CN118103394A

CN118103394A - 寡色肽的组合物和用途以及制备方法

Info

Publication number: CN118103394A
Application number: CN202280062924.7A
Authority: CN
Inventors: J·R·科莫罗夫斯基
Original assignee: Bonafield Health Co ltd
Current assignee: Bonafield Health Co ltd
Priority date: 2021-09-24
Filing date: 2022-09-26
Publication date: 2024-05-28

Abstract

公开了从藻蓝蛋白产生寡色肽的方法。另外，公开了包含寡色肽和寡色肽与至少一种化合物(即烟酰胺核苷、锌、硒或其组合)的组合的组合物。还公开了治疗、预防或改善年龄相关的躯体疾病、细菌和/或病毒感染/疾病、以及与氧化应激相关的疾病或与任何前述相关的症状的用途和方法。

Description

寡色肽的组合物和用途以及制备方法

发明背景

螺旋藻(Spirulina)是蓝藻(蓝绿藻)的光合成生物质，其含有许多色素蛋白(藻胆蛋白)，统称为藻蓝蛋白(PC)。PC中的主要藻胆蛋白是C-藻蓝蛋白(C-PC)、别藻蓝蛋白(APC)和藻红蛋白(PCE)。C-PC和APC结合发色团藻蓝胆素(PCB)。C-PC包含具有α-和β-亚基的异二聚体，其中一个PCB分子与α-亚基的Cys-84残基共价结合，两个PCB分子与β-亚基的Cys-82和Cys-153残基共价结合。C-PC的异二聚体结构和PCB结合导致C-PC在溶液中具有强烈的蓝色和强烈的荧光特征。

PC、C-PC和PCB因其潜在的健康益处而在医学领域引起了广泛关注。由于其高荧光特性，C-PC已被用作生物标志物，例如用于监测生物液体和细胞中氧化还原和免疫状态的方面，以及追踪应用的那些。多种研究也已显示，PC、C-PC和PCB由于其抗氧化、抗炎、抗肿瘤、自由基清除和免疫调节性质，可用作治疗或预防与氧化应激相关疾病的治疗剂。

沿着这些思路，氧化应激也被认为是心境障碍，例如抑郁症出现的关键因素。抑郁个体发生与年龄相关的躯体疾病(例如冠心病和痴呆)的风险增加，并且经历加速衰老，这可能发生在细胞水平，尤其是端粒水平。端粒是核蛋白复合物，其通过封盖线性DNA末端来保护染色体末端免受融合和DNA损伤。应激会增加氧化损伤并降低抗氧化防御，并且已显示氧化应激随着衰老和在多种疾病状态下增加，从而增加细胞损伤的可能性。应激激素，例如皮质酮(CORT)，在抑郁症的发展中发挥着关键作用。多种研究已显示，慢性CORT施用引起下丘脑-垂体-肾上腺轴中的功能障碍，导致抑郁症，其进而与加速衰老相关。

其他研究已提示，使用PC和C-PC治疗或预防传染病(例如病毒和细菌感染/疾病)具有有益效果。病毒性疾病是最常见的人类呼吸道疾病，并以其高发病率和死亡率而闻名，尤其是在老年人和慢性病患病人群中。病毒引起季节性流行病以及可迅速传播并感染多达50％受影响群体的大流行病。除了死亡率之外，病毒性疾病还给社会带来沉重的经济和医疗负担，代表需要待有效解决的严重公共卫生问题。病毒毒力可能是由高病毒载量和过度侵略性的宿主免疫反应驱动的，其结合起来诱导广泛的炎症和细胞凋亡。免疫力对于预防这些疾病起着非常重要的作用。众所周知，巨噬细胞通过分泌多种细胞因子作为哺乳动物中抵御感染的一线免疫防御而在免疫反应中发挥重要作用。细胞因子由多种细胞分泌，并在针对细菌和病毒感染进行保护中发挥至关重要的作用。研究已显示，PC和C-PC可增强淋巴细胞的活性和生物体的免疫力以预防和抵抗疾病，且不产生毒性。

本发明人已发现，通过产生并利用来自PC消化的寡色肽片段(O-CP)代替PC、C-PC或PCB，可以进一步改善PC、C-PC和PCB的上述性质。Komorowski等人“EnhancedAntioxidant Activity of Phycocyanin Oligopeptides,”(其通过引用以其整体并入本文)发现，与PC相比，使用O-CP赋予显著的抗氧化效力，如在Folin-Ciocalteu反应测定和氧自由基吸收能力(ORAC)6.0测定中评估的。

此外，本发明人已经考虑包括被认为改善O-CP的上述效果的额外化合物。

所考虑的此类化合物是矿物质，例如锌(Zn)和硒(Se)。膳食缺锌在全球范围内是常见的，并看起来促进许多疾病的发病机制。除了膳食缺乏之外，低锌水平存在于患有其他异常的个体，这些异常限制例如酗酒者中锌的吸收，或引起肝脏锌滞留，例如病毒或细菌感染。缺锌产生许多异常，对上皮细胞和免疫系统特别有害。例如，据报道，在锌水平低的HIV-1感染者中细菌感染的发生率较高，并且较低水平的锌与疾病的更晚期阶段相关。硒是一种营养必需的微量矿物质，其在多种炎症和免疫反应中发挥着至关重要的作用。据报道，硒化合物可调节中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、B淋巴细胞和T细胞的功能，并影响硒掺入重要的免疫器官。补充Se抑制小鼠中的急性炎症反应，并通过减轻脂多糖(LPS)诱导的促炎细胞因子，例如白细胞介素6(IL-6)和前列腺素内过氧化物合酶2(COX-2)的表达来促进免疫功能。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的结构和功能成分，其由外部(O)多糖、核心和脂质成分脂质A组成。LPS通过与toll样受体4(TLR4)结合来激活先天免疫系统的细胞并开始类似于脓毒症的高炎症状态。

所考虑的另一种化合物是烟酰胺核苷(NR)；NR是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)生物合成的天然前体。NAD+水平通过作为不同酶家族(例如去乙酰化酶(SIRT)和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP))的底物，在能量稳态和基因组稳定性中发挥着至关重要的作用。NAD+生物利用度在代谢疾病(包括饮食引起的肥胖和非酒精性脂肪肝病(NAFLD))的情况中以及衰老过程中下降，促进了与年龄相关的生理衰退。NAD+使胰岛素敏感并诱导线粒体生物发生的能力提示它可以在代谢紊乱和神经退行性疾病的治疗中具有重要的应用。

虽然O-CP已显示出一些治疗前景，但从PC、C-PC或PCB中制备和分离O-CP仍具有重大挑战。

从PC、C-PC或PCB中制备和分离O-CP的过程包括高压均质、酸处理、酶处理(通过溶菌酶)、有机溶剂提取和超声处理，仅举几例。在一些情况下，这些过程需要使用危险化学品并且具有较低的提取效率。在其他情况下，由于悬浮颗粒的存在，该过程具有较低的过滤速率，这使得该过程漫长且繁琐。最终产品的过滤、离心和纯化方面的挑战使得现有过程无法进行商业规模生产。

由PCB制备O-CP的过程包括McCarty等人(美国专利号8,709,434)公开的那些以及Minic等人“Digestion by pepsin releases biologically active chromopeptidesfrom C-phycocyanin,a blue-colored biliprotein of microalga Spirulina,”用于从C-PC制备O-CP的那些，这两篇文章均通过引用以其整体并入本文。McCarty公开了制备O-CP的方法，其中所述方法包括使用热甲醇从螺旋藻中提取PCB，过滤，并与含有抗坏血酸的甲醇在60℃下反应8小时。这些条件导致连接PCB和PC载脂蛋白的硫醚键通过甲醇分解被裂解。然后根据现有技术中已知的标准有机化学步骤对反应产物进行检查。Minic公开了制备O-CP的方法，其中所述方法包括在磷酸盐缓冲液中提取C-PC，随后在模拟胃液(包含～0.1MHCl，pH 1.2的(SGF))中用胃蛋白酶消化C-PC。然而，现有技术的这些方法未能提供用于制备与大规模制造兼容的O-CP的可靠方法，因此这些受限于学术环境。McCarty中甲醇(危险且易燃的溶剂)的使用，和Minic中对强酸条件(SGF)的依赖与大规模制造的相关条件不兼容；去除甲醇成本高昂以确保最终产品的安全性，并且HCl与钢不兼容并需要专门的设备来大规模运行。此外，在营养补充剂、药物、维生素或人类待摄取的其他物品的背景下，现有技术的过程导致残留溶剂或刺激性化学物质的可能性，所述残留溶剂或刺激性化学物质可能对环境造成危害或者对人类消费有害或不安全。

本发明人已经确定需要改进的、经济上可行的、并且大规模生产兼容的过程，用于以高产率从螺旋藻或PC中提取和生产O-CP，其可以进一步用于医学目的。本发明人还确定O-CP可以比其PC对应物提供更好的治疗益处。与现有技术的已知方法和化合物相比，避免使用甲醇和HCl的制备O-CP的两种方法及其治疗用途提供了优异的且意想不到的益处。这一发现是新颖的。如此，通过根据本文公开的方法制备O-CP并提供O-CP作为药剂和/或膳食补充剂，可以单独地、共同地或与其他药剂和/或膳食补充剂结合来实现治疗和营养益处。

发明概述

本公开的实施方案提供了用于生产源自藻蓝蛋白(PC)的寡色肽(O-CP)的方法。本文所述的方法提供了从PC生产O-CP的提高效率、更高的超滤速率和从PC生产O-CP的缩短过程，通过改进消化、过滤、离心、纯化和避免使用与大规模制造不兼容的溶剂而克服了与从PC、C-PC或PCB生产O-CP相关的其他挑战，从而为商业规模生产提供了可行的方法。本公开的实施方案满足了在有需要的受试者中治疗、预防或改善年龄相关的躯体疾病、细菌和/或病毒感染/疾病、以及与氧化应激相关的疾病的需要，其中提供了组合物和方法。

本公开的实施方案还提供了用于在有需要的受试者中治疗、预防或改善与年龄相关的躯体疾病、细菌和/或病毒感染/疾病、以及与氧化应激相关的疾病、或与任何上述相关的症状的组合物。

将参考以下描述、所附权利要求和附图来理解本实施方案的这些和其他特征、方面和优点。

附图简述

本公开的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。将通过参考阐述说明性实施方案(其中利用了本公开的原理)的以下详细描述及其附图，获得对本公开的特征和优点的更好理解：

图1举例说明了用于从PC生产O-CP的过程的流程图；

图2是阐明PC在1M HCl中完全消化的吸收光谱的图，其显示了500至700nm之间的吸收；

图3A是阐明以PC含量表示的用于光度测定O-CP的校准曲线的图。

图3B是阐明以O-CP含量表示的用于光度测定O-CP的校准曲线的图；

图4A是阐明在280nm和615nm检测到的完整色谱图的图；

图4B是阐明在280nm和615nm下在10-16分钟的范围内检测到的包含O-CP峰的色谱图的图；

图5是阐明基于615nm的吸收的PC完全消化的HPLC色谱图的图；

图6A是阐明以PC含量表示的用于通过HPLC定量O-CP的校准曲线的图；

图6B是阐明以O-CP含量表示的用于通过HPLC定量O-CP的校准曲线的图；

图7A是阐明52g/L的PC在多种温度、pH和酶促条件下的时间降解的图，在存在酶的情况下，以2g酶/kg PC包含所述酶；

图7B是阐明105g/L的PC在多种温度、pH和酶促条件下的时间降解的图，在存在酶的情况下，以2g酶/kg PC包含所述酶；

图7C是阐明210g/L的PC在多种温度、pH和酶促条件下的时间降解的图，在存在酶的情况下，以2g酶/kg PC包含所述酶；

图7D是阐明50g/L的PC在多种温度、pH和酶促条件下的时间降解的图，在存在酶的情况下，以2g酶/kg PC包含所述酶；

图7E是阐明100g/L的PC在多种温度、pH和酶促条件下的时间降解的图，在存在酶的情况下，以4g酶/kg PC包含所述酶；

图7F是阐明200g/L的PC在多种温度、pH和酶促条件下的时间降解的图，在存在酶的情况下，以8g酶/kg PC包含所述酶；

图8A是阐明多种量的碱性蛋白酶(alcalase)在65℃和pH 8下对50g/L的PC的时间降解的图；

图8B是阐明多种量的碱性蛋白酶在50℃和pH 8下对50g/L的PC的时间降解的图；

图8C是阐明多种量的碱性蛋白酶在65℃和pH 8下对100g/L的PC的时间降解的图；

图8D是阐明多种量的碱性蛋白酶在50℃和pH 8下对100g/L的PC的时间降解的图；

图8E是阐明多种量的碱性蛋白酶在65℃和pH 8下对200g/L的PC的时间降解的图；

图8F是阐明多种量的碱性蛋白酶在50℃和pH 8下对200g/L的PC的时间降解的图；

图8G是阐明多种量的碱性蛋白酶在65℃和pH 8下对300g/L的PC的时间降解的图；

图8H是阐明多种量的碱性蛋白酶在50℃和pH 8下对300g/L的PC的时间降解的图；

图9是阐明三种不同PC来源(1-PC、2-PC和3-PC)、通过使PC经受碱性蛋白酶(0.2g/g)而制备的O-CP(1-O-CP(A)、2-O-CP(A)和3-O-CP(A))以及通过使PC经受碱性蛋白酶(0.2g/g)和复合纤维素酶(0.2g/g)而制备的O-CP(1-O-CP(A+V)、2-O-CP(A+V)和3-O-CP(A+V))的ORAC的图；

图10是阐明PC(PC)、通过使PC在65℃和pH 8下不经受酶5小时而制备的O-CP(O-CP-C1)、通过使PC在65℃、pH 8下经受碱性蛋白酶(0.1g/g)5小时而制备的O-CP(O-CP-E1)，以及通过使PC在65℃、pH 8下经受碱性蛋白酶(0.2g/g)5小时而制备的O-CP(O-CP-E2)的ORAC的图；

图11是阐明(A)PC和O-CP；(B)EpiCor和(C)Wellmune的总抗氧化能力的图；

图12是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune在外周血单核细胞(PBMC)中的剂量反应的图；

图13显示流式细胞术数据，其显示淋巴细胞、单核细胞和淋巴细胞的四个亚组的门，允许分析所有五种细胞类型上的CD69表达；

图14是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对自然杀伤细胞(NK细胞)上CD69表达的剂量反应影响的图-直接影响，其中原始数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图15是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对NK细胞上CD25表达的剂量反应影响的图-直接影响，其中原始数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图16是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对自然杀伤T(NKT)细胞上CD69表达的剂量反应影响的图-直接影响，其中原始数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图17是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对NKT细胞上CD25表达的剂量反应影响的图-直接影响，其中原始数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图18是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对T细胞上CD69表达的剂量反应影响的图-直接影响，其中原始数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图19是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对T细胞上CD25表达的剂量反应影响的图-直接影响，其中原始数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图20是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对非NK或T细胞的细胞上的CD69表达的剂量反应影响的图-直接影响，其中原始数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图21是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对非NK或T细胞的细胞上的CD25表达的剂量反应影响的图-直接影响，其中原始数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图22是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对单核细胞上CD69表达的剂量反应影响的图-直接影响，其中原始数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图23是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对CD69+和CD25+淋巴细胞数量的剂量反应影响的图-直接影响，其中原始数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图24是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对NK细胞上CD69表达的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图25是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对NK细胞上CD25表达的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图26是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对NKT细胞上CD69表达的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份的培养物的平均值±标准差；

