CN118078890A - 黄秋葵桃仁中药组合物在制备预防和/或治疗马兜铃酸肾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体涉及黄秋葵桃仁中药组合物在制备预防和/或治疗马兜铃酸肾病药物中的应用。黄秋葵桃仁中药组合物在用于前述疾病治疗方面，具备显著的降低马兜铃酸肾病肾损伤炎症的作用，是潜在的防治马兜铃酸肾病中药，有望减轻马兜铃酸肾病的全球负担，对于治疗并防治马兜铃酸肾病进展具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及黄秋葵桃仁中药组合物在制备预防和/或治疗马兜铃酸肾病药物中的应用。
背景技术
马兜铃酸(AAs)是存在于马兜铃科植物中结构相似的硝基菲羧酸类化合物，广泛存在于马兜铃属和细辛属植物中。马兜铃酸肾病(AAN)是因服用含有AAs成分的药物而造成的急、慢性肾小管间质疾病，表现为肾小管变性、萎缩、坏死和广泛的肾间质纤维化。尽管近年来人们对含AAs中草药肾毒性认识不断提高，然而仍有新发的AAN病例不断出现；且AAN进展迅速，即使停止使用含AAs药物后病情依然进展。
马兜铃酸肾病的确切发病机制仍不明确。现有研究表明，马兜铃酸主要损伤肾小管上皮细胞，但不同剂量马兜铃酸损伤肾小管、导致间质纤维化的机制并不相同：大剂量马兜铃酸直接引起急性肾小管上皮细胞坏死，并进而发生肾间质纤维化。长期小剂量摄入马兜铃酸(累积剂量大)则通过诱导上皮细胞转分化及马兜铃酸代谢产物马兜铃酰胺与细胞DNA形成AA-DNA加合物等机制导致肾小管损伤和肾间质纤维化。不论急性或慢性马兜铃酸肾病，目前均无有效的治疗方法，主要以预防为主。
申请人的专利CN 2023102279916公开了一种主要用于治疗慢性肾脏病的中药组合物，表现在改善或降低慢性肾脏病患者蛋白尿症状。大剂量马兜铃酸引起的马兜铃酸肾病一般表现为急性肾损伤，相关肾损伤持续数月易发展为慢性肾脏病及其他肾损害，因此，急性马兜铃酸肾病发展为慢性肾脏病的风险较大。临床上，马兜铃酸肾病和慢性肾功能损伤症状有类似，容易误诊，但其和慢性肾脏病属于完全不同的肾脏方面的疾病类型，病因、发病机制、病理及治疗思路不同。若能在急性马兜铃酸肾病期进行有效控制治疗，有望降低其进一步发展为慢性肾脏病的风险。
本次申请以专利CN 2023102279916公开的QT1样品1#工艺所制备样品为研究对象，研究其对马兜铃酸诱导的斑马鱼马兜铃酸肾病模型的影响，考察该中药组合物对马兜铃酸肾病的治疗价值和功效。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了黄秋葵桃仁中药组合物在制备预防和/或治疗马兜铃酸肾病药物中的应用。表明黄秋葵桃仁中药组合物在用于该疾病治疗方面，具备显著的降低马兜铃酸肾病肾损伤炎症的作用，是潜在的防治马兜铃酸肾病中药，有望减轻马兜铃酸肾病的全球负担，对于治疗并防治马兜铃酸肾病进展具有重大意义。
本发明提供了如下技术方案：
黄秋葵桃仁中药组合物在制备预防和/或治疗马兜铃酸肾病药物中的应用。
进一步地，所述马兜铃酸肾病为急性马兜铃酸肾病。
进一步地，黄秋葵桃仁中药组合物的活性成分由以下重量份的原料制成：黄秋葵30份、桃仁1份。
进一步地，黄秋葵桃仁中药组合物能够显著上调马兜铃酸斑马鱼肾病模型Nephrin、PPARγ基因表达，并显著下调IL-6、TNF-α炎症因子。表明本发明黄秋葵桃仁中药组合物能够显著改善马兜铃酸肾病模型的炎症与细胞凋亡的发生，使肾脏中转录因子基因表达水平基本恢复到正常状态，对治疗马兜铃酸肾病具有积极效果。
本发明的有益效果包括但不限于：
