CN118084699A - 一种可电离脂质化合物及其制备方法与医学上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可电离脂质化合物及其制备方法与医学上的应用，可电离脂质化合物的结构式如下通式(Ⅰ)所示。本发明的可电离脂质化合物通过引入双键，改进可电离脂质分子的结构，得到一类新型的可电离脂质化合物，由其组成的脂质纳米颗粒递送载体用于递送mRNA，其递送效率高、细胞毒性低、免疫原性高，从而促进核酸药物的发展。
Description
技术领域
本发明涉及有机合成药物技术领域，涉及核酸药物的递送技术，具体是一种可电离脂质化合物及其制备方法与医学上的应用。
背景技术
基因治疗是通过将遗传物质(DNA或RNA)转移到患者的细胞中来，以纠正或弥补缺陷或异常基因引起的疾病。近年来，基因治疗取得了飞速发展，取得了巨大的成功，超过二十种基因疗法被正式批准为临床用药。其治疗的对象已经由最初的遗传性单基因疾病逐步拓展到由隐性基因疾病(如囊性纤维化、血友病、肌肉萎缩症和镰状细胞性贫血)、获得性遗传病(如癌症)和某些病毒感染(如艾滋病)引起的疾病。基因治疗药物需进入细胞内且完成内体逃逸才可发挥作用，但核酸具有分子量大、带负电荷、易降解等理化性质，使得其难以穿过细胞膜，并且核酸在进入体内后很容易被细胞内核酸酶降解而失去治疗作用，因此设计安全有效的递送系统是核酸药物研发的关键。
目前比较常见的核酸递送载体主要有病毒载体和非病毒载体。病毒载体，如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和逆转录病毒载体，由于其独特的基因传递特性和靶向特异性，在基因递送中广泛应用。然而，病毒载体存在毒性大、免疫原性高、致癌性、成本高、临床难以大规模生产等局限性。因此，越来越多的科学家将注意力转向非病毒载体的开发。最近的研究表明，非病毒载体具有以下优点：免疫原性低、生物降解性强、易于合成、生产成本低。目前研究最广泛的非病毒载体主要是聚合物、脂质体和纳米颗粒等。其中，脂质纳米颗粒(LNP)的发展最为迅速，被认为是递送核酸药物的首选。LNP主要由可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的脂质组成。其中最关键的是可电离的阳离子脂质，它是核酸包封、递送和转染效率的决定性因素。可电离脂质化合物在低pH值下质子化，这使它们带正电，通过静电作用结合带负电的核酸药物，保护核酸药物免受核酸酶降解，促进膜不稳定并促进纳米颗粒的内体逃逸。此外，它们在生理pH值下保持中性，从而提高了脂质纳米颗粒的生物相容性。
目前已上市应用的可电离阳离子脂质只有3个，包括DLin-MC3-DMA、SM-102、ALC-0315。其中，DLin-MC3-DMA制备的脂质纳米颗粒已经用于递送siRNA，而SM-102和ALC-0315组成的脂质纳米颗粒都是用于mRNA的递送。尽管已经报道了一系列可电离脂质化合物，但目前的可电离脂质化合物仍存在细胞毒性大、递送效率低、肝清除率高等缺点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可电离脂质化合物及其制备方法与医学上的应用，可电离脂质化合物制备得到的脂质纳米颗粒能有效进行核酸药物的递送，实现针对性的基因治疗。
本发明的技术方案为：
一种可电离脂质化合物，结构式如下通式(Ⅰ)所示：
通式(I)中，R1选自未取代的C2-C6亚烷基，R2选自C2-C8亚烷基，R3选自(Z,E)-C4亚烯基或Z构型的C4亚烯基，R4选自C5-C9烷基。
所述的R1选自未取代的C2亚烷基、C3亚烷基或C4亚烷基，R2选自C3亚烷基或C4亚烷基，R4选自C7烷基或C8烷基。
所述的可电离脂质化合物的结构式选自下式(Ⅰ-1)-(Ⅰ-12)：
制备可电离脂质化合物的化学反应式见下式：
一种可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：将通式(Ⅱ)的化合物加入到有机溶剂中，并在碱性条件下加入通式(Ⅲ)的化合物和催化剂，在60-80℃下、反应2-5h后，对反应液进行后处理，得到可电离脂质化合物。
所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或两种以上的组合；所述的碱性条件是由碳酸钾、碳酸钠和碳酸铯中的一种碱性化合物或两种以上的碱性组合物提供，碱性化合物或碱性组合物与通式(Ⅱ)化合物的摩尔比为1:2-3；所述的催化剂选自碘化钾或碘化钠，催化剂和通式(Ⅱ)化合物的摩尔比为1:0.2-1；
所述的后处理的具体步骤为：将反应液中的溶剂旋干后，向反应液中加入饱和NaCl水溶液，并用乙酸乙酯萃取，萃取的有机相经无水硫酸钠干燥、减压蒸干、硅胶柱层析色谱分离得到可电离脂质化合物；其中，硅胶柱层析色谱分离所用洗脱剂为甲醇和乙酸乙酯的混合液，甲醇和乙酸乙酯的体积比为1:20。