图27是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对NKT细胞上CD25表达的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图28是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对T细胞上CD69表达的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图29是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对T细胞上CD25表达的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图30是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对非NK或T细胞的细胞上CD69表达的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图31是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对非NK或T细胞的细胞上的CD25表达的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图32是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对单核细胞上CD69表达的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图33是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对CD69+和CD25+淋巴细胞数量的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图34是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对NK细胞上CD69表达的剂量反应影响的图-聚肌苷酸:聚胞苷酸(Poly I:C)免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图35是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对NK细胞上CD25表达的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图36是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对NKT细胞上CD69表达的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图37是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对NKT细胞上CD25表达的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图38是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对T细胞上CD69表达的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图39是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对T细胞上的CD25表达的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图40是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对非NK或T细胞的细胞上的CD69表达的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图41是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对非NK或T细胞的细胞上的CD25表达的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图42是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对单核细胞上CD69表达的剂量反应效果的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图43是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对CD69+和CD25+淋巴细胞数量的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图44是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中白细胞介素-1-β(IL-1β)表达水平的剂量反应影响的图-直接影响，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图45是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中白细胞介素-6(IL-6)表达水平的剂量反应影响的图-直接影响，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图46是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中白细胞介素-8(IL-8)表达水平的剂量反应影响的图-直接影响，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图47是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中白细胞介素-10(IL-10)表达水平的剂量反应影响的图-直接影响，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图48是阐明PC、O-CP、Epicor和Wellmune对PBMC培养物中白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)表达水平的剂量反应影响的图-直接影响，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图49是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中巨噬细胞炎症蛋白1α(CCL3)(MIP-1α)表达水平的剂量反应影响的图-直接影响，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图50是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中巨噬细胞炎症蛋白1β(CCL4)(MIP-1β)表达水平的剂量反应影响的图-直接影响，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图51是阐明PC、O-CP、Epicor和Wellmune对PBMC培养物中干扰素-γ(IFN-γ)表达水平的剂量反应影响的图-直接影响，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图52是阐明PC、O-CP、Epicor和Wellmune对PBMC培养物中肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平的剂量反应影响的图-直接影响，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图53是阐明PC、O-CP、Epicor和Wellmune对PBMC培养物中粒细胞集落刺激因子(G-CSF)表达水平的剂量反应影响的图-直接影响，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图54是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IL-1β表达水平的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图55是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IL-6表达水平的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图56是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IL-8表达水平的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图57是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IL-10表达水平的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图58是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IL-1ra表达水平的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图59是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中MIP-1α表达水平的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图60是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中MIP-1β表达水平的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图61是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IFN-γ表达水平的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图62是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中TNF-α表达水平的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图63是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中G-CSF表达水平的剂量反应影响的图-LPS诱导的炎症，其中与LPS处理的对照培养物相比的变化百分比，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图64是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IL-1β表达水平的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图65是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IL-6表达水平的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图66是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IL-8表达水平的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图67是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IL-10表达水平的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图68是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IL-1ra表达水平的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图69是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中MIP-1α表达水平的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图70是阐明PC、O-CP、Epicor和Wellmune对PBMC培养物中MIP-1β表达水平的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图71是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中IFN-γ表达水平的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图72是阐明PC、O-CP、Epicor和Wellmune对PBMC培养物中TNF-α表达水平的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图73是阐明PC、O-CP、EpiCor和Wellmune对PBMC培养物中G-CSF表达水平的剂量反应影响的图-Poly I:C免疫激活，数据显示为一式三份培养物的平均值±标准差；

图74是分别阐明30mg或300mg人类等效剂量(HED)的O-CP、O-CP30或O-CP300、300mg HED的烟酰胺核苷(NR)及其组合对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠中端粒长度的影响的图，不同的符号(a-f)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)。

图75是阐明O-CP、NR及其组合对CORT诱导的衰老大鼠中的(A)肝脏IL-6水平、(B)肝脏TNF-α水平、(C)肝脏IL-1β水平和(D)肝脏IL-8水平的影响的图。不同的符号(a-f)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图76是阐明O-CP、NR及其组合对CORT诱导的衰老大鼠中的(A)端粒蛋白1-a(POT1a)水平的肝脏保护、(B)端粒蛋白1-b(POT1b)水平的肝脏保护、(C)肝脏端粒重复结合因子1(TRF1)水平和(D)肝脏端粒重复结合因子2(TRF2)水平的影响的图。不同的符号(a-e)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图77是阐明O-CP、NR及其组合对CORT诱导的衰老大鼠中的肝脏TRF1相互作用核因子2(Tin2)水平的影响的图。不同的符号(a-f)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图78是阐明O-CP、NR及其组合对CORT诱导的衰老大鼠中的(A)肝脏去乙酰化酶(sirtuin)1(SIRT1)水平、(B)肝脏去乙酰化酶3(SIRT3)水平和(C)肝脏烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)水平的影响的图。不同的符号(a-e)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图79是阐明O-CP、NR及其组合对CORT诱导的衰老大鼠中的(A)脑核因子κB(NF-κB)水平和(B)脑核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)水平的影响的图。不同的符号(a-f)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图80是阐明O-CP、NR及其组合对CORT诱导的衰老大鼠中的(A)脑脑源性神经营养因子(BDNF)水平、(B)脑神经生长因子(NGF)水平、(C)脑突触后密度93(PSD93)水平和(D)脑突触后密度95(PSD95)水平的影响的图。不同的符号(a-e)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图81是阐明O-CP、NR及其组合对CORT诱导的衰老大鼠中脑突触蛋白I水平的影响的图。不同的符号(a-e)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图82是阐明200μg HED的Se、30mg HED的Zn、300mg HED的O-CP(PC-O)及其组合对LPS诱导的小鼠中(A)暂时发热反应和(B)总发热的影响的图。

图83是阐明Se、Zn、O-CP及其组合对LPS诱导小鼠中的(A)血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平、(B)血清天冬氨酸转氨酶(AST)水平、(C)血清碱性磷酸酶(ALP)和(D)血清乳酸脱氢酶(LDH)水平的影响的图。不同的符号(a-e)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图84是阐明Se、Zn、O-CP及其组合对LPS诱导的小鼠中的(A)血清IL-1β水平、(B)血清IL-6水平、(C)血清TNF-α水平和(D)血清受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2(Neu)水平的影响的图。不同的符号(a-e)表示组间统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图85是阐明Se、Zn、O-CP及其组合对LPS诱导的小鼠中的(A)肝脏Zn水平、(B)肝脏Se水平、(C)肺Zn水平和(D)肺Se水平的影响的图。不同的符号(a-c)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图86是显示Se、Zn、O-CP及其组合对LPS诱导的小鼠中的肺损伤的影响的组织学图像；

图87是显示Se、Zn、O-CP及其组合对LPS诱导的小鼠中的肝脏损伤的影响的组织学图像；

图88是阐明Se、Zn、O-CP及其组合对LPS诱导的小鼠中的(A)肝脏IL-1β水平、(B)肝脏IL-6水平、(C)肝脏白细胞介素-17(IL-17)水平、(D)肝脏TNF-α水平、(E)肝脏NF-κB水平、(F)肝脏COX-2水平和(G)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平的影响的图。不同的符号(a-e)表示组间统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图89是阐明Se、Zn、O-CP及其组合对LPS诱导的小鼠中的(A)肝脏金属硫蛋白(MT)水平、(B)肝脏锌转运蛋白ZIP1(ZIP1)水平、(C)肝脏锌转运蛋白ZIP4(ZIP4)、(D)肝脏锌转运蛋白ZIP14(ZIP14)水平和(E)肝脏锌转运蛋白1(ZNT1)水平的影响的图。不同的符号(a-d)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；

图90是阐明Se、Zn、O-CP及其组合对LPS诱导的小鼠中的(A)肺IL-1β水平、(B)肺IL-6水平、(C)肺IL-17水平、(D)肺TNF-α水平、(E)肺NF-κB水平、(F)肺COX-2水平和(G)肺iNOS水平的影响的图。不同的符号(a-e)表示组间统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)；和

图91是阐明Se、Zn、O-CP及其组合对LPS诱导的小鼠中的(A)肺MT水平、(B)肺ZIP1水平、(C)肺ZIP4水平、(D)肺ZIP14水平、(E)肺ZNT1水平和(F)肺锌转运蛋白4(ZNT4)水平的影响的图。不同的符号(a-d)表示组间的统计学差异(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)。

图14至73含有根据下表的星号，对应于与对照相比的统计学差异：

发明详述

在下面的详细描述中，参考了构成其一部分的附图。在图中，相似的符号通常标识相似的组分，除非上下文另有指示。详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着限制。在不背离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以做出其他改变。如本文通常描述和附图中所示的本公开的方面可以以多种不同的配置来排列、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文中有所考虑并且本领域技术人员鉴于本公开设想出这样的不同配置。

本公开尤其涉及某些O-CP、其生产方法以及利用某些色肽和某些O-CP的治疗。

制备方法

简而言之，本文将技术和步骤描述为生产藻蓝蛋白衍生的O-CP的方法。该方法包括过滤粗PC溶液以将具有大于10kDa分子量的蛋白质级分与具有小于或等于10kDa分子量的化合物分离，保留具有大于10kDa分子量的蛋白质级分，用酶水解大于10kDa的蛋白质级分以获得粗水解液，任选地中和粗水解液以获得中和的粗水解液，并将中和的粗水解液进行超滤，以将O-CP与未水解的蛋白质、所用的酶和其他材料分离。

例如，本文使用的粗PC溶液可包含25％纯C-藻蓝蛋白(C-PC)，其余75％包含天然蛋白质、肽和多糖(藻蓝蛋白α和β亚基、别藻蓝蛋白、藻红蛋白、天然发生的肽、氨基酸和糖)，以及帮助干燥的干燥剂或添加剂(稳定剂)(35％海藻糖和5％柠檬酸三钠)。本文使用的添加剂被称为低分子量复合物或化合物(LMWC)(小于或等于10kDa)并且使用过滤器从大尺寸蛋白质级分中分离。这仅允许较大的化合物保留在过滤器上，包括例如C-PC、藻蓝蛋白α和β亚基、别藻蓝蛋白、藻红蛋白和其他肽。该蛋白质级分被进一步消化成O-CP。因此，这是O-CP的独特混合物，其产生意想不到的增强活性。

本公开证明，从不含有分子量小于或等于10kDa的化合物的粗PC的超滤获得的蛋白质级分的水解对于生产O-CP来说要简单得多且成本有效。目前公开的方法的一些益处是生产了生物兼容的且环境友好的O-CP。此外，可以使用本文公开的方法来避免或减少与现有技术的O-CP生产相关的化学危害，即需要甲醇和强酸性条件(HCl)的方法。此外，通过本文公开的方法制备的O-CP具有意想不到的增强活性，如本文进一步描述的。

图1是图解根据本公开的一个或多个实施方案生产O-CP的方法的流程图。所述方法100，过滤粗PC溶液以分离蛋白质级分102，水解蛋白质级分以获得粗水解液104，任选地，中和粗水解液106，并使中和的粗水解液进行超滤以获得O-CP 108。在102处，对粗PC溶液进行超滤以分离蛋白质级分。在一个实例中，在102处，处理粗PC溶液以去除不想要的LMWC，例如但不限于0.1至10kDa化合物。在一个实例中，在进一步处理之前对PC进行光度测定表征。将620nm和280nm处的吸光度比用作PC纯度的指标，并且在整个实验过程中维持不小于1的比值(A₆₂₀/A₂₈₀)。在一个实例中，将粗PC溶解在软化水中以形成浓度为50g/L的溶液。在一个实例中，通过切向流超滤去除分子量大小小于10kDa的化合物。丢弃去除的低分子量化合物。在一个实例中，超滤在室温下使用0.6m² 10-kDa截留分子量(MWCO)Hydrosart盒在0.1-1巴压力和约1-20L/min的切向流速下进行，产生约0.1-2L/min的过滤速率。继续超滤直至截留物的体积，即蛋白质级分的体积减少至起始体积的四分之一。通过重复洗涤，低分子量化合物的量减少至起始值的1％以下，如通过以下计算：

最终截留物，即蛋白质级分，可以直接用于104的下一步骤，在-30℃(-22°F)下冷冻储存或冷冻干燥。渗透物可以作为无害的水性废物被丢弃。

在过滤粗溶液102之后，然后可以溶解所得浓度的蛋白质级分，并且然后可以调节溶液中的蛋白质级分的浓度。在一些实施方案中，蛋白质级分可溶解于水溶液或水，例如软化水。鉴于本文所包含的公开，本领域技术人员将容易想到未明确列出的其他水溶液，然而某些溶剂，例如甲醇和其他有害溶剂不会被技术人员考虑，也不与本文公开的方法的范围相称。在某些实施方案中，溶液中蛋白质级分的浓度可调节至约50g/L至约300g/L，或其间的任何范围或浓度。

在过滤和/或调节溶液浓度之后，然后可以使溶液进行水解104。在一些实施方案中，水解104可包括使用酶水解蛋白质级分。在一些实施方案中，如本文所述的蛋白质级分与一定量的酶组合。所述酶包括但不限于碱性蛋白酶(alcalase)、中性酶(neutrase)、复合蛋白酶(protamex)、纤维素酶(celluclast)、复合纤维素酶(viscozyme)、以及前述酶的任意组合。酶的量可以是约0.002g/g(酶比蛋白质)至约1g/g。例如，酶的量可以是约0.002g/g、0.01g/g、0.05g/g、0.1g/g、0.2g/g、0.3g/g、0.4g/g、0.5g/g、0.6g/g、0.7g/g、0.8g/g、0.9g/g、1.0g/g、或任何两个前述值之间的任何范围或量和本文公开的任何其他范围或量。

在一些实施方案中，如本文所述，在添加酶后，调节溶液的pH、温度或两者。所述调节没有特别限制，然而，所述溶液的优选pH为约6和约8，并且该溶液的优选温度为约50℃和约65℃。鉴于本文所包含的公开，本领域技术人员将容易想到未明确列出的其他调节。此外远远超出这些范围的pH和温度，例如强酸性(小于pH 2)和与大规模制造不兼容的其他条件，技术人员不会考虑，也不与本文公开的方法的范围相称。

在某些实施方案中，如本文所述，在调节溶液pH、温度或两者之后，允许溶液反应。反应时间可以小于约1小时至约36小时，或其间的任何时间长度。该范围内的优选实施方案是约2小时、约5小时、约7小时和约24小时的反应时间。

实验性地使用研究方法来制备本文公开的O-CP。本文公开的这些方法可以使用甲醇、HCl或两者，以及胃蛋白酶。这些研究方法仅呈现为从PC制备O-CP的方法来筛选O-CP其体外或体内活性。

在制备O-CP的备选方法中，使用32％食品级盐酸将来自102的溶液的pH调节至1.2的值。这对应于约80mM HCl的最终浓度。以这样的方式选择反应容器，所述方式可以承受低pH值和氯化物的存在。然后将猪胃蛋白酶添加到溶液中至终浓度为1000FIP单位/L(即，0.5g/L，标准活性≥2,000FIP单位/克)。初始混合后，不需要搅拌或进一步的pH调节。该反应在密闭容器中进行，以避免HCl损失到大气中。通过HPLC或光度测定来监测水解的进程。在一个实例中，水解在37℃(98.6°F)下36小时后完成。粗水解液用于下一步骤106。在该水解步骤104期间没有产生水性废物。

在水解反应104之后，中和粗水解液106以返回组合物至中性pH(pH 7)。在一些情况下，使用食品级NaOH或HCl溶液来中和粗水解液106的pH；在用于进行水解104的pH的背景下，将容易理解所使用的化合物。进行中和时，必须避免过度滴定，因为如果pH值太低或太高，都会看到对产品稳定性的负面影响。

在水解反应104或中和步骤106之后，所得产物可以任选地进行过滤，例如切向流超滤(10kDa MWCO)108，以将渗透物中小于10kDa的期望O-CP与不想要的不溶性污染物、酶、未水解的蛋白质等分开。酶可包括未反应的酶或已用于水解蛋白质级分的废酶。在某些实施方案中，过滤108可以在室温下使用0.6m² 10-kDa MWCO Hydrosart(SARTORIUS)盒在0.1-1巴压力和约1L/min至约20L/min的切向流速或约0.1L/min至约2L/min的过滤速率下进行。在一些实施方案中，可以继续过滤直至截留物的体积尽可能地减少。在上下文中将容易理解其中对水解反应104产物的产物或中和步骤106的产物进行过滤108的情况。例如，在水解反应104期间不利用HCl的方法可能不需要经历中和步骤，因此如果要进行过滤108，则可以在水解反应104之后对产物进行。类似地，如果水解反应104在强酸性条件(HCl)下进行，则水解反应104的产物可进行中和步骤106，因此如果要进行过滤108，则可在中和步骤106之后对产物进行。