本发明黄秋葵桃仁中药组合物用于马兜铃酸肾病的治疗，具备显著的降低马兜铃酸肾病肾损伤炎症的作用，是潜在的防治马兜铃酸肾病的中药，有望减轻马兜铃酸肾病的全球负担，对于治疗并防治马兜铃酸肾病进展具有意义重大。
本发明所用模型动物斑马鱼是一种和哺乳动物有着相似生物结构和功能的实验动物，因其具有体积小、易饲养、发育快速、繁殖力强、便于观察等优势，广泛应用于医药研究领域。本发明用马兜铃酸处理发育早期的斑马鱼，会引起仔鱼水肿、眼距增宽、卵黄囊吸收缓慢等肾功能异常表征，另外在利用马兜铃酸进行处理造成斑马鱼肾脏损伤的基础上，加用黄秋葵桃仁中药组合物进行干预，研究结果发现，黄秋葵桃仁中药组合物能够较好的预防及减轻马兜铃酸造成的肾损伤，可用于防治马兜铃酸肾病，尤其急性马兜铃酸肾病。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为7.5μM马兜铃酸造模后各组斑马鱼显微镜下背面观察的眼间距离、卵黄囊吸收情况及眼肿情况；
图2为7.5μM马兜铃酸造模后各组斑马鱼显微镜下侧面观察的卵黄囊吸收情况及眼肿情况；
图3为本发明样品在0.25mg/ml浓度下活性评价柱状图；
图4为在7.5μM马兜铃酸造模下，各组的马兜铃酸肾病炎症相关基因表达情况。
其中，图1中A为眼间距离、B为卵黄囊吸收情况、E为眼肿情况；
图3中A为卵黄囊吸收活性评价，B为眼距活性评价；图3中##表示模型组与空白组相比具有极显著性差异(P<0.01)，***表示HKC阳性药物组、本发明样品组与马兜铃酸模型组相比具有极显著性差异(P<0.001)；
图4中A为各组Nephrin表达情况，B为各组IL-6表达情况，C为各组TNF-α表达情况，D为各组PPARγ表达情况；图4中Ctl表示空白对照组，##表示模型组与空白组相比具有极显著性差异(P<0.001)，***表示阳性药物组、样品组与模型组相比具有极显著性差异(P<0.001)。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。
1、材料与仪器
1.1材料
健康巨噬细胞荧光转基因斑马鱼(Tg:zlyz-EGFP)为山东省科学院生物研究所斑马鱼药物筛选平台提供。黄秋葵桃仁中药组合物样品(批号：QT-3，本发明样品)由山东宏济堂制药集团股份有限公司提供；采用申请人已有专利CN 2023102279916公开的QT1样品1#工艺所制备。
1.2 SZX16型荧光显微镜及DP2-BSW图像采集系统(日本Olympus公司)；X51型倒置显微镜(日本Olympus公司)；Forma 3111型水套式CO2培养箱(美国Forma公司)；斑马鱼养殖饲养设备(北京爱生科技公司)。
2、斑马鱼胚胎获取
♀♂斑马鱼分开喂养，照明14h/黑暗10h交替进行，定时喂以人工颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体(Artemia nauplii)。采卵时取健康性成熟的斑马鱼按♀♂1:2或2:2的比例放入交配缸内，次日10-11时获得受精卵。对受精卵进行消毒和洗涤后移入斑马鱼胚胎培养用水(含5.0mM NaCl，0.17mM KCl，0.4mM CaCl2，0.16mM MgSO4)中，28℃下控光培养。
3、造模药浓度筛选与样品浓度依赖检测及表型
在受精卵发育4dpf(days post fertilization)时，在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入24孔培养板中，每孔10枚，每次每组两个重复孔。设置空白组、模型组、阳性药物组和样品(黄秋葵桃仁中药组合物)组，除空白组外，均加入相同剂量马兜铃酸造模。
