CN118108959A - 掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶及其制法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶及其制法与应用。所述制法包括：使包含丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸的聚合物混合体系，通过辣根过氧化物酶与过氧化氢酶进行酶催化交联，形成水凝胶网络；使海参状表面粗糙金‑硫化铜异质结构材料掺杂于水凝胶网络中，之后通过辣根过氧化物酶与过氧化氢进行酶催化交联，制得掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶。本发明制备的水凝胶成胶时间可控、内部孔隙分布均匀、机械性能好、生物相容性高，纳米材料的加入不仅提高水凝胶的机械性能以及粘附性，其具有的止血、杀菌、促增殖性能通过与水凝胶的协同，能够程序性的促进伤口的护理及修复，可广泛用于伤口修复或组织工程等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶催化交联可注射水凝胶材料，具体涉及一种掺杂海参状表面粗糙的金-硫化铜异质结构复合材料的基于辣根过氧化物酶与过氧化氢的酶催化交联的可注射水凝胶及其制备方法与应用，属于组织工程材料制备技术领域。
背景技术
水凝胶是一种交联的亲水性聚合物网络，含水量较高，通常被用于伤口敷料。水凝胶在再生医学、药物输送和组织工程上已经成为一种有前途的医学应用支架，因为它们具有许多吸引人的特性，例如3D微孔结构、柔软的稠度、吸收渗出物、冷冻伤口和材料依赖性的生物粘附性。它们可以通过分子聚合链之间的化学、酶促、热或光诱导交联形成。同时，水凝胶为细胞封装、细胞迁移、药物递送(抗生素、纳米颗粒、抗氧化剂等)和组织再生提供了3D微结构框架。可注射水凝胶已被公认为一种人工细胞外基质，与简单的光聚合水凝胶支架相比，它可以更好地覆盖不规则形状的伤口。由于不需要手术植入，它更适合应用于组织工程。由于涉及多种因素，糖尿病患者的伤口愈合难以加速，因此，多功能水凝胶(止血、抗菌、促血管生成、抗炎和再生)的开发对于临床应用尤为重要。
透明质酸是一种天然存在的非硫酸化葡糖胺聚糖。透明质酸遍布全身，具有亲水性并带有净负电荷，可以为组织提供水合作用和结构支持。此外，透明质酸在胚胎发育、炎症、血管生成、细胞-基质相互作用和伤口愈合等许多生物学功能中发挥重要作用。由于其生物学和结构重要性，以及易于修饰，透明质酸已经成为一种具有吸引力的生物医学应用聚合物。酪胺取代的透明质酸可在生理条件下与辣根过氧化物酶和过氧化氢通过酶促交联形成生物相容性水凝胶。由于透明质酸的降解较快，每天大约三分之一的透明质酸总含量会降解和重组，因此，有必要进一步了解和提高组织工程目的的机械稳定性是必要的，这可以通过加入额外的聚合物来实现，例如丝素蛋白。
丝素蛋白是一种源于自家蚕茧的纤维蛋白，可形成具有良好生物相容性、机械强度和在几个月内相对缓慢降解的天然水凝胶。丝基水凝胶可以通过多种方法制备，包括酶促交联、超声处理、改变pH值、涡旋、施加电场以及添加多元醇或表面活性剂。使用辣根过氧化物酶和过氧化氢共价交联酪氨酸残基的酚基团，即丝素蛋白中约5％的氨基酸，形成细胞相容、机械可调的弹性蛋白水凝。由于弹性、缺乏苛刻的交联条件以及与天然组织相似的机械性能，酶交联的丝水凝胶为组织工程应用提供了有用的系统。然而，这些丝水凝胶缺乏细胞特异性表位，并且取决于交联程度和环境条件，由于逐渐结晶，可能会随着时间的推移发生显着的力学变化。通过其他聚合物、肽和蛋白质的交联来调节丝水凝胶可以提供解决这些限制的途径。
基于透明质酸和丝素蛋白的生物材料具有优异的生物相容性、生物降解性、多功能性和仿生特性而成为组织工程应用中调节细胞和生物反应的有吸引力的原始材料。丝素蛋白通常形成具有足够机械强度和缓慢降解速率的生物相容性水凝胶，另一方面，透明质酸通常形成机械强度差和快速降解的水凝胶。
伤口愈合是一个多方面的、受控的和系统的生物过程。由于防御机制受损、血管生成受损、慢性炎症和生长因子分泌不足，糖尿病伤口更容易受到感染且难以自愈。伤口愈合延迟是一项重大挑战，会导致高昂的医疗费用、发病率和死亡率。因此，迫切需要解决糖尿病患者伤口愈合受损的问题。因此，亟需寻找一种纳米材料可以程序性的加速慢性伤口的愈合。
各种金属基抗菌、半导体和粗糙表面纳米材料，包括金属和碳纳米材料(银、金、氧化铜、氧化锌和石墨烯)，已成为一种促进伤口愈合有前途的材料。具有高表面粗糙度的金属基纳米颗粒可以表现出纳米桥效应，可以促进受伤皮肤的粘附，并可以防止血液/液体流失。由于金属纳米粒子和硫化铜纳米材料之间存在较强的局域电磁场产生共振能量转移，形成电子-空穴的分离，显著提高纳米材料的光动力效应，可以有效杀灭细菌。同时利用近红外光激发可有效解决紫外光激发电荷载体导致的皮肤疼痛问题。最近的研究发现，具有粗糙表面纹理的纳米粒子加速伤口愈合的增殖(可以将巨噬细胞极化为抗炎M2表型)和重塑阶段(促进胶原蛋白沉积)。然而，这些研究基于平面模型，不适用于它们的生物医学应用。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种掺杂纳米材料的基于辣根过氧化物酶与过氧化氢的酶催化交联可注射水凝胶及其制备方法，以克服当前水凝胶技术中的不足。
本发明的另一个目的在于提供所述掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明实施例提供了一种掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶的制备方法，其包括：
提供丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸；
使包含丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸的聚合物混合体系，通过辣根过氧化物酶与过氧化氢酶进行酶催化交联，形成水凝胶网络；
使海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料掺杂于水凝胶网络中，之后通过辣根过氧化物酶与过氧化氢进行酶催化交联，制得掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶。
本发明实施例还提供了由前述制备方法制得的掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶，其包括丝素蛋白-透明质酸水凝胶，以及掺杂的海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。
进一步地，所述掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为25～200μm，所述掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶的机械强度为0.8～2.2kPa。
本发明实施例还提供了前述的掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶于制备具有伤口止血、杀菌、细胞增殖迁移或伤口修复等功能的产品中的应用。
较之现有技术，本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的基于辣根过氧化物酶与过氧化氢的酶催化交联的可注射水凝胶的水凝胶，通过将酪胺修饰到透明质酸上，并不同比例的掺入丝素蛋白，解决了透明质酸本身脆性较大的弊端，形成了水溶性好且可注射的丝素蛋白-透明质酸水凝胶；
2)本发明提供了一种基于辣根过氧化物酶与过氧化氢的酶催化可注射水凝胶，并实现与海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的共混，具有运载体的效应，制备方法简单，具有普适性；
3)本发明所获的基于辣根过氧化物酶和过氧化氢的酶催化可注射水凝胶，所包含的表面粗糙异质结构金-硫化铜纳米材料，具有优异止血、抗菌性能，同时促进糖尿病伤口的愈合，应用于伤口护理。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施例中掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶的制备机理示意图。
图2是本发明一典型实施例中所获25％丝素蛋白的丝素蛋白-透明质酸水凝胶的微观形貌图。
图3是本发明一典型实施例中所获海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1的能量色散X射线光谱图。
图4是本发明一典型实施例中所获海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2的能量色散X射线光谱图。
图5a是本发明一典型实施例中所合成的海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料-2的微观形貌图。
图5b是本发明一典型实施例中所合成的海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料-1的微观形貌图。
图6是本发明一典型实施例中海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1的储能模量测试结果图。
图7是本发明一典型实施例中25％丝素蛋白-75％透明质酸水凝胶的流变结果图。
图8是本发明一典型实施例中25％丝素蛋白-75％透明质酸水凝胶、海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2进行剪切速率相关的粘度变化测试结果图。