一种脂质纳米颗粒，是由可电离脂质、磷脂、聚乙二醇脂质和胆固醇组成。
脂质纳米颗粒在作为核酸药物递送载体方面的应用。
脂质纳米颗粒组成的核酸药物组合物，包括核酸药物和作为核酸药物递送载体的脂质纳米颗粒。
所述的核酸药物为siRNA、mRNA、tRNA、质粒DNA或microRNA。
本发明的优点：
(1)、本发明的可电离脂质化合物通过引入双键，改进可电离脂质分子的结构，得到一类新型的可电离脂质化合物，由其组成的脂质纳米颗粒递送载体用于递送mRNA，其递送效率高、细胞毒性和免疫原性低，从而促进核酸药物的发展。
(2)、本发明可电离脂质化合物是通过酯化、取代反应制备而成，路径简单科学，原料价格低廉易得，反应条件温和、易于实现，产物分离便捷。
(3)、本发明可电离脂质化合物与磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质组合制成脂质纳米颗粒(LNP)，制成的脂质纳米颗粒具有更加优异的核酸递送效率，可有效递送siRNA、mRNA、DNA等核酸药物进入细胞内发挥作用。
附图说明
图1是本发明实施例制备得到的可电离脂质化合物与DLin-MC3-DMA、SM-102在CD19核酸体外递送效率方面的对比图。
图2是本发明实施例制备得到的可电离脂质化合物与DLin-MC3-DMA、SM-102在转染CD19核酸至细胞后的细胞存活率对比图。
图3是本发明本发明实施例制备得到的可电离脂质化合物与DLin-MC3-DMA、SM-102在转染CD19核酸至细胞后的免疫原性对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
术语解释：
“烷基”是指饱和的脂肪族烃基团，包括直链和支链烷基基团；在一些实施方案中，烷基基团具有7-9个碳，也被称为C7-9烷基。
“亚烷基”是指烷基的一个氢原子进一步被取代，例如：“亚甲基”指-CH2-、“亚乙基”指-(CH2)2-、“亚丙基”指-(CH2)3-。
“烯基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个双键的不饱和脂肪族烃基，烯基的非限制性实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、异丁烯基、1,3-丁二烯基等。
缩略语解释：
EDCI：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；
DMAP：4-二甲氨基吡啶；
DIEA：N,N-二异丙基乙胺；
PhMe：甲苯；
K2CO3：碳酸钾；
ACN：乙腈；
Et3N：三乙胺；
TBAB：四丁基溴化铵；
NaOH：氢氧化钠；
KI：碘化钾；
Na2SO4：无水硫酸钠；
EA：乙酸乙酯；
PE：石油醚；
MeOH：甲醇；
TLC：薄层色谱；
CDCl3：氖代氯仿；
1H-NMR：核磁共振氢谱；
MS：高分辨质谱；
DMG-PEG：磷脂-聚乙二醇；
DOPE：磷脂。
实施例1
式(Ⅰ-1)可电离脂质化合物的化学反应式为：
式(Ⅰ-1)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
(1)、8-溴辛酸十七碳-9-基酯(1a)的合成：
将8-溴辛酸(6.1g，27.35mmol)和15mL甲苯溶剂加入反应瓶中，8-溴辛酸溶于甲苯溶剂中后，加入DIEA(3.85mL，23.44mmol)、DMAP(0.5g，3.88mmol)和EDCI(5.6g，27.18mmol)于室温搅拌半小时，接下来称取十七烷-9-醇(5g，19.53mmol)溶于少量甲苯溶剂中，再分批加入到反应瓶中，继续在室温下搅拌5h，TLC监测反应完全后，旋蒸仪减压蒸馏除去溶剂后，加入300mL乙酸乙酯，依次用稀盐酸溶液(1wt％，200mL×3)、饱和碳酸钾溶液(200mL×3)和水(200mL×3)洗涤，洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到白色油状液体8.4g，即为8-溴辛酸十七碳-9-基酯(1a)，收率93.33％；
(2)、8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(1b)的合成：
将乙醇胺(6.64g，108.76mmol)和10mL乙腈加入反应瓶中，乙醇胺溶于乙腈中后，加入碳酸钾(4.5g，32.61mmol)和8-溴辛酸十七碳-9-基酯(1a，5g，10.87mmol)，在65℃下搅拌3h，TLC监测反应完全后，旋蒸仪减压蒸馏除去溶剂后，加入200mL乙酸乙酯，用饱和食盐水洗涤三次，洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂，产物通过柱层析色谱分离纯化(洗脱剂为EA:MeOH:Et3N＝20:1:0.3)，浓缩得到白色油状液体1.8g，即为8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(1b)，收率45.93％；
