工と比較して異なる角度で行われることが分かる。これは、１つの微細加工ステップから次の微細加工ステップへの集束イオンビームに対する試料担体の向きを変更することによって行うことができる。

上記から、増大された視覚的コントラストは、ラメラ場所を識別するのを助けることになる。

要約すると、図２ａ～図２ｆは、本明細書に開示される方法を示しており、この方法は、
－ビーム、特に集束イオンビーム（ＦＩＢ）を提供するステップと、
－荷電粒子顕微鏡法を使用して、当該試料エリア１０１を位置特定するステップと、
－関心領域における生体材料１０４とその周囲１００との間の視覚的コントラストを増大させるために、関心エリア１００における、かつ関心領域１０２を部分的に取り囲む材料を除去するように、当該試料担体１００を、ビームに対して実質的に直交するように位置決めし、当該ビームを使用して、生体試料の少なくとも一部を微細加工するステップと、
－ビームに対する試料担体１００の相対位置を変化させるステップと、
－荷電粒子顕微鏡法及び当該増大された視覚的コントラストを使用して、ラメラ１４０が作成され得る関心領域における生体材料内の当該場所を識別するステップと、
－当該ビームを使用して、当該ラメラ１４０を作成するために試料を微細加工するステップと、を含む

図３ａ～３ｃは、本明細書に開示される方法の部分の顕微鏡画像を示す。ここで、図３ａは、前部１１１（前パターン１１１）及び後部１１２を示す、ほぼ直交する、又は実質的に直交する図における試料を示す。関心領域１０２は、実際にはあまり画定されておらず、試料領域１０２（すなわち、関心領域の周囲）に徐々に広がっていることが分かる。したがって、ここで見られる後部１１２は、実際に関心領域１０２のわずかに干渉することが予想され得る。生体材料１０４の大部分がそのままであり、ラメラ１４０を掘削することができるので、これは依然として問題ない。図３ａはまた、左側トレンチ１１３及び右側トレンチ１１４を示す。これらのトレンチは、材料応力低減のために一般的に使用されるが、コントラスト差も明らかであるので、基準又は位置合わせパターンとして使用することもできる。

図３ｂは、図３ａの状況の斜視図を示しており、この図から、後部１１２がセル１０４と周囲との間の視覚的コントラストを増大させることが分かる。これにより、セルの上部１０５がはっきりと見える。

図３ｃは、ラメラ１４０を作成するための生体材料１０４の更なる微細加工を示す。

図４は、潜在的なラメラ２４０を有するクライオＥＭ試料を示す。ここでは、試料がその上にいくつかの汚染２３１、２３２を有することが分かる。試料表面上に分布された様々な氷粒子による汚染は、低温電子断層撮影のための低温ラメラ調製物を、ラメラ２４０の品質を破壊する傾向にする。これまでのところ、試料調製又は試料取り扱いは、常に、いくらかの量の不均一な汚染をもたらすようである。

本発明者らは、不均一な汚染を２つの部分に分類することができる：１）スペックル汚染－試料表面全体に分布したかなりの数の非常に小さい氷粒子２３１。スペックル汚染をミリングすると、最終的なラメラはカーテニング効果を有することになり、断層撮影には適さなくなる。

２）大きな氷汚染－試料表面上のどこかに少数の非常に大きな氷粒子２３２。大きな氷汚染の周りをミリングするとき、ビームは、氷粒子の電荷によって影響を受け、したがって、ミリングは、予測不可能な方法で影響を受ける（右トレンチ２１４内に少し見られる）。

通常の自動ミリングプロセスでは、任意のパターン配置の前に、ドリフト補正アルゴリズムを使用して、様々なソースに関連付けられたドリフトを補正することができる。代替実施形態では、機械学習及び画像処理技法を使用して、すでに取得されたドリフト補正画像を利用することができる。ドリフト補正画像は、畳み込みニューラルネットワークを使用して、又は氷粒子２３１、２３２に常に存在する低コントラストを介して、発見的にセグメント化することができる。

