CN118085041A - 检测非洲马瘟病毒抗体的试剂盒及其多肽表位 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测非洲马瘟病毒抗体的试剂盒及其多肽表位。本发明提供了多肽或成套多肽，所述多肽为eVP2‑1；所述成套多肽由eVP2‑1和eVP5‑1组成或者由eVP2‑1和eVP7‑1组成；所述eVP2‑1为SEQ ID No.1的多肽；所述eVP5‑1为SEQ IDNo.4的多肽；所述eVP7‑1为SEQ ID No.7的多肽。本发明以BSA‑eVP2‑1+BSA‑eVP5或BSA‑eVP2‑1+BSA‑eVP7‑1作为包被原制备的抗体检测试剂盒特异性强、敏感性高，准确性高，操作简单、快速，适用于基层各级兽医部门和出入境检验检疫局对非洲马瘟病毒感染血清抗体的快速大量筛选检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及检测非洲马瘟病毒抗体的试剂盒及其多肽表位。
背景技术
非洲马瘟(African horse sickness，AHS)为一种由蠓虫传播的急性或亚急性传染病，主要引起马属动物发热、皮下水肿和病毒血症。非洲马瘟病毒(African horsesickness virus，AHSV)是呼肠孤病毒科环状病毒属成员，该属病毒除AHSV外，还包括流行性出血热病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)、蓝舌病病毒(Bluetonguevirus,BTV)和马器质性脑病病毒(Equine encephalosis orbivirus,EEV)等。非洲马瘟病毒通过昆虫媒介传播，例如库蠓、螯蝇、伊蚊等，其中以马类最为易感，影响马匹的呼吸和循环功能，主要症状为发热、皮下水肿和病毒血症，能够导致高达95％的死亡率。
非洲马瘟病毒共分为9个血清型，病毒粒子直径大约80nm，基因组是分节段的双股RNA，含有S1-S10 10个节段，基因分别编码VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP7、NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4蛋白。非结构蛋白NS1-NS4在AHSV感染细胞中主要参与病毒复制、装配和释放等过程，并且在病毒拮抗宿主细胞天然免疫反应中扮演着重要角色。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何提高非洲马瘟病毒抗体检测的特异性与灵敏度，从而更准确地诊断非洲马瘟病毒病。
为了解决上述技术问题，本发明提供了用于制备非洲马瘟病毒抗体检测试剂的成套多肽或用于制备非洲马瘟病毒病诊断试剂的成套多肽。
第一方面，本发明要求保护一种多肽或成套多肽。
本发明所要求保护的多肽为eVP2-1多肽。
本发明所要求保护的成套多肽为成套多肽1或成套多肽2。
所述成套多肽1由所述eVP2-1多肽和eVP5-1多肽组成。
所述成套多肽2由所述eVP2-1多肽和eVP7-1多肽组成。
所述eVP2-1多肽为如下P11、P12或P13所示：
P11、氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽；
P12、氨基酸序列为SEQ ID No.1的第2-46位的多肽；
P13、在P12所示多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基后得到的能够与载体蛋白偶联的多肽。
所述eVP5-1多肽为如下P21、P22或P23所示：
P21、氨基酸序列为SEQ ID No.4的多肽；
P22、氨基酸序列为SEQ ID No.4的第2-38位的多肽；
P23、在P22所示多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基后得到的能够与载体蛋白偶联的多肽。
所述eVP7-1多肽为如下P21、P22或P23所示：
P31、氨基酸序列为SEQ ID No.7的多肽；
P32、氨基酸序列为SEQ ID No.7的第2-51位的多肽；
P33、在P32所示多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基后得到的能够与载体蛋白偶联的多肽。
其中，SEQ ID No.1由46个氨基酸残基组成，第1位的半胱氨酸残基是为了与载体蛋白连接添加的连接臂，其它氨基酸残基来源于非洲马瘟病毒VP2蛋白；SEQ ID No.4由38个氨基酸残基组成，第1位的半胱氨酸残基是为了与载体蛋白连接添加的连接臂，其它氨基酸残基来源于非洲马瘟病毒VP5蛋白。SEQ ID No.7由51个氨基酸残基组成，第1位的半胱氨酸残基是为了与载体蛋白连接添加的连接臂，其它氨基酸残基来源于非洲马瘟病毒VP7蛋白。
在所述成套多肽1中，所述eVP2-1多肽和所述eVP5-1多肽的质量比本领域技术人员可根据对非洲马瘟病毒抗体检测效果确定，如可为1:1。
在所述成套多肽2中，所述eVP2-1多肽和所述eVP7-1多肽的质量比本领域技术人员可根据对非洲马瘟病毒抗体检测效果确定，如可为1:1。
第二方面，本发明要求保护一种偶联物或成套偶联物。
本发明所要求保护的偶联物为eVP2-1偶联物。
本发明所要求保护的成套偶联物为成套偶联物1或成套偶联物2。
所述成套偶联物1由所述eVP2-1偶联物和eVP5-1偶联物组成。
所述成套偶联物2由所述eVP2-1偶联物和eVP7-1偶联物组成。
所述eVP2-1偶联物为由前文第一方面中所述eVP2-1多肽和载体蛋白偶联得到的完全抗原；
所述eVP5-1偶联物为由前文第一方面中所述eVP5-1多肽和载体蛋白偶联得到的完全抗原；
所述eVP7-1偶联物为由前文第一方面中所述eVP7-1多肽和载体蛋白偶联得到的完全抗原。
在本发明的具体实施方式中，在所述成套偶联物1中，所述eVP2-1偶联物和所述eVP5-1偶联物的质量比为1:1。
在本发明的具体实施方式中，在所述成套偶联物2中，所述eVP2-1偶联物和所述eVP7-1偶联物的质量比为1:1。
其中，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白等。
在本发明的具体实施方式中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)。
