CN118109515A - 一种基于生物正交技术的病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于生物正交技术的病毒载体及其制备方法和应用。所述病毒载体表面修饰有正交基团，所述正交基团包括Azide、Alkyne、BCN、DBCO、Tz、TCO、Cyclopropene、Norbornene、ketone或hydroxylamine中任意一种或至少两种的组合。本发明利用高效特异的内源性代谢修饰或脂质体膜融合等方法将生物正交基团无损地标记在细胞表面，通过导入病毒包装质粒或病毒载体颗粒，包装产生携带生物正交基团的病毒载体，利用快速、特异、专一的生物正交反应实现病毒载体对宿主细胞的高效低毒转染，进而提高目的基因递送效率。

Description

一种基于生物正交技术的病毒载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于生物正交技术的病毒载体及其制备方法和应用。
背景技术
病毒载体，指利用基因工程技术对病毒进行改造，使其成为外源基因递送的载体，可靠、高效地携带治疗基因并将治疗基因导入靶细胞，进行长期基因表达。工程病毒载体作为一项生物药物递送技术，其具有转染效率高且外源基因表达水平高等优点，广泛应用于基础研究、基因疗法等领域。现阶段病毒包装技术比较成熟的病毒种类包含慢病毒、腺病毒和腺相关病毒。不同病毒载体各有用途、优缺点、包装难度和条件，其中病毒滴度和感染手段对病毒载体功能发挥十分关键，低滴度会降低病毒和细胞有效碰撞概率，减低对靶细胞的感染效率；而缺乏合适的促感染方法会显著增加感染细胞的死亡概率并提高应用所需的成本。
在对难转染的细胞进行病毒转染时，现有技术通常如采用如下手段：1.病毒转染过程中添加阳离子聚合物，利用静电吸附提高转染效率；2.病毒转染过程中添加病毒转导增强剂，改变宿主细胞膜的通透性和细胞内外的跨膜转运；3.平角离心机浓缩沉淀，提高病毒与细胞接触的效率；这些方法均存在不同程度的缺点。方法1仅适用于贴壁细胞，且中和了细胞表面与病毒粒子表面的电荷，影响细胞与病毒的正常生理功能，具有明显的细胞毒性；方法2仅适用于特定的病毒载体，影响细胞膜的通透性和跨膜转运功能，因而在复杂环境中对细胞有明显毒性，且试剂制备成本高，促转染能力有限；方法3时间成本高，需要特殊的仪器设备，对贴壁细胞无效。
生物正交化学(Bioorthogonal Chemistry)，泛指一类可以在活体系统中快速进行的化学反应，该反应可以在生物体内复杂的生理条件下发生，既不会与体内其他成分发生反应，也不会对生物体和目标生物分子产生任何干扰与损伤，基于代谢工程修饰的生物正交化学的标记策略因具有无损、高效、稳定、特异的特点，正日益成为一种理想的体内、外生物修饰策略，它凭借细胞代谢工程在目标分子中无损地引入特定的化学报告基团，然后通过生物正交反应与携带配对基团的目标形成稳定的共价连接物，实现对目标分子的特异标记与捕获。
综上所述，如何克服目前促转染试剂细胞毒性大，方法适用范围窄，易受环境影响，促转染效率低下等缺点，提供一种基于生物正交技术的新型病毒载体及促转染方法，是目前病毒载体领域亟需解决的问题之一。
发明内容
针对目前促转染试剂细胞毒性大，方法适用范围窄，易受环境影响，促转染效率低下等缺点等问题，本发明提供一种基于生物正交技术的病毒载体及其制备方法和应用，以实现病毒载体对多种宿主细胞的高效低毒转染，提高目的基因递送效率。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于生物正交技术的病毒载体，所述病毒载体表面修饰有正交基团，所述正交基团包括Azide、Alkyne、BCN、Tz、DBCO、TCO、Cyclopropene、Norbornene、ketone或hydroxylamine中任意一种或至少两种的组合。
本发明在采用生物正交技术对病毒载体(包括但不限于慢病毒、腺病毒和腺相关病毒)表面进行无损标记，修饰正交基团，可与特定配对基团修饰的靶细胞进行化学连接反应，实现对病毒的高效、温和、特异性功能增强，实现病毒载体对多种宿主细胞的高效低毒转染，提高目的基因递送效率。
