CN118076749A - 原位表观转录组分析 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于分析细胞中表观转录组RNA修饰的方法、组合物和系统。本公开还提供了用于分析细胞中一种或多种感兴趣的RNA与RNA结合蛋白之间相互作用的方法(例如，在感兴趣的RNA上引入表观转录组修饰的蛋白质)。本公开还提供了用于诊断受试者的疾病或病症的方法，该方法基于细胞(包括完整组织内的细胞)中表观转录组RNA修饰的分析或RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的分析。本公开还提供了筛选或测试能够调节一种或多种RNA的表观转录组修饰或一种或多种RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用的候选试剂的方法。本公开还提供了用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法。本公开还描述了包含可用于进行本文所述方法的寡核苷酸部分的探针对和探针组。另外，本公开提供了包含本文描述的任何探针的试剂盒。
Description
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求享有2021年8月10日提交的美国临时申请U.S.S.N.63/231,585的优先权，其通过引用并入本文。
背景技术
细胞RNA含有丰富的酶催化修饰化学库(即，表观转录组)(Roundtree,I.A.etal.,Dynamic RNAmodifications in gene expression regulation.Cell 169,1187(2017))。模式生物的遗传分析表明，RNA修饰酶对于高等真核生物至关重要。此外，RNA修饰途径已被确定可以调节细胞命运、器官发育和人类疾病(例如，癌症)(Jonkhout,N.et al.,The RNA modification landscape in human disease.RNA 23,1754(2017)；Li,X.etal.,Epitranscriptome sequencing technologies:decoding RNAmodifications.Nature Methods 14,23(2017))。然而，对这些表观转录组修饰如何影响复杂生物系统中细胞功能的理解仍然有限。这是因为传统的RNA修饰分析依赖于使用批量RNA测序或质谱法的数百万个细胞的混合物(Li,X.et al.,Epitranscriptome sequencingtechnologies:decoding RNA modifications.Nature Methods 14,23(2017))。然而，最近通过单细胞测序方法进行的研究表明，多细胞生物由不同的细胞类型组成，甚至表面上同质的细胞群也具有可变的单细胞状态。此外，相同类型的RNA修饰可能具有相反的调节作用，具体取决于细胞类型和生理环境。虽然单细胞RNA测序技术已经为转录组分析带来了变革，但表观转录组研究中单细胞分辨率和亚细胞分辨率的缺乏掩盖了生物组织中RNA修饰模式的异质性，并削弱了剖析RNA修饰如何跨越不同的细胞类型调节基因表达的能力。因此，需要用于以单细胞分辨率和/或亚细胞分辨率分析表观转录组RNA修饰的系统。
发明概述
为了解决与先前开发的单细胞RNA测序方法相关的局限性，开发了用于RNA修饰三维(3D)原位测序的平台，以及分析RNA和安装此类RNA修饰的蛋白质之间相互作用的平台(图1、10A、12A、13A和13C)。这些平台可用于在完整生物组织中以单细胞甚至亚细胞分辨率分析RNA修饰介导的基因调控机制。表观转录组RNA修饰(例如，N6-甲基腺苷(m6A))因此可被分析，以及RNA结合蛋白(例如，安装表观转录组RNA修饰的酶)和RNA之间的相互作用。本文公开的方法、探针、组合物和系统广泛适用于分析各种组织中的各种表观转录组RNA修饰或RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用。这些方法和系统也可用于研究各种细胞类型中的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白如何相互作用以定义细胞状态，并例如，调节脑功能(Widagdo,J.et al.,The m6A-epitranscriptomic signature in neurobiology:fromneurodevelopment to brain plasticity.Journal of Neurochemistry 147,137(2018))。本文描述的方法、组合物和系统也可用于在复杂的生物系统中以单细胞或亚细胞分辨率(大约150-400nm空间分辨率，取决于DNA扩增子的大小和光学极限)建立转录后基因调控机制的新原理，以及发现RNA化学指纹(表观转录组RNA修饰)在健康和疾病中的作用。本文描述的方法、组合物和系统还可以用于存在于完整组织(例如，由人类或非人类受试者提供的或来自人类或非人类受试者的组织样品，例如活检)内的细胞。
因此，一方面，本公开提供了用于分析一个或多个细胞中的表观转录组RNA修饰的方法、组合物和系统(参见，例如，图1、10A和12A)。在本文公开的方法和系统中，细胞可以与一个或多个探针对或探针组接触，其在本文中进一步描述并且可以用于扩增(例如，通过滚环扩增)感兴趣的表观转录组修饰的RNA，以产生一个或多个串联的扩增子。然后可以将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中并进行测序以确定转录本的身份及其在聚合物基质内的位置(例如，通过SEDAL测序(通过动态退火和连接的误差减少的测序)，如本文进一步描述的)。使用修饰的感兴趣的转录本的位置，可以对包含至少一种表观转录组修饰的感兴趣的RNA进行分析，并且可以获得时空信息以增进对健康和疾病中表观转录组修饰、亚细胞定位和时间如何影响细胞功能的理解。该方法和系统可用于比较例如来自患病和健康组织样品的细胞(或多个细胞)中的表观转录组RNA修饰；或在例如用试剂(例如，治疗剂或潜在的治疗剂，例如小分子、蛋白质、肽、核酸、脂质或碳水化合物)处理的细胞和未处理的细胞，或患病细胞和健康细胞中用于比较表观转录组RNA修饰。
在一些实施方案中，本公开提供了用于分析细胞中表观转录组RNA修饰的方法，包括以下步骤:
a)使细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针(即，“挂锁探针”)、第二探针(即，“夹板探针”)和第三探针(即，“引物探针”)，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每个感兴趣的RNA的独特序列，例如，通过如本文所讨论的SEDAL测序)、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子进行测序，以确定细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置。
在一些实施方案中，本公开提供了用于分析细胞中表观转录组RNA修饰的方法，包括以下步骤:
a)使细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包括第一探针(即，“挂锁探针”)和第二探针(即，“引物探针”)，其中:
i)第一探针包含与第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每个感兴趣的RNA的独特序列，例如通过如本文所讨论的SEDAL测序)；和
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置。在某些实施方案中，其中仅两个探针用于本文的方法中，不使用夹板探针。
因此，这些方法可用于确定细胞或细胞群内(例如，在完整的组织中)，或细胞的细胞器内用一种或多种感兴趣的表观转录组修饰修饰的感兴趣的RNA的位置。在一些实施方案中，使用本文描述的方法对超过1个、超过2个、超过3个、超过4个、超过5个、超过10个、超过20个、超过30个、超过40个、超过50个、超过100个、超过200个、超过500个、超过1000个、超过2000个或超过3000个感兴趣的RNA同时进行分析。在一些实施方案中，表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6Am)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。
另一方面，本公开提供了用于分析一个或多个细胞中或亚细胞位置例如一个或多个特定细胞器中RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的方法、探针、组合物和系统(参见，例如，图13A和13C)。在本文公开的方法和系统中，细胞可以与一个或多个探针对或探针组接触，其在本文中进一步描述并且可以用于扩增(例如，通过滚环扩增)与RNA结合蛋白结合的感兴趣的RNA，以产生一个或多个串联的扩增子。然后可以将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中并进行测序以确定转录本的身份及其在聚合物基质内的位置(例如，通过SEDAL测序(通过动态退火和连接的误差减少的测序)，如本文进一步描述的)。使用修饰的感兴趣的转录本的位置，可以对与至少一种RNA结合蛋白结合的感兴趣的RNA进行分析，并且可以获得时空信息以增进对健康和疾病中RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用、这种相互作用的亚细胞位置以及这种相互作用的时间如何影响细胞功能的理解。该方法和系统可在例如来自患病和健康组织样品的细胞(或多个细胞)中用于比较RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用；或者在例如用试剂(例如，治疗剂或潜在的治疗剂)处理的细胞和未处理的细胞，或患病细胞和健康细胞中用于比较RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用。
在一些实施方案中，本公开提供了用于分析细胞中RNA结合蛋白与一种或多种感兴趣的RNA之间的相互作用的方法，该方法包括:
a)使细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针(即，“挂锁探针”)、第二探针(即，“夹板探针”)和第三探针(即，“引物探针”)，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每种感兴趣的RNA的独特序列，例如，通过如本文所讨论的SEDAL测序)、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中由RNA结合蛋白结合的每个感兴趣的RNA的身份和位置。
因此，这些方法可用于在细胞或细胞群内(例如，在完整的组织中)，或在细胞的细胞器内确定与一种或多种RNA结合蛋白(例如，安装表观转录组RNA修饰的酶)结合的感兴趣的RNA的位置。
本文描述的方法、组合物和系统可用于研究组织(例如、发育组织、正常组织、患病组织、治疗组织)中的表观转录组RNA修饰和RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用，用于诊断和治疗各种疾病、用于研究目的和用于药物发现。因此，一方面，本公开提供了用于诊断受试者的疾病或病症的方法。例如，用于分析本文所述的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的方法可以在取自受试者(例如，被认为患有或有风险患有疾病或病症的受试者，或者健康或被认为是健康的受试者)的一个细胞或多个细胞上进行。然后可以将细胞中各种表观转录组修饰的感兴趣的RNA或与RNA结合蛋白结合的感兴趣的RNA的表达与非患病细胞或来自非患病组织样品的细胞(例如，来自健康个体的细胞，或来自健康个体群体的多个细胞)中的相同修饰的感兴趣的RNA的表达进行比较。细胞的表观转录组RNA修饰分析或细胞中RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的分析相对于一种或多种非患病细胞的任何差异(包括感兴趣的单个RNA或多个RNA，例如，特定疾病特征)，可以指示受试者患有疾病或病症。一种或多种非患病细胞(例如，正常细胞)中的表观转录组RNA修饰和/或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用可作为对照实验与患病细胞中的表达一起进行分析。一种或多种非患病细胞(例如，正常细胞)中表观转录组RNA修饰和/或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用先前也可能已经进行了分析，并且对患病细胞的分析可与非患病细胞的该参考数据进行比较。