第三方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的多肽或成套多肽或前文第二方面中所述的偶联物或成套偶联物在如下任一中的应用：
(A1)制备检测非洲马瘟病毒抗体的试剂或试剂盒；
(A2)制备非洲马瘟病毒诊断抗原。
第四方面，本发明要求保护含有前文第一方面中所述的多肽或成套多肽或前文第二方面中所述的成套偶联物的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒用于检测非洲马瘟病毒抗体；在所述试剂盒中，前文第一方面中所述的多肽或成套多肽或前文第二方面中所述的偶联物或成套偶联物作为包被抗原。
更进一步地，所述试剂盒为化学发光免疫分析试剂盒；所述试剂盒中还含有辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗、包被缓冲液、洗涤液、二抗稀释液和/或校准品；所述二抗为能够抗所述非洲马瘟病毒抗体的抗体。
第五方面，本发明要求保护如下任一生物材料：
(B1)核酸分子，为核酸分子1；所述核酸分子1为能够编码前文第一方面中所述eVP2-1多肽的核酸分子。
(B2)表达盒，为表达盒1；所述表达盒1为含有(B1)中所述核酸分子1的表达盒。
(B3)重组载体，为重组载体1；所述重组载体1为含有(B1)中所述核酸分子1的重组载体。
(B4)重组菌，为重组菌1；所述重组菌1为含有(B1)中所述核酸分子1的重组菌。
(B5)转基因细胞系，为转基因细胞系1；所述转基因细胞系1为含有(B1)中所述核酸分子1的转基因细胞系。
(B6)成套核酸分子，为成套核酸分子1或成套核酸分子2；所述成套核酸分子1由(B1)中所述核酸分子1和核酸分子2组成；所述成套核酸分子2由(B1)中所述核酸分子1和核酸分子3组成；所述核酸分子2为能够编码前文第一方面中所述eVP5-1多肽的核酸分子；所述核酸分子3为能够编码前文第一方面中所述eVP7-1多肽的核酸分子。
(B7)成套表达盒，为成套表达盒1或成套表达盒2；所述成套表达盒1由(B2)中所述表达盒1和表达盒2组成；所述成套表达盒2由(B2)中所述表达盒1和表达盒3组成；所述表达盒2为含有(B6)中所述核酸分子2的表达盒；所述表达盒3为含有(B6)中所述核酸分子3的表达盒。
(B8)成套重组载体，为成套重组载体1或成套重组载体2；所述成套重组载体1由(B3)中所述重组载体1和重组载体2组成；所述成套重组载体2由(B3)中所述重组载体1和重组载体3组成；所述重组载体2为含有(B6)中所述核酸分子2的重组载体；所述重组载体3为含有(B6)中所述核酸分子3的重组载体。
(B9)成套重组菌，为成套重组菌1或成套重组菌2；所述成套重组菌1由(B4)中所述重组菌1和重组菌2组成；所述成套重组菌2由(B4)中所述重组菌1和重组菌3组成；所述重组菌2为含有(B6)中所述核酸分子2的重组菌；所述重组菌3为含有(B6)中所述核酸分子3的重组菌。
(B10)成套转基因细胞系，为成套转基因细胞系1或成套转基因细胞系2；所述成套转基因细胞系1由(B5)中所述转基因细胞系1和转基因细胞系2组成；所述成套转基因细胞系2由(B5)中所述转基因细胞系1和转基因细胞系3组成；所述转基因细胞系2为含有(B6)中所述核酸分子2的转基因细胞系；所述转基因细胞系3为含有(B6)中所述核酸分子3的转基因细胞系。
第六方面，本发明要求保护前文第五方面中所述生物材料在如下任一中的应用：
(C1)制备前文第一方面中所述的多肽或成套多肽或前文第二方面中所述的偶联物或成套偶联物或前文第四方面中所述的试剂盒；
(C2)制备检测非洲马瘟病毒抗体的试剂或试剂盒；
(C3)制备非洲马瘟病毒诊断抗原。
第七方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的多肽或成套多肽或前文第二方面中所述的偶联物或成套偶联物作为免疫原在制备非洲马瘟病毒抗体中的应用。
实验证明：用非洲马瘟病毒的全长VP2重组蛋白或非洲马瘟病毒的全长VP5重组蛋白或非洲马瘟病毒的全长VP7重组蛋白作为半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物作为包被原，不能有效地区分非洲马瘟病毒抗体与马传染性贫血病毒抗体、马动脉炎病毒抗体、马疱疹病毒抗体、马流感病毒抗体、马沙门氏菌抗体。为了提高非洲马瘟病毒抗体检测的特异性，本发明从非洲马瘟病毒的全长VP2和非洲马瘟病毒的全长VP5以及非洲马瘟病毒的全长VP7分别选择优势抗原表位eVP2-1、eVP5-1和eVP7-1，分别与载体蛋白偶联得到的偶联物(BSA-eVP2-1和/或BSA-eVP5-1和/或BSA-eVP7-1)作为包被原，可以有效地区分马传染性贫血病毒抗体、马动脉炎病毒抗体、马疱疹病毒抗体、马流感病毒抗体、马沙门氏菌抗体，提高了非洲马瘟病毒抗体检测的特异性。分别用BSA-eVP2-1和/或BSA-eVP5-1和/或BSA-eVP7-1作为包被抗原制备的检测血清中的非洲马瘟病毒抗体的试剂盒可以将马传染性贫血病毒抗体阳性血清、马动脉炎病毒抗体阳性血清、马疱疹病毒抗体阳性血清、马流感病毒抗体阳性血清、马沙门氏菌抗体阳性血清进行准确区分。
利用包被抗原为BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1的本发明CLIA方法2与非洲马瘟病毒血清补体结合试验方法的总符合率为95.83％(阳性符合率为96.67％，阴性符合率为95％)；利用包被抗原为BSA-eVP2-1+BSA-eVP7-1的本发明CLIA方法3与非洲马瘟病毒血清补体结合试验方法的总符合率为95.83％(阳性符合率为93.33％，阴性符合率为98.33％)。利用包被抗原为BSA-eVP2-1的本发明对照CLIA方法1与非洲马瘟病毒血清补体结合试验方法的总符合率为85.83％(阳性符合率为83.33％，阴性符合率为88.33％)。
本发明以BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1或BSA-eVP2-1+BSA-eVP7-1作为包被原制备的抗体检测试剂盒特异性强、敏感性高，准确性高，操作简单、快速，适用于基层各级兽医部门和出入境检验检疫局对非洲马瘟病毒感染血清抗体的快速大量筛选检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pET32a(+)为华大基因公司产品。鲁米诺化学发光底物为洛阳现代生物技术研究院有限公司产品；化学发光酶标板为美国Thermo公司产品；10％的胎牛血清、细胞培养基与相关细胞培养试剂为美国Gibco公司产品；具备血清中和效价背景的非洲马瘟病毒抗体阴性与阳性样本血清由中国动物疫病预防控制中心(农业农村部兽医诊断中心)保存，西班牙英吉纳公司产品，货号：AHSK32。化学发光免疫分析仪，型号HEXU，为洛阳现代生物技术有限公司产品。