图2是图解使用胃蛋白酶在1M HCl中完全消化PC 24小时的500和700nm之间的吸收光谱的图200。纵轴202代表消光系数，横轴204代表吸光度。吸光度曲线206指示消光系数随吸光度的变化。O-CP的质量消光系数约高10倍，峰值位于约640nm处，消光系数为1.92mLmg^-1cm^-1。与中性pH下的PC相比，峰红移，消光系数不到一半，因为从PC的O-CP产率仅为约10.2％，为O-CP表示的消光系数为18.8mL mg^-1cm^-1。

图3A是阐明用于光度测定PC的校准曲线的图300，而图3B是图解以O-CP含量表示的PC光度测定的校准曲线的图310。在图3A中，纵轴302代表640nm处的吸光度，横轴304代表PC的浓度。最佳拟合线306指示标准曲线高达至少约0.6mg/mL的PC的线性度。在图3B中，纵轴312代表640nm处的吸光度，横轴314代表PC的浓度。最佳拟合线316指示标准曲线高达至少约0.06mg/mL的O-CP的线性度。假定A₆₄₀值在0.05到1之间时定量是可靠的。线的斜率与确定的消光系数很好地对应，PC的测试标准为1.92mL mg^-1cm^-1相对于1.91mL mg^-1cm^-1，通过本文公开的方法产生的O-CP的测试标准为18.8mL mg^-1cm^-1相对于18.7mL mg^-1cm^-1。

除了如图3A和3B所示的光度表征之外，还建立了通过HPLC定量PC的方案。HPLC产生了额外的优点，即产生了对通过完全消化获得的O-CP的数量的指示。图4A是图解在25分钟运行时间内在280nm和615nm处检测到的含有O-CP的完整色谱图的图400，而图4B是图解在10-16分钟范围内在280nm和615nm处检测到的含有O-CP的色谱图的图410。在图4A中，纵轴402代表以毫吸光度单位(mAU)为单位的吸光度强度的测量，横轴404代表以分钟为单位的时间。色谱图406指示每个峰的保留时间。类似地，在图4B中，纵轴412代表以mAU为单位的吸光度强度的测量，横轴414代表以分钟为单位的时间。色谱图416指示每个峰的保留时间。280nm处的检测适用于含有芳香族残基，特别是色氨酸的所有肽，而615nm处的检测对O-CP特异。在10至16分钟范围之外未检测到615nm处的峰。

图5是图解基于615nm处的吸收的PC完全消化的HPLC色谱图的图500。在图5中，纵轴502代表以mAU为单位的吸光度强度的测量，横轴504代表以分钟为单位的时间。色谱图506指示主峰和次峰中的每一个的保留时间。检测到五个主峰和两个次峰。

图6A是图解以PC表示的O-CP通过HPLC定量的校准曲线的图600。在图6A中，纵轴602代表总面积单位(mAU min)并且横轴604代表PC的浓度(mg/mL)。校准曲线606指示总面积和浓度之间的相关性在整个浓度范围内是高度线性的，并且由以下方程捕获：

y＝23.277x–3.4594，R²为0.9999

图6B是图解以O-CP表示的O-CP通过HPLC定量的校准曲线的图610。在图6B中，纵轴612代表总面积单位(mAU min)并且横轴614代表色肽(chromopeptide)的浓度(mg/mL)。校准曲线616指示总面积和浓度之间的相关性在整个浓度范围内是高度线性的，并且由以下方程捕获：

y＝228.46x–3.4594，R²为0.9999

使用方法

简而言之，组合物一般被描述为治疗、预防或改善与年龄相关的躯体疾病、细菌和/或病毒感染/疾病、以及与氧化应激相关的疾病或与任何前述相关的症状。当与PC或市售免疫调节补充剂(例如但不限于EpiCor和Wellmune)以及多种锌的化合物或形式(例如但不限于葡萄糖酸锌和吡啶甲酸锌)相比时，该组合物显示出意想不到的结果，即O-CP提供意想不到且改进的性质。O-CP在多种情况下，例如但不限于，在3种培养条件下，在总抗氧化能力、细胞抗氧化保护或生物利用度、以及免疫激活和细胞因子产生方面提供了意想不到且改进的性质，即直接影响(无应激培养物)、细菌炎症免疫攻击背景下的影响以及病毒模拟免疫攻击背景下的影响。因此，本文描述的是提供O-CP的有效活性的组合物及其治疗方法，其包括单独的O-CP或与其他化合物组合的O-CP以提供免疫调节作用。在一些实施方案中，本文公开的组合物可以与烟酰胺核苷(NR)、硒或其化合物(例如硒代甲硫氨酸)、锌或其化合物(例如吡啶甲酸锌)或其组合一起施用。在一些情况下，包含O-CP和NR的组合物显示出意想不到的结果，因为当与单独的O-CP或NR相比时，该组合提供了意想不到且改进的性质。该组合物还显示出意想不到的结果，因为与常规膳食补充剂相比时，O-CP提供了意想不到且改进的性质。类似地，当与单独的O-CP、吡啶甲酸锌或硒代甲硫氨酸相比时，O-CP与吡啶甲酸锌和硒代甲硫氨酸的组合提供了意想不到且改进的性质。因此，本文描述的是包含为受试者提供治疗或营养活性的有效剂量的组合物、其治疗用途和方法，其包括治疗有效量的O-CP以及NR、吡啶甲酸锌、硒代甲硫氨酸中的至少一种，或其任意组合。

如本文所公开的，免疫调节作用或免疫调节是指在细菌和病毒攻击或感染的背景下的免疫激活和调节或免疫抑制。免疫激活是指免疫系统的效应细胞被激活，以增殖、迁移、分化或以任何其他形式变得有活性。另一方面，免疫抑制或调节是指降低免疫系统的激活或功效。在该背景下，免疫调节也可以指通过影响仍在发展或成熟的免疫反应，或者通过调节已建立的免疫反应的特征来影响免疫反应的性质或特征。

在一些实施方案中，O-CP组合物可包含治疗有效量的O-CP和至少一种药学上可接受的赋形剂，用于治疗、预防或改善、或预防年龄相关的躯体疾病或细菌或病毒感染。在实施方案中，组合物可包含治疗有效量的O-CP与NR的组合，用于治疗、预防或改善、或预防受试者中与年龄相关的躯体疾病。在一些实施方案中，组合物可包含治疗有效量的O-CP与吡啶甲酸锌和/或硒代甲硫氨酸的组合，用于治疗、预防或改善、或预防受试者中的细菌或病毒感染。

如本文所用，表述“治疗有效量”包括无毒但充足量的组合物，其用于本文公开的实施方案中以提供期望的治疗或营养效果。本文公开的组合物的活性成分的量在不同的受试者中可以变化，这取决于多种因素，例如但不限于所治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、所治疗的病况的严重程度、所施用的特定的活性成分、受试者的体重和施用方式。因此，指定准确的“有效量”可以根据本文公开的实施方案而变化。此外，合适的“有效量”可以由本领域技术人员根据本文所包含的公开的特定情况确定。

举例来说，用于治疗年龄相关躯体疾病的本文公开的O-CP的“治疗有效量”可以是例如(以受试者体重的剂量计)30mg/70kg或0.428mg/kg、300mg/70kg或4.286mg/kg、3g/70kg或0.0428g/kg，或用于人类受试者的O-CP范围之间的任何分数。因此，在一些实施方案中，本文公开的组合物中O-CP的剂量对于人类受试者可以是约0.428mg/kg/天、4.286mg/kg/天或0.0428g/kg/天。可以使用例如6.17的转换因子将人类剂量转换为大鼠或鼠类剂量。因此，在一些实施方案中，本文公开的用于治疗年龄相关躯体疾病的O-CP的“治疗有效量”可以是例如2.64mg/kg、26.44mg/kg、0.264g/kg或用于鼠类受试者的O-CP范围之间的任何分数。因此，在一些实施方案中，本文公开的组合物中O-CP的剂量对于鼠类受试者可以是约2.64mg/kg/天、26.44mg/kg/天或0.264g/kg/天。在一些实施方案中，如在受试者中实现期望的治疗效果所需，上面列出的示例性治疗有效量可以在每天基础上施用，例如连续21天。

举例来说，用于治疗年龄相关躯体疾病的本文公开的NR(与O-CP组合使用)的“治疗有效量”对于人类受试者可以是例如30mg/70kg至300mg/70kg或0.428mg/kg至4.286mg/kg。因此，在一些实施方案中，本文公开的组合物中NR的剂量对于人类受试者可以是约0.428mg/kg至约4.286mg/kg/天。可以使用例如6.17的转换因子将人类剂量转换为大鼠或鼠类剂量。因此，在一些实施方案中，本文公开的用于治疗年龄相关躯体疾病的NR的“治疗有效量”对于鼠类受试者可以是例如2.64mg/kg或26.44mg/kg。因此，在一些实施方案中，本文公开的组合物中NR的剂量对于鼠类受试者可以是约2.64mg/kg/天至26.44mg/kg/天。在一些实施方案中，如在受试者中实现期望的治疗效果所需，上面列出的示例性治疗有效量可以在每天基础上施用，例如连续21天。

举例来说，用于治疗细菌或病毒感染的本文公开的O-CP的“治疗有效量”对于人类受试者可以是例如30mg/70kg至3g/70kg或0.428mg/kg至0.0428g/kg。因此，在一些实施方案中，本文公开的组合物中O-CP的剂量对于人类受试者可以是每天约0.428mg/kg至约0.0428g/kg。可以使用例如12.33的转换因子将人类剂量转换为小鼠或鼠类剂量。因此，在一些实施方案中，本文公开的用于治疗细菌或病毒感染的O-CP的“治疗有效量”对于鼠类受试者可以是例如5.28mg/kg或0.528g/kg。因此，在一些实施方案中，本文公开的组合物中O-CP的剂量对于鼠类受试者可以是约5.28mg/kg/天至约0.528g/kg/天。在一些实施方案中，如在受试者中实现期望的治疗效果所需，上面列出的示例性治疗有效量可以在例如LPS治疗前2周向受试者施用。

举例来说，本文公开的吡啶甲酸锌用于治疗细菌或病毒感染的“治疗有效量”对于人类受试者可以是例如5mg/70kg至100mg/70kg或0.071mg/kg至1.428mg/kg。因此，在一些实施方案中，本文公开的组合物中吡啶甲酸锌的剂量对于人类受试者可以是约0.071mg/kg/天至约1.428mg/kg/天。使用例如12.33的转换因子将人类剂量转换为小鼠或鼠类剂量。因此，在一些实施方案中，本文公开的用于治疗细菌或病毒感染的吡啶甲酸锌的“治疗有效量”对于小鼠受试者可以是例如0.875(元素锌)mg/kg至17.61(元素锌)mg/kg，或4.375mg/kg至88.05mg/kg。因此，在一些实施方案中，本文公开的组合物中吡啶甲酸锌的剂量对于鼠类受试者可以是约0.875(元素锌)mg/kg/天至约17.61(元素锌)mg/kg/天，或4.375mg/kg/天至约88.05mg/kg/天。在一些实施方案中，如在受试者中实现期望的治疗效果所需，上面列出的示例性治疗有效量可以在例如LPS治疗前2周向受试者施用。

举例来说，本文公开的硒代甲硫氨酸用于治疗细菌或病毒感染的“治疗有效量”对于人类受试者可以是例如50μg/70kg至500μg/70kg或0.714μg/kg至7.14μg/kg。因此，在一些实施方案中，本文公开的组合物中硒代甲硫氨酸的剂量对于人类受试者可以是约0.714μg/kg/天至约7.14μg/kg/天。使用例如12.33的转换因子将人类剂量转换为小鼠或鼠类剂量。因此，在一些实施方案中，本文公开的用于治疗细菌或病毒感染的硒代甲硫氨酸的“治疗有效量”对于鼠类受试者可以是例如8.80μg/kg或88.0μg/kg。因此，在一些实施方案中，本文公开的组合物中硒代甲硫氨酸的剂量对于鼠类受试者可以是约8.80μg/kg/天至约88.0μg/kg/天。在一些实施方案中，如在受试者中实现期望的治疗效果所需，上面列出的示例性治疗有效量可以在例如LPS治疗前2周向受试者施用。

在一些实施方案中，如本文所述的O-CP组合物可进一步包含一定量的酶。在某些实施方案中，所述酶可以是用于从PC制备O-CP的水解反应中的酶。因此，如果包含酶，则所述酶优选具有至少“普遍认为安全”(GRAS)的质量，并且更优选该酶因此至少是“食品级”酶。在某些实施方案中，酶可以是碱性蛋白酶。存在的酶的量没有特别限制，并且可以是约10μg至约10g。例如，组合物中酶的量可以是10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、225μg、250μg、275μg、300μg、325μg、350μg、375μg、400μg、425μg、450μg、475μg、500μg、525μg、575μg、600μg、625μg、650μg、675μg、700μg、725μg、750μg、775μg、800μg、825μg、850μg、875μg、900μg、925μg、950μg、975μg、1000μg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg、800mg、825mg、850mg、875mg、900mg、925mg、950mg、975mg、1000mg、1.25g、1.5g、1.75g、2.0g、2.25g、2.5g、2.75g、3.0g、3.25g、3.5g、3.5g、3.75g、4.0g、4.25g、4.5g、4.75g、5.0g、5.25g、5.5g、5.75g、6.0g、6.25g、6.5g、6.75g、7.0g、7.25g、7.5g、7.75g、8.0g、8.25g、8.5g、8.75g、9.0g、8.25g、9.5g、9.75g、10g或更多，或任何两个前述值之间的任何范围或量和本文公开的任何其他范围或量。

本文公开的组合物的一些实施方案可进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂或媒介物。例如，药学上可接受的媒介物可以包括载体、赋形剂、稀释剂等，及其组合或混合物。如本文所用，“赋形剂”是指出于长期稳定、体积、粘稠度、结合能力、润滑、崩解能力、药物吸收、增强的溶解度等目的而添加到组合物中的物质。“稀释剂”是赋形剂的一种类型。

如本文所用，“载体”是指与活性成分相互作用并增强活性成分的性质或促进化合物掺入受试者的细胞或组织中的化合物。

如本文所用，“稀释剂”是指在制剂中充当填料以增加重量并改善含量均匀性的成分。稀释剂在制剂中可能是必需的或期望的。

在一些实施方案中，本文公开的组合物通过多种递送模式施用，所述递送模式包括但不限于口服、静脉内或皮下。组合物的其他施用方式包括但不限于皮内、肌内或腹膜内。本文描述的组合物可以施用于人类受试者。在一些实施方案中，组合物与其他活性成分或载体、稀释剂、赋形剂或其组合混合。

在一些实施方案中，本文公开的组合物可以采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、微丸、胶囊剂、含有液体的胶囊剂、粉剂、缓释制剂、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、咀嚼剂型、明胶剂型、液体剂型或任何其他适合使用的形式。

本文所公开的组合物可以泡罩包装或分配器装置等形式提供。泡罩包装可包括例如金属或塑料箔等。分配器装置可附有组合物施用的说明书。本文公开的组合物可以在合适的容器中提供并贴上用于治疗指定病况或疾病的标签。