第二方面，本发明提供第一方面所述的基于生物正交技术的病毒载体的制备方法，所述方法包括：
对病毒载体包装细胞进行内源性代谢修饰、化学基团修饰或脂质体膜融合修饰，在病毒载体包装细胞表面修饰正交基团，利用修饰后病毒载体包装细胞包装病毒载体，得到所述的基于生物正交技术的病毒载体，所述内源性代谢修饰包括改性糖的代谢修饰、非天然氨基酸的代谢修饰或改性胆碱的代谢修饰中任意一种或至少两种的组合。
可选地，所述正交基团包括Azide、Alkyne、BCN、Tz、DBCO、TCO、Cyclopropene、Norbornene、ketone或hydroxylamine中任意一种或至少两种的组合。
本发明中，利用高效特异的内源性代谢修饰(包括但不限于改性糖的代谢修饰、非天然氨基酸的代谢修饰、改性胆碱的代谢修饰)或脂质体膜融合等方法将生物正交基团无损地标记在细胞表面，通过导入病毒包装质粒或病毒载体颗粒，包装产生携带生物正交基团的病毒载体，利用快速、特异、专一的生物正交反应实现病毒载体对宿主细胞的高效低毒转染，进而提高目的基因递送效率。对于相对复杂的生物体系如血液、人体组织等体系中，这种基因递送增强策略的生物正交反应，可以在生物体内复杂的生理条件下发生，既不会与体内其他成分发生反应，也不会对生物体和目标生物分子产生任何干扰与损伤。
可以理解，能够进行正交化学反应修饰的修饰化合物均适用于本发明。
可选地，所述改性糖选自Ac4ManNAz、Ac4GalNAz、Ac4GlcNAz、Ac4ManNBCN、Ac4GalNBCN、Ac4GlcNBCN、Ac4ManNAl、Ac4GalNAl、Ac4GlcNAl、Ac4GalNAz、Ac4GlcNAz、Ac4ManNCycp、Ac4GalNCycp或Ac4GlcNCycp中任意一种或至少两种的组合。
可选地，所述非天然氨基酸选自Aha和/或HPG。
可选地，所述改性胆碱包括AE-Cho。
可以理解，本领域通用病毒包装细胞均适用于本发明。
可选地，所述病毒包装细胞选自HEK 293T细胞、HEK 293A细胞、Hela细胞、HepG2细胞或Vero细胞中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述包装病毒载体的方法包括：
利用修饰后病毒载体包装细胞与病毒载体颗粒或病毒包装质粒混合。
可选地，所述病毒载体颗粒选自慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒中任意一种或至少两种的组合。
可选地，所述病毒包装质粒选自psPAX2、pMD2.G、pZsGreenI、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pHBAd或pBHGlox中任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供第一方面所述的基于生物正交技术的病毒载体在制备核酸转染产品中的应用。
第四方面，本发明提供一种核酸转染试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的基于生物正交技术的病毒载体。
第五方面，本发明提供第一方面所述的基于生物正交技术的病毒载体在核酸转染中的应用。
第六方面，本发明提供一种核酸转染方法，所述核酸转染方法包括：
利第一方面所述的基于生物正交技术的病毒载体转染宿主细胞，所述宿主细胞表面修饰有正交基团，所述正交基团包括Azide、Alkyne、BCN、Tz、TCO、Cyclopropene、DBCO、Norbornene、ketone或hydroxylamine中任意一种或至少两种的组合。
本发明利用生物正交反应提高病毒载体基因递送高效率，在病毒载体与宿主细胞(包括但不限于原代细胞、免疫细胞、干细胞及肿瘤细胞)感染过程中引入生物正交反应，将宿主细胞与适当浓度的工程化改造病毒载体共孵育，通过生物正交反应高效介导病毒与细胞的黏附与入侵，在短时间内实现对宿主细胞的感染，提高对难转染细胞的基因递送效率。