下述实施例中的非洲马瘟病毒血清补体结合试验(MCF)方法，参照的主要是OIE标准条目：CHAPTER 3.6.1AFRICAN HORSE SICKNESS(INFECTION WITH AFRICAN HORSESICKNESS VIRUS)。此外还有GB/T 21675-2008非洲马瘟诊断技术标准过程(现已更换为GB/T21675-2022)。具体如下：
1材料
1.1含1％明胶的巴比妥盐缓冲液(VBSG)。
1.2血清样品，要求无红细胞，必须加热灭活：马血清56℃灭活30min。
1.3抗原是AHSV感染鼠脑的蔗糖丙酮提取物，对照抗原是用同样方法提取的未感染鼠脑。在缺乏国际标准血清时，抗原应用本地制备的阳性对照血清进行滴定，在试验中，使用4个～8个单位。
1.4补体(C')是正常的豚鼠血清。
1.5溶血素是用绵羊红细胞(SRBCs)高免的兔血清，SRBCs由无菌静脉采血并保存在阿氏液中。
1.6溶血素系统(HS)是通过稀释溶血素以包含2个溶血剂量，并使用它洗涤后的SRBCs的标准化浓度为3％。
1.7对照血清：阳性对照血清来源于通过ELISA或其他方法得到证实的阳性马，阴性对照血清来源于抗体阴性的健康马。本试验中使用保存的标准血清。
2.操作方法
反应在96孔圆底微滴定板中进行，最后总体积为100μL/孔，如果使用宏观系统，则在试管中进行，4℃环境下进行18小时。
2.1所有血清、样品和对照组均用VBSG稀释1/5，每份血清重复添加25μL，每个血清被稀释两次，从1/5到1/180。
2.2加入25μL按上述步骤滴定稀释的抗原，加入25μL稀释的补体，4℃环境下进行18小时。
2.3在微量滴定板上的所有孔中加入25μL的HS，37℃条件下反应30分钟。
2.4将微量板以1000r/min离心5min。
2.5记录所有孔的溶血情况。以50％溶血作为终点读取结果。
3.试验成立的条件：
当空白对照孔完全不溶血；补体对照孔完全溶血,说明试验结果成立。
4.结果判定
与CF抗原特异性结合补体的血清最高稀释度的倒数即为其效价。效价1/10或更高为阳性，低于1/10为阴性。
实施例1、化学发光免疫分析(CLIA)检测非洲马瘟病毒感染血清抗体
本发明人在研发过程中利用pET32a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶性表达了非洲马瘟病毒的全长VP2重组蛋白、非洲马瘟病毒的全长VP5重组蛋白和非洲马瘟病毒的全长VP7重组蛋白。实验结果表明将非洲马瘟病毒的全长VP2重组蛋白、非洲马瘟病毒的全长VP5重组蛋白和非洲马瘟病毒的全长VP7重组蛋白分别作为包被抗原建立的化学发光免疫分析方法不能有效地区分马传染性贫血病毒抗体、马动脉炎病毒抗体、马疱疹病毒抗体、马流感病毒抗体、马沙门氏菌抗体，特异性差。发明人从非洲马瘟病毒的全长VP2蛋白中选择了3个优势抗原表位多肽(分别记为eVP2-1、eVP2-2、eVP2-3)，从非洲马瘟病毒的全长VP5蛋白中选择了3个优势抗原表位多肽(分别记为eVP5-1、eVP5-2、eVP5-3)，从非洲马瘟病毒的全长VP7蛋白中选择了3个优势抗原表位多肽(分别记为eVP7-1、eVP7-2、eVP7-3)，分别与BSA偶联后作为包被抗原建立的化学发光免疫分析方法，特异性得到了显著提高，可以有效区分非洲马瘟病毒抗体和口蹄疫病毒抗体，但是敏感性差异较大。将eVP2-1与BSA的偶联物记为BSA-eVP2-1，eVP5-1与BSA的偶联物记为BSA-eVP5-1，eVP7-1与BSA的偶联物记为BSA-eVP7-1。将BSA-eVP2-1和BSA-eVP5-1按照1:1的质量比混合得到的混合完全抗原作为包被抗原，以及将BSA-eVP2-1和BSA-eVP7-1)按照1:1的质量比混合得到的混合完全抗原作为包被抗原，建立的化学发光免疫分析方法，特异性得到了显著提高，可以有效区分马传染性贫血病毒抗体、马动脉炎病毒抗体、马疱疹病毒抗体、马流感病毒抗体、马沙门氏菌抗体，敏感性也显著提高。具体的实验方法如下：
一、包被抗原的制备
本实施例制备了以下16种抗原：
1)BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1+BSA-eVP7-1；
2)BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1；
3)BSA-eVP2-1+BSA-eVP7-1；
4)BSA-eVP5-1+BSA-eVP7-1；
5)BSA-eVP2-1(eVP2-1偶联物)；
6)BSA-eVP2-2(eVP2-2偶联物)；
7)BSA-eVP5-3(eVP2-3偶联物)；
8)BSA-eVP5-1(eVP5-1偶联物)；
9)BSA-eVP5-2(eVP5-2偶联物)；
10)BSA-eVP5-3(eVP5-3偶联物)；
11)BSA-eVP7-1(eVP7-1偶联物)；
12)BSA-eVP7-2(eVP7-2偶联物)；
13)BSA-eVP7-3(eVP7-3偶联物)；
14)非洲马瘟病毒的全长VP2重组蛋白；
15)非洲马瘟病毒的全长VP5重组蛋白；
16)非洲马瘟病毒的全长VP7重组蛋白。
1、优势抗原表位多肽
从非洲马瘟病毒的VP2蛋白、VP5蛋白和VP7蛋白中选择优势抗原表位多肽，由北京六合华大基因科技有限公司合成N末端连接有半胱氨酸的多肽eVP2-1、eVP2-2、eVP2-3、eVP5-1、eVP5-2、eVP5-3、eVP7-1、eVP7-2和eVP7-3(表1)，纯度均大于95％，冻干保存。
表1、多肽
注：序列中的C*为半胱氨酸残基，是为了与载体蛋白连接，是在非洲马瘟病毒的VP2蛋白的抗原表位多肽或VP5蛋白的抗原表位多肽或VP7蛋白的抗原表位多肽的氨基末端添加的连接臂；其它氨基酸残基来源于非洲马瘟病毒。
2、9种优势抗原及其组合的制备