图9是本发明一典型实施中海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2的粘附性能测试图。
图10a和图10b是本发明一典型实施例中海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2的抗菌性能测试图。
图11是本发明一典型实施例中海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2的细胞划痕实验结果图。
图12是本发明一典型实施例中掺有海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1的ELISA检测结果图。
图13是本发明一典型实施例中海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1的伤口愈合结果图。
具体实施方式
针对现有透明质酸水凝胶与丝素蛋白水凝胶技术的诸多缺陷，本案发明人经过长期的研究和大量的实践，得以提出本发明的技术方案，提供一种基于海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料用于可注射水凝胶的制备方法和应用，以解决当前医学中慢性糖尿病伤口难以愈合的难题。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。但是应当理解的是，在本发明范围内本案上述的各技术特征和下文(实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互合作，从而构成新的或者优越的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
作为本发明技术方案的一个方面，所涉及的是一种基于辣根过氧化物酶与过氧化氢的酶催化交联的可注射水凝胶，其包括聚合物和水，所述聚合物由丝素蛋白和透明质酸形成。
作为优选方案之一，所述基于辣根过氧化物酶与过氧化氢的酶催化交联可注射水凝胶具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为25～200μm，所述水凝胶的机械强度为0.8～2.2kPa。
作为本发明技术方案的另一个方面，其所涉及的是一种掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶的制备方法，其包括：
提供丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸；
使包含丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸的聚合物混合体系，通过辣根过氧化物酶与过氧化氢酶进行酶催化交联，形成水凝胶网络；
使海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料掺杂于水凝胶网络中，之后通过辣根过氧化物酶与过氧化氢进行酶催化交联，制得掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶。
本发明主要是以透明质酸、丝素蛋白和海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料颗粒为原料，首先在透明质酸上修饰酪胺，随后掺入不同量的丝素蛋白，再用辣根过氧化物酶与过氧化氢进行酶催化反应得到稳定的可注射水凝胶，同时以海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料对该水凝胶的治疗行为进行研究。
作为优选方案之一，所述掺入纳米材料的基于辣根过氧化物酶的酶催化交联可注射水凝胶的制备方法具体包括以下步骤：
(1)提供丝素蛋白；
(2)将透明质酸与酪胺共轭，通过透明质酸的羧基和酪胺的胺基之间的酰胺化反应进行，使酪胺修饰到透明质酸上，获得酪胺修饰的透明质酸；
(3)将包含丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸的聚合物混合体系进行混合，通过辣根过氧化物酶与过氧化氢的酶催化交联形成水凝胶网络；
(4)提供海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料；
(5)将海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料掺入水凝胶中，之后通过辣根过氧化物酶与过氧化氢的酶催化交联形成掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶。
作为优选方案之一，步骤(1)具体包括：使天然剥离的蚕茧进行脱胶反应，获得水溶性优良的纯净的丝素蛋白。
具体的，所述制备方法的步骤(1)包括：将天然剥离的蚕茧与中性盐溶液在50～100℃中反应1～3h，获得脱胶处理后纯净溶解于水的丝素蛋白纤维。
进一步地，步骤(1)中，所述中性盐溶液所包含的盐包括硝酸镁、氯化钙、溴化锂等中的任意一种或者两种以上的组合，但不限于此。
进一步地，步骤(1)中，所述中性盐溶液的浓度为8～10mol/L。
进一步地，步骤(1)中，所述丝素蛋白与中性盐溶液的质量体积比为1:2～10w/v％。
作为优选方案之一，所述制备方法的步骤(1)还包括：对脱胶处理后的丝素蛋白纤维进行洗涤，需进行多次用水洗涤，并将所获混合物稀释1～2倍置于截留分子量为7～14kDa透析袋中，并进行离心除去不溶性丝颗粒，之后进行冷冻干燥2～3天，获得纯净的丝素蛋白材料；其中，所述离心的转速为8000～15000rpm/min，时间为15～30min。
作为优选方案之一，步骤(2)包括：将透明质酸与酪胺混合，透明质酸与酪胺的反应需要激活透明质酸分子上的羧基，通过透明质酸的羧基和酪胺的胺基之间的酰胺化反应进行共轭，获得酪胺修饰的透明质酸。
进一步地，所述制备方法的步骤(2)具体包括：将透明质酸的羧基进行活化，修饰酪胺，获得酪胺修饰的透明质酸。
进一步地，所述透明质酸与酪胺的质量比为1：0.1～1：3w/w％。
进一步地，所述透明质酸的分子量为1～20kDa。
进一步地，所述制备方法包括：透明质酸与酪胺的反应需要激活透明质酸分子上的羧基，在室温环境25～35℃条件下对透明质酸的羧基进行激活，反应1～3h，之后加入酪胺，在室温环境25～35℃黑暗状态下搅拌反应12～24h，获得酪胺修饰的透明质酸。
作为优选方案之一，所述制备方法具体包括：将透明质酸加入2-吗啉代乙磺酸缓冲液中，之后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，在25～35℃搅拌0.5～3h，激活透明质酸上的羧基。
进一步地，所述透明质酸的活化所用的2-吗啉代乙磺酸缓冲液的浓度为1～100mmol/L，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与透明质酸的质量比为1：1～3：1，所述N-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的质量比为0.5：1～1.5：1。
具体的，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺所用的质量为1～3g，N-羟基琥珀酰亚胺所用的质量为1～2g。
进一步地，所述制备方法的步骤(2)还包括：在所述酰胺化反应结束后，将所获混合物依次在氯化钠溶液中透析2～3天、25％乙醇溶液透析2～3天，最后在去离子水中透析2～3天，其中采用的透析袋的截留分子量为3.5～10kDa，之后进行冷冻干燥2～4天，获得酪胺修饰的透明质酸。其中，所述混合物的pH值为7.5～8.5。
作为优选方案之一，步骤(3)具体包括：将丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸混合，形成聚合物混合体系，之后加入辣根过氧化物酶和过氧化氢，混合得到交联反应体系，其中，所述交联反应体系中丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸的最终总浓度为1～5％w/v％，辣根过氧化物酶的终浓度为0.01U～2U，过氧化氢的终浓度为0.01mM～10mM。
作为优选方案之一，所述酶催化交联的温度为25～35℃，时间为15s～10min。丝素蛋白-酪胺修饰的透明质酸的其成胶时间在15s～10min。
作为优选方案之一，步骤(4)包括：采用种子生长方法合成金纳米棒，之后在金纳米棒上生长硫化铜纳米材料，获得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。
具体的，步骤(4)具体包括：
将金源与十六烷基三甲基溴化铵(作为表面活性剂)混合，之后在混合物中加入硼氢化钠，静置生长，形成种子溶液；
使金源、十六烷基三甲基溴化铵、银盐和对苯二酚进行反应，获得金纳米棒生长溶液；
使所述种子溶液与金纳米棒生长溶液混合并进行避光反应，制得金纳米棒；
在所述金纳米棒表面生长硫化铜纳米材料，获得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。
进一步地，步骤(4)具体包括：合成的种子溶液在使用前需在37℃环境中保存30min，且在120min之内使用；所获得金纳米棒的生长溶液进行避光反应的温度为40～50℃，避光反应时间为12～24h；随后在金纳米棒表面生长硫化铜纳米材料，所获得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。