(3)、4-(庚氧基)丁-2-烯-1-醇(1c)的合成：
将1,4-丁烯二醇(2.5g，28.41mmol)和5mL的1,4-二氧六环加入反应瓶中，1,4-丁烯二醇溶于1,4-二氧六环中后，加入四丁基溴化铵(0.09g，0.28mmol)和氢氧化钠(0.25g，6.25mmol)，接下来称取1-溴代庚烷(1g，5.59mmol)分批加入到反应瓶中，在100℃下搅拌5h，薄层色谱法(TLC)监测，原料基本反应完全后，向反应液中加入50mL的正己烷，用水洗涤三次，洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂，得到黄色油状液体0.48g，即为4-(庚氧基)丁-2-烯-1-醇(1c)，收率46.15％；
(4)、4-(庚氧基)丁-2-烯-1-基6-溴己酸酯(1d)的合成：
将6-溴己酸(0.75g，3.85mmol)和10mL甲苯溶剂加入反应瓶中，6-溴己酸溶于甲苯溶剂中后，加入DIEA(0.51mL，3.11mmol)、DMAP(0.067g，0.52mmol)和EDCI(0.80g，3.88mmol)室温搅拌半小时，接下来将4-(庚氧基)丁-2-烯-1-醇(1c，0.48g，2.58mmol)溶于少量甲苯溶剂中，分批加入到反应瓶中，继续在室温下搅拌5h，TLC监测反应完全后，旋蒸仪减压蒸馏除去溶剂后，加入50mL乙酸乙酯，并依次用稀盐酸溶液(1wt％，100mL×3)、饱和碳酸钾溶液(100mL×3)和水(100mL×3)洗涤，洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到黄色油状液体0.82g，即为4-(庚氧基)丁-2-烯-1-基6-溴己酸酯((1d))，收率87.23％；
(5)、8-((6-((4-(庚氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-6-氧代己基)(2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(Ⅰ-1)的合成：
将8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(1b，0.71g，1.61mmol)和5mL乙腈加入反应瓶中，8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯溶于乙腈中后，加入碳酸钾(0.67g，4.86mmol)、碘化钾(0.053g，0.32mmol)和4-(庚氧基)丁-2-烯-1-基6-溴己酸酯(1d，0.82g，2.27mmol)，在70℃下搅拌3h，TLC监测反应完全后，旋蒸仪减压蒸馏除去溶剂后，加入50mL乙酸乙酯，并用饱和食盐水洗涤三次，洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂，产物通过柱层析色谱分离纯化(洗脱剂为PE:EA＝1:1)，浓缩得到白色油状液体0.34g，即为8-((6-((4-(庚氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-6-氧代己基)(2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(Ⅰ-1)，收率29.06％。
实施例2
式(Ⅰ-2)可电离脂质化合物的化学反应式为：
式(Ⅰ-2)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
步骤(1)-(3)同实施例1，制得4-(庚氧基)丁-2-烯-1-醇(1c)，将步骤(4)中的6-溴己酸替换为5-溴戊酸(2.32g，12.82mmol)，制备得到中间体2d(0.7g，2.01mmol)，将步骤(5)中将1d替换成2d，制备得到白色油状液体0.23g，即为8-((5-((4-(庚氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-5-氧代戊基)(2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯，收率22.77％。
实施例3
式(Ⅰ-3)可电离脂质化合物的化学反应式为：
式(Ⅰ-3)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