阳性药物组加入不同剂量黄葵胶囊内容物(HKC)，样品组加入不同剂量的黄秋葵桃仁中药组合物样品，空白组和模型组不需加药物，各组分别加培养水至2.0mL。然后将24孔板置于光照培养箱(28℃)处理24h，然后放于0.8％的低融点琼脂溶液内，显微镜下调整仔鱼体位，分别从侧面和背面观察仔鱼表型有无异常变化，观察仔鱼有无局部或全身水肿，并拍照。
观察：死亡情况、眼距以及卵黄囊吸收情况。参见下表1。
表1 10μM马兜铃酸造模样品浓度依赖结果
以上表1结果显示，马兜铃酸工作液浓度为10μM时，斑马鱼模型组幼鱼全部死亡，阳性对照组及本发明样品组出现不同程度死亡或畸形。表明药物在一定程度上能减轻马兜铃酸急性毒性，降低死亡率，且相同浓度下(0.25mg/ml)本发明样品(半致死)效果优于HKC阳性组(全部死亡)。
表2 7.5μM马兜铃酸造模样品浓度依赖结果
以上表2结果显示，马兜铃酸工作液浓度为7.5μM时，斑马鱼模型组幼鱼死亡率低于50％，且无严重畸形，表明造模成功。HKC阳性组(0.5mg/ml)与本发明样品组(0.25、0.5mg/ml)对斑马鱼畸形均有明显效果，且相同浓度下，本发明样品组效果显著优于HKC阳性组。
参见图1，为7.5μM马兜铃酸造模后各组斑马鱼眼间距离、卵黄囊吸收情况及眼肿情况观察。从图中可以看出，与Ctl空白组相比，模型组斑马鱼马兜铃酸处理后，眼部明显水肿、眼距明显增宽、卵黄囊较大，吸收异常。本发明样品组QT-3斑马鱼形态与Ctl空白组相近，表明本发明样品能够大大减轻斑马鱼马兜铃酸肾病模型的畸形表征。
下表3和表4分别是对马兜铃酸肾病模型进行眼距活性评价和卵黄囊吸收活性评价结果。
表3马兜铃酸肾病模型眼距活性评价
注：##表示模型组与空白组相比具有极显著性差异(P<0.01)，***表示HKC阳性药物组、本发明样品组与马兜铃酸模型组相比具有极显著性差异(P<0.001)。
表4马兜铃酸肾病模型卵黄囊吸收活性评价
注：##表示模型组与空白组相比具有极显著性差异(P<0.01)，***表示HKC阳性药物组、本发明样品组与马兜铃酸模型组相比具有极显著性差异(P<0.001)。
本发明样品在0.25mg/ml浓度下活性评价结果如图3所示。由图3中A可知，模型组与空白组相比具有极显著性差异(P<0.01)；图3中B可知，HKC阳性药物组、本发明样品组与马兜铃酸模型组相比具有极显著性差异(P<0.001)。
结论：马兜铃酸A工作液为10uM时，斑马鱼模型组幼鱼全部死亡。7.5uM浓度死亡率低于50％，且无严重畸形。故选用7.5uM作为马兜铃酸A造模浓度，建立急性马兜铃酸肾病模型。此造模浓度下，黄葵胶囊工作液为0.25mg/mL时，斑马鱼幼鱼出现卵黄囊吸收缓慢、心包水肿等现象；黄葵胶囊工作液为0.5mg/mL及本发明样品工作液为0.25、0.5mg/mL时，斑马鱼幼鱼无死亡现象，且对于眼部水肿、眼距、卵黄囊吸收情况均有较好效果。
4、马兜铃酸造模情况下药物对斑马鱼马兜铃酸肾病炎症基因表达的影响
在受精卵发育3dpf(days post fertilization)时，在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入12孔培养板中，每孔15枚，每次每组两个重复孔。设置空白组、模型组、阳性药物组和样品组，除空白组外均加入相同剂量马兜铃酸。
阳性药物组加入黄葵胶囊内容物(HKC)，样品组加入不同剂量的本发明样品，空白组和模型组不需加药物，各组分别加培养水至4.0mL。然后将24孔板置于光照培养箱(28℃)让胚胎继续发育。孵育24h后，进行收样、总RNA的提取、反转录合成cDNA，最后进行目的基因表达检测。