セグメント化を使用して、以下によって、画像内に存在する汚染によって引き起こされる問題に対処することができる。
１）パターンを別の場所に再位置決めするようにユーザに促す（スペックル汚染２３１の場合）。
２）パターンを別の場所に自動的に再位置決めする（スペックル汚染２３１の場合）。
３）時間を節約するために、ラメラ２４０のミリング部位をワークフローから除去する（大きな氷汚染２３２の場合）。
４）氷を自動的に除去しようと試みる（大きな氷汚染２３２の場合、氷汚染を除去することができる手順が存在する）。この手順は、各ＤＣＭ再走査間隔中の不均一な汚染の監視を可能にする。

自動パターン配置の一例が図５に示されており、氷汚染（小さなスペックル３３１）が潜在的ラメラ部位３４０を取り囲んでいる。汚染によって引き起こされる問題に対処するための上記の手順は、例えば、ラメラ部位３４０（灰色のボックスによって示される）を自動的に選択することによって、使用することができる。

図６ａ及び図６ｂを参照すると、クライオＥＭラメラ調製において、所望の関心領域（regions of interest、ＲＯＩ）を最適化する実施形態が示されている。研磨されたラメラの内側にできるだけ多くの所望のＲＯＩを含むラメラ６４０を有することが望ましい（図６ｂ参照）。ラメラミリングに使用されるイオンビーム６１１、６１２、６１３と試料平面６００との間の角度は、ミリング角度と呼ばれる（様々な角度が、ステージ傾斜を変更することによって達成される）。多くの場合、ラメラ６４０の最大表面積を可能にするために、（試料表面６００に対して垂直に近い）可能な限り低いミリング角度を目指す。これは、ブラインド（ブルートフォース）ラメラミリング手順のための有効な戦略であり、より大きなラメラを用いると、所望のＲＯＩを含む可能性がより大きくなる。しかしながら、（例えば、蛍光顕微鏡からの）ＲＯＩの位置の知識では、そのようなアプローチは最適ではない。

図６ａ及び図６ｂは、自動方法が最適なラメラミリング角度の画定のためにどのように使用され得るかを示しており、セル６０１において識別されたＲＯＩが使用される。標的化の結果は、試料体積６０１内部の標的化構造（ＲＯＩ）の３Ｄ位置である。

セル６０１内のＲＯＩの場所を使用して、実現可能なミリング角度６１１、６１２、６１３を計算することができる。ここで、ハードウェア定義された限界、達成可能なラメラミリングの条件、及びＲＯＩの既知の３Ｄ位置を使用することができる。これらのＲＯＩは、蛍光顕微鏡法などの同定技術から得ることができる。最良の可能な結果、すなわちラメラ６４０（図６ｂ参照）内に存在するＲＯＩの大部分は、ミリング手順が開始する前に計算することができる。本方法はまた、標的ＲＯＩの体積情報を利用することができる（ラメラの厚さと比較してより大きいＲＯＩの場合）。この方法は、より少ないラメラが実験のために必要とされることを可能にし、これは、ツール時間及びユーザのリソースを有意に低減する。

図６ｃに示されるように、方法は、比較的低いミリング角度αが使用されることを可能にするために、試料平面６００の回転／傾斜βを含んでもよい。ステージ傾斜軸の周りに角度βだけステージを傾斜させることによって、イオンビーム６３３は、所望のラメラ６４０を生成するように向けられ得る。

所望の保護は、添付の特許請求の範囲によって決定される。

Claims (16)