将步骤1中的eVP2-1、eVP2-2、eVP2-3、eVP5-1、eVP5-2、eVP5-3、eVP7-1、eVP7-2和eVP7-3这9种多肽分别与BSA偶联得到9种抗原：1)BSA-eVP2-1(eVP2-1与BSA的偶联物)；2)BSA-eVP2-2(eVP2-2与BSA的偶联物)；3)BSA-eVP2-3(eVP2-3与BSA的偶联物)；4)BSA-eVP5-1(eVP5-1与BSA的偶联物)；5)BSA-eVP5-2(eVP5-2与BSA的偶联物)；6)BSA-eVP5-3(eVP5-3与BSA的偶联物)；7)BSA-eVP7-1(eVP7-1与BSA的偶联物)；8)BSA-eVP7-2(eVP7-2与BSA的偶联物)；9)BSA-eVP7-3(eVP7-3与BSA的偶联物)。具体制备方法如下：使用美国KPL公司生产的BSA标签偶联试剂盒(ReadilinkTM BSA Conjugation Kit)货号：5501，批号：148045，按照说明书要求对合成的多肽片段进行偶联，制备成上述9种抗原。
将BSA-eVP2-1和BSA-eVP5-1和BSA-eVP7-1按照3:2:5的质量比混合得到包被抗原BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1+BSA-eVP7-1。
将BSA-eVP2-1和BSA-eVP5-1按照1：1的质量比混合得到包被抗原BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1。
将BSA-eVP2-1和BSA-eVP7-1按照1：1的质量比混合得到包被抗原BSA-eVP2-1+BSA-eVP7-1。
将BSA-eVP5-1和BSA-eVP7-1按照1：1的质量比混合得到包被抗原BSA-eVP5-1+BSA-eVP7-1。
3、非洲马瘟病毒的全长VP2重组蛋白、非洲马瘟病毒的全长VP5重组蛋白和非洲马瘟病毒的全长VP7重组蛋白的表达
(1)全长VP2重组蛋白基因表达载体的构建
用核苷酸序列是GenBank Accession No.KT715602.1(Update Date是09-DEC-2015)的第13-3218位替换pET32a(+)的BamH I和XhoI识别位点间的片段(BamH I识别位点和XhoI识别位点间的小片段)，保持pET32a(+)的其它序列不变，得到非洲马瘟病毒的全长VP5蛋白基因重组表达载体，命名为pET32a-VP2。pET32a-VP2能表达含有非洲马瘟病毒的全长VP2蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.10所示)的融合蛋白。
(2)全长VP5重组蛋白基因表达载体的构建
用核苷酸序列是GenBank Accession No.KM886359.1(Update Date是23-SEP-2015)的第20-1537位替换pET32a(+)的BamH I和XhoI识别位点间的片段(BamH I识别位点和XhoI识别位点间的小片段)，保持pET32a(+)的其它序列不变，得到非洲马瘟病毒的全长VP5蛋白基因重组表达载体，命名为pET32a-VP5。pET32a-VP5能表达含有非洲马瘟病毒的全长VP5蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.11所示)的融合蛋白。
(3)全长VP7重组蛋白基因表达载体的构建
用核苷酸序列是GenBank Accession No.FJ011114.1(Update Date是21-MAY-2009)的第18-1067位替换pET32a(+)的BamH I和XhoI识别位点间的片段(BamH I识别位点和XhoI识别位点间的小片段)，保持pET32a(+)的其它序列不变，得到非洲马瘟病毒的全长VP1重组蛋白基因重组表达载体，命名为pET32a-VP7。pET32a-VP7能表达含有非洲马瘟病毒的全长VP7蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.12所示)的融合蛋白。
(4)重组菌的构建
将步骤(1)至(3)构建的pET32a-VP2、pET32a-VP5和pET32a-VP7这3种表达载体分别单独转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将其均匀涂布于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒进行测序，将测序结果表明含有pET32a-VP2的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)-pET32a-VP2，将测序结果表明含有pET32a-VP5的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)-pET32a-VP5，将测序结果表明含有pET32a-VP7的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)-pET32a-VP7。
(5)非洲马瘟病毒的全长VP2重组蛋白或非洲马瘟病毒的全长VP5重组蛋白或非洲马瘟病毒的全长VP7重组蛋白的可溶性表达
将BL21(DE3)-pET32a-VP2、BL21(DE3)-pET32a-VP5、BL21(DE3)-pET32a-VP7这3个菌株分别单独接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入氨苄青霉素至氨苄青霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D600值(以含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入IPTG进行诱导表达。该诱导表达用0.75mM的IPTG在16℃诱导13h。取IPTG诱导表达13h后的发酵液收集菌体沉淀。加入PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，于4℃离心机中16000rpm/min离心30min，收集上清液，弃沉淀。将上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗镍柱挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化，分别得到分子筛纯化的非洲马瘟病毒的全长VP2重组蛋白、分子筛纯化的非洲马瘟病毒的全长VP5重组蛋白和分子筛纯化的非洲马瘟病毒的全长VP7重组蛋白。
二、利用诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒进行化学发光免疫分析