另一方面，本公开提供了筛选能够调节一种或多种感兴趣的RNA的表观转录组修饰或RNA结合蛋白与一种或多种感兴趣的RNA之间的相互作用的试剂的方法。例如，用于分析本文所述的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的方法可以在存在一种或多种候选试剂的情况下在细胞中进行。然后，可以将细胞中各种表观转录组修饰的感兴趣的RNA的表达和/或细胞中RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的分析(例如，正常细胞或患病细胞)与未暴露于一种或多种候选试剂的细胞中相同修饰的感兴趣的RNA或由RNA结合蛋白结合的RNA的表达进行比较。表观转录组RNA修饰分析或RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的分析相对于未暴露于一种或多种候选试剂的细胞的任何差异都可能表明一种或多种感兴趣的RNA的表观转录组修饰受到一种或多种候选试剂的调节。在一些实施方案中，已知与疾病治疗相关的特定特征(例如，多个表观转录组修饰的感兴趣的RNA、或RNA结合蛋白与多个感兴趣的RNA之间的相互作用)可用于鉴定能够以期望的方式调节表观转录组RNA修饰和/或RNA结合蛋白与RNA之间相互作用，从而治疗疾病的试剂。本文描述的方法和系统还可用于，例如，当用候选试剂或已知药物(或多种候选试剂和/或已知药物的组合，例如，如化合物筛选文库中提供的)处理一个或多个细胞时，通过寻找特定的表观转录组RNA修饰特征或RNA结合蛋白-RNA相互作用特征，来鉴定具有某些副作用的药物。本文描述的方法和系统还可用于鉴定可用于研究表观转录组修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的基础生物学的研究试剂或化学探针。
另一方面，本公开提供了用于治疗受试者的疾病或病症的方法。例如，用于分析本文所述的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的方法和系统可以在取自受试者(例如，被认为患有或有风险患有疾病或病症的受试者)的样品的细胞中进行。然后，可以将细胞中表观转录组RNA修饰分析或与一种或多种感兴趣RNA的RNA结合蛋白相互作用的分析与来自非患病组织样品的细胞中的表观转录组RNA修饰分析或与一种或多种感兴趣RNA的RNA结合蛋白相互作用的分析进行比较。如果观察到相对于非患病细胞的表观转录组RNA修饰分析或RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的分析存在任何差异，则可以将疾病或病症的治疗(例如、药剂、手术、放射治疗、外科手术、物理治疗、生活方式的改变等)施用于受试者。一种或多种非患病细胞中的表观转录组RNA修饰和/或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用可以作为对照实验与患病细胞中的表观转录组RNA修饰一起进行分析。一种或多种非患病细胞(例如，正常细胞)中的表观转录组RNA修饰和/或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用先前也可能已经进行了分析，并且可以将患病细胞中的表观转录组RNA修饰和/或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用与非患病细胞的该参考数据进行比较。
另一方面，本公开提供了探针对，其包含第一探针(本文也称为“挂锁”探针)和第二探针(本文也称为“引物”探针)，其中:
i)第一探针包含与第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每种感兴趣的RNA的独特序列，例如通过如本文所讨论的SEDAL测序)；和
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
另一方面，本公开提供了包含第一探针(即，“挂锁探针”)、第二探针(即，“夹板探针”)和第三探针(即，“引物探针”)的探针组，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
另一方面，本公开提供了包含第一探针(即，“挂锁探针”)、第二探针(即，“夹板探针”)和第三探针(即，“引物探针”)的探针组，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
另一方面，本公开提供了试剂盒(例如，包含本文公开的任何探针对或探针组的试剂盒)。在一些实施方案中，试剂盒包含如本文所述的多个探针对或探针组，其中每一个可用于鉴定特定的表观转录组修饰的感兴趣的RNA或特定RNA结合蛋白与感兴趣的RNA之间的相互作用。在某些实施方案中，试剂盒包含多于1对、多于2对、多于3对、多于4对、多于5对、多于10对、多于20对、多于30对、多于40对、多于50对、多于100对、多于200对、多于500对、多于1000对、多于2000对或多于3000对探针。在某些实施方案中，试剂盒包含多于1组、多于2组、多于3组、多于4组、多于5组、多于10组、多于20组、多于30组、多于40组、多于50组、多于100组、多于200组、多于500组、多于1000组、多于2000组、或多于3000组探针。本文所述的试剂盒还可以包括可用于实施本文所述的方法的任何其他试剂或组分，包括但不限于细胞、酶例如连接酶和/或聚合酶、胺修饰的核苷酸、结合RNA修饰的试剂(例如、一抗、二抗、蛋白质、肽、适体、小分子等)缓冲液、试剂(包括染料、染色剂、缓冲液等)和用于制备聚合物基质(例如，聚丙烯酰胺基质)的单体。
另一方面，本公开提供了用于分析细胞中表观转录组RNA修饰的系统。在一些实施方案中，这样的系统包括：
a)细胞(例如、分离的细胞或存在于完整组织内的细胞)；
b)一个或多个探针对，其包含第一探针(即，“挂锁探针”)和第二探针(即，“引物探针”)，其中:
i)第一探针包含与第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每种感兴趣的RNA的独特序列，例如通过如本文所讨论的SEDAL测序)；和
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；和
d)计算机。
在一些实施方案中，本公开提供的系统包括：
a)细胞；
b)一个或多个探针组，其包含第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；和
d)计算机。
在一些实施方案中，本公开提供的系统包括：
a)细胞；
b)一个或多个探针组，其包含第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；和
d)计算机。
本文所述的任何探针(即，探针对、探针组)可用于本公开所考虑的系统中。
应当理解，前述概念和下面讨论的附加概念可以以任何合适的组合来排列，因为本公开在这方面不受限制。此外，当结合附图考虑时，本公开的其他优点和新颖特征将从以下各种非限制性实施方案的详细描述中变得显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步展示本公开的某些方面，这些方面可以通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述更好的理解。
图1提供了原位m6A-修饰的RNA的分析方法的概述。二级抗m6A抗体与可聚合的DNA引物缀合，该引物与位于同一RNA上的挂锁探针退火。然后从共定位的DNA引物和挂锁探针生成功能化cDNA扩增子。然后将化学功能化的cDNA扩增子共价连接到聚丙烯酰胺基质上，以实现组织光学透明和生物分子处理。
图2A-2D显示了m6A RNA修饰的单细胞原位分析的实例。图2A显示了m6A修饰的β-肌动蛋白RNA的检测。图2B-2C提供了几种阴性对照，即，无一抗(图2B)、无DNA缀合的二抗孵育(2C)和无二抗(图2D)。
图3A-3D是显示了通过启用单细胞原位表观转录组分析来解析生物组织中RNA修饰介导的基因调控的方法的图像。图3A显示了对真核生物信使RNA进行的各种化学修饰。所有修饰位点的集合称为表观转录组。图3B提供了显示不同细胞类型、状态和亚细胞位置的表观转录组状态的单细胞异质性的示意图。先前开发的批量转录组或表观转录组分析方法尚未解决这些问题。图3C显示了RNA和RNA修饰的三维(3D)原位测序。DNA缀合的修饰特异性结合剂与RNA序列特异性DNA探针一起使用，探针与细胞mRNA杂交，以选择性地可视化完整组织中修饰的RNA。每个RNA序列特异性探针都包含编码基因身份的条形码，其可通过基于图像的原位测序读出。这种对具有化学修饰状态的RNA的3D高度多重单细胞的定量能够实现细胞类型和表观转录组细胞状态的单细胞发现。图3D显示了解析组织中RNA修饰介导的基因调节，如大脑活动期间RNA修饰的四种可能的变化所例证的。表观转录组模式的转变以及RNA修饰通路的基因表达变化，提供了不同细胞和大脑区域中可能的基因调控方案的信息。原位表观转录组测序还可以与精确的遗传扰动相结合，以充分剖析基因调控机制。
图4提供了示意图，其显示了无法通过批量表观转录组测序方法回答的有关RNA修饰的问题。
图5显示了诱变和非诱变表观转录组RNA修饰的实例。
图6提供了示意图，其显示了m6A在大脑功能中的作用。m6A修饰是可逆的并被调节mRNA生命周期多个步骤的m6A结合蛋白识别。m6A蛋白复合物已发现在突触中富集。m6A通路的改变影响多种生理功能，并与一系列精神疾病相关。
图7提供了3D-m6A-seq方法的示意图。制备好脑组织后，将DNA缀合的m6A特异性结合剂与RNA序列特异性DNA探针在完整组织内一起与细胞mRNA杂交。仅m6A修饰位点酶促复制为cDNA扩增子，而未修饰的RNA则不会被扩增。每个RNA序列特异性探针都包含编码基因身份和m6A位点的条形码，通过原位测序(SEDAL)读出。
图8提供了可以使用RNA修饰的单细胞原位测序进行的四个示例性生物学研究的示意图。(1)使用皮层3D-m6A-seq映射确定m6A甲基化是否具有细胞类型和区域特异性；(2)使用3D-m6A-seq研究神经元培养物(KCl去极化)或小鼠视觉皮层(暗/光调节)的整体刺激，以确定活性调节基因(ARG)在不同细胞类型中是否存在差异表达，以及m6A是否随ARG而变化；(3)使用3D-m6A-seq研究m6A特定经历(例如，急性约束应力)期间的动态来确定是否m6A在不同的大脑区域具有回路偏好和不同的反应；以及(4)单细胞m6A模式的综合分析和m6A通路蛋白(例如、甲基转移酶、去甲基酶和结合蛋白)的基因表达水平来确定哪些因素塑造了表观转录组模式并调节不同细胞类型中的基因表达，以及是否神经刺激期间的m6A依赖性基因调节对于每个神经元来说都是普遍的，或者与大脑中的平均活动相比，其在特定神经回路的特定神经元细胞类型中更加活跃(或更沉默)。
图9A-9D显示了空间表观转录组学的背景和应用。图9A表明m6A及其相关的RNA结合蛋白(RBP)调节多种重要通路。图9B和9C显示了本文提供的方法适用于阐明的表观转录组学中的知识差距。图9D提供了原位单细胞表观转录组学的示意图。
图10A-10E显示了m6A-map v1的设计和原理。图10A显示了m6A-map v1的工作流程。图10B显示了用于合成PAPG-oligo的缀合策略。图10C显示了经由抗体-PAPG-oligo检测的HeLa细胞中肌动蛋白β(ACTB)位点1217m6A的检测，显示了与阴性对照相比20-30倍的信号富集。图10D显示了经由不依赖于抗体的生物素化-YTH-链霉亲和素-寡聚检测的HeLa细胞中转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)位点2601m6A的代谢检测，显示了与阴性对照相比没有富集。图10E显示了经由抗体-PAPG-oligo检测的小鼠海马中的MALAT1位点1248m6A的检测，显示了与阴性对照相比约15倍的信号富集。
图11A-11B显示了PAPG的二抗替代。图11A显示了SiteClick抗体标记试剂盒使用的标记化学(随后与炔-寡核苷酸的缀合可以使用点击化学进行)。图11B显示了经由抗体-PAPG-寡核苷酸检测和抗体-抗体-寡核苷酸检测的HeLa细胞中的ACTB位点1217m6A的检测。抗体-抗体-寡核苷酸检测方案显示出比IgG对照组低得多的信号富集。
图12A-12D显示了m6A-map v2的设计和原理。图12A显示了m6A-map v2的工作流程，实现了m6A甲基化RNA及其非甲基化对应物的同时检测。图12B显示了靶向相同RNA的探针的“赢家通吃”行为:当两对STARmap探针(参见PCT公开号WO 2019/199579，其通过引用并入本文)靶向HeLa细胞中相同的ACTB mRNA时，仅其中一个会在每个ACTBmRNA分子中得到扩增。图12C显示了经由m6A-map v2的HeLa细胞中的MALAT1位点2601m6A的检测，显示了M期和早期G1期中更高的m6A的化学计量。图12D显示了经由m6A-map v2的HeLa细胞中的ACTB位点1217m6A的检测，显示了非分裂细胞中更高的m6A的化学计量。
图13A-13C显示了RBP-map原理和实验结果。图13A显示了单个RBP-RNA相互作用映射的工作流程。图13B显示了经由图13A所示的工作流程测试用3xFLAG-YTH(WT/mut)-T2A-mCherry转染的HeLa细胞的ACTB的YTH结合。图13C显示了多重RBP-RNA映射的工作流程。每种抗体都与独特的DNA引物缀合，并与相应的间隙填充探针退火。首先，三部分探针与mRNA杂交。然后将靶向不同RBP的不同抗体混合物添加到样品中，然后进行连接和RCA。可以通过原位测序读取探针上的条形码信息。