步骤(1)和(2)同实施例1，制备得到8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(1b)，将实施例1步骤(3)中的1-溴代庚烷替换为1-溴代辛烷(3g，15.63mmol)，制备得到中间体3c(1.5g，7.5mmol)，步骤(4)中的1c替换成3c，制备得到中间体3d(1.2g，3.19mmol)，步骤(5)中的1d替换成3d，制备得到白色油状液体0.37g，即为8-((6-((4-(辛氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-6-氧代己基)(2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯，收率22.16％。
实施例4
式(Ⅰ-4)可电离脂质化合物的化学反应式为：
式(Ⅰ-4)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
步骤(1)和(2)同实施例1，制备得到8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(1b)，将实施例1步骤(3)中的1,4-丁烯二醇替换为(Z)-1,4-丁烯二醇(6.88g，78.18mmol)、1-溴代庚烷替换为1-溴代辛烷(3g，15.63mmol)，制备得到中间体4c(2.3g，11.50mmol)，步骤(4)中的6-溴己酸替换为5-溴戊酸(3.12g，17.24mmol)、1c替换成4c，制备得到中间体4d(1.03g，2.85mmol)，步骤(5)中的1d替换成4d，制备得到白色油状液体0.48g，即为(Z)-8-((5-((4-(辛氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-5-氧代戊基)(2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯，收率32.43％。
实施例5
式(Ⅰ-5)可电离脂质化合物的化学反应式为：
式(Ⅰ-5)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
步骤(1)和(2)同实施例1，制备得到8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(1b)，将实施例1步骤(3)中的1,4-丁烯二醇替换为
(Z)-1,4-丁烯二醇(6.88g，78.18mmol)，制备得到中间体5c，步骤(4)中的6-溴己酸替换为5-溴戊酸(3.12g，17.24mmol)、1c替换成5c(2.4g，12.77mmol)，制备得到中间体5d(0.99g，2.84mmol)，步骤(5)中的1d替换成5d，制备得到白色油状液体0.32g，即为(Z)-8-((5-((4-(庚氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-5-氧代戊基)(2-羟乙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯，收率22.07％。
实施例6
式(Ⅰ-6)可电离脂质化合物的化学反应式为：
式(Ⅰ-6)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
步骤(1)同实施例1，制备得到8-溴辛酸十七碳-9-基酯(1a)，将实施例1步骤(2)中的乙醇胺替换为3-氨基-1-丙醇(6.70g，89.20mmol)，制备得到中间体6b，将实施例1步骤(5)中的1b替换成6b、1d替换成实施例2制备得到的2d，制备得到白色油状液体0.23g，即为8-
((5-((4-(庚氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-5-氧代戊基)(3-羟基丙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯，收率10.49％。
实施例7
式(Ⅰ-7)可电离脂质化合物的化学反应式为：
式(Ⅰ-7)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
步骤(1)和(2)同实施例6的步骤(1)和(2)相同，制备得到中间体6b，步骤(3)同实施例3的步骤(3)，制备得到中间体3c，将实施例3步骤(4)中的5-溴戊酸替换为6-溴己酸，制备得到中间体7d，将实施例3步骤(5)中的中间体3d替换成7d、1b替换成6b，制备得到白色油状液体0.48g，即为8-((5-((4-(辛氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-5-氧代戊基)(3-羟基丙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯，收率32.21％。