本实施例提供了16种诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒。这16种试剂盒均包括包被抗原、辣根过氧化物酶(HRP)标记马二抗(货号5220-0370，中联瑞(北京)生物科技有限责任公司)、包被缓冲液(货号HC210，禾旭(郑州)生物技术有限公司)、洗涤液(货号HX221，禾旭(郑州)生物技术有限公司)、二抗稀释液(货号HM391，禾旭(郑州)生物技术有限公司)。这16种试剂盒的区别仅在于包被抗原不同，其它组分完全相同。
这16种试剂盒分别为：
包被抗原为步骤1的BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1+BSA-eVP7-1的诊断非洲马瘟病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称本发明的试剂盒1；包被抗原为步骤1的BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称本发明的试剂盒2；包被抗原为步骤1的BSA-eVP2-1+BSA-eVP7-1的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称本发明的试剂盒3；包被抗原为步骤1的BSA-eVP5-1+BSA-eVP7-1的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称本发明的试剂盒4。
包被抗原为步骤1的BSA-eVP2-1的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒1；包被抗原为步骤1的BSA-eVP2-2的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒2；包被抗原为步骤1的BSA-eVP2-3的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒3；包被抗原为步骤1的BSA-eVP5-1的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒4；包被抗原为步骤1的BSA-eVP5-2的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒5；包被抗原为步骤1的BSA-eVP5-3的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒6；包被抗原为步骤1的BSA-eVP7-1的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒7；包被抗原为步骤1的BSA-eVP7-2的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒8；包被抗原为步骤1的BSA-eVP7-3的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒9；包被抗原为步骤1的非洲马瘟病毒的全长VP2重组蛋白的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒10；包被抗原为步骤1的非洲马瘟病毒的全长VP5重组蛋白的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒11；包被抗原为步骤1的非洲马瘟病毒的全长VP7重组蛋白的诊断非洲马瘟病毒病的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒12。
(一)利用本发明的试剂盒1，经过优化实验建立了以BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1+BSA-eVP7-1为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称本发明CLIA方法1)。
1、操作步骤
(1)包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1+BSA-eVP7-1的浓度(BSA-eVP2-1、BSA-eVP5-1、BSA-eVP7-1的总质量浓度)为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被缓冲液包被实验孔，100μL/孔加至酶标板，4℃孵育16h。
(2)洗涤：倾去孔内包被原溶液，用洗涤液洗涤5次，每次3min；拍干。
(3)封闭：加入1％BSA封闭液，350μL/孔，37℃孵育2h。
(4)洗涤：同步骤(2)。
(5)加样：在血清稀释板中，用样品稀释液(1×PBST)将待检样品按照1﹕20比例进行稀释；取出包被板，每次实验需设置系列校准品6孔。首先在血清稀释板上依次加入校准品1～6(具体参见下文)各100μL，其余各孔依次加入稀释后的待检样品各100μL，置37℃恒温培养箱中温育30min(±1min)。
(6)洗涤：同步骤(2)。
(7)向以上各孔均加入二抗稀释液稀释后的辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗100μL，震荡混匀。每孔吸取100μL转移至包被板对应孔内；置37℃恒温培养箱中温育30min(±1min)。
(8)洗涤：同步骤(2)。
(9)加入鲁米诺化学发光底物：每孔各加入100μL的鲁米诺化学发光底物，振荡混匀；在15℃～25℃条件下避光静置5min，静置后15min内用化学发光仪读取发光值。
2、结果计算方法
NCU(National clinical unit)即国家临床单位，是由国家临检中心制定的单位，在本方法中引用该单位对标准阳性血清(中和抗体效价为1：512)赋值为20000NCU/ml，以不同稀释倍数的标准阳性血清建立四参数法校准曲线，由检测样品的发光值和校准曲线换算样品的抗体剂量值(NCU/ml)，从而实现半定量检测。具体如下：
将具备血清中和效价背景的非洲马瘟病毒抗体阳性血清按照补体结合试验结果设定校准品1～6，对应的抗体剂量值(0NCU/mL、10NCU/mL、20NCU/mL、40NCU/mL、100NCU/mL、200NCU/mL)。以校准品1至校准品6的发光值为纵坐标，以对应的抗体剂量值为横坐标，通过ELISACalc软件绘制校准品的四参数拟合曲线，四参数模式为Y＝(a-b)/[1+(x/c)*b]+d。其中，a为曲线上渐近线估值；b为曲线的斜率；c为最大结合一半时对应的剂量；d为曲线下渐近线估值。