图14提供了m6A-map 100-基因数据收集实验中第一轮测序的代表性图像。Ch01和ch04对应于STARmap扩增子，而ch02和ch03对应于m6A扩增子。
图15A-15H显示了m6A-map 100-基因数据集的质量控制和统计概述。孔标签:A1:STARmap；A2-抗-m6A:使用Abcam ab151230的m6A-map v1；A3-抗-m6A:使用SYSY 202003的m6A-map v1；B3-抗-m6A:使用Invitrogen RM362的m6A-map v1；B2-抗-m6A:使用CST 2729S正常家兔IgG的m6A-map v1的阴性对照。图15A显示了每个基因的每个细胞的读数的平均数。图15B显示了每个孔中的信噪比(使用抗m6A信号与IgG的比率计算)。图15C显示了每个孔中每个细胞检测到的基因和读数。图15D显示了A2孔和B3孔之间估计的相对m6A化学计量的相关性。图15E显示了估计m6A化学计量和STARmap读数之间的相关性。图15F显示了每个孔中测量的每个基因的相对m6A化学计量。图15G提供了代表性基因座通过m6A-map v1估计的m6A化学计量与报告的m6A化学计量的比较。图15H提供了图15G中所示的数据的散点图。
图16A-16C显示了m6A-map v1 100-基因数据集的亚细胞分析和细胞周期分析。图16A显示了m6A沉积对RNA亚细胞定位的影响(x轴:给定RNA的m6A沉积部分与非m6A沉积部分的核百分比的log2倍数变化；y轴:p值的-log10)。图16B显示了使用FUCCI荧光强度测定的细胞周期。图16C显示了具有细胞周期依赖性的m6A波动的代表性基因。
定义
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义:Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary ofGenetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有它们所赋予的含义。
术语“施用(administer)”、“施用(administering)”和“施用(administration)”是指将治疗或治疗剂、或治疗或治疗剂的组合物植入、吸收、摄取、注射、吸入或以其他方式引入受试者体内或受试者上。
本文所用的术语“扩增子”是指核酸(例如，RNA)，它是扩增反应的产物(即，遗传片段或靶序列的一个或多个拷贝的产生)或复制反应的产物。扩增子可以使用例如PCR或其他聚合反应人工形成。术语“串联的扩增子”是指连接在一起形成单个核酸分子的多个扩增子。串联的扩增子可以例如通过滚环扩增(RCA)形成，其中环状寡核苷酸被扩增以产生寡核苷酸的多个线性拷贝作为包含多个串联的扩增子的单个核酸分子。
“抗体”是指属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白。术语抗体和免疫球蛋白可互换使用。除了一些例外，哺乳动物抗体通常由基本结构单元组成，每个基本结构单元具有两条大重链和两条小轻链。有几种不同类型的抗体重链，以及几种不同种类的抗体，它们根据它们拥有的重链被分为不同的同种型。哺乳动物中有五种不同的抗体同种型(IgG、IgA、IgE、IgD和IgM)，它们发挥不同的作用，并帮助指导针对他们遇到的每种不同类型的异物的的适当免疫应答。本文使用的术语“抗体”还涵盖抗体片段、纳米抗体和单链抗体，以及抗体的变体。术语“抗体变体”也可用于涵盖抗体片段。在一些实施方案中，施用抗体或抗体变体作为疾病或病症的治疗(例如，与取自受试者的细胞中表观转录组RNA修饰分析的变化有关)。在一些实施方案中，抗体与本文所述的寡核苷酸探针缀合。在某些实施方案中，抗体结合表观转录组RNA修饰(例如，该抗体是抗m6A抗体、抗m1A抗体、抗假尿苷抗体、抗m6Am抗体、抗m7G抗体、抗ac4C抗体、抗Nm抗体或抗m5C抗体)。
如本文所用，“细胞”可以存在于细胞群中(例如，在组织、样品、活检、器官或类器官中)。在一些实施方案中，细胞群由多种不同的细胞类型组成。用于本公开的方法和系统的细胞可以存在于生物体、衍生自生物体的单一细胞类型或细胞类型的混合物内。包括天然存在的细胞和细胞群、基因工程细胞系、衍生自转基因动物的细胞、来自受试者的细胞等。实际上任何细胞类型和大小都可以适应本文描述的方法和系统。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞(例如，复杂的细胞群，例如天然存在的组织)。在一些实施方案中，细胞来自人类。在某些实施方案中，细胞通过医疗程序，例如活检收集自受试者(例如，人类)。或者，细胞可以是培养群体(例如，衍生自复杂群体的培养物或衍生自单一细胞类型的培养物，其中细胞已分化为多个谱系)。还可以在组织样品中原位提供细胞。
预期用于本公开的方法和系统的细胞类型包括但不限于干细胞和祖细胞(例如，胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经嵴细胞等)、内皮细胞、肌肉细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和骨骼肌细胞、间充质细胞、上皮细胞、造血细胞、淋巴细胞如T细胞(例如、ThlT细胞、Th2 T细胞、ThO T细胞、细胞毒性T细胞)和B细胞(例如，前B细胞)、单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、脂肪细胞、免疫细胞、神经元、肝细胞和涉及特定器官的细胞(例如，胸腺、内分泌腺、胰腺、脑、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、树突状细胞及其遗传修饰的细胞)。这些细胞也可以是不同类型的转化细胞或肿瘤细胞(例如，不同细胞来源的癌、不同细胞类型的淋巴瘤等)或任何种类的癌细胞(例如，来自本文公开的任何癌症)。不同来源(例如，外胚层、中胚层和内胚层)的细胞也预期用于本公开的方法和系统中。在一些实施方案中，细胞是小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、兴奋性神经元或抑制性神经元。在某些实施方案中，细胞是HeLa细胞。在一些实施方案中，多种细胞类型的细胞存在于同一样品中。
本文使用的术语“互补”是指两个包含彼此形成氢键的碱基的寡核苷酸序列(例如，DNA或RNA)。两个寡核苷酸序列之间的互补程度可以不同，从完全互补到不互补(例如，100％互补性、99％互补性、98％互补性、97％互补性、96％互补性、95％互补性、90％互补性、85％互补性、80％互补性或小于80％互补性)。例如，两个寡核苷酸序列可能彼此仅部分互补(例如，在本文所述的探针中，其中仅探针的一部分与另一探针或感兴趣的RNA互补)。在一些实施方案中，序列仅与另一序列的一部分互补。在一些实施方案中，序列在特定条件(例如，特定盐浓度、pH等)下与另一序列互补。
术语“表观转录组修饰”、“表观转录组RNA修饰”和“转录后修饰”在本公开全文中可互换使用。表观转录组修饰包括细胞内RNA的任何生物化学修饰。此类修饰可以是化学修饰，包括例如核苷酸在不同位置的甲基化。化学表观转录组修饰包括但不限于N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6A)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)和5-甲基胞嘧啶(m5C)。在某些实施方案中，表观转录组修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。其他化学表观转录组RNA修饰包括腺苷至肌苷突变和辫苷(queuosine)(即，辫苷取代了RNA中的另一个核苷酸)。多种类型的细胞RNA可以进行表观转录修饰，包括但不限于核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)和信使RNA(mRNA)。其他表观转录组修饰包括Kumar,S.et al.,Frontiers in Cell and Developmental Biology.9(2021)；以及Harcourt,E.M.etal.Nature.541,339-346(2017)中描述的那些。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”是指DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)且意指两个或更多个核苷酸的任何链。多核苷酸可以是嵌合混合物或其衍生物或修饰形式，并且可以是单链的或双链的。可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链处修饰寡核苷酸，例如以改善分子的稳定性、其杂交参数等。“适体”是一种与特定靶分子(例如，表观转录组修饰)结合的寡核苷酸分子。
“蛋白质”、“肽”或“多肽”包含通过肽键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。该术语指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。通常，蛋白质的长度为至少三个氨基酸。蛋白质可以指单个蛋白质或蛋白质的集合。蛋白质可以仅含有天然氨基酸，尽管可以替代性地使用本领域已知的非天然氨基酸(即，自然界中不存在但可以掺入多肽链的化合物)和/或氨基酸类似物。另外，蛋白质中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如，通过添加化学实体，例如碳水化合物基团、羟基、磷酸基团、法呢基、异法呢基、脂肪酸基团、用于缀合或官能化的接头、或其他修饰。蛋白质还可以是单分子或者可以是多分子复合物。蛋白质可以是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质可以是天然存在的、重组的、合成的或这些的任意组合。蛋白质也可以是作为疾病或病症的治疗施用的治疗性蛋白质(例如，与取自受试者的细胞中的表观转录组RNA修饰分析的变化有关的蛋白质)。在某些实施方案中，蛋白质是抗体或抗体变体(包括抗体片段)。在一些实施方案中，蛋白质结合表观转录组RNA修饰(例如，m6A特异性YTH结构域蛋白)。
“RNA结合蛋白”是指能够结合RNA或RNA的表观转录组修饰的任何蛋白质。例如，RNA结合蛋白可以是在RNA上引入表观转录组修饰的蛋白质。RNA结合蛋白还可以是识别并结合RNA的表观转录组修饰的蛋白质。在某些实施方案中，RNA结合蛋白包含YTH家族蛋白(例如，YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1或YTHDC2)、IGF2BP家族蛋白(例如，IGF2BP1、IGF2BP2或IGF2BP3)或FMR1。可以使用本文提供的方法分析的另外的RNA结合蛋白还包括但不限于以下文献中公开的那些:Wang,X.et al.,N(6)-methyladenosine ModulatesMessenger RNA Translation Efficiency.Cell 161,1388-1399,doi:10.1016/j.cell.2015.05.014(2015)；Wang,X.et al.,N6-methyladenosine-dependentregulation of messenger RNA stability.Nature 505,117-120,doi:10.1038/nature12730(2014)；Shi,H.et al.,YTHDF3 facilitates translation and decay of N(6)-methyladenosine-modified RNA.Cell Res 27,315-328,doi:10.1038/cr.2017.15(2017)；Xiao,W.et al.,Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing.MolCell 61,507-519,doi:10.1016/j.molcel.2016.01.012(2016)；Roundtree,I.A.et al.,YTHDC1mediates nuclear export of N(6)-methyladenosine methylated mRNAs.Elife6,doi:10.7554/eLife.31311(2017)；Hsu,P.J.et al.,Ythdc2 is an N(6)-methyladenosine binding protein that regulates mammalian spermatogenesis.CellRes 27,1115-1127,doi:10.1038/cr.2017.99(2017)；Huang,H.et al.,Recognition ofRNAN(6)-methyladenosine by IGF2BP proteins enhances mRNA stability andtranslation.Nat Cell Biol 20,285-295,doi:10.1038/s41556-018-0045-z(2018)；和Edens,B.M.et al.,FMRP Modulates Neural Differentiation through m(6)A-Dependent mRNA Nuclear Export.Cell Rep 28,845-854e845,doi:10.1016/j.celrep.2019.06.072(2019)。