如图4中A所示，在7.5μM马兜铃酸A造模下，与空白对照组(Ctl)相比，模型组Nephrin水平显著降低，说明急性马兜铃酸肾病模型造模成功；与模型组相比，本发明给药组的Nephrin表达上调，并呈现浓度依赖性，随着浓度的增加0.25、0.5mg/ml时，呈现显著性升高，表明本发明样品在0.25、0.5mg/ml能有效调控斑马鱼马兜铃酸肾病模型的炎症反应，对马兜铃酸肾病有积极治疗效果。且通过与阳性药物组比较，本发明样品在浓度0.25、0.5mg/ml时，具备与阳性药物组相比，更明显的上调Nephrin的效果。
如图4中B所示，与空白对照组(Ctl)相比，模型组IL-6水平显著升高，说明急性马兜铃酸肾病模型造模成功；与模型组相比，本发明给药组的IL-6表达下调，并呈现浓度依赖性，随着浓度的增加，在0.5mg/ml时呈现显著性降低，表明本发明样品在0.5mg/ml能有效抑制斑马鱼马兜铃酸肾病模型的炎症反应，对马兜铃酸肾病有一定的治疗效果。与阳性药物组比较，本发明样品在浓度0.5mg/ml时，下调IL-6表达的效果略次。
如图4中C所示，与空白对照组(Ctl)相比，模型组TNF-α水平显著升高，说明急性马兜铃酸肾病模型造模成功；与模型组相比，本发明给药组的TNF-α表达下调，并呈现浓度依赖性，表明本发明样品在0.125、0.25、0.5mg/ml能有效调控斑马鱼马兜铃酸肾病模型的炎症反应，对马兜铃酸肾病有积极治疗效果。且通过与阳性药物组比较，本发明样品在浓度0.25、0.5mg/ml时，具备与阳性药物组相比，更明显的下调TNF-α的效果。
如图4中D所示，在7.5μM马兜铃酸A造模下，与空白对照组(Ctl)相比，模型组PPARγ水平显著降低，说明急性马兜铃酸肾病模型造模成功；与模型组相比，本发明给药组的PPARγ表达上调，并在0.125、0.25mg/ml时呈现显著性升高，表明本发明样品在0.125、0.25mg/ml能更有效调控斑马鱼马兜铃酸肾病模型的炎症反应，对马兜铃酸肾病有积极治疗效果。且通过与阳性药物组比较，本发明样品在浓度0.125、0.25mg/ml时，具备与阳性药物组相比，更明显的上调PPARγ的效果。
结论：以上研究表明，本发明样品组能够显著上调急性马兜铃酸斑马鱼肾病模型Nephrin、PPARγ基因表达，并显著下调IL-6、TNF-α炎症因子。表明本发明样品能够显著改善急性马兜铃酸肾病炎症与细胞凋亡的发生，使肾脏中转录因子基因表达水平基本恢复到正常状态，通过显著降低肾损伤炎症的作用，实现有效预防和/或治疗马兜铃酸肾病的目的。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (4)
1.黄秋葵桃仁中药组合物在制备预防和/或治疗马兜铃酸肾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述马兜铃酸肾病为急性马兜铃酸肾病。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，黄秋葵桃仁中药组合物的活性成分由以下重量份的原料制成：黄秋葵30份、桃仁1份。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，黄秋葵桃仁中药组合物能够显著上调马兜铃酸斑马鱼肾病模型Nephrin、PPARγ基因表达，并显著下调IL-6、TNF-α炎症因子。
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