可选地，所述宿主细胞的修饰方法包括内源性代谢修饰或脂质体膜融合修饰，在宿主细胞细胞表面修饰所述正交基团。
可以理解，本发明核酸转染方法具备普适性，能够对多种细胞进行转染。
可选地，所述宿主细胞选自人肾上皮细胞HEK 293T、单核巨噬细胞瘤细胞RAW264.7、T淋巴细胞瘤细胞Jurkat、肝癌细胞HepG2或乳腺癌细胞MDA-MB-231中任意一种或至少两种的组合。
作为优选的技术方案，所述核酸转染方法包括以下步骤：
(1)对病毒载体包装细胞进行内源性代谢修饰或脂质体膜融合修饰，在病毒载体包装细胞表面修饰正交基团，利用修饰后病毒载体包装细胞包装病毒载体，得到所述的基于生物正交技术的病毒载体；
对宿主细胞进行内源性代谢修饰或脂质体膜融合修饰，在宿主细胞细胞表面修饰正交基团；
(2)利用所述基于生物正交技术的病毒载体转染所述宿主细胞；
所述正交基团包括Azide、Alkyne、BCN、Tz、TCO、Cyclopropene、DBCO、Norbornene、ketone或hydroxylamine中任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明在采用生物正交技术对病毒载体表面修饰正交基团，可与特定配对基团修饰的靶细胞进行化学连接反应，实现对病毒的高效、温和、特异性功能增强，实现病毒载体对多种宿主细胞的高效低毒转染，提高目的基因递送效率；
(2)本发明在病毒载体与宿主细胞感染过程中引入生物正交反应，将宿主细胞与适当浓度的工程化改造病毒载体共孵育，通过生物正交反应高效介导病毒与细胞的黏附与入侵，在短时间内实现对宿主细胞的感染，提高对难转染细胞的基因递送效率。
附图说明
图1为实施例1和实施例2宿主细胞与病毒载体生物正交基团标记的示意图；
图2为实施例3生物正交基团介导病毒载体对靶细胞感染的示意图；
图3为实施例1内源性代谢对HEK 293T的代谢修饰的荧光图；
图4A为实施例2生物正交基团增强病毒对293T细胞的感染能力荧光定量图；
图4B为实施例2内源性代谢对病毒载体代谢修饰的荧光图；
图5A为实施例3生物正交基团增强病毒对RAW264.7细胞的感染能力荧光定量图；
图5B为实施例3生物正交基团增强病毒对Jurkat细胞的感染能力荧光定量图；
图6A为实施例4病毒载体转染宿主细胞效率统计图；
图6B为实施例4病毒载体转染后宿主细胞存活率统计图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例进行细胞内源性代谢修饰生物正交基团，修饰示意图如图1所示。
在HEK 293T细胞培养基中添加糖类衍生物(Ac4ManNAz)至终浓度为30μM，培养48h，分别加入的荧光探针DBCO-AZDye 488，25℃孵育20min，PBS洗涤，加入细胞核染色料Hoechst 33342后孵育染核，以溶剂DMSO处理的细胞作为空白对照(control)，PBS洗涤后，使用激光共聚焦显微镜拍摄成像，如图3所示，通过共聚焦显微镜图像可在实验组细胞膜表面检测到强烈荧光，而对照组仅检测到微弱的背景荧光，证明在实验浓度下，生物正交基团能利用代谢途径高效地整合到HEK 293T细胞膜表面。
实施例2
本实施例利用糖类衍生物对慢病毒载体的代谢修饰，修饰示意图如图1所示。
将糖类衍生物修饰处理的HEK293T细胞用于转染病毒包装质粒，将病毒包装原始质粒pZsGreenI，psPAX2，与PMD2.G依次加入到DMEM培养基中，与脂质体促转染试剂充分混合，制得转染复合物，然后将复合物缓慢滴加到HEK293T细胞培养基中，包装质粒在细胞中表达包装，最终通过细胞的糖类代谢和病毒包装出芽将生物正交基团嵌入到病毒囊膜上。