进一步地，在所述种子溶液中，金源的浓度为0.1～0.5mmol/L，十六烷基三甲基溴化铵的浓度为0.01～0.2mmol/L，硼氢化钠的浓度为1～10mmol/L。
进一步地，所述静置生长的温度为30～37℃，时间为30～120min。
进一步地，在所述金纳米棒生长溶液中，十六烷基三甲基溴化铵的浓度为0.1～0.5mol/L，金源的浓度为0.1～1mmol/L，银盐的浓度为0.01～0.1mol/L，苯二酚的浓度为0.01～0.1mol/L。
进一步地，所述金源包括三水氯化金，但不限于此。
进一步地，所述银盐包括硝酸银，但不限于此。
进一步地，所述三水氯化金与十六烷基三甲基溴化铵的体积总和为1～5mL。
进一步地，所述加入的种子溶液为25～200μL。
作为优选方案之一，步骤(4)具体包括：使所述金纳米棒与十六烷基三甲基溴化铵溶液混合，之后与四氯铂酸盐和铜源溶液进行反应，最后，利用硫源进行硫化，获得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料；其中，反应温度为95～120℃，反应时间为1～3h。
进一步地，所述十六烷基三甲基溴化铵、四氯铂酸钾、铜盐与硫源的摩尔比为0.1～1：1～5：0.1～0.5：0.1～1。
进一步地，所述铜源包括氯化铜，所述四氯铂酸盐包括四氯铂酸钾，所述硫源包括硫化钠，但不限于此。
具体的，所述十六烷基三甲基溴化铵的物质的量为0.1～1mmol/L，四氯铂酸钾的物质的量为1～5mmol/L，氯化铜的物质的量为0.1～0.5mol/L，硫化钠的物质的量为0.1～1mol/L。
具体的，所述利用硫源进行硫化反应温度为30～40℃，反应时间为12～24h。
作为优选方案之一，步骤(5)具体包括：配制不同浓度的海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料溶液，将其与水凝胶网络搅拌混合，形成混合溶液，之后加入辣根过氧化物酶和过氧化氢，进行酶催化交联，制得所述掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶。
进一步地，所述海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料溶液的浓度为25～200μg/mL。
进一步地，所述混合溶液中辣根过氧化物酶的终浓度为0.01U～2U，过氧化氢的终浓度为0.01mM～10mM。
其中，在一些更为具体的实施案例之中，所述基于辣根过氧化物酶与过氧化氢的酶催化交联的可注射水凝胶的制备方法包括以下步骤：
a)将透明质酸钠、2-吗啉代乙磺酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合，得到第一反应产物；
b)将第一反应物和酪胺反应，得到第二反应产物；
c)将第二反应物加入一定量的氢氧化钠，透析，得到溶液后冻干，得到酪胺修饰后的透明质酸；
d)将蚕茧切成薄片并去除其表面，与碳酸钠混合，得到第三反应产物；
e)将第三反应产物与溴化锂反应，离心后去除沉淀物冷冻干燥，得到丝素蛋白材料；
f)将步骤c)的终产物与步骤e)的终产物混合，得到第四反应产物；
g)将第四反应产物与辣根过氧化物酶溶液和过氧化氢溶液混合，交联反应后得到丝素蛋白-透明质酸混合水凝胶。
进一步地，所述透明质酸的的分子量为1～20kDa，所述透明质酸钠的质量为0.1～5，所述的将透明质酸的活化所用的2-吗啉代乙磺酸的浓度为1～100mmol/L，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺所用的质量为1～3g，N-羟基琥珀酰亚胺所用的质量为1～2g。
进一步地，所述步骤b)中所述透明质酸与酪胺的质量比为1：0.1～1：3w/w％。
进一步地，所述步骤d)中碳酸钠的物质的量为0.01～0.02mol/L。
进一步地，所述步骤e)中溴化锂的物质的量为0.01～10mol/L。
进一步地，所述步骤a)的反应时间为0.5～3h；所述步骤b)的反应条件为溶液pH值为8。
进一步地，在所述步骤c)结束后，将所得混合物置于3.5～10KDa透析袋中，在氯化钠(100～150mmol/L)缓冲液中透析2天，25％乙醇溶液透析2天，最后在去离子水中透析2天，冷冻干燥后即得到酪胺修饰的透明质酸材料。
进一步地，所述步骤e)的反应温度为50～100℃，离心转速大小为8000～15000rpm/min；所述步骤f)中的丝素蛋白与修饰有酪胺的透明质酸的比为：0～100％；所述步骤g)中辣根过氧化物酶的终浓度为0.01U～2U，过氧化氢的终浓度为0.01～10mmol/L。
作为优选方案之一，所述一种基于海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料用于可注射水凝胶的制备方法和应用，包括以下步骤：
a)制备金种子溶液用于金纳米棒的生长，将十六烷基三甲基溴化铵、三水氯化金溶液和硼氢化钠溶液进行混合，静置生长，得到第一反应物；
b)将十六烷基三甲基溴化铵、三水氯化金、硝酸银、苯二酚溶液混合，第一反应物，得到第二反应物；
c)将第二反应物与十六烷基三甲基溴化铵混合，得到第三反应物；
d)将第三反应物与四氯铂酸钾、氯化铜混合反应，最后利用硫化钠进行硫化，离心，得到沉淀物后清洗后烘干，得到终产物为海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。
e)将终产物掺入上述所述的丝素蛋白-透明质酸水凝胶中，形成基于海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料用于可注射水凝胶。
进一步地，所述步骤a)的静置生长时间为37℃环境中30～120min。
进一步地，步骤b)中，所述十六烷基三甲基溴化铵、三水氯化金、硝酸银、苯二酚的物质的量的比为：0.1～1mol/L:0.1～5mmol/L:1～100mmol/L:1～100mmol/L，优选的，本发明将十六烷基三甲基溴化铵溶液、三水氯化金溶液和硼氢化钠溶液混合反应，得到金种子溶液，取25～200μL的第一反应物的溶液在步骤b)进行反应，剧烈搅拌3～10min，反应条件为40℃，并避光静置12～24h，使用离心条件为8000～15000rpm/min，8～15min。
进一步地，步骤c)中所述十六烷基三甲基溴化铵的物质的量为1～100mmol/L。
进一步地，步骤d)中所述四氯铂酸钾、氯化铜与硫化钠的摩尔比为1～5：0.1～0.5：0.1～1；所述溶液的总体积为1～50mL，反应条件温度为90～100℃，反应时间为1～2h。
进一步的，步骤d)中所述利用硫化钠进行硫化，反应温度为30～40℃，反应时间为12～24h。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述制备方法制得的掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶，其包括丝素蛋白-透明质酸水凝胶，以及掺杂的海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。
作为优选方案之一，所述海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料为纳米棒状结构，长度尺寸为50～100nm，所述海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料包括金纳米棒，以及包覆于金纳米棒表面的硫化铜壳层，所述硫化铜壳层包覆于金纳米棒表面形成金-硫化铜异质结构，所述硫化铜壳层的厚度为2～8nm。
作为优选方案之一，所述掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为25～200μm，所述掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶的机械强度为0.8～2.2kPa。
本发明的水凝胶成胶时间可控、内部孔隙分布均匀、机械性能好、生物相容性高，同时水凝胶具有的可注射性能，更好地吻合不同的伤口部位，具有普适性。
综上所述，本发明的由酪胺和丝素蛋白组成的复合水凝胶可以保持优异的性能，并使用辣根或氧化物酶和过氧化氢，可以弥补现有技术的不足。
本发明实施例的另一个方面还提供了所述的掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶于制备具有伤口止血、杀菌、细胞增殖迁移或伤口修复等功能的产品中的应用。
进一步地，所述掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶可以用于糖尿病伤口愈合治疗领域，并且不同水凝胶对伤口的止血、杀菌、细胞增殖迁移及伤口修复。
本发明的水凝胶同时可以作为一种运载体、掺入的以纳米材料为代表的内容物，水凝胶的可注射性能可以很好地稳固填充不规则的伤口，纳米材料的加入不仅提高水凝胶的机械性能以及粘附性，同时纳米材料本身具有的止血、杀菌、促增殖性能，通过与水凝胶的协同，能够促进糖尿病为代表的高级伤口的护理及修复，可广泛用于伤口修复或组织工程等领域。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种三维组织工程治疗的载体，其包含前述的基于酶催化反应的可注射水凝胶、海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种糖尿病伤口治疗的方法，其包括：
以前述的基于辣根过氧化物酶和过氧化氢的酶催化交联的可注射水凝胶掺入表海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料进行糖尿病伤口的治疗，并促使所述糖尿病伤口处的止血、验证、增殖迁移和重塑。