实施例8
式(Ⅰ-8)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
步骤(1)和(2)同实施例6的步骤(1)和(2)相同，制备得到中间体6b，步骤(3)-(4)同实施例3的步骤(3)和(4)，制备得到中间体3d，将实施例3步骤(5)中的1b替换成6b，制备得到白色油状液体0.43g，即为8-((6-((4-(辛氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-6-氧代己基)(3-羟基丙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(Ⅰ-8)，收率28.86％。
实施例9
式(Ⅰ-9)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
步骤(1)和(2)同实施例6的步骤(1)和(2)相同，制备得到中间体6b，步骤(3)和(4)同实施例5步骤(3)和(4)相同，制备得到中间体5d，将实施例5步骤(5)中的1b替换成6b，制备得到白色油状液体0.2g，即为(Z)-8-((5-((4-(庚氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-5-氧代戊基)(3-羟基丙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(Ⅰ-9)，收率13.70％。
实施例10
式(Ⅰ-10)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
步骤(1)和(2)同实施例6的步骤(1)和(2)相同，制备得到中间体6b，步骤(3)和(4)同实施例4步骤(3)和(4)相同，制备得到中间体4d，将实施例4步骤(5)中的1b替换成6b，制备得到白色油状液体0.32g，即为(Z)-8-((5-((4-(辛氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-5-氧代戊基)(3-羟基丙基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(Ⅰ-10)，收率21.20％。
实施例11
式(Ⅰ-11)可电离脂质化合物的化学反应式为：
式(Ⅰ-11)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
步骤(1)同实施例1的步骤(1)，制得8-溴辛酸十七碳-9-基酯(1a)，步骤(2)是将实施例1步骤(2)中的乙醇胺替换为4-氨基-1-丁醇(6.28g，70.56mmol)，制备得到中间体11b，步骤(3)和(4)同实施例4的步骤(3)和(4)，制备得到中间体4d，将实施例4步骤(5)中的1b替换成11b，制备得到白色油状液体0.4g，即为(Z)-的8-((5-((4-(辛氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-5-氧代戊基)(4-羟基丁基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯，收率27.78％。
实施例12
式(Ⅰ-12)可电离脂质化合物的化学反应式为：
式(Ⅰ-12)可电离脂质化合物的制备方法，具体包括有以下步骤：
步骤(1)和(2)同实施例11的步骤(1)和(2)相同，制备得到中间体11b(0.9g，1.92mmol)，步骤(3)与实施例4的步骤(3)相同，制备得到中间体4c(2g，5.32mmol)，步骤(4)将实施例4步骤(4)中的5-溴戊酸替换为6-溴己酸，制备得到中间体12d(1.01g，2.69mmol)，步骤(5)是将实施例11步骤(5)中的中间体4d替换成12d，制备得到白色油状液体0.2g，即为(Z)-8-((6-((4-(辛氧基)丁-2-烯-1-基)氧基)-6-氧代己基)(4-羟基丁基)氨基)辛酸十七碳-9-基酯(Ⅰ-12)，收率13.61％。
实施例1-实施例12制得可电离脂质化合物的质谱和核磁氢谱参数见下表1。
表1
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脂质纳米颗粒的制备：
将实施例1-12制备的可电离脂质化合物、胆固醇、DMG-PEG、DOPE按照33:44:1:22的摩尔比溶于乙醇中，制备脂质乙醇溶液(其中可电离脂质的浓度为10mg/mL)。使用柠檬酸盐或醋酸钠缓冲液(pH＝3-5)将CD19核酸mRNA稀释至0.2mg/mL。利用NanoAssemblr微流控设备将脂质乙醇溶液和mRNA溶液以体积比为1:5到1:1的比例快速混合制备得到含有脂质纳米颗粒的溶液。溶液通过超滤和透析的手段纯化除去乙醇后，得到脂质纳米颗粒。