“转录本”或“RNA转录本”是由RNA聚合酶催化DNA序列转录产生的产物。当RNA转录本是DNA序列的互补拷贝时，它被称为初级转录本，或者它可以是衍生自初级转录本的转录后加工的RNA序列并被称为成熟RNA。“信使RNA (mRNA)”是指没有内含子并且可以被细胞翻译成多肽的RNA。
术语“样品”或“生物样品”是指任何样品，包括组织样品(例如组织切片、手术活检和组织的针吸活检)；细胞样品；或细胞级分、片段或细胞器(例如通过裂解细胞并通过离心或其他方式分离其组分而获得的)。生物样品的其他实例包括但不限于血液、血清、尿液、精液、粪便、脑脊液、间质液、粘液、泪液、汗液、脓液、活检组织(例如，通过手术活检或针吸活检获得的)、乳头抽吸物、乳汁、阴道液、唾液、拭子(例如口腔拭子)或含有衍生自第一生物样品的生物分子的任何材料。在一些实施方案中，生物样品是取自受试者的手术活检，例如本文所述的任何组织的活检。在某些实施方案中，生物样品是肿瘤活检。在一些实施方案中，样品是脑组织。在一些实施方案中，组织是心脏组织。在一些实施方案中，样品是上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织。在一些实施方案中，样品是来自中枢神经系统(例如，脑)的组织。在一些实施方案中，本文描述的方法中使用的细胞来自这样的样品或生物样品。
考虑施用的“受试者”是指人类(即，任何年龄段的男性或女性，例如儿科受试者(例如，婴儿、儿童或青少年)或成人受试者(例如，青年人、中年人或老年人)或非人类动物。在一些实施方案中，非人类动物是哺乳动物(例如灵长类动物(例如，食蟹猴或恒河猴)或小鼠)。术语“患者”是指需要治疗疾病的受试者。在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，患者是人类。人类可以是处于任何发育阶段的男性或女性。“需要”治疗疾病或病症的受试者或患者包括但不限于表现出疾病或病症的任何风险因素或症状的那些受试者或患者。在一些实施方案中，受试者是非人类实验动物(例如，小鼠、大鼠、狗或非人类灵长类动物)。
本文所用的术语“治疗剂”是指可用于治疗疾病或病症、或减少或缓解疾病或病症的症状的任何药剂。在一些实施方案中，治疗剂是小分子、蛋白质、肽、核酸、脂质或碳水化合物。在一些实施方案中，治疗剂是已知药物和/或FDA批准的药物。在某些实施方案中，蛋白质是抗体。在某些实施方案中，蛋白质是抗体变体。在某些实施方案中，蛋白质是受体或其片段或变体。在某些实施方案中，蛋白质是细胞因子。在某些实施方案中，核酸是mRNA、反义RNA、miRNA、siRNA、RNA适体、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA (shRNA)或反义寡核苷酸(ASO)。
治疗或治疗剂的“治疗有效量”是足以在病况的治疗中提供治疗益处或延迟或最小化与病况相关的一种或多种症状的量。治疗或治疗剂的治疗有效量是指在病况的治疗中提供治疗益处的单独的或与其他疗法组合的治疗的量。术语“治疗有效量”可以涵盖改善总体治疗、减少或避免病况的症状、体征或原因、和/或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。
如本文所用，“组织”是来自相同来源的一组细胞及其细胞外基质。细胞一起执行特定的功能。多种组织类型联合在一起形成器官。细胞可以是不同的细胞类型。在一些实施方案中，组织是上皮组织。上皮组织由覆盖器官表面(例如，皮肤表面、呼吸道、软器官、生殖道和消化道内壁)的细胞形成。上皮组织发挥保护功能，也参与分泌、排泄和吸收。上皮组织的实例包括但不限于单层鳞状上皮、复层鳞状上皮、单层立方上皮、移行上皮、假复层上皮、柱状上皮和腺上皮。在一些实施方案中，组织是结缔组织。结缔组织是由非生命物质分隔的细胞组成的纤维组织(例如，细胞外基质)。结缔组织为器官提供形状并固定器官的位置。结缔组织包括纤维结缔组织、骨骼结缔组织和液体结缔组织。结缔组织的实例包括但不限于血液、骨骼、腱、韧带、脂肪和网状结缔组织。在一些实施方案中，组织是肌肉组织。肌肉组织是由肌肉细胞形成的主动收缩组织。肌肉组织的功能是产生力并引起运动。肌肉组织包括平滑肌(例如，如在器官内壁中发现的)、骨骼肌(例如，通常附着在骨骼上)和心肌(例如，如在心脏中发现的，其在那里收缩以将血液泵送到整个有机体)。在一些实施方案中，组织是神经组织。神经组织包括组成中枢神经系统和周围神经系统的细胞。神经组织形成脑、脊髓、脑神经和脊神经(例如，运动神经元)。在某些实施方案中，组织是脑组织。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指逆转、减轻、延迟本文所述疾病的发作或抑制本文所述疾病的进展。在一些实施方案中，可以在疾病的一种或多种体征或症状已经出现或已经观察到之后施用治疗(例如，预防性地或在怀疑或有疾病风险时)。在其他实施方案中，可以在没有疾病体征或症状的情况下施用治疗。例如，可以在症状出现之前对易感受试者施用治疗(例如，根据受试者或受试者家庭成员的症状史)。症状缓解后也可以继续治疗，例如，以延迟或预防复发。在一些实施方案中，可以在使用本文公开的方法并观察与健康细胞或组织相比细胞或组织中的表观转录组RNA修饰分析的变化之后施用治疗。
某些实施方案的详细描述
本文描述的方面不限于特定实施方案、系统、组合物、方法或配置，并且因此当然可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，并且除非本文具体定义，否则并不旨在进行限制。
本公开提供了用于以单细胞分辨率和亚细胞分辨率分析一个细胞或多个细胞中的表观转录组RNA修饰的方法、组合物和系统(例如，细胞存在于完整组织或分离的细胞内)。本公开还提供了用于分析细胞中一种或多种感兴趣的RNA与RNA结合蛋白(例如，引入感兴趣RNA的表观转录组修饰的蛋白质)之间相互作用的方法。本公开还提供了诊断受试者中的疾病或病症的方法，该方法基于细胞中(包括完整组织内的细胞)表观转录组RNA修饰的分析或RNA结合蛋白与一个或多个RNA之间相互作用的分析。本公开还提供了用于治疗有此需要的受试者的疾病或病症的方法。本公开还提供了筛选或测试能够调节一种或多种RNA的表观转录组修饰或一种或多种RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用的候选试剂的方法。本公开还提供了可用于执行本文描述的方法的探针对和探针组，以及包含本文描述的任何探针的试剂盒。分析细胞中表观转录组RNA修饰或RNA与RNA结合蛋白之间相互作用的方法
一方面，本公开提供了用于分析一个细胞中(或多个细胞中，例如，在完整的组织中)表观转录组RNA修饰的方法。在本文公开的方法中，细胞可以与一个或多个探针对或探针组接触，其在本文中进一步描述并且可以用于鉴定和定位包含至少一种表观转录组修饰的感兴趣的RNA以产生一个或多个串联的扩增子。然后可以将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中并进行测序以确定转录本的身份及其在聚合物基质内的位置(例如，通过如本文进一步描述的SEDAL测序)。利用感兴趣的修饰转录本的位置，可以对细胞中的表观转录组修饰的RNA进行分析。
在一些实施方案中，本公开提供了用于分析细胞中表观转录组RNA修饰的方法，包括以下步骤:
a)使细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针(即，“挂锁探针”)、第二探针(即，“夹板探针”)和第三探针(即，“引物探针”)，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每种感兴趣的RNA的独特序列，例如，通过如本文所讨论的SEDAL测序)、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置。
在一些实施方案中，本公开提供了用于分析一个细胞(或多个细胞，例如，在完整的组织中)中的表观转录组RNA修饰的方法，包括以下步骤：
a)使细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包括第一探针(即，“挂锁探针”)和第二探针(即，“引物探针”)，其中:
i)第一探针包含与第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每种感兴趣的RNA的独特序列，例如通过如本文所讨论的SEDAL测序)；和
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置。
本公开考虑了任何表观转录组RNA修饰的分析。在一些实施方案中，表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6Am)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。其他表观转录组修饰包括Kumar,S.et al.,Frontiers in Cell and Developmental Biology.9(2021)；以及Harcourt,E.M.etal.,Nature.541,339-346(2017)中描述的那些。在一些实施方案中，表观RNA修饰是腺苷至肌苷修饰。在一些实施方案中，表观转录组修饰是辫苷(即，辫苷取代RNA中的另一个核苷酸)、聚腺苷酸化、内含子剪接或组蛋白mRNA加工。在某些实施方案中，表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。可以使用本文公开的方法在细胞中分析单个表观转录组修饰，或在细胞中同时分析多个不同的表观转录组修饰(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)。
在一些实施方案中，本文公开的用于分析表观转录组RNA修饰的方法考虑使用包含第一探针、第二探针和第三探针的探针组。此类方法利用本文所称的“三探针策略”。该探针组中的第二探针(本文也称为“夹板探针”)包含识别表观转录组RNA修饰的部分(即，存在于特定感兴趣的RNA上的转录后修饰)。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含肽。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含适体。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含小分子。在某些实施方案中，第二探针通过包括生物素-链霉亲和素相互作用的机制结合表观转录组修饰。识别表观转录组RNA修饰的探针的部分可以是蛋白质(例如，抗体或抗体变体，或任何其他能够结合特定表观转录组修饰的蛋白质)。在某些实施方案中，蛋白质是PAPG。在一些实施方案中，识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。例如，第二探针可包含二抗，并且一抗可用于结合表观转录组RNA修饰。然后，第二探针上的二抗识别与表观转录组RNA修饰结合的一抗。参见，例如图1。在另一个实例中，第二探针可以包含蛋白质PAPG，其可以结合与表观转录组RNA修饰结合的抗体。当识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分是蛋白质时，该方法可以任选地进一步包括使细胞与识别表观转录组RNA修饰的抗体接触，其中识别表观转录组RNA修饰的抗体被第二探针的蛋白(例如，PAPG)识别并结合。在某些实施方案中，识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含抗体(例如，二抗)或抗体变体。当识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分是二抗时，该方法可以任选地进一步包括使细胞与识别表观转录组RNA修饰并被第二探针的二抗识别的一抗接触。细胞可以在与一个或多个探针对接触之前或之后与一抗接触。在某些实施方案中，细胞在与一个或多个探针对接触之前与一抗接触。在一些实施方案中，一抗是抗m6A抗体、抗m1A抗体、抗假尿苷抗体、抗m6Am抗体、抗m7G抗体、抗ac4C抗体、抗Nm抗体或抗m5C抗体。本公开还考虑使用能够直接结合本文所述探针上的表观转录组RNA修饰的任何试剂来代替一抗。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分直接包含蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质是m6A特异性YTH结构域蛋白。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分直接包含抗体或抗体变体。