将样本的发光值代入校准曲线计算，即可得出样品中非洲马瘟病毒抗体的含量。
3、试验成立条件与结果判定
将6个校准品的发光值与对应抗体剂量值进行四参数拟合，R2≥0.96，试验成立。否则，试验不成立。
4、阴阳性临界值的确定
将200份非洲马瘟病毒抗体阴性血清采用上述方法进行CLIA检测，计算该200份非洲马瘟病毒抗体阴性血清的剂量值的平均值(X)和标准偏差(SD)。200份非洲马瘟抗体阴性血清的平均剂量值X为30.25，SD为3.25，因此阴阳性临界剂量值为40NCU/mL。即剂量值≥40NCU/mL判为阳性；剂量值＜40NCU/mL判为阴性。
(二)利用本发明的试剂盒2，经过优化实验建立了以BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称本发明CLIA方法2)步骤同(一)。包被的BSA-eVP2-1和BSA-eVP5-1的总质量浓度为1.0μg/ml。
(三)利用本发明的试剂盒3，经过优化实验建立了以BSA-eVP2-1+BSA-eVP7-1为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称本发明CLIA方法3)步骤同(一)。包被的BSA-eVP2-1和BSA-eVP7-1的总质量浓度为1.0μg/ml。
(四)利用本发明的试剂盒4，经过优化实验建立了以BSA-eVP5-1+BSA-eVP7-1为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称本发明CLIA方法4)步骤同(一)。包被的BSA-eVP5-1和BSA-eVP7-1的总质量浓度为1.0μg/ml。
(五)利用本发明的对照试剂盒1，经过优化实验建立了以BSA-eVP2-1为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法1)步骤同(一)。包被的BSA-eVP2-1的质量浓度为1.0μg/ml。
(六)利用本发明的对照试剂盒2，经过优化实验建立了以BSA-eVP2-2为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法2)步骤同(一)。包被的BSA-eVP2-2的质量浓度为1.0μg/ml。
(七)利用本发明的对照试剂盒3，经过优化实验建立了以BSA-eVP2-3为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法3)步骤同(一)。包被的BSA-eVP2-3的质量浓度为1.0μg/ml。
(八)利用本发明的对照试剂盒4，经过优化实验建立了以BSA-eVP5-1为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法4)步骤同(一)。包被的BSA-eVP5-1的质量浓度为1.0μg/ml。
(九)利用本发明的对照试剂盒5，经过优化实验建立了以BSA-eVP5-2为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法5)步骤同(一)。包被的BSA-eVP5-2的质量浓度为1.0μg/ml。
(十)利用本发明的对照试剂盒6，经过优化实验建立了以BSA-eVP5-3为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法6)步骤同(一)。包被的BSA-eVP5-3的质量浓度为1.0μg/ml。
(十一)利用本发明的对照试剂盒7，经过优化实验建立了以BSA-eVP7-1为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法7)步骤同(一)。包被的BSA-eVP7-1的质量浓度为1.0μg/ml。
(十二)利用本发明的对照试剂盒8，经过优化实验建立了以BSA-eVP7-2为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法8)步骤同(一)。包被的BSA-eVP7-2的质量浓度为1.0μg/ml。
(十三)利用本发明的对照试剂盒9，经过优化实验建立了以BSA-eVP7-3为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法9)步骤同(一)。包被的BSA-eVP7-3的质量浓度为1.0μg/ml。
(十四)利用本发明的对照试剂盒10，经过优化实验建立了以全长VP2蛋白为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法10)步骤同(一)。包被的全长VP2蛋白的质量浓度为1.0μg/ml。
(十五)利用本发明的对照试剂盒11，经过优化实验建立了以全长VP5蛋白为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法11)步骤同(一)。包被的全长VP5蛋白的质量浓度为1.0μg/ml。
(十六)利用本发明的对照试剂盒12，经过优化实验建立了以全长VP7蛋白为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照CLIA方法12)步骤同(一)。包被的全长VP7蛋白的质量浓度为1.0μg/ml。
三、特异性试验
利用步骤二的本发明CLIA方法1-4、对照CLIA方法1-12与马传染性贫血病毒抗体阳性血清、马动脉炎病毒抗体阳性血清、马疱疹病毒抗体阳性血清、马流感病毒抗体阳性血清、马沙门氏菌抗体阳性血清(各种阳性血清均采集自临床发病动物的血清)进行比对，观察与其它同种属疾病有无交叉反应。另外，同时通过补体结合试验进行检测(具体方法参见前文)。
结果显示：
本发明CLIA方法1-4的检测结果显示，抗体剂量值均小于40NCU/ml,判定为阴性。特异性为100％。补体结合试验的中和指数均小于1:10这一国家标准，结果均为阴性。具体结果参见表2。
对照CLIA方法1-12的检测结果显示，对照CLIA方法1、对照CLIA方法4、对照CLIA方法7的抗体剂量值均小于40NCU/ml,判定为阴性。特异性为100％。其余特异性均不足100％。具体结果参见表3。
表2、本发明CLIA方法1-4与补体结合试验特异性试验结果
表3、对照CLIA方法1-12特异性试验结果
四、灵敏度试验
将非洲马瘟病毒抗体阳性血清进行倍比稀释，分别采用本发明CLIA方法1-4和已知血清中和效价背景的血清样本进行比对检测，得出阳性临界值时的最大稀释度。结果表明本发明CLIA方法1-4检测阳性血清的最高稀释倍数均为1:1024倍。补体结合试验结果检测阳性血清的最高稀释倍数为1:512。见表4。