脂质纳米颗粒体外递送效率及安全性评估：
本实验选用CD19-mRNA作为核酸药物mRNA，在RAW-ISG细胞检测12个LNP的mRNA转染效率，具体操作方法如下：取对数生长期的RAW-ISG细胞按照10*104/孔的密度接种于装有DMEM培养基24孔板上并在细胞培养箱中培养过夜，37℃培养24小时后采用流式细胞仪检测CD19阳性细胞比例。以已上市可电离脂质Dlin-MC3-DMA(MC3)、SM-102作为阳性对照。由表2结果可知，本发明实施例1-12制得的可电离脂质化合物制备的脂质纳米颗粒能够转染表达CD19的mRNA至RAW-ISG细胞，其中化合物(Ⅰ-1)转染效率最佳。同时，24小时后对于平行的脂质纳米颗粒处理的细胞组应用CCK-8试剂进行细胞毒性的测试。试验中以仅加入PBS的细胞组为阴性对照。具体步骤如下：在细胞中加入CCK-8溶液后，于37℃细胞培养箱中静置4小时，于多功能酶标仪在吸收光波段为450nm的条件下读取吸光值。将经过纳米颗粒处理过的细胞读取吸光值与阴性对照的吸光值的比值作为细胞存活率的表征参数。
由实施例1-12制备的纳米颗粒在体外细胞水平上的递送效果以及毒性数据如表2所示。
表2
综上所述，本发明通过引入双键，改进可电离脂质分子的结构，得到一类新型的可电离脂质化合物，随后与磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质组合制成12种LNP。通过体外实验表明，该发明实施例1制得化合物(Ⅰ-1)的体外递送效率比已上市产品DLin-MC3-DMA更高(见图1)。大部分可电离脂质分子细胞毒性基本与MC3相当，且都低于SM-102(见图2)。除了化合物(Ⅰ-4)，所有可电离脂质化合物的免疫原性都显著低于SM-102(见图3)。以上数据证实了本发明实例在mRNA药物递送上的高效性与低毒性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种可电离脂质化合物，其特征在于：结构式如下通式(Ⅰ)所示：
通式(I)中，R1选自未取代的C2-C6亚烷基，R2选自C2-C8亚烷基，R3选自(Z,E)-C4亚烯基或Z构型的C4亚烯基，R4选自C5-C9烷基。
2.根据权利要求1所述的一种可电离脂质化合物，其特征在于：所述的R1选自未取代的C2亚烷基、C3亚烷基或C4亚烷基，R2选自C3亚烷基或C4亚烷基，R4选自C7烷基或C8烷基。
3.根据权利要求2所述的一种可电离脂质化合物，其特征在于：所述的可电离脂质化合物的结构式选自下式(Ⅰ-1)-(Ⅰ-12)：
4.根据权利要求1所述的一种可电离脂质化合物的制备方法，其特征在于：制备可电离脂质化合物的化学反应式见下式：
5.根据权利要求4所述的一种可电离脂质化合物的制备方法，其特征在于：具体包括有以下步骤：将通式(Ⅱ)的化合物加入到有机溶剂中，并在碱性条件下加入通式(Ⅲ)的化合物和催化剂，在60-80℃下、反应2-5h后，对反应液进行后处理，得到可电离脂质化合物。
6.根据权利要求5所述的一种可电离脂质化合物的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或两种以上的组合；所述的碱性条件是由碳酸钾、碳酸钠和碳酸铯中的一种碱性化合物或两种以上的碱性组合物提供，碱性化合物或碱性组合物与通式(Ⅱ)化合物的摩尔比为1:2-3；所述的催化剂选自碘化钾或碘化钠，催化剂和通式(Ⅱ)化合物的摩尔比为1:0.2-1；
所述的后处理的具体步骤为：将反应液中的溶剂旋干后，向反应液中加入饱和NaCl水溶液，并用乙酸乙酯萃取，萃取的有机相经无水硫酸钠干燥、减压蒸干、硅胶柱层析色谱分离得到可电离脂质化合物；其中，硅胶柱层析色谱分离所用洗脱剂为甲醇和乙酸乙酯的混合液，甲醇和乙酸乙酯的体积比为1:20。
7.根据权利要求1所述的一种可电离脂质化合物组成的脂质纳米颗粒，其特征在于：所述的脂质纳米颗粒是由可电离脂质、磷脂、聚乙二醇脂质和胆固醇组成。
8.根据权利要求7所述的脂质纳米颗粒在作为核酸药物递送载体方面的应用。
9.根据权利要求8所述的脂质纳米颗粒组成的核酸药物组合物，其特征在于：所述的核酸药物组合物包括核酸药物和作为核酸药物递送载体的脂质纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的核酸药物组合物，其特征在于：所述的核酸药物为siRNA、mRNA、tRNA、质粒DNA或microRNA。
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