在一些实施方案中，如本文所述的组合物可以施用于人类受试者。在一些实施方案中，组合物与其他活性成分或载体、稀释剂、赋形剂或其组合混合。旨在口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制造药学上可接受的组合物的任何方法来制备，并且此类组合物可以包括一种或多种以下试剂：甜味剂、调味剂、着色剂、包衣剂和防腐剂。甜味剂和调味剂将增加制剂的适口性。含有与适合片剂制造的无毒药学上可接受的赋形剂混合的复合物的片剂是可接受的。药学上可接受的媒介物例如赋形剂与制剂的其他成分兼容(并且对患者无损害)。这些赋形剂包括惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术进行包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在较长时间内提供持续的作用。例如，可以使用时间延迟材料，例如单独的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯或与蜡一起。

用于口服使用的制剂还可以呈现为含硬明胶或非明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者呈现为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。水性悬浮液可以含有与适合于制造水性悬浮液的赋形剂混合的本文所述的复合物。此类赋形剂包括悬浮剂、分散剂或润湿剂、一种或多种防腐剂、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。

油悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或悬浮在矿物油例如液体石蜡中来配制。油悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂，例如上述的那些，和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加的抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。适合于通过添加水来制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒可以提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。还可以存在额外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。

糖浆剂和酏剂可以与甜味剂，例如甘油、山梨糖醇或蔗糖一起配制。此类制剂还可含有缓和剂、防腐剂、调味剂或着色剂。

用于肠胃外施用的组合物可以是无菌注射制剂的形式，例如无菌注射水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据本领域熟知的方法使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。合适的稀释剂包括例如水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油可以常规地用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸同样可以用于制备注射制剂。

应当理解，一定量的化合物可以与载体材料组合以产生单一剂型。这些形式将根据所治疗的宿主和特定的施用模式而变化。

在一些实施方案中，本文描述的组合物可以通过为动物设计的补充剂或剂量来施用。在一些动物应用中，化合物或组合物可以添加至和/或包含宠物零食或饼干，例如狗饼干或猫零食。

水性悬浮液可以含有与适合于制造水性悬浮液的赋形剂混合的本文公开的化合物。此类赋形剂包括悬浮剂、分散剂或润湿剂、一种或多种防腐剂、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。

旨在口服施用的组合物可以根据本领域已知的用于制造组合物的任何方法来制备，并且此类组合物还可以含有至少一种试剂，即甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。

在一些实施方案中，本文公开的组合物可以配制在控释媒介物(vehicle)中。鉴于本文所包含的公开，药物科学领域的技术人员将容易地设想利用控释媒介物，并且这些方面可以应用于营养和膳食补充剂。本领域的技术和产品被不同地称为控释、缓释、延长作用、贮库、储存库、延迟作用、延迟释放和定时释放；本文所用的词语“控释”旨在并入上述每一项技术。

可以使用多种控释媒介物，包括可生物降解或可生物侵蚀的聚合物，例如聚乳酸、聚乙醇酸和再生胶原。控释药物递送装置可包括霜剂、洗剂、片剂、胶囊、凝胶、微球、脂质体、眼插入物、微型泵和其他输注装置例如泵和注射器。缓慢释放活性成分的可植入或可注射的聚合物基质和透皮制剂可以用于所公开的方法中。

控释制剂可以通过使用聚合物与组合物形成复合物或吸收组合物来实现。可以通过选择合适的大分子例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯醋酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和硫酸鱼精蛋白来进行控制递送，并且选择这些大分子的浓度以及掺入方法来控制活性复合物的释放。

活性复合物的控释可被认为是指任何延长释放剂型。为了本公开的目的，以下术语可以被认为基本上等同于控释：连续释放、控释、延迟释放、贮库、逐渐释放、长期释放、程序化释放、延长释放、程序化释放、成比例释放、延长释放、储存库、延迟、缓慢释放、间隔释放、持续释放、时间外衣(time coat)、时间释放、延迟作用、延长作用、分层时间作用、长期作用、延长作用、持续作用药物和延长释放、在肠道和肠道的pH水平、分子的分解以及基于吸收和生物利用度方面的释放。

水凝胶(其中本文所公开的组合物溶解在水性成分中以随时间逐渐释放)可以通过亲水性单烯单体例如乙二醇甲基丙烯酸酯的共聚来制备。可以使用基质装置，其中组合物分散在载体材料的基质中。载体可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、可渗透的或不可渗透的。或者，包含被速率控制膜包围的本文公开的组合物的中央贮库的装置可用于控制复合物的释放。速率控制膜包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物或对苯二甲酸丁二醇酯/聚四亚甲基醚对苯二甲酸酯(tetramethylene ether terephthalate)。还考虑使用硅橡胶或乙烯-乙烯醇储存库。

也可以使用控释口服制剂。在实施方案中，将本文所述的组合物掺入可溶性或易蚀性基质中，例如丸剂或锭剂。在另一个实例中，口服制剂可以是用于舌下施用的液体。这些液体组合物还可以是凝胶或糊剂的形式。通常使用亲水性树胶，例如羟甲基纤维素。润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或硬脂酸钙可用于帮助压片过程。

本文描述的组合物可以每天施用一次、两次或三次。在一些实施方案中，组合物一天施用四次。例如，组合物可以在餐前、餐后或餐中施用。口服施用的给药可以是要求单次日剂量、或每隔一天单次剂量、或首次施用剂量72小时内单次剂量、或全天多次间隔剂量的方案。构成治疗的活性剂可以以组合剂型或以旨在基本上同时口服施用的单独剂型同时施用。构成治疗的活性剂也可以依次施用，其中任一活性组分通过要求两步摄入的方案施用。因此，方案可能要求依次施用活性剂，同时间隔地摄取单独的活性剂。多个摄取步骤之间的时间段可以在几分钟至长达约72小时的范围内，这取决于每种活性剂的性质，例如活性剂的效力、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学曲线，还取决于患者的年龄和状况。治疗的活性剂无论是同时、基本上同时还是依次施用，都可以涉及要求通过口服途径施用一种活性剂并且通过静脉内途径施用其他活性剂的方案。一方面，本文描述的实施方案可以实现先前未认识到或无法实现的治疗和/或营养益处，并因此出乎意料且令人惊讶地实现使用组合物的改进的能力。在一些实施方案中，组合物被配制用于静脉内施用，因为可以产生更浓缩的溶液。无论治疗的活性剂是通过口服或静脉内途径、单独还是一起施用，每种这样的活性剂都将包含在药学上可接受的赋形剂、稀释剂或其他制剂组分的合适的药物制剂中。

一般而言，本公开的组合物的剂型可以通过本领域的参考文献Remington'sPharmaceutical Sciences中描述的技术来制备[Gennaro AR,编辑Remington:TheScience and Practice of Pharmacy.第20版.Baltimore:Lippincott,Williams&Williams,2000]。为了治疗目的，该联合治疗应用的活性组分可以与适合于指定施用途径的一种或多种佐剂组合。这些组分可以与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、明胶、阿拉伯树胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，然后压片或封装以方便施用，其量可由本领域技术人员确定。此类胶囊或片剂可含有控释制剂，如可在羟丙基甲基纤维素中的活性化合物的分散体中提供。固体剂型可被制造为缓释产品，以在数小时内提供连续释放药物。压缩片剂可以是糖包衣的或薄包衣的，以掩盖任何不愉快的味道并保护片剂免受大气影响，也可以是肠包衣的，用于在胃肠道中选择性崩解。固体和液体口服剂型都可以含有着色剂和调味剂，以增加患者的接受度。可以利用其他佐剂和施用模式，并且这些方面也可以应用于本文描述的任何营养或膳食补充剂。

在一些实施方案中，组合物可以包含用于治疗或预防细菌感染的O-CP，其可以升高细胞例如但不限于受试者中的NK细胞、NKT细胞、T淋巴细胞、以及非NK非T细胞的激活标志物CD25和CD69的表达水平。单核细胞的激活标志物CD69在受试者的细菌感染期间也可以具有升高的水平。细菌感染可以是细菌脂多糖(LPS)诱导的感染。在其他实施方案中，组合物可包含用于治疗或预防病毒感染的O-CP，其可升高细胞例如但不限于受试者中的NK细胞、NKT细胞和非NK非T细胞的激活标志物CD25和CD69的表达水平。T淋巴细胞和单核细胞的激活标志物CD69在受试者的病毒感染期间也可以具有升高的水平。病毒感染可以是由模拟病毒的聚肌苷酸:聚胞苷酸(Poly I:C)诱导的感染。在其他实施方案中，在没有免疫攻击的情况下，组合物可包含O-CP，其可升高细胞例如但不限于受试者中的NK细胞、NKT细胞、T淋巴细胞和非NK非T细胞的激活标志物CD25和CD69的表达水平。本文公开的受试者可以是特定细胞类型或模式细胞类型，例如但不限于人红细胞(RBC)。在其他实施方案中，组合物可包含与葡萄糖酸锌和/或吡啶甲酸锌组合的O-CP，用于治疗或预防受试者的细菌或病毒感染。

如本文所公开，CD69是指导致淋巴细胞增殖和细胞信号传导的淋巴激活期间最早的可诱导细胞表面糖蛋白。如本文所公开，CD25是指存在于激活的T细胞和B细胞上的细胞因子白细胞介素-2(IL-2)的受体。CD25也可以在NK和NKT细胞上表达，并且在一些情况下显示与CD69表达负相关。

本文公开的组合物中的O-CP可以在LPS诱导的感染期间、在模拟病毒的Poly I:C诱导的感染期间或在不存在任何免疫攻击的情况下刺激CD69+CD25+双阳性细胞的增加。

如本文所公开，Poly I:C被称为合成双链RNA，作为通过toll样受体3(TLR3)激活病毒的模型。如本文所公开，LPS是指来自大肠杆菌(E.coli)的高度炎症性细菌脂多糖LPS(细菌毒素)，其用于在用天然产物处理免疫细胞后诱导炎症。

在一些实施方案中，组合物可包含O-CP，用于通过测定免疫激活细胞因子、抗炎细胞因子和生长因子的表达水平来治疗或预防细菌或病毒感染。本文公开的免疫激活细胞因子可以是例如白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、巨噬细胞炎症蛋白1α(CCL3)(MIP-1α)、巨噬细胞炎症蛋白1β(CCL4)(MIP-1β)、干扰素γ(IFN-γ)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。本文公开的抗炎细胞因子可以是例如白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)或白介素10(IL-10)。本文公开的生长因子可以是例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。在其他实施方案中，组合物可包含O-CP，其可在细菌感染期间升高IL-1β、IL-6、MIP-1β、TNF-α、IL-1ra、IL-10或G-CSF的表达水平。在其他实施方案中，组合物可包含O-CP，其可在病毒感染期间升高IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α、MIP-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-1ra、IL-10或G-CSF的表达水平。

一些实施方案提供了通过测定细胞例如但不限于NK细胞、NKT细胞、T淋巴细胞和非NK非T细胞的激活标志物CD25和CD69的表达水平，并通过测定免疫激活细胞因子、抗炎细胞因子和生长因子的表达水平来预测或监测遭受细菌或病毒感染的受试者是否响应包含O-CP的组合物的治疗的方法。作为非限制性实例，本文公开的免疫激活细胞因子可以是IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α、MIP-1β、IFN-γ或TNF-α。作为非限制性实例，本文公开的抗炎细胞因子可以是IL-1ra或IL-10。作为非限制性实例，本文公开的生长因子可以是G-CSF。

如本文所公开，IL-1β是指重要的炎症介质，其由激活的巨噬细胞产生为被胱天蛋白酶1裂解的前蛋白。如本文所公开，IL-6主要指促炎细胞因子。IL-6的抑制剂可开发为类风湿性关节炎的药物。如本文所公开，IL-8是指中性粒细胞趋化因子，其通常与炎症相关并且在干细胞生物学中发挥复杂的作用。如本文所公开，MIP-1α是指巨噬细胞在用细菌内毒素刺激后产生的因子。这些对于针对感染和炎症的免疫反应至关重要。同样，它们还激活中性粒细胞并诱导促炎细胞因子的释放。如本文所公开，MIP-1β还指巨噬细胞在用细菌内毒素刺激后产生的因子。这些对于针对感染和炎症的免疫反应也至关重要。同样，它们激活中性粒细胞并诱导促炎细胞因子的释放。如本文所公开，IFN-γ是指与许多自身炎症和自身免疫疾病相关的巨噬细胞激活因子。如本文所公开，TNF-α是指参与全身炎症的脂肪因子，其主要由激活的巨噬细胞产生。它们是指刺激急性期反应的一组细胞因子的成员。

如本文所公开，IL-1ra是指IL-1β促炎作用的天然抑制剂。如本文所公开，IL-10是指抗炎细胞因子，但其需要激活细胞来诱导。

如本文所公开，G-CSF是指促进中性粒细胞增殖的糖蛋白。G-CSF可在药学上用于动员干细胞并加速组织修复，例如在中风、心脏病发作后以及许多其他临床情况或状况中。

一些实施方案提供治疗、预防或改善受试者中年龄相关躯体疾病的方法，其包括鉴定患有年龄相关躯体疾病或处于发生年龄相关躯体疾病风险的受试者，以及向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含O-CP或O-CP与NR的组合。与年龄相关的躯体疾病包括冠心病、痴呆、高血压和神经退行性疾病。其他实施方案提供治疗、预防或改善受试者中细菌或病毒感染的方法，其包括鉴定患有细菌或病毒感染的受试者，以及向所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含O-CP或O-CP与吡啶甲酸锌和/或硒代甲硫氨酸的组合。细菌感染可以是脂多糖(LPS)诱导的感染。

本文提供的是通过向受试者提供治疗有效量的O-CP、或与NR组合的O-CP、或与吡啶甲酸锌和/或硒代甲硫氨酸组合的O-CP治疗上述病况或感染的方法，如本文所公开。在本文公开的多种实施方案中，受试者可以是哺乳动物，例如动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、马、美洲驼、羊驼、鸭子等，以及人。

如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指医疗状况的补救或改善，或疾病或病症的任何不期望的征兆或症状减轻到一定程度，或抑制疾病或病症的进展，或甚至预防疾病或病症，或改善由于疾病或病症导致的病况也可以被视为治疗。术语“治疗”并不一定意味着完全治愈疾病或病症。除了治疗或预防之外，本文公开的组合物可用于改善或减少疾病的影响，例如当用作膳食补充剂或营养药物或组合物时。此外，本文公开的组合物可用于补充饮食以帮助减少发生本文所述疾病的可能性，例如当用作膳食补充剂以帮助减少细菌或病毒感染时。

在用于人类受试者之前，可以在体外和体内测定本文公开的组合物的期望治疗或预防活性。例如，体内测定可用于测定施用本文所述的特定化合物或本文公开的组合物组合是否优选用于治疗、预防或改善与年龄相关的躯体疾病、细菌和/或病毒感染/疾病，以及与氧化应激相关的疾病，或与上述任何相关的症状。本文公开的组合物还显示在动物模型或动物受试者中是有效且安全的。本文公开的组合物显示在体外模式细胞例如但不限于人红细胞(RBC)中是有效且安全的。

此外，可以采用体外测定来帮助测定最佳剂量范围。待在组合物中使用的精确剂量可取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并且可根据执业医师的决定来决定。待在PBMC中施用的O-CP的合适剂量范围通常为约0.039g/L-2.5g/L。在优选的实施方案中，剂量范围为约0.25g/L-2.0g/L。用于施用本文所述的组合物的技术是本领域技术人员已知的。

实施例

以下实施例旨在说明性且非限制性的，并且代表本公开的具体实施方案。

实施例1：

PC溶液的表征

光度测定表征

620nm和280nm处的吸光度比率通常用作PC纯度的指标。食品级C-PC显示约0.7的A₆₂₀/A₂₈₀，而分析型(“纯”)C-PC具有高于4的A₆₂₀/A₂₈₀。粗PC溶液的规定规格(statedspecification)是不小于1的A₆₂₀/A₂₈₀。615nm处的消光系数用于PC的光度测定定量(5.92mLmg^-1cm^-1)。对于所有光度测定测量，将PC溶液(磷酸盐缓冲液pH 7.0)稀释，以在1^-cm比色皿中产生不超过1的吸光度。具体而言，在室温下在100mL 10mM磷酸钠缓冲液(pH 7)中制备0.5g粗PC的溶液。在1-cm光程石英比色皿中，以10mM磷酸钠缓冲液(pH 7)为空白，测量280、615和620nm处的吸光度。620和280nm处的吸光度比率(A₆₂₀/A₂₈₀)不小于1。使用5.92mL mg^- ¹cm^-1的消光系数，由615nm处的吸光度计算样品溶液中PC的浓度。C-PC的单位质量百分比不低于30％。