本发明所获的基于辣根过氧化物酶和过氧化氢的酶催化可注射水凝胶，所包含的海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料，具有优异止血、抗菌性能，同时促进糖尿病伤口的愈合，应用于伤口护理。
本发明实施例的另一方面还提供了海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶对糖尿病伤口的止血作用、对伤口处的细菌进行杀伤从未达到消炎效果、促进伤口处细胞的增殖和血管的生成等方面的应用以及一些组织修复工程领域中的用途。
在一些实施案例中，所述海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶的止血效果为纳米桥效应，在体外所用模型为小鼠皮肤，同时在糖尿病小鼠体内利用肝出血模型验证其止血效果。
在一些实施方案中，所述的细菌为革兰氏阴性细菌大肠杆菌和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌。
在一些实施案例中，所述的细胞为巨噬细胞(RAW 264.7)和小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)。
在一些实施案例中，所述的细胞培养所用为Transwell细胞培养皿，RAW 264.7细胞以1×104/孔的细胞密度接种在Transwell的上室中，而3T3细胞以5×103/孔的细胞密度接种在Transwell的下室中。
在一些实施案例中，所述糖尿病伤口模型的建立所用小鼠为雄性BALB/c小鼠，体重为20～25g，使用链脲佐菌素诱导的糖尿病动物模型，通过连续5天腹腔注射链脲佐菌素药物，并且监测小鼠的血糖水平。连续两周血糖超过300mg dL-1(16.65mmol L-1)的小鼠用于建造糖尿病伤口模型。
在一些实施案例中，所述海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶所用激光器为808nm近红外光，所用激光器功率为0.75W/cm2，光照时间为10min。
因此，综上所述，本发明通过合成粗糙表面金属异质结构来调节巨噬细胞M2的极化可以促进多阶段的伤口愈合。因此，本案发明人设计了具有海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料，并将其结合到可注射的水凝胶中，该水凝胶可以适应大的伤口表面，控制伤口愈合的多个阶段，并以程序方式加速糖尿病伤口的愈合。本发明打破了伤口治疗材料的单一性，并通过整合可注射的生物活性水凝胶、纳米材料的纳米拓扑结构和等离子体性能，为程序化伤口愈合加速提供了新的见解。
藉由上述技术方案，提供一种基于辣根过氧化物酶与过氧化氢的酶催化交联可注射水凝胶及其制备方法，提供一种基于海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料用于可注射水凝胶的制备方法和应用，用于伤口愈合过程中多阶段的程序加速。天然透明质酸和丝素蛋白的复合材料结合了两种成分的有用特性，并更好地控制了胶凝时间和机械性能。此外，使用酶介导的交联过程(辣根过氧化物酶和氧化氢)可以调整生物物理特性，并增加支架对不同创伤条件的适用性。本发明所提供的可注射水凝胶，由于海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的的加入可以赋予稳定的流变性能，它们与注射水凝胶的协同组合可以有效地封闭糖尿病患者的大伤口，从而实现止血阶段的程序化加速。海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料可注射水凝胶在近红外光照射下可以产生大量的活性氧从而诱导抗菌活性。在增殖和重塑阶段，一种粗糙的海参样结构可以促进巨噬细胞极化为M2表型，促进伤口中的血管生成和胶原蛋白生成。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
对照例1
(1)合成酪胺修饰的透明质酸，透明质酸与酪胺的共轭是通过透明质酸羧基和酪胺的胺基之间的酰胺化反应进行的。简而言之，将2g透明质酸钠(Mw＝34KDa)溶解在80mL2-吗啉代乙磺酸(100mM)缓冲液中，加入2.86g 1-1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1.72g的N-羟基琥珀酰亚胺。在室温下搅拌溶液1h以激活透明质酸分子上的羧基。
(2)向上述混合物中加入1.72g酪胺，并用氢氧化钠(NaOH)溶液将pH调节至约8。将反应混合物在室温在黑暗中搅拌过夜。
(3)上述反应结束后，将混合物置于3.5kDa透析袋中，在氯化钠(100mM)缓冲液中透析2天，25％乙醇溶液透析2天，最后在去离子水中透析2天。最后进行冷冻干燥3天，得到修饰酪胺的透明质酸材料，为细粒白色丝状物，4℃避光保存备用丝素蛋白材料的制备。
(4)丝素蛋白材料的制备，将蚕茧进行剥离切成薄片并去除其内表面。然后将去皮的茧(10g)在5L碳酸钠(0.02M)中煮沸(95℃)1h，以去除胶状丝胶并获得脱胶纤维。然后将获得的生物材料用水洗涤数次，直到产品表面没有油腻的透明材料。将脱胶的丝纤维通风并在室温下干燥过夜。
(5)将1g脱胶后得丝素溶解在5mL溴化锂(9.3M)溶液中，并用磁力搅拌下在65℃下保持4h。反应完成后，将溶液稀释至1.5倍并放入透析袋中(MV 3.5kDa)透析。最后，通过离心(9000rpm，20min)除去不溶性丝颗粒。最后将丝素蛋白材料经冷冻干燥2天后得到，4℃保存备用。
(6)丝素蛋白-透明质酸水凝胶的制备，丝素蛋白-酪胺修饰的透明质酸水凝胶聚合物的总浓度为2％w/v，在此，丝素蛋白所占的比率为0％，使用辣根过氧化物酶(1U mL-1)和氧化氢(1mM)的浓度进行酶催化成胶反应。
对照例2
(1)合成酪胺修饰的透明质酸，透明质酸与酪胺的共轭是通过透明质酸羧基和酪胺的胺基之间的酰胺化反应进行的。简而言之，将2g透明质酸钠(Mw＝34KDa)溶解在80mL2-吗啉代乙磺酸(100mM)缓冲液中，加入2.86g 1-1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1.72g的N-羟基琥珀酰亚胺。在室温下搅拌溶液1h以激活透明质酸分子上的羧基。
(2)向上述混合物中加入1.72g酪胺，并用氢氧化钠(NaOH)溶液将pH调节至约8。将反应混合物在室温在黑暗中搅拌过夜。
(3)上述反应结束后，将混合物置于3.5kDa透析袋中，在氯化钠(100mM)缓冲液中透析2天，25％乙醇溶液透析2天，最后在去离子水中透析2天。最后进行冷冻干燥3天，得到修饰酪胺的透明质酸材料，为细粒白色丝状物，4℃避光保存备用丝素蛋白材料的制备。
(4)丝素蛋白材料的制备，将蚕茧进行剥离切成薄片并去除其内表面。然后将去皮的茧(10g)在5L碳酸钠(0.02M)中煮沸(95℃)1h，以去除胶状丝胶并获得脱胶纤维。然后将获得的生物材料用水洗涤数次，直到产品表面没有油腻的透明材料。将脱胶的丝纤维通风并在室温下干燥过夜。
(5)将1g脱胶后得丝素溶解在5mL溴化锂(9.3M)溶液中，并用磁力搅拌下在65℃下保持4h。反应完成后，将溶液稀释至1.5倍并放入透析袋中(MV 3.5kDa)透析。最后，通过离心(9000rpm，20min)除去不溶性丝颗粒。最后将丝素蛋白材料经冷冻干燥2天后得到，4℃保存备用。
(6)丝素蛋白-透明质酸水凝胶的制备，丝素蛋白-酪胺修饰的透明质酸水凝胶聚合物的总浓度为2％w/v，在此，丝素蛋白所占的比率为25％，使用辣根过氧化物酶(1U mL-1)和氧化氢(1mM)的浓度进行酶催化成胶反应。
对照例3
(1)合成酪胺修饰的透明质酸，透明质酸与酪胺的共轭是通过透明质酸羧基和酪胺的胺基之间的酰胺化反应进行的。简而言之，将2g透明质酸钠(Mw＝34KDa)溶解在80mL2-吗啉代乙磺酸(100mM)缓冲液中，加入2.86g 1-1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1.72g的N-羟基琥珀酰亚胺。在室温下搅拌溶液1h以激活透明质酸分子上的羧基。
(2)向上述混合物中加入1.72g酪胺，并用氢氧化钠(NaOH)溶液将pH调节至约8。将反应混合物在室温在黑暗中搅拌过夜。
(3)上述反应结束后，将混合物置于3.5kDa透析袋中，在氯化钠(100mM)缓冲液中透析2天，25％乙醇溶液透析2天，最后在去离子水中透析2天。最后进行冷冻干燥3天，得到修饰酪胺的透明质酸材料，为细粒白色丝状物，4℃避光保存备用丝素蛋白材料的制备。
(4)丝素蛋白材料的制备，将蚕茧进行剥离切成薄片并去除其内表面。然后将去皮的茧(10g)在5L碳酸钠(0.02M)中煮沸(95℃)1h，以去除胶状丝胶并获得脱胶纤维。然后将获得的生物材料用水洗涤数次，直到产品表面没有油腻的透明材料。将脱胶的丝纤维通风并在室温下干燥过夜。
(5)将1g脱胶后得丝素溶解在5mL溴化锂(9.3M)溶液中，并用磁力搅拌下在65℃下保持4h。反应完成后，将溶液稀释至1.5倍并放入透析袋中(MV 3.5kDa)透析。最后，通过离心(9000rpm，20min)除去不溶性丝颗粒。最后将丝素蛋白材料经冷冻干燥2天后得到，4℃保存备用。
(6)丝素蛋白-透明质酸水凝胶的制备，丝素蛋白-酪胺修饰的透明质酸水凝胶聚合物的总浓度为2％w/v，在此，丝素蛋白所占的比率为50％，使用辣根过氧化物酶(1U mL-1)和氧化氢(1mM)的浓度进行酶催化成胶反应。
实施例1
(1)金种子溶液的制备，将总体积为5mL的三水氯化金(0.5mM)和十六烷基三甲基溴化铵(0.1mM)彻底混合。在上述溶液中加入0.6mL硼氢化钠溶液(10mM)并在37℃水浴中静置30min，然后使用。