在一些实施方案中，探针组的第二探针还包含聚合阻断剂。聚合阻断剂可以是能够阻止在本文所述方法的步骤(c)的滚环扩增中使用第二寡核苷酸探针作为引物的任何部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂位于第二寡核苷酸探针的3’末端。聚合阻断剂可以是例如防止聚合酶使用第二寡核苷酸探针作为聚合引物的任何化学部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂是包含封闭的3’羟基的核酸残基(例如，在3’羟基上包含氧保护基)。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替3’羟基的氢。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替3’羟基的任何化学部分，所述化学部分防止添加另外的核苷酸。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含反向核酸残基。在一些实施方案中，聚合阻断剂是反向腺苷、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟苷或尿苷残基。在某些实施方案中，聚合阻断剂是反向胸腺嘧啶残基。
除了识别表观转录组RNA修饰的部分之外，第二探针还包含与第一探针的一部分互补的部分。在本文提供的探针组中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在每个探针组上可以是相同的。在一些实施方案中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在第一探针和第二探针中的每一个上是唯一的。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3-20、约4-19、约5-18、约6-17、约7-16、约8-15、约9-14、约10-13或约11-12个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。
在一些实施方案中，第二探针的每个部分通过任选的接头连接。在一些实施方案中，任选的接头是核苷酸接头。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述方法中使用的探针组中的第二探针包含以下结构:
5’-[识别表观转录组RNA修饰的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[代表第二探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。在一些实施方案中，识别表观转录组RNA修饰的部分和探针的寡核苷酸部分经由点击化学彼此连接(参见，例如图10B)。
本文所述方法中使用的探针组中的第一探针(本文也称为“挂锁”探针)包括与第二探针互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约4-20、约5-19、约6-18、约7-17、约8-16、约9-15、10-14或约11-13个核苷酸。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。在某些实施方案中，与第二探针互补的第一探针的寡核苷酸部分在第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
本文公开的方法中使用的探针组中的第一探针还包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10-30、约11-29、约12-28、约13-27、约14-26、约15-25、约16-24、约17-23、约18-22或约19-21个核苷酸。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或多于30个核苷酸。
本文公开的方法中使用的探针组中的第一探针还包含由特定核苷酸序列组成的寡核苷酸条形码序列。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。本文所述的寡核苷酸探针的条形码可以包含用于鉴定感兴趣的RNA的基因特异性序列(即，已被至少一种特定表观转录组修饰修饰的RNA)。
本公开考虑了第一寡核苷酸探针的部分以任何顺序的排列。在一些实施方案中，第一探针的一部分通过任选的接头连接至另一部分。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针包含以下结构:
5’-[与第二探针互补的部分]-[寡核苷酸条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第三探针互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[表示第一探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。在一些实施方案中，构成本文提供的探针组的探针的任何寡核苷酸部分包含DNA。
本文提供的方法中使用的探针组中的第三探针(也称为“引物探针”)包含与感兴趣的RNA互补的部分和与探针组中的第一探针互补的部分。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第三探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第三探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第三探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第三探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
在某些实施方案中，探针组的第三探针包含以下结构:
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[代表第一探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。
在一些实施方案中，本文公开的用于分析表观转录组RNA修饰的方法考虑使用包含第一探针和第二探针的探针对。此类方法利用本文所称的“双探针策略”。探针对中的第二探针(本文中也称为“引物探针”)包含识别表观转录组RNA修饰的部分(即，存在于特定感兴趣RNA上的转录后修饰)。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含肽。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含适体。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含小分子。在某些实施方案中，第二探针通过包括生物素-链霉亲和素相互作用的机制结合表观转录组修饰。识别表观转录组RNA修饰的探针的部分可以是蛋白质(例如，抗体或抗体变体，或任何其他能够结合特定表观转录组修饰的蛋白质)。在一些实施方案中，识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。例如，第二探针可包含二抗，并且一抗可用于结合表观转录组RNA修饰。然后，第二探针上的二抗识别与表观转录组RNA修饰结合的一抗。参见，例如图1。在某些实施方案中，识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含抗体(例如，二抗)或抗体变体。当识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分是二抗时，该方法可以任选地进一步包括使细胞与识别表观转录组RNA修饰并被第二探针的二抗识别的一抗接触。细胞可以在与一个或多个探针对接触之前或之后与一抗接触。在某些实施方案中，细胞在与一个或多个探针对接触之前与一抗接触。在一些实施方案中，一抗是抗m6A抗体、抗m1A抗体、抗假尿苷抗体、抗m6Am抗体、抗m7G抗体、抗ac4C抗体、抗Nm抗体或抗m5C抗体。本公开内容还考虑使用能够结合本文所述探针上的表观转录组RNA修饰的任何试剂来代替抗体。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质是PAPG。在一些实施方案中，当识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含蛋白质时，该方法进一步包括使细胞与识别表观转录组RNA修饰的抗体接触，其中识别表观转录组RNA修饰的抗体被PAPG识别并结合。在某些实施方案中，蛋白质是m6A特异性YTH结构域蛋白，其可直接结合表观转录组RNA修饰。在一些实施方案中，结合表观转录RNA修饰的第二探针的部分直接结合修饰并包含抗体或抗体变体。
除了识别表观转录组RNA修饰的部分之外，探针对中的第二探针还包含与第一探针的一部分互补的部分。在本文提供的探针对中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在每个探针组上可以是相同的。在一些实施方案中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在每个探针对上是唯一的。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3-20、约4-19、约5-18、约6-17、约7-16、约8-15、约9-14、约10-13或约11-12个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。
在一些实施方案中，探针对的第二探针的每个部分通过任选的接头连接。在一些实施方案中，任选的接头是核苷酸接头。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，本文描述的方法中使用的第二探针包含以下结构:
5’-[识别表观转录组RNA修饰的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[代表第二探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。
本文所述方法中使用的探针对中的第一探针(本文也称为“挂锁”探针)包括与第二探针互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约3-20、约4-19、约5-18、约6-17、约7-16、约8-15、约9-14、约10-13或约11-12个核苷酸。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。在某些实施方案中，与第二探针互补的第一探针的寡核苷酸部分在第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
本文公开的方法中使用的探针对中的第一探针还包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10-30、约11-29、约12-28、约13-27、约14-26、约15-25、约16-24、约17-23、约18-22或约19-21个核苷酸。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或多于30个核苷酸。
本文公开的方法中使用的探针对中的第一探针还包含由特定核苷酸序列组成的寡核苷酸条形码序列。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。本文所述的寡核苷酸探针的条形码可以包含用于鉴定感兴趣的RNA的基因特异性序列(即，已被至少一种特定表观转录组修饰修饰的RNA)。
本公开考虑了探针对的第一寡核苷酸探针的部分以任何顺序的排列。在一些实施方案中，第一探针的一部分通过任选的接头连接至另一部分。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针包含以下结构:
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-3’；
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-3’；或者
5’-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[代表第一探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。在一些实施方案中，第一探针和/或第二探针的任何寡核苷酸部分包含DNA。
在一些实施方案中，本公开提供了用于分析细胞中RNA结合蛋白与一种或多种感兴趣的RNA之间的相互作用的方法，该方法包括:
a)使细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中由RNA结合蛋白结合的每个感兴趣的RNA的身份和位置。