改造过的病毒载体分别与核酸染料Syto 82在25℃下孵育染色，然后将混合液通过NAP-5除盐柱去除游离的染料；在Syto 82标记过的病毒中加入配对的荧光探针DBCO-AZDye 488，25℃孵育，以未改造的病毒载体为对照(control)，用PBS洗涤后固定封片，将制备好的荧光载玻片样品置于激光共聚焦显微镜下观察，如图4A和4B所示，293T+LV为未经修饰的293T细胞与未经代谢修饰的慢病毒载体转染组，293T+LV-N3为未经修饰的293T细胞与经代谢修饰的慢病毒载体的转染组，293T-BCN+LV为经修饰的293T细胞与未经代谢修饰的慢病毒载体的转染组，293T-BCN+LV-N3为经代谢修饰的293T细胞与经代谢修饰的慢病毒载体转染实验组，可见293T-BCN+LV-N3组中检测到很强的绿色Fluor488荧光信号和红色的Syto 82荧光，转染效率最高，证明了生物正交功能基团已成功修饰到病毒载体。
实施例3
本实施例分析生物正交基团增强病毒对多种类型宿主细胞的感染能力，感染示意图如图2所示。
(1)将实施例1中代谢修饰的HEK 293T细胞2×105个接种于六孔板中，以感染复数为1加入适量的改造病毒载体颗粒的浓缩液。
(2)将代谢修饰的单核巨噬细胞瘤细胞RAW264.7(修饰方法参考实施例1)约2×105个接种于六孔板中，以感染复数为20加入适量的改造病毒载体颗粒的浓缩液。
(3)将代谢修饰的T淋巴细胞瘤细胞Jurkat(修饰方法参考实施例1)约2×105个接种于六孔板中，以感染复数为20加入适量的改造病毒载体颗粒的浓缩液，加入病毒后置于平角离心机2000rpm离心40min，离心后置于37℃培养。
(4)以未经代谢修饰的HEK 293T、RAW264.7、Jurkat细胞为对照。
感染12h后将含病毒培养基更换为完全培养基，继续培养36h，使用倒置荧光显微镜观察绿色荧光的表达情况，流式细胞仪定量检测荧光。如图5A和5B所示，-BCN和-N3分别表示经过代谢修饰，实验处理组GFP基因表达阳性的细胞比例与对照组相比有显著提高，该实验结果证明，在病毒感染病毒过程中引入生物正交反应的基团能有效提高病毒感染效率，且该效果适用于常见的难转染细胞，如单核巨噬细胞瘤细胞RAW264.7、T淋巴细胞瘤细胞Jurkat。
实施例4
本实施例分析生物正交基团提高病毒载体转染的安全性。
以常见商业化促转染试剂聚凝胺(polybrene)为对照，将HEK 293T细胞接种于十二孔板中，向细胞培养基中分别加入说明书指导用量1μg/mL或3μg/mL的聚凝胺，然后分别加入实施例2制备代谢修饰病毒颗粒的浓缩液，12h后将含病毒培养基更换为完全培养基，继续培养36h；使用流式细胞仪定量检测荧光表达，用CCK-8试剂盒(Cell Proliferationand Cytotoxicity Assay Kit)检测细胞活力。
结果如图6A和6B所示，其中control组为未经修饰的293T细胞，293T+LV为未经修饰的293T细胞与未经代谢修饰的慢病毒载体转染组，293T+LV+1μg/mL polybrene为未经修饰的293T细胞、未经代谢修饰的慢病毒载体并添加低浓度促转染试剂的转染组，293T+LV+3μg/mL polybrene为未经修饰的293T细胞、未经代谢修饰的慢病毒载体并添加高浓度促转染试剂的转染组，293T-BCN+LV-N3为经代谢修饰的293T细胞与经代谢修饰的慢病毒载体转染实验组，与聚凝胺试剂处理组相比，生物正交基团修饰组可以在实现更优的促转染效率(83.5±2.72％)的同时，与阴性对照组(88.6±3.03％)相比仅导致极少量的细胞死亡，说明病毒的生物正交基团修饰在提高病毒感染能力的同时，在感染过程中对宿主细胞不具有明显的毒性，具有更好的安全性。
综上所述，本发明利用高效特异的内源性代谢修饰或脂质体膜融合等方法将生物正交基团无损地标记在细胞表面，通过导入病毒包装质粒或病毒载体颗粒，包装产生携带生物正交基团的病毒载体，利用快速、特异、专一的生物正交反应实现病毒载体对宿主细胞的高效低毒转染，进而提高目的基因递送效率。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种基于生物正交技术的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体表面修饰有正交基团；
所述正交基团包括Azide、Alkyne、BCN、Tz、DBCO、TCO、Cyclopropene、Norbornene、ketone或hydroxylamine中任意一种或至少两种的组合。