(2)合成金纳米棒生长溶液，将5mL十六烷基三甲基溴化铵(0.2M)与5mL三水氯化金(1mM)混合。加入0.12mL硝酸银(0.1M)溶液，充分搅拌，再加入0.6mL对苯二酚(0.1M)溶液。此时溶液颜色由黄色变为无色。剧烈搅拌1min后，加入75μL种子溶液(如上制备)，继续搅拌3min，40℃避光静置12h。最后，通过以8000rpm离心10min收集金纳米棒。
(3)使用收集上述合成的Au纳米棒溶液(5mL)并用水洗涤3次以去除多余的表面活性剂。然后将其重新分散到5mL十六烷基三甲基溴化铵溶液(1mM)中。然后将四氯铂酸钾溶液(5mM，200μL)加入到金纳米棒溶液中，轻轻摇5min，使PtCl4 2-吸附在Au纳米棒上。然后将新制备的500μL氯化铜溶液(0.5M)和去离子水(4.3mL)依次添加到金纳米棒溶液中。溶液的最终总体积为10mL，将其置于100℃的烘箱中1h，反应结束之后，待其冷却至37℃，加入硫化钠(0.5M)进行硫化，反应24h后，以获得具有海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料，可标记为“海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料-1”。
实施例2
(1)金种子溶液的制备，将总体积为5mL的三水氯化金(0.5mM)和十六烷基三甲基溴化铵(0.1mM)彻底混合。在上述溶液中加入0.6mL硼氢化钠溶液(10mM)并在37℃水浴中静置30min，然后使用。
(2)合成金纳米棒生长溶液，将5mL十六烷基三甲基溴化铵(0.2M)与5mL三水氯化金(1mM)混合。加入0.12mL硝酸银(0.1M)溶液，充分搅拌，再加入0.6mL对苯二酚(0.1M)溶液。此时溶液颜色由黄色变为无色。剧烈搅拌1min后，加入75μL种子溶液(如上制备)，继续搅拌3min，40℃避光静置12h。最后，通过以8000rpm离心10min收集金纳米棒。
(3)使用收集上述合成的Au纳米棒溶液(5mL)并用水洗涤3次以去除多余的表面活性剂。然后将其重新分散到5mL十六烷基三甲基溴化铵溶液(1mM)中。然后将四氯铂酸钾溶液(1mM，200μL)加入到金纳米棒溶液中，轻轻摇5min，使PtCl4 2-吸附在Au纳米棒上。然后将新制备的500μL氯化铜溶液(0.1mM，500μL)和去离子水(4.3mL)依次添加到金纳米棒溶液中。溶液的最终总体积为10mL，将其置于100℃的烘箱中1h，反应结束之后，待其冷却至37℃，加入硫化钠(0.5M)进行硫化，反应24h后，以获得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料，可标记为“海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料-2”，该产物的海参状结构不如实施例产物的海参状结构明显，原因可能在于：四氯铂酸以及氯化铜的量都较低，从而在金纳米棒上进行生长的铂的量较少，于是在后续的加入铜之后会发生交换，所以在金纳米棒上生长出来的CuS也相对较少的，导致最终形成的海参状结构没有那么明显，但仍可得到海参状结构。
实施例3
(1)合成酪胺修饰的透明质酸，透明质酸与酪胺的共轭是通过透明质酸羧基和酪胺的胺基之间的酰胺化反应进行的。简而言之，将2g透明质酸(Mw＝3.4KDa)溶解在80mL 2-吗啉代乙磺酸(100mM)缓冲液中，加入2.86g 1-1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1.72g的N-羟基琥珀酰亚胺。在室温(25℃)下搅拌溶液1h以激活透明质酸分子上的羧基。
(2)向上述混合物中加入1.72g酪胺，并用氢氧化钠(NaOH)溶液将pH调节至约8。将反应混合物在室温(25℃)在黑暗中搅拌过夜。
(3)上述反应结束后，将混合物置于3.5kDa透析袋中，在氯化钠(100mM)缓冲液中透析2天，25％乙醇溶液透析2天，最后在去离子水中透析2天。最后进行冷冻干燥3天，得到修饰酪胺的透明质酸材料，为细粒白色丝状物，4℃避光保存备用丝素蛋白材料的制备。
(4)丝素蛋白材料的制备，将蚕茧进行剥离切成薄片并去除其内表面。然后将去皮的茧(10g)在5L碳酸钠(0.02M)中煮沸(95℃)1h，以去除胶状丝胶并获得脱胶纤维。然后将获得的生物材料用水洗涤数次，直到产品表面没有油腻的透明材料。将脱胶的丝纤维通风并在室温下干燥过夜。
(5)将1g脱胶后得丝素溶解在5mL溴化锂(9.3M)溶液中，并用磁力搅拌下在65℃下保持3h。反应完成后，将溶液稀释至1.5倍并放入透析袋中(MV 8.5kDa)透析。最后，通过离心(9000rpm，20min)除去不溶性丝颗粒。最后将丝素蛋白材料经冷冻干燥2天后得到，4℃保存备用。
(6)丝素蛋白-透明质酸水凝胶的制备，丝素蛋白-酪胺修饰的透明质酸水凝胶聚合物的总浓度为2％w/v，在此，丝素蛋白所占的比率为25％。所述酶催化交联的温度为25℃，时间为10min。
(7)金种子溶液的制备，将总体积为5mL的三水氯化金(0.5mM)和十六烷基三甲基溴化铵(0.1mM)彻底混合。在上述溶液中加入0.6mL硼氢化钠溶液(10mM)并在37℃水浴中静置30min，然后使用。
(8)合成金纳米棒生长溶液，将5mL十六烷基三甲基溴化铵(0.2M)与5mL三水氯化金(1mM)混合。加入0.12mL硝酸银(0.1M)溶液，充分搅拌，再加入0.6mL对苯二酚(0.1M)溶液。此时溶液颜色由黄色变为无色。剧烈搅拌1min后，加入75μL种子溶液(如上制备)，继续搅拌3min，40℃避光静置12h。最后，通过以8000rpm离心10min收集金纳米棒。
(9)使用收集上述合成的Au纳米棒溶液(5mL)并用水洗涤3次以去除多余的表面活性剂。然后将其重新分散到5mL十六烷基三甲基溴化铵溶液(1mM)中。然后将四氯铂酸钾溶液(5mM，200μL)加入到金纳米棒溶液中，轻轻摇5min，使PtCl42-吸附在Au纳米棒上。然后将新制备的500μL氯化铜溶液(0.5M)和去离子水(4.3mL)依次添加到金纳米棒溶液中。溶液的最终总体积为10mL，将其置于100℃的烘箱中1h，反应结束之后，待其冷却至37℃，再加入硫化钠(0.5M)进行硫化，反应24h后，以获得具有海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。
(10)将所得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料与优选的掺入25％丝素蛋白的丝素蛋白-透明质酸水凝胶中，形成一种海参状表面粗糙异质结构金-硫化铜纳米材料的可注射水凝胶，使用辣根过氧化物酶(1U mL-1)和氧化氢(1mM)的浓度进行酶催化成胶反应，产物可标记为“海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1”。
实施例4
(1)合成酪胺修饰的透明质酸，透明质酸与酪胺的共轭是通过透明质酸羧基和酪胺的胺基之间的酰胺化反应进行的。简而言之，将2g透明质酸钠(Mw＝34KDa)溶解在80mL2-吗啉代乙磺酸(100mM)缓冲液中，加入2.86g 1-1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1.72g的N-羟基琥珀酰亚胺。在室温下搅拌溶液1h以激活透明质酸分子上的羧基。
(2)向上述混合物中加入1.72g酪胺，并用氢氧化钠(NaOH)溶液将pH调节至约8。将反应混合物在室温在黑暗中搅拌过夜。
(3)上述反应结束后，将混合物置于3.5kDa透析袋中，在氯化钠(100mM)缓冲液中透析2天，25％乙醇溶液透析2天，最后在去离子水中透析2天。最后进行冷冻干燥3天，得到修饰酪胺的透明质酸材料，为细粒白色丝状物，4℃避光保存备用丝素蛋白材料的制备。
(4)丝素蛋白材料的制备，将蚕茧进行剥离切成薄片并去除其内表面。然后将去皮的茧(10g)在5L碳酸钠(0.02M)中煮沸(95℃)1h，以去除胶状丝胶并获得脱胶纤维。然后将获得的生物材料用水洗涤数次，直到产品表面没有油腻的透明材料。将脱胶的丝纤维通风并在室温下干燥过夜。
(5)将1g脱胶后得丝素溶解在5mL溴化锂(9.3M)溶液中，并用磁力搅拌下在65℃下保持4h。反应完成后，将溶液稀释至1.5倍并放入透析袋中(MV 3.5kDa)透析。最后，通过离心(9000rpm，20min)除去不溶性丝颗粒。最后将丝素蛋白材料经冷冻干燥2天后得到，4℃保存备用。
(6)丝素蛋白-透明质酸水凝胶的制备，丝素蛋白-酪胺修饰的透明质酸水凝胶聚合物的总浓度为2％w/v，在此，丝素蛋白所占的比率为25％。
(7)金种子溶液的制备，将总体积为5mL的三水氯化金(0.5mM)和十六烷基三甲基溴化铵(0.1mM)彻底混合。在上述溶液中加入0.6mL硼氢化钠溶液(10mM)并在37℃水浴中静置30min，然后使用。
(8)合成金纳米棒生长溶液，将5mL十六烷基三甲基溴化铵(0.2M)与5mL三水氯化金(1mM)混合。加入0.12mL硝酸银(0.1M)溶液，充分搅拌，再加入0.6mL对苯二酚(0.1M)溶液。此时溶液颜色由黄色变为无色。剧烈搅拌1min后，加入75μL种子溶液(如上制备)，继续搅拌3min，40℃避光静置12h。最后，通过以8000rpm离心10min收集金纳米棒。
(9)使用收集上述合成的Au纳米棒溶液(5mL)并用水洗涤3次以去除多余的表面活性剂。然后将其重新分散到5mL十六烷基三甲基溴化铵溶液(1mM)中。然后将四氯铂酸钾溶液(1mM，200μL)加入到金纳米棒溶液中，轻轻摇5min，使PtCl4 2-吸附在Au纳米棒上。然后将新制备的500μL氯化铜溶液(0.1mM，500μL)和去离子水(4.3mL)依次添加到金纳米棒溶液中。溶液的最终总体积为10mL，将其置于100℃的烘箱中1h，反应结束之后，待其冷却至37℃，再加入硫化钠(0.5M)进行硫化，反应24h后，以获得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料-2。