任何RNA结合蛋白与一种或多种感兴趣的RNA的相互作用可以使用本文提供的方法进行分析。在一些实施方案中，RNA结合蛋白是在RNA上引入表观转录组修饰的蛋白质。在某些实施方案中，RNA结合蛋白包含YTH家族蛋白(例如，YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1或YTHDC2)、IGF2BP家族蛋白(例如，IGF2BP1、IGF2BP2或IGF2BP3)或FMR1。可以使用本文提供的方法分析的另外的RNA结合蛋白还包括但不限于以下文献中公开的那些：Wang,X.etal.,N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.Cell161,1388-1399,doi:10.1016/j.cell.2015.05.014(2015)；Wang,X.et al.,N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.Nature 505,117-120,doi:10.1038/nature12730(2014)；Shi,H.etal.,YTHDF3 facilitatestranslation and decay of N(6)-methyladenosine-modified RNA.Cell Res 27,315-328,doi:10.1038/cr.2017.15(2017)；Xiao,W.et al.,Nuclear m(6)A Reader YTHDC1Regulates mRNA Splicing.Mol Cell 61,507-519,doi:10.1016/j.molcel.2016.01.012(2016)；Roundtree,I.A.et al.,YTHDC1mediates nuclear export of N(6)-methyladenosine methylated mRNAs.Elife 6,doi:10.7554/eLife.31311(2017)；Hsu,P.J.et al.,Ythdc2 is an N(6)-methyladenosine binding protein that regulatesmammalian spermatogenesis.Cell Res 27,1115-1127,doi:10.1038/cr.2017.99(2017)；Huang,H.et al.,Recognition of RNA N(6)-methyladenosine by IGF2BP proteinsenhances mRNAstability and translation.Nat Cell Biol 20,285-295,doi:10.1038/s41556-018-0045-z(2018)；和Edens,B.M.et al.,FMRP Modulates NeuralDifferentiation through m(6)A-Dependent mRNA Nuclear Export.Cell Rep 28,845-854e845,doi:10.1016/j.celrep.2019.06.072(2019)。
在一些实施方案中，本文公开的用于分析RNA结合蛋白和感兴趣的RNA之间的相互作用的方法考虑使用包含第一探针、第二探针和第三探针的探针组。该探针组中的第二探针(本文也称为“夹板探针”)包含识别RNA结合蛋白的部分(例如，在RNA上引入表观转录组修饰的酶)。在一些实施方案中，结合RNA结合蛋白的第二探针的部分包含肽。在一些实施方案中，结合RNA结合蛋白的第二探针的部分包含适体。在一些实施方案中，结合RNA结合蛋白的第二探针的部分包含小分子。在某些实施方案中，第二探针通过包括生物素-链霉亲和素相互作用的机制结合RNA结合蛋白。识别RNA结合蛋白的探针的部分可以是蛋白质(例如，抗体或抗体变体，或任何其他能够结合特定RNA结合蛋白的蛋白质)。在一些实施方案中，识别RNA结合蛋白的第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。例如，第二探针可包含二抗，并且一抗可用于结合RNA结合蛋白。然后第二探针上的二抗识别与RNA结合蛋白结合的一抗。参见，例如图13A和13C。在某些实施方案中，识别RNA结合蛋白的第二探针的部分包含抗体(例如，二抗)或抗体变体。当识别RNA结合蛋白的第二探针的部分是二抗时，该方法可以任选地进一步包括使细胞与识别RNA结合蛋白并被第二探针的二抗识别的一抗接触。细胞可以在与一个或多个探针对接触之前或之后与一抗接触。在某些实施方案中，细胞在与一个或多个探针对接触之前与一抗接触。本公开还考虑使用能够识别并直接结合本文所述探针上的RNA结合蛋白的任何试剂来代替一抗。在一些实施方案中，直接结合RNA结合蛋白的第二探针的部分包含蛋白质。在一些实施方案中，直接结合RNA结合蛋白的第二探针的部分包含抗体或抗体变体。
在一些实施方案中，探针组的第二探针还包含聚合阻断剂。聚合阻断剂可以是能够阻止在本文所述方法的步骤(c)的滚环扩增中使用第二寡核苷酸探针作为引物的任何部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂位于第二寡核苷酸探针的3’末端。聚合阻断剂可以是例如防止聚合酶使用第二寡核苷酸探针作为聚合引物的任何化学部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂是包含封闭的3’羟基的核酸残基(例如，在3’羟基上包含氧保护基)。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替3’羟基的氢。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替3’羟基的任何化学部分，所述化学部分防止添加另外的核苷酸。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含反向核酸残基。在一些实施方案中，聚合阻断剂是反向腺苷、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟苷或尿苷残基。在某些实施方案中，聚合阻断剂是反向胸腺嘧啶残基。
除了识别RNA结合蛋白的部分之外，第二探针还包含与第一探针的一部分互补的部分。在本文提供的探针组中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在每个探针组上可以是相同的。在一些实施方案中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在第一探针和第二探针中的每一个上是唯一的。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3-20、约4-19、约5-18、约6-17、约7-16、约8-15、约9-14、约10-13或约11-12个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。
在一些实施方案中，第二探针的每个部分通过任选的接头连接。在一些实施方案中，任选的接头是核苷酸接头。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述方法中使用的探针组中的第二探针包含以下结构:
5’-[识别RNA结合蛋白的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[代表第二探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。
本文所述方法中使用的探针组中的第一探针(本文也称为“挂锁”探针)包括与第二探针互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约4-20、约5-19、约6-18、约7-17、约8-16、约9-15、10-14或约11-13个核苷酸。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。在某些实施方案中，与第二探针互补的第一探针的寡核苷酸部分在第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
本文公开的用于分析RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的方法中使用的探针组中的第一探针还包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10-30、约11-29、约12-28、约13-27、约14-26、约15-25、约16-24、约17-23、约18-22或约19-21个核苷酸。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或多于30个核苷酸。
本文公开的方法中使用的探针组中的第一探针还包含由特定核苷酸序列组成的寡核苷酸条形码序列。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。本文所述的寡核苷酸探针的条形码可以包含用于鉴定感兴趣的RNA的基因特异性序列(即，由至少一种RNA结合蛋白结合的RNA)。
本公开考虑了第一寡核苷酸探针的部分以任何顺序的排列。在一些实施方案中，第一探针的一部分通过任选的接头连接至另一部分。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针包含以下结构:
5’-[与第二探针互补的部分]-[寡核苷酸条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第三探针互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[代表第一探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。在一些实施方案中，构成本文提供的探针组的探针的任何寡核苷酸部分包含DNA。
本文提供的用于分析RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的方法中使用的探针组中的第三探针(也称为“引物探针”)包含与感兴趣的RNA互补的部分和与探针组中的第一探针互补的部分。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第三探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第三探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第三探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第三探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
在某些实施方案中，探针组的第三探针包含以下结构:
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[代表第一探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。
本公开考虑了在本文公开的方法中使用任何类型的细胞(例如，本文描述的任何细胞类型)。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，细胞是人类细胞。本公开还涵盖对多个细胞同时进行用于分析本文所述的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的方法。在一些实施方案中，该方法在相同细胞类型的多个细胞上进行。在一些实施方案中，该方法在包含不同细胞类型的细胞的多个细胞上进行。在一些实施方案中，表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用在超过10个细胞、超过20个细胞、超过50个细胞、超过100个细胞、超过200个细胞、超过300个细胞、超过400个细胞、超过500个细胞或超过1000个细胞中同时进行分析。可以使用本文公开的方法分析其中表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的细胞类型包括但不限于，干细胞、祖细胞、神经元细胞、星形胶质细胞、树突细胞、内皮细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、肌肉细胞、心肌细胞、间充质细胞、上皮细胞、免疫细胞、肝细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、造血细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、脂肪细胞和神经元。在某些实施方案中，一个或多个细胞存在于完整组织内(例如，本文描述的任何组织类型)。在某些实施方案中，完整组织是固定的组织样品。在一些实施方案中，完整组织包含多种细胞类型。在一些实施方案中，组织是上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织。在某些实施方案中，组织是心脏组织、淋巴结组织、肝脏组织、肌肉组织、骨组织、眼组织、脑组织或耳组织。
在本文描述的方法中用于分析表观转录组修饰或与RNA结合蛋白的相互作用的感兴趣的RNA可以是已经从细胞的基因组DNA表达的转录本。在一些实施方案中，感兴趣的RNA是信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和/或核糖体RNA(rRNA)。在一些实施方案中，感兴趣的RNA包含尚未被加工的转录本(例如，前体mRNA)。本文描述的方法可用于一次分析细胞中的一种表观转录组修饰的RNA或由RNA结合蛋白结合的RNA，或同时分析多种表观转录组修饰的感兴趣的RNA或由RNA结合蛋白结合的感兴趣的RNA。在一些实施方案中，在一个细胞或多个细胞中同时分析多于1个、多于2个、多于3个、多于4个、多于5个、多于10个、多于20个、多于30个、多于40个、多于50个、多于100个、多于200个、多于500个、多于1000个、多于2000个或多于3000个RNA的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用。