低分子量化合物的含量

将10.0g粗PC溶解在100mL软化水中。将所得溶液转移至10-kDa截留分子量(MWCO)透析管中，并在室温下针对5升软化水五次更换透析24小时。然后将透析管的内容物定量转移至聚乙烯皿中，在-70℃下冷冻、冻干并称重。PC的原始量(10.0g)与透析后剩余量之间的重量差异被解释为小于10kDa的材料。低分子量内容物不超过PC质量的45％。

当光度测定表征的结果符合预期规格时，使用PC溶液进行处理，而当结果不符合预期规格时，丢弃PC溶液。

实施例2：

蛋白质级分的制备

粗PC溶液的制备：

在经过粗PC溶液的质量控制或光度测定表征后，将粗PC溶液溶解在软化水中至50g/L的浓度。具体而言，在室温下将1kg PC溶解在20L软化水中。使用适度搅拌15分钟(50-100rpm，单个60-mm直径六叶片Rushton搅拌器)。避免将空气引入溶液中以防止起泡。使溶液均匀且无结块。

切向流过滤：

通过过滤(例如切向流超滤)从粗PC溶液中去除大小小于10kDa的化合物并丢弃。使用0.6m²(6.5ft²)10-kDa截留分子量(MWCO)Hydrosart盒在0.5巴(7.25psi)压力和约5-10L/min(1.3-2.6gal/min)的切向流速在室温下进行切向流超滤，产生约0.5-1L/min(0.13-0.26gal/min)的过滤速率。继续过滤直至截留物或蛋白质级分的体积减少至起始体积的四分之一，即5L。通过添加5L软化水将截留物或蛋白质级分洗涤五次，所述截留物或蛋白质级分再次减少至5L。如此通过重复洗涤将低分子量化合物的量减少至起始值的1％以下，其通过以下计算：

由此获得的滤液是澄清的，并且颜色为无色或淡黄至浅绿色。由此获得的蛋白质级分立即使用或任选地冷冻储存在-30℃(-22°F)或冷冻干燥。滤液作为无害含水废物丢弃。

实施例3：

水解

溶液的制备：

使用软化水将先前步骤中获得的截留物或蛋白质级分的浓度调节至50g/L溶解的>10kDa的固体。所需的体积可以从PC溶液表征获得的值来计算。然后使用32％食品级盐酸将溶液的pH调节至1.2的值。这对应于约80mM HCl的终浓度。酸以小批量添加，充分搅拌以防止结块。反应容器对低pH值和氯化物的耐受性也得到了证实。

胃蛋白酶水解：

将猪胃蛋白酶添加到蛋白质级分中至1000FIP单位/L(即，标准活性≥2,000FIP单位/克时为0.5g/L)的终浓度。初始混合或搅拌后，不需要进一步调节pH，但反应在密闭容器中进行，以避免HCl损失到大气中。通过高压液相色谱(HPLC)或光度测定法监测水解的进程，并在37℃(98.6°F)下36小时后完成。由此获得的粗水解液在进入下一阶段之前不进行储存。在此步骤期间没有产生含水废物。

实施例4：

粗水解液的中和

溶液的制备：

使用食品级氢氧化钠溶液将酸性粗水解液调节至pH 7，以获得中和的粗水解液。小心不要过度滴定，因为碱性pH值会对产品稳定性具有负面影响。

实施例5：

下游处理以获得(O-CP)

切向流过滤：

中和的粗水解液立即进行过滤，例如切向流超滤(10kDa MWCO)，以将渗透物中小于10kDa的所需O-CP与截留物中不想要的不溶性污染物、胃蛋白酶和未水解蛋白质分离。这在室温下使用0.6m²(6.5ft²)10-kDa MWCO Hydrosart(Sartorius)盒在0.5巴(7.25psi)压力和约5-10L/min(1.3-2.6gal/min)的切向流速下进行，产生约0.5-1L/min(0.13-0.26gal/min)的过滤速率。过滤继续直至截留物的体积尽可能减少(小于一升)。任选地洗涤截留物以回收任何剩余的<10kDa肽，但是由于这引入了需要通过冷冻干燥去除的额外的水，因此针对回收的产物的价值权衡额外的干燥成本。废物截留物作为无害含水废物丢弃。此步骤不需要质量控制放行措施。

实施例6：

冷冻干燥

冷冻：

根据浓度，如果未完全冷冻，渗透物容易起泡。因此，将渗透液填充到不锈钢板中至2.5cm(1英寸)的填充高度，并在-70℃(-94°F)下冷冻12小时以避免起泡。

干燥：

将板转移至冷冻干燥器。初次干燥在0.42mbar(0.006psi)和-20℃(-4°F)下进行，二次干燥在相同压力下进行，无需加热。将如此获得的干燥粉末储存在阴凉干燥处并避光。最终产品或干燥粉末的O-CP含量通过光度测定法和HPLC测定。当结果符合预期规格时，最终产品被放行，当结果不符合预期规格时，最终产品被丢弃。

实施例7：

喷雾干燥

下游加工后获得的渗透物可以任选地经历喷雾干燥方法以从渗透物产生干粉末。喷雾干燥包括例如用热气体快速干燥渗透物。然后将干粉末储存在阴凉、干燥和黑暗的地方。最终产品或干燥粉末的O-CP含量通过光度测定法和/或HPLC测定。

实施例8：

PC产物

建立测定的基础是来自Delhi Nutraceuticals Pvt Ltd的材料(食品级PC粉末)。该材料的C-PC含量先前确定为32％。PC的纯色肽的所有定量均基于此测定，即100g的PC(食品级)相当于32g纯的C-PC。

实施例9：

PC沉淀

许多蛋白质，包括PC，可以通过高浓度的三氯乙酸或盐酸沉淀。为了测定合适的HCl浓度，通过添加0.1mL多种浓度的HCl处理1g/L粗PC(对应于0.32g/L PC)的0.9mL储备溶液体积，以产生0.1M、0.25M、0.5M、1M和2M HCl的最终浓度。将这些样品充分混合并在冰上温育10分钟，然后在室温下以13,000×g离心5分钟。记录上清液在640nm处的吸收作为溶液中剩余PC的量度。发现1M HCl的浓度可产生令人满意的沉淀。

实施例10：

光度测定表征

615nm处的消光系数用于PC(5.92mL mg^-1cm^-1)的光度测定定量。PC的所有光度测定定量均在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中进行。记录光谱以测定酸性条件下O-CP的最大吸收。将粗PC的样品稀释以在1-cm比色皿中产生不超过1的吸光度。

实施例11：

定量消化PC以获得O-CP

用胃蛋白酶将已知量的PC完全消化(24小时)以获得已知量的O-CP。简而言之，将80μL蛋白质级分(5mg/mL)添加到760μL 84mM HCl和35mM NaCl(pH 1.2)中，并与每μg蛋白质级分0.4μg胃蛋白酶(≥2,000FIP单位/克，CARL ROTH)在37℃下温育24小时。完全消化后，将一体积的10M HCl添加到九体积的消化产物或粗水解液中，然后在冰上温育10分钟。然后在室温下以13,000×g离心5分钟去除不溶性沉淀物。

O-CP含量的计算基于PC的α和β亚基的以下序列。

PC的完全消化进行至最短的片段，产生1272g/mol的平均O-CP分子量。事实上，消化产生了β亚基的第一个片段的肽长度的一些变化，但分子量的变化相对小。由于标准材料的不可用性，现阶段对每个长度变体进行精确定量是不可能的。

完全消化一摩尔二聚体PC亚基(37,454g/mol)产生3,816g(3×1272g/mol)的O-CP，或PC质量的10.2％。如果所有可变长度肽均为最长形式而不是此处假设的最短形式(AACLRD而不是CL)，则O-CP产量将为11.3％而不是10.2％。因此，误差相对低，并且目前的假设是保守的。

实施例12：

O-CP的光度测定定量

对于O-CP的光度测定定量，将0.1mL的10M HCl添加到0.9mL消化液或粗水解液中，然后混合并立即在冰上温育10分钟。然后将该样品在室温下以13,000×g离心5分钟。在1-cm比色皿中针对水空白测量上清液的A₆₄₀。A₆₄₀应介于0.05和1之间用于可靠测量；如有必要，样品可以任选地用1M HCl稀释。应分别使用1.91mL mg^-1cm^-1和18.7mL mg^-1cm^-1的质量消光系数将A₆₄₀值转换为PC或O-CP的mg/mL。该转换给出了在添加HCl进行沉淀后在样品中的浓度。此外，为了确定添加HCl之前的浓度，应将计算值乘以1.11。

实施例13：

通过高压液相色谱(HPLC)定量O-CP

进行HPLC以实现RP-C8柱上峰的良好分离。将柱(Acclaim 120 C8，粒径5μm，孔径2.1mm×250mm，THERMO SCIENTIFIC)用水中0.1％甲酸(缓冲液A)以0.3mL/min的流速平衡20分钟。通过将0.1mL 10M HCl添加到0.9mL消化液或粗水解液中，然后混合并立即在冰上温育10分钟来制备样品。然后将样品在室温下以13,000×g离心5分钟。注射准备好的样品(5μL)，然后继续使用缓冲液A运行5分钟。然后在接下来的15分钟内应用从0到100％缓冲液B(乙腈中的0.1％甲酸)的线性梯度，然后在接下来的2分钟内应用100％B，并在另外3分钟内返回到100％A。使用缓冲液A和缓冲液B作为流动相。在280nm和615nm处进行检测。该系统是UltiMate 3000(DIONEX)。需要定期准备浓度范围0.3至6mg/mL(PC)或0.03至0.6mg/mL(O-CP)的校准曲线，并且每个运行序列中需要包括至少两个已知浓度的标准品用于验证。在10-16分钟保留时间间隔内对所有峰进行积分。

实施例14：

O-CP合成和抗氧化剂合成的无HCl优化

作为其中阐述的公开的一部分，获得并创建了省略HCl的过程的实施方案，因为HCl与钢不兼容并且需要专门的设备来大规模操作。本发明人试图开发在不存在HCl的情况下制备O-CP的新方法，以产生允许O-CP的改进的大规模制造的方法。因此，进行实验以确定在没有HCl的情况下制备O-CP的加工条件，其可以更有效且更经济地在更大的工业规模上使用。

进行初步筛选以评估粗PC浓度、温度、pH、反应时间和所用酶在PC降解为O-CP中所起到的重要性，并显示在图7中。从初步筛选来看，食品级碱性蛋白酶、pH 8和65℃被确定为最佳条件，导致可在5小时内将PC至少80％转化为O-CP，且不依赖于粗PC组合物。然后对碱性蛋白酶进行二次筛选以确定酶的最佳浓度、温度和pH，以用于水解反应来实现PC的最大转化，其结果示于图8中。通过二次筛选，本发明人确定了用于制备O-CP的最佳反应条件是溶液中粗PC的浓度为50g/L，pH为8，65℃，以及0.2g碱性蛋白酶/g的PC。利用这些条件从三种PC来源制备O-CP。然后评估O-CP的抗氧化活性(ORAC测定)并示于图9中。在图9中，在通过使PC经受碱性蛋白酶而制备的O-CP中发现最高的抗氧化活性。进行最后的实验以进一步提高O-CP的抗氧化活性，其结果示于图10中。在图10中，最佳条件是通过使PC在65℃和pH 8下经受碱性蛋白酶(0.1g/g)5小时来制备O-CP(O-CP-E1)。该条件产生了令人惊讶且意想不到的结果，即抗氧化活性高于未处理PC的10倍增加，和抗氧化活性高于经受没有碱性蛋白酶的相同条件下的PC(O-CP-C1)的4倍增加。

结果

已成功开发了用于定量O-CP的光度测定法和HPLC方案。本研究用于确定允许区分未消化PC和O-CP的条件，并通过光度测定法和HPLC建立定量方法。O-CP已经被定义为PC的水解片段，其可溶于酸并在600nm至700nm之间呈现最大吸收。

通过酸沉淀区分PC和O-CP

向PC储备液中添加HCl并离心后，在较高浓度(0.5M及以上)下容易地观察到蓝色沉淀，并且上清液中很少或没有蓝色着色。基于这些结果，选择1M HCl的浓度来沉淀PC，同时将O-CP留在溶液中。向PC的完全消化物中添加1M HCl不会沉淀任何蓝色物质，也不会导致溶液的A₆₁₅降低，表明O-CP仍然可溶。

O-CP的光度测定定量

用胃蛋白酶将含有0.476g/L(终浓度)PC的溶液消化24小时至完全。这对应于0.152g/L纯PC。HCl沉淀后记录光谱以确定酸性条件下的最大吸收，如图2所示。吸收最大值位于640nm处，其总PC含量的消光系数为1.92mL mg^-1cm^-1。与中性pH下的PC相比，最大值发生红移，并且消光系数低于一半。由于来自PC的O-CP产率仅为约10.2％，因此为O-CP表示的消光系数为18.8mL mg^-1cm^-1。

记录校准曲线以确定使用光度测定法来测量O-CP浓度的有用范围。图3A显示了以PC浓度表示的用于光度测定O-CP的校准曲线的结果。A₆₄₀和浓度之间的相关性在高达至少约0.6mg/mL PC时呈线性。图3B显示了以纯O-CP浓度表示的用于光度测定O-CP的校准曲线。A₆₄₀和浓度之间的相关性在高达至少约0.06mg/mL O-CP时呈线性。假定A₆₄₀值在0.05到1之间时定量是可靠的。直线的斜率与先前部分中确定的消光系数很好地对应，即对于PC为1.92mL mg^-1cm^-1相对于1.91mL mg^-1cm^-1，对于O-CP为18.8mL mg^-1cm^-1相对于18.7mL mg^-1cm^-1。

通过HPLC定量O-CP

还建立了通过HPLC定量O-CP的方案。HPLC产生了额外的优点，即产生了通过完全消化蛋白质级分获得的肽数量的指示。预计通过HPLC观察到五个主要峰。图4A和4B显示了在280nm和615nm处检测到的完整PC消化物的色谱图。图4A显示了完整的色谱图，而图4B仅显示了含有所有O-CP峰的10-16分钟范围。该样品中的PC浓度为2.89mg/ml，对应于0.294mg/ml O-CP。280nm处的检测适用于含有芳香族残基，特别是色氨酸的所有肽，而615nm处的检测则对O-CP特异。在10至16分钟范围之外未检测到615nm处的峰。在图5中，对于许多不同的O-CP浓度，显示了10-16分钟的范围。

在先前的研究中，检测到五个主要峰和两个次要峰。由于不可能为每个峰分配特定的肽，因此使用所有峰的总面积进行定量。无需手动调整的清晰峰检测仅当浓度为0.36mg/mL纯PC(0.037mg/mL O-CP)或高达5.77mg/mL PC时才是可能的。图5显示了基于615nm处的吸收的PC完全消化的HPLC色谱图。最高峰对应于5.77mg/ml PC的消化物，并且每个较低浓度是上述浓度的一半。总面积和浓度之间的相关性在此范围内呈高度线性，并用于定量。相应的校准示于图6A和6B中。特别地，图6A显示了以PC表示的通过HPLC定量O-CP的校准曲线。图6B显示了以纯O-CP含量表示的通过HPLC定量O-CP的校准曲线。