(10)将所得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料-2与优选的掺入25％丝素蛋白的丝素蛋白-透明质酸水凝胶中，形成一种海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2，使用辣根过氧化物酶(1U mL-1)和氧化氢(1mM)的浓度进行酶催化成胶反应，产物可标记为“海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2”。
实施例5
(1)合成酪胺修饰的透明质酸，透明质酸与酪胺的共轭是通过透明质酸羧基和酪胺的胺基之间的酰胺化反应进行的。简而言之，将2g透明质酸(Mw＝20KDa)溶解在80mL 2-吗啉代乙磺酸(50mM)缓冲液中，加入2g 1-1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1g的N-羟基琥珀酰亚胺。在35℃下搅拌溶液0.5h以激活透明质酸分子上的羧基。
(2)向上述混合物中加入0.2g酪胺，并用氢氧化钠(NaOH)溶液将pH调节至约7.5。将反应混合物在室温(25℃)在黑暗中搅拌12h。
(3)上述反应结束后，将混合物置于5kDa透析袋中，在氯化钠(100mM)缓冲液中透析2天，25％乙醇溶液透析2天，最后在去离子水中透析2天。最后进行冷冻干燥2天，得到修饰酪胺的透明质酸材料，为细粒白色丝状物，4℃避光保存备用丝素蛋白材料的制备。
(4)丝素蛋白材料的制备，将蚕茧进行剥离切成薄片并去除其内表面。然后将去皮的茧(10g)在5L碳酸钠(0.02M)中煮沸(95℃)1h，以去除胶状丝胶并获得脱胶纤维。然后将获得的生物材料用水洗涤数次，直到产品表面没有油腻的透明材料。将脱胶的丝纤维通风并在室温下干燥过夜。
(5)将1g脱胶后得丝素溶解在5mL氯化钙(8M)溶液中，并用磁力搅拌下在50℃下保持3h。反应完成后，将溶液稀释至2倍并放入透析袋中(MV 7kDa)透析。最后，通过离心(8000rpm，30min)除去不溶性丝颗粒。最后将丝素蛋白材料经冷冻干燥3天后得到，4℃保存备用。
(6)丝素蛋白-透明质酸水凝胶的制备，丝素蛋白-酪胺修饰的透明质酸水凝胶聚合物的总浓度为1％w/v。所述酶催化交联的温度为35℃，时间为15s。
(7)金种子溶液的制备，将总体积为5mL的三水氯化金(0.3mM)和十六烷基三甲基溴化铵(0.2mM)彻底混合。在上述溶液中加入0.6mL硼氢化钠溶液(5mM)并在30℃水浴中静置120min，然后使用。
(8)合成金纳米棒生长溶液，将5mL十六烷基三甲基溴化铵(0.1M)与5mL三水氯化金(0.5mM)混合。加入0.12mL硝酸银(0.05M)溶液，充分搅拌，再加入0.6mL对苯二酚(0.05M)溶液。此时溶液颜色由黄色变为无色。剧烈搅拌1min后，加入75μL种子溶液(如上制备)，继续搅拌3min，45℃避光静置24h。最后，通过以8000rpm离心10min收集金纳米棒。
(9)使用收集上述合成的Au纳米棒溶液(5mL)并用水洗涤3次以去除多余的表面活性剂。然后将其重新分散到5mL十六烷基三甲基溴化铵溶液(0.5mM)中。然后将四氯铂酸钾溶液(2mM，200μL)加入到金纳米棒溶液中，轻轻摇5min，使PtCl42-吸附在Au纳米棒上。然后将新制备的500μL氯化铜溶液(0.2M)和去离子水(4.3mL)依次添加到金纳米棒溶液中。溶液的最终总体积为10mL，将其置于120℃的烘箱中1h，反应结束之后，待其冷却至30℃，再加入硫化钠(0.1M)进行硫化，反应20h后，以获得具有海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。
(10)将所得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料与优选的掺入25％丝素蛋白的丝素蛋白-透明质酸水凝胶中，形成一种海参状表面粗糙异质结构金-硫化铜纳米材料的可注射水凝胶，使用辣根过氧化物酶(2U mL-1)和氧化氢(10mM)的浓度进行酶催化成胶反应。
实施例6
(1)合成酪胺修饰的透明质酸，透明质酸与酪胺的共轭是通过透明质酸羧基和酪胺的胺基之间的酰胺化反应进行的。简而言之，将2g透明质酸(Mw＝20KDa)溶解在80mL 2-吗啉代乙磺酸(1mM)缓冲液中，加入6g 1-1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和3g的N-羟基琥珀酰亚胺。在30℃下搅拌溶液3h以激活透明质酸分子上的羧基。
(2)向上述混合物中加入6g酪胺，并用氢氧化钠(NaOH)溶液将pH调节至约8.5。将反应混合物在35℃在黑暗中搅拌24h。
(3)上述反应结束后，将混合物置于10kDa透析袋中，在氯化钠(100mM)缓冲液中透析3天，25％乙醇溶液透析3天，最后在去离子水中透析3天。最后进行冷冻干燥4天，得到修饰酪胺的透明质酸材料，为细粒白色丝状物，4℃避光保存备用丝素蛋白材料的制备。
(4)丝素蛋白材料的制备，将蚕茧进行剥离切成薄片并去除其内表面。然后将去皮的茧(10g)在5L碳酸钠(0.02M)中煮沸(95℃)1h，以去除胶状丝胶并获得脱胶纤维。然后将获得的生物材料用水洗涤数次，直到产品表面没有油腻的透明材料。将脱胶的丝纤维通风并在室温下干燥过夜。
(5)将1g脱胶后得丝素溶解在5mL硝酸镁(10M)溶液中，并用磁力搅拌下在100℃下保持1h。反应完成后，将溶液稀释至2倍并放入透析袋中(MV 10kDa)透析。最后，通过离心(15000rpm，15min)除去不溶性丝颗粒。最后将丝素蛋白材料经冷冻干燥3天后得到，4℃保存备用。
(6)丝素蛋白-透明质酸水凝胶的制备，丝素蛋白-酪胺修饰的透明质酸水凝胶聚合物的总浓度为5％w/v。所述酶催化交联的温度为30℃，时间为2min。
(7)金种子溶液的制备，将总体积为5mL的三水氯化金(0.1mM)和十六烷基三甲基溴化铵(0.01mM)彻底混合。在上述溶液中加入0.6mL硼氢化钠溶液(1mM)并在35℃水浴中静置80min，然后使用。
(8)合成金纳米棒生长溶液，将5mL十六烷基三甲基溴化铵(0.5M)与5mL三水氯化金(0.1mM)混合。加入0.12mL硝酸银(0.01M)溶液，充分搅拌，再加入0.6mL对苯二酚(0.01M)溶液。此时溶液颜色由黄色变为无色。剧烈搅拌1min后，加入75μL种子溶液(如上制备)，继续搅拌3min，50℃避光静置20h。最后，通过以8000rpm离心10min收集金纳米棒。
(9)使用收集上述合成的Au纳米棒溶液(5mL)并用水洗涤3次以去除多余的表面活性剂。然后将其重新分散到5mL十六烷基三甲基溴化铵溶液(0.1mM)中。然后将四氯铂酸钾溶液(3mM，200μL)加入到金纳米棒溶液中，轻轻摇5min，使PtCl42-吸附在Au纳米棒上。然后将新制备的500μL氯化铜溶液(0.4M)和去离子水(4.3mL)依次添加到金纳米棒溶液中。溶液的最终总体积为10mL，将其置于95℃的烘箱中3h，反应结束之后，待其冷却至40℃，再加入硫化钠(0.5M)进行硫化，反应12h后，以获得具有海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。
(10)将所得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料与优选的掺入25％丝素蛋白的丝素蛋白-透明质酸水凝胶中，形成一种海参状表面粗糙异质结构金-硫化铜纳米材料的可注射水凝胶，使用辣根过氧化物酶(0.01U mL-1)和氧化氢(0.01mM)的浓度进行酶催化成胶反应。
性能测试一
在扫描电子显微镜上分析了掺入25％丝素蛋白的丝素蛋白-透明质酸水凝胶的形态内部结构及孔径大小，其操作方法包括：将上述丝素蛋白-透明质酸水凝胶液氮冷冻，-80℃冷冻干燥48h，0.2mA喷金3min，扫描电镜观察水凝胶的微观形貌图(如图2所示)，通过扫描电镜可以看出，该水凝胶的孔洞的孔径为100～200μm。
在扫描电子显微镜上分析了海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶，通过能量色散X射线光谱进一步分析证实了水凝胶中的每个元素的存在，其操作方法包括：将上述丝素蛋白-透明质酸水凝胶液氮冷冻，-80℃冷冻干燥48h，0.2mA喷金3min，利用能量色散X射线光谱进行元素分析，扫描结果显示(如图3所示)，金、铜、硫均匀的分散在水凝胶中，表明海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的成功掺入。
在扫描电子显微镜上分析了海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2，通过能量色散X射线光谱进一步分析证实了水凝胶中的每个元素的存在，其操作方法包括：将上述丝素蛋白-透明质酸水凝胶液氮冷冻，-80℃冷冻干燥48h，0.2mA喷金3min，利用能量色散X射线光谱进行元素分析，扫描结果显示(如图4所示)，金、铜、硫均匀的分散在水凝胶中，已知结果表明海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料-2的成功掺入。
性能测试二
将总体积为5mL的三水氯化金(0.5mM)和十六烷基三甲基溴化铵(0.1mM)彻底混合。在上述溶液中加入0.6mL硼氢化钠溶液(10mM)并在37℃水浴中静置30min，然后使用。