在滚环扩增之后，在本文描述的方法中使用聚合物基质以促进细胞中表观转录组修饰的感兴趣的RNA或被RNA结合蛋白结合的感兴趣的RNA的测序和成像。本公开考虑了各种聚合物基质的使用，并且其中可以嵌入一个或多个串联扩增子的任何聚合物基质都适合用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，聚合物基质是水凝胶(即，亲水性交联聚合物网络)。在一些实施方案中，水凝胶是聚乙烯醇水凝胶、聚乙二醇水凝胶、聚丙烯酸酯水凝胶或聚丙烯酰胺水凝胶。在某些实施方案中，水凝胶是聚丙烯酰胺水凝胶。此类水凝胶可以例如通过在包含丙烯酰胺和双丙烯酰胺的缓冲液中孵育样品、除去缓冲液并在聚合混合物(包含，例如，过硫酸铵和四甲基乙二胺)中孵育来制备。此类试剂也可以在试剂盒中提供，例如，用于进行本文描述的任何方法的试剂盒或本文描述的任何试剂盒。
在一些实施方案中，进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸以产生一个或多个串联的扩增子的步骤还包括提供用反应性化学基团修饰的核苷酸(例如，胺修饰的核苷酸，例如5-(3-氨基烯丙基)-dUTP)。在一些实施方案中，用反应性化学基团修饰的核苷酸构成扩增反应中使用的约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的核苷酸。例如，进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸以产生一个或多个串联的扩增子的步骤还包括提供胺修饰的核苷酸，例如5-(3-氨基烯丙基)-dUTP。在扩增过程中，胺修饰的核苷酸在产生时被掺入一个或多个串联的扩增子中。所得扩增子用伯胺官能化，伯胺可以进一步与另一个相容的化学部分(例如,N-羟基丁二酰亚胺)反应以促进将串联的扩增子嵌入聚合物基质中的步骤。在一些实施方案中，将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中的步骤包括使一个或多个串联的扩增子的胺修饰核苷酸与丙烯酸N-羟基丁二酰亚胺反应，并且使一个或多个串联的扩增子与聚合物基质共聚。
本文公开的方法还包括对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序的步骤。在一些实施方案中，测序步骤包括进行“通过动态退火和连接的误差减少的测序”(SEDAL测序)。Wang,X.et al.,Three-dimensional intact-tissue sequencing ofsingle-cell transcriptional states.Science 2018,361,380和2019年10月17日公布的国际专利申请公开号WO 2019/199579中进一步描述了SEDAL测序，其中每一篇均通过引用并入本文。简而言之，将包含可检测标记(即，可用于可视化另外的寡核苷酸探针的位置的任何标记，例如，通过成像)的寡核苷酸探针提供给细胞。在某些实施方案中，可检测标记是荧光的(例如，荧光团)。另外的寡核苷酸探针与第一探针的寡核苷酸条形码序列互补，因此与感兴趣的RNA的身份相关联，并且可以用于在细胞内(或者在细胞器内，当该方法在亚细胞分辨率下进行时，例如，用染色来鉴定单个细胞器的位置)鉴定感兴趣的RNA。
本文描述的方法中使用的另外的寡核苷酸探针(例如，如SEDAL测序中使用的)可以使用本领域已知的任何合适的成像技术读出。例如，在另外的寡核苷酸探针包含荧光团的实施方案中，可以使用成像读出荧光团以鉴定感兴趣的RNA。如上所讨论的，另外的寡核苷酸探针包含与第一寡核苷酸探针上的条形码序列互补的序列，其用于检测特定的感兴趣的RNA。通过对包含荧光团的另外的寡核苷酸探针的位置进行成像，可以确定样品中感兴趣的特定RNA的位置。在一些实施方案中，成像步骤包括荧光成像。在某些实施方案中，成像步骤包括共焦显微镜术。在某些实施方案中，成像步骤包括落射荧光显微镜术。在某些实施方案中，进行两轮成像。在某些实施方案中，进行三轮成像。在某些实施方案中，进行四轮成像。在某些实施方案中，进行五轮或更多轮成像。
在一些实施方案中，用于分析本文所述的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的方法可以与用于分析细胞内另外的分子的方法组合。例如，使用不包含识别表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白的部分的探针，可以对另外的RNA(包括未被表观转录组修饰的RNA和未被RNA结合蛋白结合的RNA)的表达以及表观转录组修饰的RNA或由一种或多种RNA结合蛋白结合的RNA一起进行分析。分析其他类型分子(例如，DNA、蛋白质、碳水化合物或脂质)的方法也可以与本文描述的方法组合。在某些实施方案中，进行分析的另外的分子是未修饰的RNA。在一些实施方案中，分析未修饰的RNA包括:
a)使细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包括第一探针和第二探针，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列和与未修饰的感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分；和
ii)第二探针包含与未修饰的感兴趣的RNA互补的部分和与第一探针的一部分互补的部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中每个未修饰的感兴趣的RNA的身份和位置。
在一些实施方案中，本文提供的方法还包括通过将细胞的表观转录组RNA修饰分析(或RNA与RNA结合蛋白之间相互作用的分析)与包含各种细胞类型的表观转录组RNA修饰分析(或RNA与RNA结合蛋白之间相互作用的分析)的参考数据进行比较来确定所分析的细胞的细胞类型。在一些实施方案中，该方法还包括过表达或敲除细胞中的一种或多种基因以确定所述一种或多种基因是否参与感兴趣的RNA的表观转录组修饰。在一些实施方案中，该方法还包括在多个时间点重复步骤(a)-(e)以随时间分析细胞中的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用。在一些实施方案中，该方法还包括检查一个细胞或多个细胞中表观转录组修饰的RNA的分析或RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用如何受到完整组织内的免疫应答的影响，或者该分析如何因接近肿瘤而受到影响。
在一些实施方案中，本文描述的任何方法进一步包括以亚细胞分辨率解析修饰的感兴趣的RNA的位置(即，在细胞内的特定细胞器内；大约150-400nm空间分辨率，这取决于DNA扩增子的大小和光学极限)。这可以通过本领域众所周知的细胞器染色程序来完成。例如，各种细胞器如内质网(ER)、细胞骨架和线粒体可以被染色。在一些实施方案中，用于对细胞中的各种细胞器进行染色的试剂包括小分子染料、抗体和/或蛋白质染料。
用于诊断受试者的疾病或病症的方法
另一方面，本公开提供了用于诊断受试者的疾病或病症的方法。例如，用于分析本文所述的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的方法可以在取自受试者(例如，被认为患有或有风险患有疾病或病症的受试者，或者健康或被认为是健康的受试者)的一个或多个细胞(例如，在完整的组织中)上进行。然后可以将细胞中各种感兴趣的RNA的表达与非患病细胞或来自非患病组织样品的细胞(例如，来自健康个体的细胞，或来自健康个体群体的多个细胞)中相同的感兴趣的RNA的表达进行比较。细胞的表观转录组RNA修饰分析或细胞RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的分析，相对于一种或多种非患病细胞的的任何差异(包括感兴趣的单个RNA或多个RNA，例如，特定疾病特征)，可以指示受试者患有疾病或病症。一种或多种非患病细胞中的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用可以作为对照实验与患病细胞中的表达一起进行分析。一种或多种非患病细胞中的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用先前也可能已经进行了分析，并且可以将患病细胞中的表达与非患病细胞的该参考数据进行比较。
在一些实施方案中，用于诊断受试者的疾病或病症的方法包括以下步骤:
a)使取自受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；
其中细胞中表观转录组RNA修饰分析相对于一种或多种非患病细胞的差异指示受试者患有疾病或病症。
在一些实施方案中，用于诊断受试者的疾病或病症的方法包括以下步骤:
a)使取自受试者的一个细胞(或多个细胞，例如，在完整的组织中)与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包括第一探针(即，“挂锁探针”)和第二探针(即，“引物探针”)，其中:
i)第一探针包含与第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每种感兴趣的RNA的独特序列，例如通过如本文所讨论的SEDAL测序)；和
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；
其中细胞中表观转录组RNA修饰分析相对于一种或多种非患病细胞的差异表明受试者患有疾病或病症。
在一些实施方案中，用于诊断受试者的疾病或病症的方法包括以下步骤:
a)使取自受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序以确定与细胞中RNA结合蛋白结合的每个感兴趣RNA的身份和位置；
其中细胞中RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用的分析相对于一种或多种非患病细胞的差异指示受试者患有疾病或病症。
在一些实施方案中，使用本文公开的方法，一种或多种非患病细胞中的表观转录组RNA修饰，或一种或多种非患病细胞中的RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用，可以作为对照实验与取自受试者的细胞同时进行分析。在一些实施方案中，与患病细胞中的表达相比，一种或多种非患病细胞中的表观转录组RNA修饰的分析，或一种或多种非患病细胞中RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用的分析包括来自先前对一种或多种非患病细胞进行该方法时的参考数据。本公开考虑了用于诊断受试者中的疾病或病症的任何表观转录组RNA修饰的分析。在一些实施方案中，表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6Am)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。其他表观转录组修饰包括Kumar,S.et al.,Frontiers in Celland Developmental Biology.9(2021)；和Harcourt,E.M.et al.,Nature.541,339-346(2017)中描述的那些。在一些实施方案中，表观RNA修饰是腺苷至肌苷修饰。在一些实施方案中，表观转录组修饰是辫苷(即，辫苷取代RNA中的另一个核苷酸)、聚腺苷酸化、内含子剪接或组蛋白mRNA加工。在某些实施方案中，表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。使用本文公开的方法，可以分析细胞中单个表观转录组修饰以诊断受试者的疾病或病症，或者可以同时分析细胞中多个不同的表观转录组修饰(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)。本公开还考虑了RNA与任何RNA结合蛋白之间的相互作用的分析。在一些实施方案中，RNA结合蛋白是向RNA引入表观转录组修饰的酶。在某些实施方案中，RNA结合蛋白是YTH家族蛋白(例如，YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1或YTHDC2)、IGF2BP家族蛋白(例如，IGF2BP1、IGF2BP2或IGF2BP3)或FMR1。使用本文公开的方法，可以分析细胞中RNA和单个RNA结合蛋白之间的相互作用以诊断受试者的疾病或病症，或者可以同时分析细胞中与多种不同RNA结合蛋白(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)之间的相互作用。