表4、本发明CLIA方法1-4与补体结合试验灵敏度结果
五、重复性试验
采用本发明CLIA方法1-4分别对10份非洲马瘟病毒抗体阳性血清在同批次板和不同批次板上分别进行检测，平行测定5次，计算批内、批间变异系数(CV)。结果显示，本发明CLIA方法1-4批内重复变异系数在8％以内，批间重复变异系数小于10％(表5至表8)。结果表明，非洲马瘟病毒抗体阳性血清具有良好的重复性。
表5、本发明CLIA方法1重复性试验
表6、本发明CLIA方法2重复性试验
表7、本发明CLIA方法3重复性试验
表8、本发明CLIA方法4重复性试验
六、符合性试验
采用中国动物疫病预防控制中心(农业农村部兽医诊断中心)保存的牛血清，挑选出了血清中和效价背景为非洲马瘟病毒抗体阳性的60份马血清与血清中和效价背景为非洲马瘟病毒抗体阴性的60份马血清。对这120份马血清分别采用本发明CLIA方法1-4、对照CLIA方法1-12进行检测，计算其与补体结合试验方法的符合率。
结果表明：该160份牛血清，本发明CLIA方法1与补体结合试验方法的总符合率为98.33％(阳性符合率为100％，阴性符合率为96.67％)，本发明CLIA方法2与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为95.83％(阳性符合率为96.67％，阴性符合率为95％)，本发明CLIA方法3与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为95.83％(阳性符合率为93.33％，阴性符合率为98.33％)，本发明CLIA方法4与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为95.83％(阳性符合率为95％，阴性符合率为96.67％)。
本发明对照CLIA方法1检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为85.83％(阳性符合率为83.33％，阴性符合率为88.33％)，本发明对照CLIA方法2检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为85％(阳性符合率为83.33％，阴性符合率为86.67％)，本发明对照CLIA方法3检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为80％(阳性符合率为81.67％，阴性符合率为78.33％)，本发明对照CLIA方法4检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为76.67％(阳性符合率为78.33％，阴性符合率为75％)，本发明对照CLIA方法5检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为76.67％(阳性符合率为73.33％，阴性符合率为80％)，本发明对照CLIA方法6检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为68.33％(阳性符合率为68.33％，阴性符合率为68.33％)，本发明对照CLIA方法7检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为80.83％(阳性符合率为80％，阴性符合率为81.67％)，本发明对照CLIA方法8检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为73.33％(阳性符合率为75％，阴性符合率为71.67％)，本发明对照CLIA方法9检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为73.33％(阳性符合率为71.67％，阴性符合率为75％)，本发明对照CLIA方法10检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为76.67％(阳性符合率为73.33％，阴性符合率为80％)，本发明对照CLIA方法11检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为80.83％(阳性符合率为75％，阴性符合率为86.67％)，本发明对照CLIA方法12检测结果与非洲马瘟补体结合试验方法的总符合率为80.83％(阳性符合率为76.67％，阴性符合率为86.67％)。
具体参见表9至表24。
以上结果说明分别将BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1+BSA-eVP7-1、BSA-eVP2-1+BSA-eVP5-1、BSA-eVP2-1+BSA-eVP7-1、和BSA-eVP5-1+BSA-eVP7-1作为包被抗原制备的诊断非洲马瘟病毒抗体化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒与补体结合试验方法的总符合率显著高于分别以BSA-eVP2-1、BSA-eVP2-2、BSA-eVP2-3、BSA-eVP5-1、BSA-eVP5-2、BSA-eVP5-3、BSA-eVP7-1、BSA-eVP7-2、BSA-eVP7-3、非洲马瘟病毒的全长VP2蛋白、非洲马瘟病毒的全长VP5蛋白和非洲马瘟病毒的全长VP7蛋白作为包被抗原制备的诊断非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒或检测非洲马瘟病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒。
表9、本发明CLIA方法1对牛血清样品检测结果
表10、本发明CLIA方法2对牛血清样品检测结果
表11、本发明CLIA方法3对牛血清样品检测结果
表12、本发明CLIA方法4对牛血清样品检测结果
表13、对照CLIA方法1对牛血清样品检测结果
表14、对照CLIA方法2对牛血清样品检测结果
表15、对照CLIA方法3对牛血清样品检测结果
表16、对照CLIA方法4对牛血清样品检测结果
表17、对照CLIA方法5对牛血清样品检测结果
表18、对照CLIA方法6对牛血清样品检测结果
表19、对照CLIA方法7对牛血清样品检测结果