2.权利要求1所述的基于生物正交技术的病毒载体的制备方法，其特征在于：所述方法包括：
对病毒载体包装细胞进行内源性代谢修饰、化学基团修饰或脂质体膜融合修饰，在病毒载体包装细胞表面修饰正交基团，利用修饰后病毒载体包装细胞包装病毒载体，得到所述的基于生物正交技术的病毒载体；
所述内源性代谢修饰包括改性糖的代谢修饰、非天然氨基酸的代谢修饰或改性胆碱的代谢修饰中任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求2所述的基于生物正交技术的病毒载体的制备方法，其特征在于，所述改性糖选自Ac4ManNAz、Ac4GalNAz、Ac4GlcNAz、Ac4ManNBCN、Ac4GalNBCN、Ac4GlcNBCN、Ac4ManNAl、Ac4GalNAl、Ac4GlcNAl、Ac4ManNCycp、Ac4GalNCycp或Ac4GlcNCycp中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述非天然氨基酸选自Aha和/或HPG；
优选地，所述改性胆碱包括AE-Cho。
4.根据权利要求2所述的基于生物正交技术的病毒载体的制备方法，其特征在于，所述病毒载体包装细胞选自HEK 293T细胞、HEK 293A细胞、Hela细胞、HepG2细胞或Vero细胞中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述包装病毒载体的方法包括：
利用修饰后病毒载体包装细胞与病毒载体颗粒或病毒包装质粒混合；
优选地，所述病毒载体颗粒选自慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述病毒包装质粒选自psPAX2、pMD2.G、pZsGreenI、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pHBAd或pBHGlox中任意一种或至少两种的组合。
5.权利要求1所述的基于生物正交技术的病毒载体在制备核酸转染产品中的应用。
6.一种核酸转染试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的基于生物正交技术的病毒载体。
7.权利要求1所述的基于生物正交技术的病毒载体在核酸转染中的应用。
8.一种核酸转染方法，其特征在于，所述核酸转染方法包括：
利用权利要求1所述的基于生物正交技术的病毒载体转染宿主细胞；
所述宿主细胞表面修饰有正交基团，所述正交基团包括Azide、Alkyne、BCN、Tz、TCO、Cyclopropene、DBCO、Norbornene、ketone或hydroxylamine中任意一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求8所述的核酸转染方法，其特征在于，所述宿主细胞的修饰方法包括内源性代谢修饰或脂质体膜融合修饰，在宿主细胞细胞表面修饰所述正交基团；
优选地，所述宿主细胞选自人肾上皮细胞HEK 293T、单核巨噬细胞瘤细胞RAW264.7、T淋巴细胞瘤细胞Jurkat、肝癌细胞HepG2或乳腺癌细胞MDA-MB-231中任意一种或至少两种的组合。
10.根据权利要求8或9所述的核酸转染方法，其特征在于，所述核酸转染方法包括以下步骤：
(1)对病毒载体包装细胞进行内源性代谢修饰或脂质体膜融合修饰，在病毒载体包装细胞表面修饰正交基团，利用修饰后病毒载体包装细胞包装病毒载体，得到所述的基于生物正交技术的病毒载体；
对宿主细胞进行内源性代谢修饰或脂质体膜融合修饰，在宿主细胞细胞表面修饰正交基团；
(2)利用所述基于生物正交技术的病毒载体转染所述宿主细胞；
所述正交基团包括Azide、Alkyne、BCN、Tz、TCO、Cyclopropene、DBCO、Norbornene、ketone或hydroxylamine中任意一种或至少两种的组合。
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