建立了基于PC和O-CP在HCl中不同溶解度的光度测定定量，并且发现该方法简单、可靠且可重复。通过HPLC分离O-CP已成功转移到HPLC设置，并在可检测峰的数量方面给出了可比较的结果。也发现通过HPLC对O-CP进行定量是可靠的。两种技术均显示非常令人满意的性能，并可用于PC水解的定量和O-CP浓度测量。

应该考虑的一个警告是，粗PC浓度的所有标准化都是基于所提供的粗PC中PC的光度测定。由于粗PC不纯，并且没有绝对测量纯度的报告，因此不可能进行直接的重量标准化。然而，确定的PC含量(32％)与产品规格(粗PC溶液的表征)中给出的不小于30％的值很好地对应。因此，校准被认为是适当的。

实施例15：

用于确定组合物的抗衰老作用的材料和方法

动物

使用Wistar大鼠(每组n＝7；8周龄)，动物在温度(22±2℃)、湿度(55±5％)和12/12小时光/暗周期下饲养。随意提供颗粒食物和水。实验在根据Firat University批准的方案下进行。

研究设计小组

选取两个对照组进行研究。正常对照组给予磷酸盐缓冲盐水(PBS)，CORT对照组给予皮质酮(CORT)。O-CP和NR的剂量是基于Shin等人(2010)的Human Equivalent Dose(HED)for Drug Development确定的。人体剂量与动物剂量的转换是基于体表面积。使用6.17的转换因子将人体剂量转换为大鼠剂量。O-CP的人体等效剂量为30mg和300mg，烟酰胺核苷的人体等效剂量为300mg。

O-CP剂量：

低：30mg/70kg＝0.428mg/kg/天人*6.17＝2.64mg/kg/天大鼠

高：300mg/70kg＝4.286mg/kg/天人*6.17＝26.44mg/kg/天大鼠

烟酰胺核苷(NR)剂量：

300mg/70kg＝4.286mg/kg/天人*6.17＝26.44mg/kg/天大鼠

有7个研究设计小组：

1.正常对照

2.CORT对照

3.CORT+NR＝300mg(HED)

4.CORT+O-CP(低)＝30mg(HED)

5.CORT+O-CP(高)＝300mg(HED)

6.CORT+O-CP(低)+NR＝30mg+300mg(HED)

7.CORT+O-CP(高)+NR＝300mg+300mg(HED)

CORT(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)悬浮在具有0.1％Tween80％和0.2％DMSO的盐水中。第2-7组的大鼠每天皮下注射CORT(40mg/kg)，连续21天。所有注射均在7:00至7:10p.m之间以2ml/kg体重的体积进行。通过口服强饲法给大鼠给药涉及多种剂量的O-CP、NR及其组合的研究产品，其每天施用一次，持续21天。

实施例16：

生物化学分析

使用便携式自动化学分析仪(Samsung LABGEO PT10,Samsung Electronics Co.,Suwon,Korea)分析葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、尿素和肌酐的血清水平。通过端粒酶重复扩增方案，使用商业试剂盒按照制造商的说明通过ELISA(Elx-800,Bio-Tek Instruments Inc,Vermont,USA)来测量总血清CORT水平以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和NAD+前体，例如烟酰胺(Nam)、色氨酸(Trp)、烟酸(Na)和烟酰胺单核苷酸(NMN)和NADPH)的水平。通过qPCR测定肝脏中的端粒长度。使用Trapeze试剂盒(Chemicon/Millipore，Billerica，MA)根据端粒酶重复扩增方案测量端粒酶活性。使用相应的商业ELISA试剂盒(Wako Pure Chemical Industries)，根据制造商的说明测定大鼠肝脏中谷胱甘肽(GSH)和活性氧类(ROS)的水平。通过高效液相色谱法(HPLC)分析丙二醛(MDA)的血清水平。使用相关商业试剂盒，根据酶联免疫吸附测定(ELISA,Elx-800,Bio-TekInstruments Inc,Vermont,USA)方法测量抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)]。

实施例17：

蛋白质印迹分析

检测了端粒加帽基因的活性，包括端粒重复结合因子1(TRF1)、端粒重复结合因子2(TRF2)、端粒保护蛋白1a(POT-1a)、端粒保护蛋白1b(Pot-1b)、和TRF1相互作用蛋白2(Tin2)、肝脏去乙酰化酶3(SIRT3)和去乙酰化酶1(SIRT1)、烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)以及几种细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8；TNF-α、COX-2)。测定了脑核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)、核因子κB(NF-κB)、突触前突触蛋白I、突触后密度蛋白PSD95、PSD93、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的表达。

实施例18：

用于测定组合物的抗菌作用或对免疫健康的作用的材料和方法

动物

六周龄雄性BALB/c小鼠购自Firat University Experimental Animal Center。在研究期间，所有小鼠均可随意获取标准啮齿动物食物和水。在整个研究过程中，小鼠都被关在笼子里。维持以下条件：温度，22±2℃；相对湿度，55±5％；以及12小时的光：暗周期。动物的护理和治疗符合Use of Laboratory Animals制定的指南，并得到Animal Care andUse Committee of Firat University的批准。

研究设计小组

选取两个对照组进行研究。正常对照组给予PBS，另一对照组给予脂多糖(LPS)与媒介物，即磷酸盐缓冲盐水。将42只小鼠随机分为6个治疗组，每组7只，如下：

1.正常对照

2.LPS+媒介物

3.LPS+硒＝来自硒代甲硫氨酸的200μg硒(HED)

4.LPS+吡啶甲酸锌＝来自吡啶甲酸锌(20％锌)的30mg锌(HED)

5.LPS+O-CP＝300mg(HED)O-CP

6.LPS+O-CPs+吡啶甲酸锌+硒(使用与第3-5组相同的剂量)。

LPS治疗前2周经口施用硒代甲硫氨酸、吡啶甲酸锌和O-CP或媒介物。对照小鼠接受50μL PBS。随后，使用Se、ZnPic和O-CP积极治疗后30分钟，第2组至第6组的大鼠接受LPS(0.04mg/kg ip)。所有治疗和LPS注射的基础温度读数均在8.00至9.00GMT之间进行，以避免昼夜节律引起的温度差异。PBS或LPS注射后30分钟记录所有大鼠直肠温度的变化，随后每隔30分钟记录一次，持续4小时。LPS治疗6小时后，对小鼠实施安乐死，并收集其血液、肝脏和肺用于进一步分析。

硒代甲硫氨酸、吡啶甲酸锌和O-CP的剂量是基于Shin等人的Human EquivalentDose(HED)for Drug Development确定的。人体剂量与动物剂量的转换是基于体表面积。使用12.33的转换因子将人体剂量转换为小鼠剂量。人体等效剂量为来自硒代甲硫氨酸的200μg硒(Se)、来自吡啶甲酸锌的30mg锌(Zn)和300mg O-CP。

硒代甲硫氨酸剂量：200μg/70kg＝2.86μg/kg/天，人*12.33＝35.23μg/kg/天/小鼠；

吡啶甲酸锌(20％)剂量：30mg/70kg＝0.428mg/kg/天人*12.33＝5.28元素锌mg/kg/天小鼠＝5.28*100/20＝26.4mg/kg/天/小鼠；

O-CP剂量：300mg/70kg＝4.29mg/kg/天人*12.33＝52.84mg/kg/天/小鼠。

实施例19：

生物化学分析

使用便携式自动化学分析仪(Samsung LABGEO PT10,Samsung Electronics Co.,Suwon,Korea)分析葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、尿素和肌酐的血清水平。通过HPLC分析MDA的血清水平。使用相关商业试剂盒，根据酶联免疫吸附测定(ELISA,Elx-800,Bio-Tek Instruments Inc,Vermont,USA)方法测量抗氧化酶(SOD、CAT、GSHPx)。通过原子吸收光谱法(AAS)检测肝脏和肺中的血清、锌和硒水平。

实施例20：

蛋白质印迹分析

通过蛋白质印迹检测肝脏和肺中的促炎细胞因子、NF-κB、TNFα、IL-1、IL-6、IL-17、COX-2、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、金属硫蛋白(MT)、ZIP1、ZIP4、ZIP14(锌输入蛋白)、ZNT1、ZNT4和ZNT9(锌输出蛋白)。

实施例21：

组织学

收获每只小鼠的肺和肝脏，储存在10％缓冲福尔马林中并包埋在石蜡中。对于组织学研究，切割3μm切片、脱石蜡、脱水并用苏木精和伊红(H&E)染色。在光学显微镜下观察组织切片的炎症变化。

实施例22：

测定组合物的抗衰老作用的测试

借助G*Power软件包程序(版本3.1.9.2)，以从先前研究计算的α误差0.05，90％功率，效应大小0.7将该研究的样本大小测定为总共49只大鼠(n＝7；7组)。使用统计分析软件(SPSS17.0)对数据进行分析。在本研究中，使用“Shapiro-Wilk”检验进行与参数检验的先决条件的正态性假设的一致性，并使用“Levene”检验来检查方差的同质性。进行方差分析(ANOVA)检验以测定组间差异，并使用事后Tukey检验进行组间多重比较。P<0.05视为具有统计学显著性。

F检验-ANOVA：固定效应、综合、单向

分析：先验：计算所需的样本大小

输入：效应大小f＝0.7

αerrprob＝0.05

功率(1-βerrprob)＝0.9

组数＝7

输出：非中心性参数λ＝24.0100000

临界F＝2.3239938

分子df＝6

分母df＝42

总样本大小＝49

实际功率＝0.9483953

实施例23：

PC和NR的抗衰老作用

PC和NR对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠初始和最终体重的影响如下表1所示。表2提供了O-CP和NR在皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠中存在的多种抗氧化酶及其前体(例如NAD+、Nam、Na和NMN、NADPH和GSH)水平方面对肝脏的影响。表3提供了O-CP和NR对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠中血清抗氧化酶(例如MDA、SOD、GSH-Px和CAT)的影响。表4提供了O-CP和NR对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠中血清生物化学(例如葡萄糖(GLU)、肌酸、血尿素氮(BUN)、ALT和AST)的影响。

表1.O-CP(PC30或PC300)和NR对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠初始和最终体重的影响

数据呈现为平均值和标准差。

a-b:同一行中没有共同上标的平均值差异显著(P<0.05)。

表2.O-CP和NR对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠肝脏的影响

数据呈现为平均值和标准差。

a-f:同一行中没有共同上标的平均值差异显著(P<0.05)

表3.O-CP和NR对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠中血清抗氧化酶的影响

/>

数据呈现为平均值和标准差。

a-f:同一行中没有共同上标的平均值差异显著(P<0.05)

表4.O-CP和NR对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠血清生物化学的影响。

数据呈现为平均值和标准差。

a-c:同一行中没有共同上标的平均值差异显著(P<0.05)

图74中显示了多种剂量的O-CP、NR及其组合对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠中肝脏相对端粒长度的影响。在图74中，与CORT对照相比，O-CP和NR的组合防止了肝脏端粒的降解，所述CORT对照显示在没有任何治疗的情况下更大程度地肝脏端粒降解。图75A-75D中显示了多种剂量的O-CP、NR及其组合对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠中肝脏白细胞介素(IL-6、IL-1β、IL-8)和TNF-α水平的影响。图76A-76D和77中显示了多种剂量的O-CP、NR及其组合对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠中肝脏POT1a、POT1b、TRF1、TRF2和Tin2水平的影响。图78A-78D中显示了多种剂量的O-CP、NR及其组合对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠中肝脏SIRT1、SIRT3和NAMPT水平的影响。图79A-79B中显示了多种剂量的O-CP、NR及其组合对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠中脑NF-κβ和Nrf2水平的影响。此外，图80A-80D和81中显示了多种剂量的O-CP、NR及其组合对皮质酮(CORT)诱导的衰老大鼠中脑BDNF、NGF、PSD93、PSD95和突触蛋白I水平的影响。

实施例24

用于测定组合物的抗菌作用或对免疫健康的影响的测试

该研究的样本大小为42只小鼠(n＝7；6组)，并借助G*Power软件包程序(版本3.1.9.2)以从先前研究计算的α误差0.05，85％功率，效应大小0.65进行分析。使用统计分析软件(SPSS17.0)对数据进行分析。在本研究中，使用“Shapiro-Wilk”检验进行与参数检验先决条件的正态性假设的一致性，并使用“Levene”检验来检查方差的同质性。进行方差分析(ANOVA)检验以确定组间差异，并使用事后Tukey检验进行组间多重比较。P<0.05视为具有统计学显著性。

F检验-ANOVA：固定效应、综合、单向

分析：先验：计算所需的样本大小

输入：效应大小f＝0.65

αerrprob＝0.05

功率(1-βerrprob)＝0.85

组数＝6

输出：非中心性参数λ＝17.7450000

临界F＝2.4771687

分子df＝5

分母df＝36

总样本大小＝42

实际功率＝0.8726155

实施例25：

Se、Zn和O-CP对免疫健康的影响

表5提供了硒(Se)、锌(Zn)和O-CP对小鼠中LPS诱导的发热中血清生物化学参数(例如ALT、AST、ALP、LDH、BUN、肌酸和T胆红素)的影响。表6提供了Se、Zn和O-CP对小鼠中LPS诱导的发热中肝脏和肺抗氧化酶(例如MDA、SOD、CAT、GSHPx)水平的影响。

表5.Se、Zn和O-CP(PC-O)对小鼠中LPS诱导的发热中血清生物化学参数的影响

数据呈现为平均值和标准差。

a-e:同一行中没有共同上标的平均值差异显著(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)。

表6.Se、Zn和O-CPs对小鼠中LPS引起的发热中肝脏和肺抗氧化酶水平的影响

数据呈现为平均值和标准差。

a-e：同一行中没有共同上标的平均值差异显著(ANOVA和Tukey事后检验；P<0.05)。

图82B中显示了多种剂量的Se、Zn和O-CP及其组合对小鼠中LPS诱导的发热反应和表示为时间过程曲线的AUC的总发热的影响。图82A显示了多种剂量的Se、Zn和O-CP对受试者的直肠温度的影响。在图82A和82B中，与LPS对照相比，Se、Zn和O-CP的组合减少了总发热，所述LPS对照显示在没有任何治疗的情况下更高的发热。在图83A-83D中显示了多种剂量的Se、Zn、O-CP及其组合对小鼠中LPS诱导的发热中血清ALT、AST、ALP和LDH水平的影响。在图84A-84D中显示了多种剂量的Se、Zn、O-CP及其组合对小鼠中LPS诱导的发热中血清白细胞介素(IL-6、IL-1β)、TNF-α和血清NEU水平的影响。在图85A-85D中分别显示了多种剂量的Se、Zn、O-CP及其组合对小鼠中LPS诱导的发热中肝脏Zn、肝脏Se、肺Zn和肺Se水平的影响。在图86-87中分别显示了多种剂量的Se、Zn、O-CP及其组合对小鼠中LPS诱导的发热中肺损伤和肝脏损伤的影响。在图88A-88G中分别显示了多种剂量的Se、Zn、O-CPs及其组合对小鼠中LPS诱导的发热中肝脏白细胞介素(IL-1β、IL-6、IL-17)、TNF-α、NF-κβ、COX-2和iNOS水平的影响。在图89A-89E中分别显示了多种剂量的Se、Zn、O-CP及其组合对小鼠中LPS诱导的发热中肝脏MT、ZIP1、ZIP4、ZIP14和ZNT1水平的影响。在图90A-90G中显示了多种剂量的Se、Zn、O-CPs及其组合对小鼠中LPS诱导的发热中肺白细胞介素(IL-1β、IL-6、IL-17)、TNF-α、NF-κβ、COX-2和iNOS水平的影响。在图91A-91G中分别显示了多种剂量的Se、Zn、O-CP及其组合对小鼠中LPS诱导的发热中肺MT、ZIP1、ZIP4、ZIP14、ZNT1和ZNT4水平的影响。