表20、对照CLIA方法8对牛血清样品检测结果
表21、对照CLIA方法9对牛血清样品检测结果
表22、对照CLIA方法10对牛血清样品检测结果
表23、对照CLIA方法11对牛血清样品检测结果
表24、对照CLIA方法12对牛血清样品检测结果
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.多肽或成套多肽，其特征在于：所述多肽为eVP2-1多肽；
所述成套多肽为成套多肽1或成套多肽2；
所述成套多肽1由所述eVP2-1多肽和eVP5-1多肽组成；
所述成套多肽2由所述eVP2-1多肽和eVP7-1多肽组成；
所述eVP2-1多肽为如下P11、P12或P13所示：
P11、氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽；
P12、氨基酸序列为SEQ ID No.1的第2-46位的多肽；
P13、在P12所示多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基后得到的能够与载体蛋白偶联的多肽；
所述eVP5-1多肽为如下P21、P22或P23所示：
P21、氨基酸序列为SEQ ID No.4的多肽；
P22、氨基酸序列为SEQ ID No.4的第2-38位的多肽；
P23、在P22所示多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基后得到的能够与载体蛋白偶联的多肽；
所述eVP7-1多肽为如下P21、P22或P23所示：
P31、氨基酸序列为SEQ ID No.7的多肽；
P32、氨基酸序列为SEQ ID No.7的第2-51位的多肽；
P33、在P32所示多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基后得到的能够与载体蛋白偶联的多肽。
2.偶联物或成套偶联物，其特征在于：所述偶联物为eVP2-1偶联物；
所述成套偶联物为成套偶联物1或成套偶联物2；
所述成套偶联物1由所述eVP2-1偶联物和eVP5-1偶联物组成；
所述成套偶联物2由所述eVP2-1偶联物和eVP7-1偶联物组成；
所述eVP2-1偶联物为由权利要求1中所述eVP2-1多肽和载体蛋白偶联得到的完全抗原；
所述eVP5-1偶联物为由权利要求1中所述eVP5-1多肽和载体蛋白偶联得到的完全抗原；
所述eVP7-1偶联物为由权利要求1中所述eVP7-1多肽和载体蛋白偶联得到的完全抗原。
3.根据权利要求2所述的成套偶联物，其特征在于：在所述成套偶联物1中，所述eVP2-1偶联物和所述eVP5-1偶联物的质量比为1:1；和/或
在所述成套偶联物2中，所述eVP2-1偶联物和所述eVP7-1偶联物的质量比为1:1。
4.权利要求1所述的多肽或成套多肽或权利要求2或3所述的偶联物或成套偶联物在如下任一中的应用：
(A1)制备检测非洲马瘟病毒抗体的试剂或试剂盒；
(A2)制备非洲马瘟病毒诊断抗原。
5.含有权利要求1所述的多肽或成套多肽或权利要求2或3所述的成套偶联物的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于检测非洲马瘟病毒抗体；在所述试剂盒中，权利要求1所述的多肽或成套多肽或权利要求2或3所述的偶联物或成套偶联物作为包被抗原。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为化学发光免疫分析试剂盒；所述试剂盒中还含有辣根过氧化物酶标记二抗、包被缓冲液、洗涤液、二抗稀释液和/或校准品；所述二抗为能够抗所述非洲马瘟病毒抗体的抗体。
8.如下任一生物材料：
(B1)核酸分子，为核酸分子1；所述核酸分子1为能够编码权利要求1中所述eVP2-1多肽的核酸分子；
(B2)表达盒，为表达盒1；所述表达盒1为含有(B1)中所述核酸分子1的表达盒；
(B3)重组载体，为重组载体1；所述重组载体1为含有(B1)中所述核酸分子1的重组载体；
(B4)重组菌，为重组菌1；所述重组菌1为含有(B1)中所述核酸分子1的重组菌；
(B5)转基因细胞系，为转基因细胞系1；所述转基因细胞系1为含有(B1)中所述核酸分子1的转基因细胞系；
(B6)成套核酸分子，为成套核酸分子1或成套核酸分子2；所述成套核酸分子1由(B1)中所述核酸分子1和核酸分子2组成；所述成套核酸分子2由(B1)中所述核酸分子1和核酸分子3组成；所述核酸分子2为能够编码权利要求1中所述eVP5-1多肽的核酸分子；所述核酸分子3为能够编码权利要求1中所述eVP7-1多肽的核酸分子；
(B7)成套表达盒，为成套表达盒1或成套表达盒2；所述成套表达盒1由(B2)中所述表达盒1和表达盒2组成；所述成套表达盒2由(B2)中所述表达盒1和表达盒3组成；所述表达盒2为含有(B6)中所述核酸分子2的表达盒；所述表达盒3为含有(B6)中所述核酸分子3的表达盒；
(B8)成套重组载体，为成套重组载体1或成套重组载体2；所述成套重组载体1由(B3)中所述重组载体1和重组载体2组成；所述成套重组载体2由(B3)中所述重组载体1和重组载体3组成；所述重组载体2为含有(B6)中所述核酸分子2的重组载体；所述重组载体3为含有(B6)中所述核酸分子3的重组载体；
(B9)成套重组菌，为成套重组菌1或成套重组菌2；所述成套重组菌1由(B4)中所述重组菌1和重组菌2组成；所述成套重组菌2由(B4)中所述重组菌1和重组菌3组成；所述重组菌2为含有(B6)中所述核酸分子2的重组菌；所述重组菌3为含有(B6)中所述核酸分子3的重组菌；
(B10)成套转基因细胞系，为成套转基因细胞系1或成套转基因细胞系2；所述成套转基因细胞系1由(B5)中所述转基因细胞系1和转基因细胞系2组成；所述成套转基因细胞系2由(B5)中所述转基因细胞系1和转基因细胞系3组成；所述转基因细胞系2为含有(B6)中所述核酸分子2的转基因细胞系；所述转基因细胞系3为含有(B6)中所述核酸分子3的转基因细胞系。
9.权利要求8所述生物材料在如下任一中的应用：
(C1)制备权利要求1所述的多肽或成套多肽或权利要求2或3所述的偶联物或成套偶联物或权利要求4-7中任一所述的试剂盒；
(C2)制备检测非洲马瘟病毒抗体的试剂或试剂盒；
(C3)制备非洲马瘟病毒诊断抗原。
10.权利要求1所述的多肽或成套多肽或权利要求2或3所述的偶联物或成套偶联物作为免疫原在制备非洲马瘟病毒抗体中的应用。
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