合成金纳米棒生长溶液，将5mL十六烷基三甲基溴化铵(0.2M)与5mL三水氯化金(1mM)混合。加入0.12mL硝酸银(0.1M)溶液，充分搅拌，再加入0.6mL对苯二酚(0.1M)溶液。此时溶液颜色由黄色变为无色。剧烈搅拌1min后，加入75μL种子溶液(如上制备)，继续搅拌3min，40℃避光静置12h。最后，通过以8000rpm离心10min收集金纳米棒。
使用收集上述合成的Au纳米棒溶液(5mL)并用水洗涤3次以去除多余的表面活性剂。然后将其重新分散到5mL十六烷基三甲基溴化铵溶液(1mM)中。然后将四氯铂酸钾溶液(5mM，200μL)加入到金纳米棒溶液中，轻轻摇5min，使PtCl42-吸附在Au纳米棒上。然后将新制备的500μL氯化铜溶液(0.5M)和去离子水(4.3mL)依次添加到金纳米棒溶液中。溶液的最终总体积为10mL，将其置于100℃的烘箱中1h，以获得具有海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。如图5a所示，所合成的表面粗糙异质结构金-硫化铜纳米材料大小在50～100nm，表面带有毛刺结构，为粗糙表面。
使用收集上述合成的Au纳米棒溶液(5mL)并用水洗涤3次以去除多余的表面活性剂。然后将其重新分散到5mL十六烷基三甲基溴化铵溶液(1mM)中。然后将四氯铂酸钾溶液(1mM，200μL)加入到金纳米棒溶液中，轻轻摇5min，使PtCl4 2-吸附在Au纳米棒上。然后将新制备的500μL氯化铜溶液(0.1mM，500μL)和去离子水(4.3mL)依次添加到金纳米棒溶液中。溶液的最终总体积为10mL，将其置于100℃的烘箱中1h，以获得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料-2。如图5b所示，所合成的海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料-2的大小在50～100nm，表面海参状结构形貌不是很明显。
性能测试三
丝素蛋白和酪胺修饰的透明质酸的聚合物的总浓度为2％w/v。丝素蛋白/透明质酸以不同的比例(0％丝素蛋白-100％透明质酸、25％丝素蛋白-75％透明质酸、50％丝素蛋白-50％透明质酸)组合形成不同的水凝胶。调整辣根过氧化物酶和过氧化氢的浓度，最终使用辣根过氧化物酶(1U mL-1)和过氧化氢(1mM)的浓度进行酶催化成胶反应。同时掺入纳米材料以形成海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2。
随后对该水凝胶进行流变学测试。用模具将水凝胶制成直径为8mm、高度为4mm的圆柱体，利用流变进行水凝胶的储能模量测试，通过流变结果图6得出，丝素蛋白的加入显著改善了水凝胶的机械性能，有利于后续利用。
优选的，选用25％丝素蛋白-75％透明质酸水凝胶，随后对该水凝胶进行流变学测试。用模具将水凝胶制成直径为8mm、高度为4mm的圆柱体，通过直径为8mm平行板的执行频率扫描模式(0.1～10Hz，1％应变)进行测试。通过流变结果图7可以看出，G’>G”且呈线性关系，说明已成凝胶状态，而且G’在13kPa左右。
优选的，选用25％丝素蛋白-75％透明质酸水凝胶(以下简称水凝胶)，海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2进行剪切速率相关的粘度变化测试，通过流变结果图8可以看出，水凝胶的粘度从8000Pa·s急剧下降，剪切速率从0.1变为100s-1。纳米材料的掺入不影响水凝胶本身的可注射特性，这种剪切稀化能力使本发明的水凝胶具有独特的可注射性。
性能测试四
丝素蛋白和酪胺修饰的透明质酸的聚合物的总浓度为2％w/v。丝素蛋白/透明质酸的比例为25％丝素蛋白-75％透明质酸。调整辣根过氧化物酶和过氧化氢的浓度，最终使用辣根过氧化物酶(1U mL-1)和过氧化氢(1mM)的浓度进行酶催化成胶反应。同时掺入纳米材料以形成海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2。
取雄性BALB/c小鼠两张皮肤，将20μL上述三种水凝胶和PBS溶液滴入一张皮肤，用手指按压30s，并以恒定速率应用1mm/min测试。使用仪器进行拉伸试验，图9的研究结果表明，海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2具有强大的纳米桥效应并表现出良好的拉伸位移此外，具有令人满意的粘附性，但是，海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1的拉伸性能最好，这得益于其表面的明显粗糙结构与皮肤产生的黏附效果。
性能测试五
丝素蛋白和酪胺修饰的透明质酸的聚合物的总浓度为2％w/v。丝素蛋白/透明质酸的比例为25％丝素蛋白-75％透明质酸。调整辣根过氧化物酶和过氧化氢的浓度，最终使用辣根过氧化物酶(1U mL-1)和过氧化氢(1mM)的浓度进行酶催化成胶反应。同时掺入纳米材料以形成海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2。
选择革兰氏阴性细菌大肠杆菌和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌作为典型菌株，对本发明的材料进行抗菌评估。在96孔板中涂覆掺杂不同浓度的水凝胶(相当于200、100、50和25μg/mL不同形貌的金-硫化铜纳米颗粒)。将生长的菌悬液在600nm处稀释至吸光度值为0.1后，向每孔中加入150μL(吸光度值＝0.1)的菌悬液。然后用808nm激光照射(0.75W/cm2，10min)，最后移入细胞培养摇床(37℃，150rpm)继续培养，每隔1h监测600nm处的吸光值，画出细菌生长曲线。通过实验结果得知(图10a和图10b)，掺有金-硫化铜纳米材料的水凝胶对两种细菌具有优异的杀菌效果。
性能测试六
丝素蛋白和酪胺修饰的透明质酸的聚合物的总浓度为2％w/v。丝素蛋白/透明质酸的比例为25％丝素蛋白-75％透明质酸。调整辣根过氧化物酶和过氧化氢的浓度，最终使用辣根过氧化物酶(1U mL-1)和过氧化氢(1mM)的浓度进行酶催化成胶反应。同时掺入纳米材料以形成海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2。
细胞划痕实验在RAW 264.7-3T3细胞Transwell系统中进行。RAW 264.7细胞以1×104/孔的细胞密度接种在上室中，而3T3细胞以5×103/孔的细胞密度接种在Transwell的下室中。过夜孵育后，用无菌的10μL移液器吸头在Transwell的下腔室中刮擦细胞。然后用PBS洗涤3次以去除细胞碎片，并加入无血清培养基。上室用PBS清洗3次，加入不同规格的水凝胶，再加入100μL新鲜培养基。然后将上腔室放置在下腔室之上以构建Transwell系统。用显微镜在不同时期(0h，24h)拍摄明场细胞照片。通过实验结果得知(图11)，掺有纳米材料的水凝胶很好的加速了细胞的迁移，24h划痕愈合率接近90％。
性能测试七
丝素蛋白和酪胺修饰的透明质酸的聚合物的总浓度为2％w/v。丝素蛋白/透明质酸的比例为25％丝素蛋白-75％透明质酸。调整辣根过氧化物酶和过氧化氢的浓度，最终使用辣根过氧化物酶(1U mL-1)和过氧化氢(1mM)的浓度进行酶催化成胶反应。同时掺入纳米材料以形成海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2。
在RAW 264.7细胞中研究了由掺有纳米材料的水凝胶诱导的细胞极化水平。选择白细胞介素(IL-10)因子分别代表巨噬细胞M2表型的代表因子。通过ELISA方法表征这个因素的水平。具体操作如下：将RAW 264.7细胞接种到96孔板中，细胞密度为1X104/孔。在细胞培养箱中培养过夜后去除上层培养基。然后添加含有不同纳米材料浓度的水凝胶共孵育48h后，将细胞培养板以200rpm的转速离心10min。取上清液50μL转移到新的ELISA检测板上，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞因子IL-10的水平。如图12所示，掺有海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的水凝胶导致IL-10水平显着且呈浓度依赖性增加，这表明表面粗糙金-硫化铜纳米材料的可注射水凝胶-1可以直接将巨噬细胞极化为M2表型。这种变化归因于所结合的金-硫化铜的粗糙表面纹理状结构。
性能测试八
丝素蛋白和酪胺修饰的透明质酸的聚合物的总浓度为2％w/v。丝素蛋白/透明质酸的比例为25％丝素蛋白-75％透明质酸。调整辣根过氧化物酶和过氧化氢的浓度，最终使用辣根过氧化物酶(1U mL-1)和过氧化氢(1mM)的浓度进行酶催化成胶反应。同时掺入纳米材料以形成海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2。
在糖尿病雄性BALB/c小鼠(20-25g)的全层皮肤伤口模型上评估了海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2对慢性伤口愈合的影响。所述糖尿病伤口模型的建立所用小鼠为雄性BALB/c小鼠，体重为20～25g，使用链脲佐菌素诱导的糖尿病动物模型，通过连续5天腹腔注射链脲佐菌素药物，并且监测小鼠的血糖水平。连续两周血糖超过300mg dL-1(16.65mmolL-1)的小鼠用于建造糖尿病伤口模型。首先，用异氟醚气体麻醉糖尿病小鼠，将其背部剃毛，形成圆形全层皮肤伤口(10mm)，对小鼠进行注射前使用200nm过滤器对水凝胶进行灭菌，并通过高压灭菌对金-硫化铜纳米材料悬浮液进行灭菌。记录伤口区域大小的变化。由实验结果得出，可注射水凝胶可以很好地吻合小鼠背后的伤口区域，在近红外光照射后，在持续伤口愈合实验中，掺入纳米材料的两种水凝胶治疗的伤口表现出明显加速的伤口愈合(图13)。其中，在第14天的时候海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-1的伤口愈合97.5％，显着高于对照PBS组(50.5％)和丝素蛋白-透明质酸组(61.7％)以及海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料的可注射水凝胶-2(82.8％)。