实施例26：

材料和方法

O-CP和PC是水溶性的。在生理盐水中制备100mg/mL储备溶液。允许粉末溶解，然后将溶液通过0.22微米过滤器进行无菌过滤。在生理盐水中进行连续稀释。EpiCor和Wellmune含有水溶性化合物，但也含有不溶性固体。在生理盐水中制备水性提取物。在温和搅拌下允许粉末再水合1小时。通过离心沉淀固体，然后将上清液通过0.22微米过滤器进行无菌过滤。在生理盐水中进行连续稀释。将离心后剩余的固体重新悬浮并在生理盐水中洗涤一次以去除或高度稀释任何剩余的水性化合物。下表1显示了测试的产品。

表1.所测试的产品

产品	溶解度	处理
			藻蓝蛋白-O	水溶性的	水性
藻蓝蛋白	水溶性的	水性
			Epicor	含有水溶性化合物	水性
Wellmune	含有水溶性化合物	水性

实施例27：

所进行的测试

使用两种不同的抗氧化测试来比较测试产品。Folin-Ciocalteu测定显示给定的测试产品是否含有抗氧化剂。CAP-e测定显示其中一些抗氧化剂是否在细胞水平上具有生物利用度。每个测定进行两次测试：第一次运行允许对标准剂量范围内的作用进行初步粗略筛选，第二次运行允许微调最佳剂量，以便对这些特定产品进行良好的比较。

此外，使用流式细胞术测量了测试产品对免疫激活的影响。在自然杀伤细胞、NKT细胞、T细胞和单核细胞/巨噬细胞上评估CD69和CD25激活标志物的表达。培养物上清液用于测试细胞因子、抗病毒肽和参与再生功能的生长因子的产生。进行了以下测试：

免疫细胞激活：

(i)测试产品对免疫细胞激活状态的直接影响。

(ii)在用细菌毒素LPS进行炎症攻击之前立即用测试产品对免疫细胞进行预处理时的影响。

(ii)在使用Poly I:C进行病毒模拟攻击之前立即用测试产品预处理免疫细胞时的影响。

对于3种免疫细胞培养条件中的每一种，测试了以下内容：

(i)2个激活标志物CD69和CD25的诱导。

(ii)细胞因子产生。

总抗氧化能力的测试

在Folin-Ciocalteu测定(也称为总酚测定)中测试了产品的抗氧化能力。该测定使用Folin-Ciocalteu试剂来测量抗氧化剂。通过将Folin-Ciocalteu苯酚试剂添加到提取物的连续稀释液中，彻底混合并温育5分钟来进行测定。添加碳酸钠，开始化学反应产生颜色。允许反应在37℃下持续30分钟。在比色板读数器中在765nm处测量吸光度。使用没食子酸作为参考标准，并以每克产品的没食子酸当量报告数据。

基于细胞的抗氧化保护测定

这允许以与ORAC测试相当的方法评估抗氧化潜力，但仅允许测量能够穿过脂质双层细胞膜、进入细胞并在氧化应激条件下提供具有生物学意义的抗氧化保护的抗氧化剂。特异性地开发CAP-e生物测定以适用于天然产品和成分。该方法已用于多种类型的天然产品和成分。

使用红细胞(RBC)作为模式细胞类型。这是惰性细胞类型，与其他细胞类型例如多形核(PMN)细胞(通常用于后续测试天然产物和提取物的抗炎作用)相反。特别开发基于红细胞的测定以能够评估来自基于细胞的系统中复杂天然产品的抗氧化剂，并帮助解释来自更复杂的细胞模型的后续数据。

在与测试产品一起温育的期间，能够穿过细胞膜的任何抗氧化剂化合物都可以进入RBC内部。然后洗涤RBC以去除细胞未吸收的化合物，并加载染料，例如DCF-DA染料，该染料在暴露于活性氧类别时会发出荧光。通过添加过氧化氢自由基发生剂AAPH引发氧化。评估荧光强度。未处理的对照细胞的低荧光强度充当基线，单独用AAPH处理的RBC充当最大氧化损伤的阳性对照。

如果观察到暴露于测试产品并随后暴露于AAPH的RBC的荧光强度降低，则表明所述测试产品含有可渗透到细胞中并保护这些细胞免受氧化损伤的抗氧化剂。基于未处理的对照孔的低荧光和暴露于氧化损伤的细胞培养物的高荧光，在暴露于氧化应激之前用测试产品处理的细胞培养物中的荧光强度用于计算细胞氧化应激的抑制百分比。

氧自由基吸收能力(ORAC)测试

ORAC测试是最受认可的方法之一，其测量针对氧自由基的抗氧化清除活性，已知所述氧自由基涉及衰老和许多常见疾病的发病机制。ORAC 6.0由六种类型的ORAC测定组成，其评估材料针对人体中发现的六种主要活性氧类别(ROS，通常称为“氧自由基”)的抗氧化能力：过氧化氢自由基、羟基自由基、超氧化物阴离子、单线态氧、过氧亚硝酸盐和次氯酸盐。这是综合小组，其用于评估材料对氧自由基的抗氧化能力。

ORAC 6.0测试基于评估目的材料保护探针(荧光探针或发色团)免受ROS损坏的能力。在所有ORAC测定中，将ROS诱导剂引入测定系统中。ROS诱导剂触发特定ROS的释放，这会降解探针并导致其发射波长或强度变化。当环境中存在抗氧化剂材料时，抗氧化剂吸收ROS并防止探针降解。探针保留的程度表明了材料的抗氧化能力。Trolox用作参考标准，结果表示为每克(或毫升)测试材料的μmol Trolox当量。

细胞存活或活力—用于进一步的生物测定工作的准备

为了测试测试产品对免疫细胞激活和细胞因子产生的激活作用的特定目的，在开始研究复杂天然产品的生物效应时，需要进行细胞活力测定作为准备步骤。该测试生成的数据有助于确定用于免疫细胞测试的最佳剂量范围。使用MTT测定测试外周血单核细胞的活力，如线粒体功能所反映的那样。MTT测定利用依赖于线粒体活性改变颜色的染料。培养新鲜收获的细胞，以允许颜色形成以与线粒体功能成比例地发生。在MTT生物测定中，化学反应会基于细胞功能触发特定的显色：

·当测量到颜色的减少时，这与细胞活力的降低有关，这是直接杀死或抑制线粒体功能的结果。

·当测量到颜色增加时，有几种可能的解释：1)细胞数量增加(生长)；2)线粒体质量增加，3)线粒体功能增加(能量产生)。

在测定中使用2倍稀释测试了7种剂量。用于4种产品，即O-CP、PC、EpiCor和Wellmune的剂量范围为0.039g/L-2.5g/L。

细菌和病毒攻击背景下对免疫调节的影响

人外周血单核细胞(PBMC)血培养物用于该测试。使用来自健康人献血者的PBMC建立了三组平行培养物。来自大肠杆菌的高度炎症细菌LPS被用作激活的阳性对照，并且在用天然产品处理免疫细胞后也用于在三种培养物之一中以诱导炎症。第三组培养物中使用了模拟病毒的聚肌苷酸：聚胞苷酸(Poly I:C)。进行测试，使得所有处理，包括每个剂量的测试产品以及每个阳性和阴性对照以一式三份进行测试。

三种平行培养条件是：

(i)在没有炎症刺激的情况下，将测试产品的连续稀释物添加到PBMC培养物中，以研究测试产品的直接影响；

(ii)将测试产品的连续稀释物添加到PBMC培养物中，允许“启动”免疫细胞，随后添加炎症刺激物LPS；和

(iii)将测试产品的连续稀释物添加到PBMC培养物中，允许“启动”免疫细胞，随后添加刺激物Poly I:C。

将PBMC培养物温育24小时，然后收获细胞和培养物上清液并用于监测每种培养物中的反应。

激活标志物的表达

虽然CD69通过增加淋巴细胞增殖和细胞信号传导在免疫中发挥重要作用，但最近CD69涉及导致控制炎症的免疫调节作用。CD69在激活后不久在NK细胞中被迅速诱导，并且其在NK细胞毒性中的直接作用已被证明。Borrego F等人,Regulation of CD69expression on human natural killer cells:differential involvement of proteinkinase C and protein tyrosine kinases；和Moretta A等人,CD69-mediated pathwayof lymphocyte activation:anti-CD69monoclonal antibodies trigger the cytolyticactivity of different lymphoid effector cells with the exception of cytolyticT lymphocytes expressing T cell receptor alpha/beta的内容由此通过引用并入本文。当人NK细胞与K562靶细胞共培养时，CD69表达被上调，并且这种增加与NK细胞活性显著相关，如通过当今的金标准CD107动员测定所测量的。Dons'koi BV等人,Measurement ofNK activity in whole blood by the CD69 up-regulation after co-incubation withK562,comparison with NK cytotoxicity assays and CD107adegranulation assay的内容由此通过引用并入本文。在没有其他NK-靶细胞粘附分子相互作用的情况下，CD69具有激活NK细胞溶解机制的能力。Borrego F等人,CD69 is a stimulatory receptor fornatural killer cell and its cytotoxic effect is blocked by CD94 inhibitoryreceptor的内容由此通过引用并入本文。重要的是：Clausen等人2003在涉及化学疗法期间重复测试的14名乳腺癌患者的研究中证明了CD69水平与NK细胞活性之间存在直接且高度显著的相关性。Clausen J等人,Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells的内容由此通过引用并入本文。因此，在天然产品的免疫调节中，用于NK细胞激活的CD69染色(并指示NK细胞活性)已用于体外和临床研究中。

CD25是细胞因子IL-2的受体，并存在于激活的T细胞和B细胞上。其显示在一些情况下，NK细胞决定是进入主要表达CD25的增殖模式，还是进入高细胞毒性杀伤模式，在这种情况下它们优先表达CD69。

实施例28：

对总抗氧化能力的影响

O-CP(藻蓝蛋白-O)具有最强的总抗氧化能力，强于PC和EpiCor。Wellmune具有很小的总抗氧化能力。图11A-11C分别显示了O-CP、PC、EpiCor和Wellmune的总抗氧化能力。表2显示，按重量计算，O-CP比PC具有3倍更强的总抗氧化能力。EpiCor比PC具有略低的总抗氧化能力。Wellmune具有低的总抗氧化能力。

表2.细胞抗氧化能力的比较

名称	GAE(mg/L)
		藻蓝蛋白-O	117
藻蓝蛋白	34
		EpiCor	22
Wellmune	5

实施例29：

氧自由基吸收能力(ORAC)

体内发现有六种主要的活性种类：过氧化氢自由基、羟基自由基、过氧亚硝酸盐、超氧化物阴离子、单线态氧和次氯酸盐。ORAC 6.0提供了食品/营养产品针对六种主要活性物质的抗氧化能力的综合分析。ORAC结果以微摩尔Trolox当量(μmol TE)/克表示。表4、表5和表6分别显示了O-CP粉末(粉末，14032019)、PC食品级粉末(粉末，CU180)和螺旋藻(Spirulina)超级Blu粉末(粉末，401G174098)的抗氧化作用。据观察，与PC食品级粉末和螺旋藻超级Blu粉末相比，O-CP在抗氧化作用方面表现出最佳结果。数字越大，抗氧化作用越强。

表4.O-CP(粉末，14032019)的ORAC结果

表5.PC食品级粉末(粉末，CU180)的ORAC结果

表6.螺旋藻超级Blu粉末(粉末，401G174098)的ORAC结果

实施例30：

细胞存活/活力

PBMC细胞对3种测试产品的耐受性非常好：O-CP、PC和Wellmune。最高剂量的EpiCor(2.5g/L)对细胞造成轻微应激。基于该数据，用于基于藻类和酵母的4种产品的免疫激活测试的剂量范围被选择为0.25–2.0g/L。在图12中显示了多种剂量的O-CP、PC、EpiCor和Wellmune对活的淋巴细胞百分比的影响。

实施例31：

在直接影响、细菌和病毒攻击背景下对免疫激活和调节的影响

将PBMC培养物温育24小时，然后收获细胞和培养物上清液并用于监测每种培养物中的反应。使用单克隆抗体组合对细胞进行染色以监测激活，并使用声学双激光Attune流式细胞仪通过多参数流式细胞术进行分析。分析包括CD3、CD25、CD56和CD69的荧光标志物。这种组合允许监测单核细胞/巨噬细胞的变化，以及自然杀伤细胞、NKT细胞和T淋巴细胞的激活。利用CD3和CD56的染色允许识别CD3-CD56+NK细胞、CD3+CD56-T淋巴细胞和CD3+CD56+NK-T细胞。将其与细胞大小和粒度的前向/侧向散射分析相结合，还可以识别单核细胞群。对于这些群体中的每个群体，可以检查激活标志物CD25和CD69的表达水平。

在数据分析过程中，不同细胞类型的物理特性允许对淋巴细胞相对于单核细胞进行电子门控，以便可以分别在这些细胞类型上分析CD69相对于CD25表达。此外，基于细胞是否用CD3、CD56或两者进行了染色，将淋巴细胞部分分为4个独立的亚群。在图13中，流式细胞术数据显示淋巴细胞、单核细胞和淋巴细胞的四个亚组的门，允许分析所有五种细胞类型上的CD69表达。

免疫激活

通过CD69和CD25的表达水平监测细菌和病毒攻击背景下的直接免疫细胞激活以及免疫调节：

·O-CP对免疫细胞激活显示出强大的作用。

·EpiCor具有一些直接的免疫细胞激活作用，而Wellmune几乎没有。

基于藻类和基于发酵的产品：对细胞因子的影响：

培养物上清液用于测试一组7种免疫激活细胞因子、2种抗炎细胞因子和生长因子G-CSF，它们涉及干细胞调节和修复功能。细胞因子结果显示O-CP和PC之间存在有趣的差异。O-CP对细胞因子的作用比PC独特且强烈：

·在无应激的培养条件下和在病毒攻击的背景下，O-CP触发更高水平的IL-6。

·在没有免疫攻击的情况下，O-CP比PC直接触发更高水平的MIP-1β。

·在细菌或病毒免疫攻击的背景下，O-CP触发升高水平的MIP-1β，与强烈降低MIP-1β水平的PC形成鲜明对比。

·在免疫攻击的背景下，与PC相比，O-CP触发更高水平的抗炎细胞因子IL-1ra。

·O-CP比PC触发更低水平的IL-1β、TNF-α和IFN-γ。

·O-CP诱导生长因子G-CSF。

在没有免疫攻击的情况下，EpiCor和Wellmune比PC具有更小的影响，而且在很大程度上也比O-CP的影响要小。在细菌免疫攻击的背景下，EpiCor以及在某种程度上Wellmune比O-CP和PC触发了更高水平的IL-6、IL-8、MIP-1α和MIP-1β。

实施例32：

通过基于藻类和基于发酵产品的免疫激活

测试产品对免疫细胞激活的直接影响

O-CP与PC的比较：对CD69水平的影响：

在没有免疫攻击的情况下，O-CP直接触发所有4种类型淋巴细胞上CD69的上调，而不影响CD69表达的单核细胞。与NK细胞上CD69的表达相关的这些结果显示在图14中。NKT细胞上CD69的表达显示在图16中；T细胞上CD69的表达显示在图18中；非NKT非T细胞上CD69的表达显示在图20中。单核细胞上CD69的表达显示在图22中。

对CD25水平的影响：在没有免疫攻击的情况下，O-CP直接触发所有4种淋巴细胞上CD25的上调。与NK细胞上CD25的表达相关的这些结果显示在图15中。NKT细胞上CD25的表达显示在图17中；T细胞上CD25的表达显示在图19中；非NKT非T细胞上CD25的表达显示在图21中。

将O-CP与EpiCor和Wellmune(含水部分)进行比较：对CD69水平的影响：

在没有免疫攻击的情况下，评估了测试产品的直接影响，其中O-CP和EpiCor显示出可比较的轻微影响，而Wellmune没有直接影响。这些结果显示在图14、16、18、20、22中。

对CD25水平的影响：

·NK细胞：在没有免疫攻击的情况下，评估测试产品的直接影响，其中O-CP强烈增加CD25表达，EpiCor显示出温和得多的直接影响，而Wellmune没有直接影响，如图15所示。