1. クライオ荷電粒子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ＣＰＭ）における分析のためのラメラを作成するために生体試料を微細加工する方法であって、
   －試料担体上に生体試料を提供するステップと、
   －前記試料担体上に試料エリアを位置特定するステップであって、前記試料エリアは、ラメラが作成され得る生体材料を有する関心領域を含む、位置特定するステップと、
   －前記関心領域における前記生体材料とその周囲との間の視覚的コントラストを増大させるために、前記関心領域を取り囲む前記試料エリアの一部における材料を除去するように、前記生体試料の少なくとも一部を微細加工するステップと、
   －前記増大された視覚的コントラストを使用して、ラメラが作成され得る前記関心領域における前記生体材料内の場所を識別するステップと、
   －前記ラメラを作成するために前記生体試料を微細加工するステップと、を含む、方法。
2. 前記微細加工するステップのうちの少なくとも１つにおいて、微細加工ツールを使用するステップを含む、請求項１に記載の方法。
3. 実行される前記ステップのうちの少なくとも１つ以上の間に、前記生体試料を撮像するために荷電粒子顕微鏡を使用するステップを含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 処理ユニットによって、前記関心領域と前記周囲との間の分離エッジを識別するステップを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記識別するステップが、前記荷電粒子顕微鏡によって得られた画像上で実行される、請求項３又は４に記載の方法。
6. １つの微細加工ステップから次の微細加工ステップへと前記試料担体の向きを変更するステップを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記微細加工するステップのうちの少なくとも１つのために、ビーム、特に集束イオンビーム（ＦＩＢ）を提供するステップを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記ラメラを作成する前記ステップにおいて、前記試料担体によって画定された平面に対してある角度で前記ビームを位置決めするステップを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記ビームを、前記試料エリアにおいて材料を除去する前記ステップにおいて、前記試料担体によって画定され、前記関心領域を部分的に取り囲む平面に実質的に直交するように位置決めするステップを含む、請求項７又は８に記載の方法。
10. －ビーム、特に集束イオンビーム（ＦＩＢ）を提供するステップと、
    －荷電粒子顕微鏡法を使用して、前記試料エリアを位置特定するステップと、
    －前記関心領域における前記生体材料とその周囲との間の視覚的コントラストを増大させるために、関心エリアにおける、かつ関心領域を部分的に取り囲む材料を除去するように、前記試料担体を、前記ビームに対して実質的に直交するように位置決めし、前記ビームを使用して、前記生体試料の少なくとも一部を微細加工するステップと、
    －前記ビームに対する前記試料担体の相対位置を変化させるステップと、
    －荷電粒子顕微鏡法及び前記増大された視覚的コントラストを使用して、ラメラが作成され得る前記関心領域における前記生体材料内の前記場所を識別するステップと、
    －前記ビームを使用して、前記ラメラを作成するために前記生体試料を微細加工するステップと、
    を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記関心領域の画像を取得し、処理ユニットによって、前記場所を識別するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記処理ユニットを使用して、前記関心領域と前記周囲との間の分離エッジを識別するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記試料表面上の氷粒子汚染が評価され、前記ラメラを選択する際に考慮される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. ミリング角度が、ＲＯＩ位置に基づいて選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法を実行するための荷電粒子ビームシステムであって、
    －試料担体上に生体試料を保持するための試料ホルダと、
    －イオン軸に沿って前記生体試料上に伝播して、前記生体試料内にラメラを作成する集束イオンビーム（ＦＩＢ）を作成するためのイオンビームカラムと、
    －荷電粒子ビーム軸に沿って、前記生体試料上に伝播する荷電粒子ビームを作成するための荷電粒子ビームカラムと、
    －前記イオンビーム及び／又は前記荷電粒子ビームによる照射に応答して、前記生体試料から放射される放射線を検出するための検出器と、
    －前記荷電粒子顕微鏡の動作を少なくとも部分的に制御するための処理ユニットと、を備え、
    前記処理ユニットは、前記増大された視覚的コントラストを使用して、ラメラが作成され得る前記関心領域における前記生体材料内の場所を識別するように配置されている、荷電粒子ビームシステム。
16. 前記処理ユニットは、前記ラメラを作成するために前記生体試料を微細加工するための前記集束イオンビームを制御するように配置され、前記処理ユニットによって識別される前記ラメラの場所が使用される、請求項１５に記載の荷電粒子ビームシステム。