综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明的丝素蛋白-透明质酸水凝胶的成胶时间可控、机械性能强、水凝胶内部孔隙分布均匀，生物相容性好、毒性低。在组织工程应用方面可以承载纳米材料用于大型伤口的治疗应用，更好的吻合伤口部位，同时水凝胶可大量制备，对很多材料具有运载的普适性。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及和/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。
Claims (12)
1.一种掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
提供丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸；
使包含丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸的聚合物混合体系，通过辣根过氧化物酶与过氧化氢酶进行酶催化交联，形成水凝胶网络；
使海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料掺杂于水凝胶网络中，之后通过辣根过氧化物酶与过氧化氢进行酶催化交联，制得掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括：使天然剥离的蚕茧进行脱胶反应，获得丝素蛋白；优选的，所述制备方法包括：将天然剥离的蚕茧与中性盐溶液在50～100℃中反应1～3h，获得脱胶处理后的丝素蛋白纤维；
其中，所述中性盐溶液所包含的盐包括硝酸镁、氯化钙、溴化锂中的任意一种或者两种以上的组合；所述中性盐溶液的浓度为8～10mol/L；优选的，所述丝素蛋白与中性盐溶液的质量体积比为1:2～10w/v％。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括：对脱胶处理后的丝素蛋白纤维进行洗涤，并将所获混合物稀释1～2倍置于截留分子量为7～14kDa透析袋中，并进行离心，之后进行冷冻干燥2～3天，获得纯净的丝素蛋白；优选的，所述离心的转速为8000～15000rpm/min，时间为15～30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括：将透明质酸与酪胺混合，通过透明质酸的羧基和酪胺的胺基之间的酰胺化反应进行共轭，获得酪胺修饰的透明质酸；
和/或，所述透明质酸与酪胺的质量比为1：0.1～1：3；
优选的，所述透明质酸的分子量为1～20kDa；
优选的，所述制备方法包括：在25～35℃条件下对透明质酸的羧基进行激活，反应1～3h，之后加入酪胺，在25～35℃黑暗状态下搅拌反应12～24h，获得酪胺修饰的透明质酸；
更优选的，所述制备方法具体包括：将透明质酸加入2-吗啉代乙磺酸缓冲液中，之后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，在25～35℃搅拌0.5～3h，激活透明质酸上的羧基；其中，所述2-吗啉代乙磺酸缓冲液的浓度为1～100mmol/L，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与透明质酸的质量比为1：1～3：1，所述N-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的质量比为0.5：1～1.5：1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括：在所述酰胺化反应结束后，将所获混合物依次在氯化钠溶液中透析2～3天、25％乙醇溶液透析2～3天、水中透析2～3天，其中采用的透析袋的截留分子量为3.5～10kDa，之后进行冷冻干燥2～4天，获得酪胺修饰的透明质酸，优选的，所述混合物的pH值为7.5～8.5。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括：将丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸混合，形成聚合物混合体系，之后加入辣根过氧化物酶和过氧化氢，混合得到交联反应体系，其中，所述交联反应体系中丝素蛋白与酪胺修饰的透明质酸的最终总浓度为1～5％w/v％，辣根过氧化物酶的终浓度为0.01U～2U，过氧化氢的终浓度为0.01mM～10mM；
和/或，所述酶催化交联的温度为25～35℃，时间为15s～10min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括：采用种子生长方法合成金纳米棒，之后在金纳米棒上生长硫化铜纳米材料，获得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料；
优选的，所述制备方法具体包括：
将金源与十六烷基三甲基溴化铵混合，之后在混合物中加入硼氢化钠，静置生长，形成种子溶液；
使金源、十六烷基三甲基溴化铵、银盐和对苯二酚进行反应，获得金纳米棒生长溶液；
使所述种子溶液与金纳米棒生长溶液混合并进行避光反应，制得金纳米棒；
在所述金纳米棒表面生长硫化铜纳米材料，获得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：在所述种子溶液中，金源的浓度为0.1～0.5mmol/L，十六烷基三甲基溴化铵的浓度为0.01～0.2mmol/L，硼氢化钠的浓度为1～10mmol/L；优选的，所述金源包括三水氯化金；
优选的，所述静置生长的温度为30～37℃，时间为30～120min；
和/或，在所述金纳米棒生长溶液中，十六烷基三甲基溴化铵的浓度为0.1～0.5mol/L，金源的浓度为0.1～1mmol/L，银盐的浓度为0.01～0.1mol/L，苯二酚的浓度为0.01～0.1mol/L；优选的，所述金源包括三水氯化金，所述银盐包括硝酸银；
和/或，所述避光反应的温度为40～50℃，时间为12～24h。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，包括：使所述金纳米棒与十六烷基三甲基溴化铵溶液混合，之后与四氯铂酸盐和铜源溶液进行反应，再利用硫源进行硫化，获得海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料；其中，反应温度为95～120℃，反应时间为1～3h；
优选的，所述硫化反应的温度为30～40℃，反应时间为12～24h；
优选的，所述十六烷基三甲基溴化铵、四氯铂酸钾、铜盐与硫源的摩尔比为0.1～1：1～5：0.1～0.5：0.1～1；
优选的，所述铜源包括氯化铜，所述四氯铂酸盐包括四氯铂酸钾，所述硫源包括硫化钠。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括：将海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料溶液、水凝胶网络搅拌混合，形成混合溶液，之后加入辣根过氧化物酶和过氧化氢，进行酶催化交联，制得所述掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶；
优选的，所述海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料溶液的浓度为25～200μg/mL；
优选的，所述混合溶液中辣根过氧化物酶的终浓度为0.01U～2U，过氧化氢的终浓度为0.01mM～10mM。
11.由权利要求1-10中任一项所述制备方法制得的掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶，其包括丝素蛋白-透明质酸水凝胶，以及掺杂的海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料；
优选的，所述海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料为纳米棒状结构，长度为50～100nm，所述海参状表面粗糙金-硫化铜异质结构材料包括金纳米棒，以及包覆于金纳米棒表面的硫化铜壳层，所述硫化铜壳层包覆于金纳米棒表面形成金-硫化铜异质结构，所述硫化铜壳层的厚度为2～8nm；
优选的，所述掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为25～200μm，所述掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶的机械强度为0.8～2.2kPa。
12.权利要求11所述的掺杂纳米材料的酶催化交联可注射水凝胶于制备具有伤口止血、杀菌、细胞增殖迁移或伤口修复功能的产品中的应用。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118108959A true CN118108959A (zh) | 2024-05-31 |
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