·NKT细胞：在没有免疫攻击的情况下，评估了测试产品的直接影响，其中O-CP增加了CD25表达，EpiCor和Wellmune都没有显示出对CD25表达的直接影响，如图17所示。

·T淋巴细胞：3种测试产品均对CD25表达没有直接影响，如图19所示。

·非NK非T细胞：虽然O-CP强烈增加CD25表达，但EpiCor表现出稍微温和的直接影响，而Wellmune没有直接影响，如图21所示。

对CD69+CD25+细胞的影响：在没有免疫攻击的情况下，O-CP刺激CD69+CD25+双阳性细胞的增加。EpiCor具有较温和的影响，Wellmune对CD69+CD25+细胞的数量没有影响，如图23所示。

实施例33：

LPS诱导炎症下免疫反应的调节

将O-CP与PC进行比较：对CD69水平的影响：

在利用细菌毒素LPS进行炎症免疫攻击的背景下，O-CP进一步增强了LPS介导的CD69表达增加。对于所分析的所有细胞类型都观察到了这一点。与NK细胞上CD69的表达相关的结果显示在图24中。NKT细胞上CD69的表达显示在图26中；T细胞上CD69的表达显示在图28中；非NKT非T细胞上CD69的表达显示在图30中。单核细胞：在LPS介导的免疫攻击的背景下，O-CP增强了CD69的表达。单核细胞上CD69的表达显示在图32中。

对CD25水平的影响：在利用细菌毒素LPS进行炎症免疫攻击的背景下，两种O-CP进一步增强了LPS介导的CD25表达增加。在所分析的所有4种类型的淋巴细胞中都观察到了这一点。与NK细胞上CD25的表达相关的这些结果显示在图25中。NKT细胞上CD25的表达显示在图27中；T细胞上CD25的表达显示在图29中；非NKT非T细胞上CD25的表达显示在图31中。

在利用细菌毒素LPS进行炎症免疫攻击的背景下，O-CP进一步增强了LPS介导的CD69表达增加，但EpiCor和Wellmune表现出几乎所有不同的影响：

·NK细胞：EpiCor轻度降低LPS介导的CD69表达增加。Wellmune没有影响，如图24所示。

·NKT细胞：EpiCor和Wellmune都没有改变LPS诱导的CD69表达，如图26所示。

·T淋巴细胞：这是一个例外，因为所有3种测试产品都显示出LPS介导的CD69表达增加的可比较的、轻微的增强，如图28所示。

·非NK非T细胞：O-CP比EpiCor增加更多的CD69表达，并且比Wellmune增加的多得多，如图30所示。

·单核细胞：EpiCor比O-CP触发略微较高的CD69表达增加。Wellmune几乎没有任何影响，如图32所示。

对CD25水平的影响：

在利用细菌毒素LPS进行炎症免疫攻击的背景下，O-CP、EpiCor相对于Wellmune对LPS介导的CD25表达增加的调节不同：

·NK细胞：O-CP增加LPS诱导的CD25表达，EpiCor显示出更温和的影响。Wellmune没有影响，如图25所示。

·NKT细胞：O-CP增加LPS诱导的CD25表达。EpiCor或Wellmune都没有影响，如图27所示。

·T淋巴细胞：3种测试产品均未显示出对LPS介导的CD25表达增加的主要影响，如图29所示。

·非NK非T细胞：O-CP和EpiCor触发了CD25表达的类似轻微增加，而Wellmune没有影响，如图31所示。

对CD69+CD25+细胞的影响：在细菌炎症免疫攻击的背景下，O-CP刺激CD69+CD25+双阳性细胞的增加。EpiCor具有较温和的影响，Wellmune对CD69+CD25+细胞的数量几乎没有任何影响，如图33所示。

实施例34：

对病毒模拟物Poly I:C的免疫反应的调节

将O-CP与PC进行比较：对CD69水平的影响：

在使用病毒模拟物Poly I:C进行免疫攻击的背景下，O-CP进一步增强了Poly I:C介导的CD69表达增加。与NK细胞上CD69的表达相关的结果显示在图34中。NKT细胞上CD69的表达显示在图36中；T细胞上CD69的表达显示在图38中；非NKT非T细胞上CD69的表达显示在图40中。单核细胞：在Poly I:C介导的免疫攻击背景下，两种产品均增强了CD69的表达。结果显示在图42中。

对CD25水平的影响：在使用病毒模拟物Poly I:C进行免疫攻击的背景下，O-CP进一步增强了NK细胞、NKT细胞和非NK非T细胞上Poly I:C介导的CD25表达的增加。与NK细胞上CD25的表达相关的结果显示在图35中。NKT细胞上CD25的表达显示在图37中；T细胞上CD25的表达显示在图39中；非NKT非T细胞上CD25的表达显示在图41中。

在使用病毒模拟物Poly I:C进行免疫攻击的背景下，O-CP进一步增强了Poly I:C介导的CD69表达增加，但EpiCor和Wellmune表现出几乎所有不同的影响：

·NK细胞：EpiCor和Wellmune轻度降低LPS介导的CD69表达增加，如图34所示。

·NKT细胞：EpiCor和Wellmune均未将LPS诱导的CD69表达改变至统计学上显著的水平，如图36所示。

·T淋巴细胞：EpiCor仅非常轻微地增加了Poly I:C介导的CD69表达增加。Wellmune没有影响，如图38所示。

·非NK非T细胞：O-CP比EpiCor更能增加CD69的表达。Wellmune没有影响，如图40所示。

·单核细胞：O-CP比EpiCor触发略微较高的CD69表达增加。Wellmune没有影响，如图42所示。

对CD25水平的影响：

在使用病毒模拟物Poly I:C进行炎症免疫攻击的背景下，O-CP进一步增强了PolyI:C介导的CD25表达增加，但EpiCor和Wellmune表现出几乎所有不同的影响：

·NK细胞：虽然O-CP触发了Poly I:C介导的CD25增加的强烈增强，但EpiCor和Wellmune都触发了CD25表达的轻微但统计学上显著的减少，如图35所示。

·NKT细胞：虽然O-CP增强了Poly I:C介导的CD25增加，但EpiCor和Wellmune都不影响CD25表达，如图37所示。

·T淋巴细胞：3种测试产品没有一种影响Poly I:C介导的CD25增加，如图39所示。

·非NK非T细胞：O-CP和EpiCor触发了类似的CD25增加，而Wellmune没有影响，如图41所示。

对CD69+CD25+细胞的影响：在存在病毒模拟免疫攻击的情况下，O-CP刺激CD69+CD25+双阳性细胞的增加。EpiCor触发了非常轻微的增加，而Wellmune对CD69+CD25+细胞的数量没有影响，如图43所示。

实施例35：

通过基于藻类和基于发酵的产品对细胞因子产生的改变

使用Luminex磁珠阵列和多重系统，将培养物上清液用于测试10种促炎和抗炎细胞因子的集中组。细胞因子组包括：IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-8、IL-10、G-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IFN-γ和TNF-α。这允许记录免疫反应中的3个重要步骤：激活、恢复和修复。

实施例36：

对免疫激活、促炎细胞因子的产生的直接影响

含水产品：

·与PC相比，O-CP触发了更高水平的这些细胞因子：IL-6和MIP-1β，如图45和50分别所示。

·O-CP增加了MIP-1α，如图49所示。

·O-CP触发了IL-1β、IL-8、IFN-γ和TNF-α的增加，如图44、46、51和52分别所示。

实施例37：

在细菌炎症攻击的背景下对免疫激活、促炎细胞因子产生的影响

含水产品

·O-CP比PC触发更高水平的IL-6，如图55所示。

·O-CP触发了MIP-1α的减少，如图59所示。

·与PC相比，O-CP触发了较低水平的这些细胞因子：IL-1β、IL-8、IFN-γ和TNF-α，如图54、56、61和62分别所示。

·O-CP和PC对MIP-1β触发相反的影响：其中O-CP与LPS对照相比触发了增加，如图60所示。

实施例38：

在病毒模拟免疫攻击的背景下对免疫激活、促炎细胞因子产生的影响

含水产品

·O-CP比PC触发更高水平的IL-6，如图65所示。

·O-CP增加了IL-8和MIP-1α，如图66和69分别所示。

·O-CP增加了IL-1β、IFN-γ和TNF-α，如图64、71和72分别所示。

·O-CP和PC对MIP-1β触发相反的影响：其中与LPS对照相比，O-CP触发增加，PC触发强烈减少，如图70所示。

·O-CPs比EpiCor触发更高水平的IL-6，而Wellmune对IL-6的影响最小，如图65所示。

实施例39：

对干细胞激活生长因子G-CSF产生的直接影响

含水产品

·O-CP直接触发G-CSF水平增加；两种产品在最高剂量下的增加相似，但O-CP在较低剂量下的影响较弱，如图53所示。

实施例40：

细菌炎症攻击背景下对G-CSF产生的影响

含水产品

·O-CP直接触发G-CSF水平增加，如图63所示。

实施例41：

在病毒模拟免疫攻击背景下对G-CSF产生的影响

含水产品

·O-CP直接触发G-CSF水平的增加，如图73所示。

实施例42：

基于藻类和基于发酵的产品

O-CP具有直接免疫细胞激活特性，并直接增加所分析的所有4种淋巴细胞上CD69和CD25的表达。O-CP在细菌炎症攻击的背景下和病毒模拟攻击的背景下具有免疫调节特性。O-CP进一步增强了所分析的所有4种淋巴细胞上LPS诱导的细胞激活。O-CP还增强了NK细胞、NKT细胞和非NK非T细胞上Poly I:C介导的免疫细胞激活。O-CP比EpiCor的含水部分表现得更稳定。Wellmune的含水部分在细胞激活标志物的诱导方面相当不活跃。表7显示了O-CP对免疫激活标志物的影响的概述。在所有情况下，O-CP表现得优于EpiCor和Wellmune。

表7.O-CP对免疫激活标志物的影响的概述

实施例43：

O-CP和PC在对细胞因子产生的影响方面展示出差异

在没有免疫攻击的情况下，和在病毒模拟攻击的背景下，O-CP对IL-6的上调具有更强的影响。在所有3种培养条件下，O-CP对MIP-1β的上调具有更强的影响。有趣的是，在存在细菌或病毒免疫攻击的情况下，O-CP触发了增加，这与触发非常强烈下降的PC截然相反。

在细菌或病毒免疫攻击的背景下，O-CP增加了IL-1ra水平。在细菌攻击的背景下，与PC相比，效果相反。在病毒模拟攻击的背景下，两种产品均增加了IL-1ra，但对于O-CP，增加得更多。两种产品在所有3种培养条件下均触发了IL-1β、TNF-α、IL-10和G-CSF产生的增加。在一般水平上，O-CP与EpiCor的含水部分表现得相似或比其表现得更好。表8显示了O-CP对细胞因子产生的影响的概述。在没有免疫攻击或直接影响的情况下在IL-6和MIP-1β的表达水平上，在存在利用细菌毒素LPS进行炎症免疫攻击的情况下在MIP-1β和IL-1ra的表达水平上，O-CP比PC表现得更好。在存在使用病毒模拟物Poly I:C进行免疫攻击的情况下，在IL-6、MIP-1β和IL-1ra的表达水平上，O-CP比PC表现得更好。在直接影响的情况下，O-CP增加IL-8、MIP-1α和IL-1ra的表达水平。

表8.O-CP对细胞因子产生的影响的概述

*O-CP和PC之间的相反影响

基于本文描述的结果，可以考虑对免疫激活和抗炎特性进行进一步测试。还可以考虑将O-CP与葡萄糖酸锌或吡啶甲酸锌混合的进一步工作。在来自健康献血者的细胞上进行一次本文描述的免疫调节工作。进一步验证重复可能是使用来自额外2名健康献血者的细胞进行的免疫激活和细胞因子测试所必需的。

本公开不限于本申请中描述的特定实施方案，其旨在作为多个方面的说明。在不背离其精神和范围的情况下可以进行许多修改和变化。除了本文列举的那些之外，从前面的描述看出在本公开的范围内的功能上等同的方法和装置是可能的。这些修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本公开仅由所附权利要求的术语以及此类权利要求所享有的等同方案的完整范围来限制。在本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的并且不旨在进行限制。

关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术那些人员可以从复数翻译成单数和/或从单数翻译成复数，如适合于上下文和/或本申请。为了清楚起见，可以在本文中明确地阐述多种单数/复数排列。

Claims

1.组合物，其包含一定量的至少一种寡色肽，用于治疗、预防或改善选自由与年龄相关的躯体疾病、细菌疾病或感染、病毒疾病或感染、与氧化应激相关的疾病、与前述任何一项相关的症状及其任意组合组成的组中的一种。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种寡色肽具有小于10kDa的分子量。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物被配制用于通过口服途径、静脉内途径、皮下途径、肌内途径或腹膜内途径递送。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含一定量的选自由烟酰胺核苷、硒、硒化合物、锌、锌化合物及其任意组合组成的组的化合物。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含酶。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述酶是碱性蛋白酶。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物被配制成选自由溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、微丸、胶囊剂、囊片、粉剂、颗粒剂、糖浆剂、酏剂、饮料、栓剂、气雾剂、喷雾剂和咀嚼剂型组成的组中的一种。

8.从藻蓝蛋白制备至少一种寡色肽的方法，所述方法包括：

过滤粗藻蓝蛋白的溶液，将具有大于10kDa分子量的蛋白质级分与具有小于或等于10kDa分子量的化合物分离，并保留具有大于10kDa分子量的蛋白质级分；

将蛋白质级分以约50g/L至约300g/L的浓度溶解在溶剂中以制备蛋白质溶液；

向蛋白质溶液中加入一定量的酶；

将蛋白质溶液的pH调节至约6至约8的pH；

将蛋白质溶液的温度调节至约50℃至约65℃的温度；

使蛋白质溶液反应约2小时至约24小时，其中所述反应水解蛋白质溶液中的蛋白质以产生具有小于10kDa分子量的至少一种寡色肽；和

通过具有10kDa截留值的过滤来过滤蛋白质溶液以获得渗透物，其中所述渗透物包含至少一种寡色肽。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述酶选自由碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、纤维素酶、复合纤维素酶及其任意组合组成的组中的一种。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述酶是碱性蛋白酶。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述酶的量为所述蛋白质溶液中每克蛋白质约0.002g酶至所述蛋白质溶液中每克蛋白质约1.0g酶。

12.根据权利要求8所述的方法，其中通过超滤进行粗藻蓝蛋白溶液的过滤。

13.治疗、预防或改善与氧化应激相关的一种或多种疾病或病况的方法，所述方法包括：

鉴定与受试者中氧化应激相关的一种或多种疾病或病况；

向所述受试者施用包含一定量的至少一种寡色肽的组合物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种寡色肽具有小于10kDa的分子量。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述组合物进一步包含一定量的选自由烟酰胺核苷、硒、硒化合物、锌、锌化合物及其任意组合组成的组的化合物。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述施用通过口服途径、静脉内途径、皮下途径、肌内途径或腹膜内途径进行。

17.膳食补充剂，用于治疗、预防或改善选自由年龄相关的躯体疾病、细菌疾病或感染、病毒疾病或感染、与氧化应激相关的疾病、与前述任何一项相关的症状及其任意组合组成的组的一种，其中所述膳食补充剂包含一定量的至少一种寡色肽。

18.根据权利要求17所述的膳食补充剂，其中所述至少一种寡色肽具有小于10kDa的分子量。

19.根据权利要求17所述的膳食补充剂，其中所述膳食补充剂进一步包含一定量的选自由烟酰胺核苷、硒、硒化合物、锌、锌化合物及其任意组合组成的组的化合物。

20.根据权利要求17所述的膳食补充剂，其中所述膳食补充剂被配制成选自由溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、微丸、胶囊剂、囊片、粉剂、颗粒剂、糖浆剂、酏剂、饮料、栓剂、气雾剂、喷雾剂和咀嚼剂型组成的组中的一种。