通过本文描述的方法预期任何疾病或病症的诊断。在一些实施方案中，疾病或病症是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝病、脾病、肺病、血液病、神经学疾病、精神疾病、胃肠(GI)道疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢紊乱、免疫紊乱、中枢神经系统(CNS)紊乱或心血管疾病。
在一些实施方案中，细胞存在于组织中(例如，上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织)。在一些实施方案中，组织是来自受试者的组织样品。在一些实施方案中，受试者是非人类实验动物(例如，小鼠)。在一些实施方案中，受试者是驯化动物。在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，组织样品包含固定的组织样品。在某些实施方案中，组织样品是活检(例如，骨、骨髓、乳房、胃肠道、肺、肝、胰腺、前列腺、脑、神经、肾、子宫内膜、宫颈、淋巴结、肌肉或皮肤活检)。在某些实施方案中，活检是肿瘤活检。在某些实施方案中，组织是脑组织。在某些实施方案中，组织来自中枢神经系统。
用于治疗受试者的疾病或病症的方法
另一方面，本公开提供了用于治疗受试者的疾病或病症的方法。例如，用于分析本文所述的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的方法可以在取自受试者(例如，被认为患有或有风险患有疾病或病症的受试者)的样品的一个细胞中(或在多个细胞中，例如，在完整的组织中)进行。然后，可以将细胞中一种或多种RNA的表观转录组修饰分析或RNA结合蛋白与一种或多种RNA之间的相互作用分析与来自非患病组织样品的细胞中的表观转录组修饰分析或与相同的感兴趣的RNA的RNA结合蛋白的相互作用分析进行比较。如果相对于非患病细胞，观察到细胞中的表观转录组RNA修饰分析或RNA结合蛋白与一种或多种RNA之间的相互作用分析存在任何差异，则可以对受试者施用疾病或病症的治疗。一种或多种非患病细胞中的表观转录组RNA修饰和/或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用可以作为对照实验与患病细胞中的表观转录组RNA修饰一起进行分析。一种或多种非患病细胞中的表观转录组RNA修饰和/或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用先前也可能已经进行了分析，并且可以将患病细胞中的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的分析与非患病细胞的该参考数据进行比较。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗受试者的疾病或病症的方法，包括以下步骤:
a)使取自受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；和
f)如果观察到细胞中表观转录组RNA修饰分析相对于一种或多种非患病细胞的差异，则对受试者施用疾病或病症的治疗。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗受试者的疾病或病症的方法，包括以下步骤:
a)使取自受试者的一个细胞(或多个细胞，例如，在完整的组织中)与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包括第一探针(即，“挂锁探针”)和第二探针(即，“引物探针”)，其中:
i)第一探针包含与第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每种感兴趣的RNA的独特序列，例如通过如本文所讨论的SEDAL测序)；和
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；和
f)如果观察到细胞中表观转录组RNA修饰分析相对于一种或多种非患病细胞的差异，则对受试者施用疾病或病症的治疗。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗受试者的疾病或病症的方法，包括以下步骤:
a)使取自受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中由RNA结合蛋白结合的每个感兴趣的RNA的身份和位置；和
f)如果观察到细胞中RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用分析相对于一种或多种非患病细胞的差异，则对受试者施用疾病或病症的治疗。
在一些实施方案中，使用本文公开的方法，一种或多种非患病细胞中的表观转录组RNA修饰，或一种或多种非患病细胞中RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用，可以作为对照实验同时分析。在一些实施方案中，与患病细胞的分析相比，一种或多种非患病细胞中的表观转录组RNA修饰数据，或一种或多种非患病细胞中RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用的分析包括来自之前对非患病细胞进行该方法时的参考数据。
可以向受试者施用针对疾病或病症的任何合适的治疗。在一些实施方案中，治疗包括施用治疗剂。在一些实施方案中，治疗包括手术。在一些实施例中，治疗包括成像。在一些实施方案中，治疗包括进行进一步的诊断方法。在一些实施方案中，治疗包括放射疗法。在一些实施方案中，治疗剂是小分子、蛋白质、肽、核酸、脂质或碳水化合物。在一些实施方案中，治疗剂是已知药物和/或FDA批准的药物。在某些实施方案中，蛋白质是抗体。在某些实施方案中，蛋白质是抗体变体。在某些实施方案中，蛋白质是受体或其片段或变体。在某些实施方案中，蛋白质是细胞因子。在某些实施方案中，核酸是mRNA、反义RNA、miRNA、siRNA、RNA适体、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)或反义寡核苷酸(ASO)。
通过本文描述的方法预期治疗任何疾病或病症。在一些实施方案中，疾病或病症是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝病、脾病、肺病、血液病、神经学疾病、胃肠(GI)道疾病、泌尿生殖系统疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢紊乱、免疫紊乱、中枢神经系统(CNS)紊乱、神经系统紊乱、眼科疾病或心血管疾病。
在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，样品包括生物样品。在一些实施方案中，样品包括组织样品。在某些实施方案中，组织样品是活检(例如，骨、骨髓、乳房、胃肠道、肺、肝、胰腺、前列腺、脑、神经、肾、子宫内膜、宫颈、淋巴结、肌肉或皮肤活检)。在某些实施方案中，活检是肿瘤活检。在某些实施方案中，活检是实体瘤活检。在一些实施方案中，组织样品是脑组织样品。在某些实施方案中，组织样品是中枢神经系统组织样品。在某些实施方案中，生物样品的表观转录组分析告知指导治疗的预后决策，包括但不限于，用于治疗各种病况的药物干预，例如糖尿病、精神疾病、肝病、肾病、血液病、内分泌或外分泌疾病、心脏病、癌症治疗例如化疗、靶向治疗、免疫治疗(例如，检查点抑制、CAR-T、癌症疫苗等)、代谢紊乱、或免疫和自身免疫性疾病。
筛选能够调节一种或多种RNA表观转录组修饰的试剂的方法
另一方面，本公开提供了筛选能够调节一种或多种感兴趣的RNA的表观转录组修饰或调节RNA结合蛋白与RNA或一种或多种感兴趣的RNA之间的相互作用的试剂的方法。例如，在一种或多种候选试剂存在的情况下，用于分析本文所述的表观转录组RNA修饰或RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的方法可以在一个细胞中(或在多个细胞中，例如，在完整的组织中)进行。可以将细胞(例如，正常细胞或患病细胞)中各种表观转录组修饰的感兴趣的RNA或由RNA结合蛋白结合的感兴趣的RNA的表达与未暴露于一种或多种候选试剂的细胞中相同的感兴趣的RNA的表达进行比较。表观转录组RNA修饰分析或RNA结合蛋白与RNA之间相互作用分析相对于未暴露于候选试剂的细胞的任何差异都可能表明一种或多种感兴趣的RNA的表观转录组修饰，或者一种或多种感兴趣的RNA与一种或多种RNA结合蛋白之间的相互作用由一种或多种候选试剂调节。在一些实施方案中，已知与疾病的治疗相关的特定特征(例如，多个感兴趣的RNA的表观转录组修饰，或RNA结合蛋白与多个感兴趣的RNA的相互作用)可用于鉴定能够以期望方式调节表观转录组RNA修饰的候选试剂。本文描述的方法还可用于鉴定具有某些副作用的药物，例如，当一个或多个细胞用候选试剂或已知药物处理时，通过寻找特定的表观转录组RNA修饰特征或RNA结合蛋白与感兴趣的RNA之间相互作用的特征。
在一些实施方案中，本公开提供了筛选能够调节一种或多种RNA表观转录组修饰的试剂的方法，包括以下步骤:
a)使正在用或已经用候选试剂处理的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；
其中，在存在候选试剂的情况下，细胞中表观转录组RNA修饰的分析，相对于不存在候选试剂的情况的差异表明候选试剂调节表观转录组RNA修饰。
在一些实施方案中，本公开提供了筛选能够调节一种或多种RNA表观转录组修饰的试剂的方法，包括以下步骤:
a)使正在用或已经用候选试剂(或多种候选试剂和/或已知药物的组合，例如，化合物筛选文库所提供的)处理的一个细胞(或多个细胞，例如在完整组织中)与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针(即，“挂锁探针”)和第二探针(即，“引物探针”)，其中:
i)第一探针包含与第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每种感兴趣的RNA的独特序列，例如通过如本文所讨论的SEDAL测序)；和
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；
其中，在存在候选试剂的情况下细胞中表观转录组RNA修饰的分析，相对于不存在候选试剂的情况的差异表明候选试剂调节表观转录组RNA修饰。
在一些实施方案中，本公开提供了筛选能够调节RNA与RNA结合蛋白之间相互作用的试剂的方法，该方法包括:
a)使取自受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入聚合物基质中的串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定细胞中由RNA结合蛋白结合的每个感兴趣的RNA的身份和位置；
其中，在存在候选试剂的情况下RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用的分析，相对于不存在候选试剂的情况的差异表明候选试剂调节RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用。
在一些实施方案中，候选试剂是小分子、蛋白质、肽、核酸、脂质或碳水化合物。在一些实施方案中，候选药剂包括已知药物或FDA批准的药物。在某些实施方案中，蛋白质是抗体。在某些实施方案中，蛋白质是抗体片段或抗体变体。在某些实施方案中，蛋白质是受体。在某些实施方案中，蛋白质是细胞因子。在某些实施方案中，核酸是mRNA、反义RNA、miRNA、siRNA、RNA适体、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)或反义寡核苷酸(ASO)。在一些实施方案中，提供了多种候选试剂作为筛选文库。可以使用本文描述的方法来筛选任何候选试剂。具体地，可以使用本文描述的方法筛选被认为能够调节一种或多种感兴趣的RNA的表观转录组修饰或一种或多种感兴趣的RNA与RNA结合蛋白的相互作用的任何候选试剂。在一些实施方案中，候选试剂对一种或多种感兴趣的RNA的表观转录组修饰和/或一种或多种感兴趣的RNA与RNA结合蛋白的相互作用的调节与减少、缓解或消除疾病或病症的症状或预防疾病或病症的发生或进展相关。在一些实施方案中，疾病或病症是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝病、脾病、肺病、血液病、神经学疾病、精神疾病、胃肠(GI)道疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢紊乱、免疫紊乱、中枢神经系统(CNS)紊乱或心血管疾病。
探针
本公开还提供了用于分析本文所述的表观转录组RNA修饰的方法和系统中的探针对。在一个方面，本公开提供了探针对，其包含第一探针(本文也称为“挂锁”探针)和第二探针(本文也称为“引物”探针)，其中:
i)第一探针包含与第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每种感兴趣的RNA的独特序列，例如通过如本文所讨论的SEDAL测序)；和
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
本文描述的所有探针可以任选地在每个所提及的组分之间具有不同核苷酸长度的间隔区或接头，或者寡核苷酸探针的组分可以直接彼此连接(即，通过磷酸二酯键)。本文描述的所有探针可以包含标准核苷酸，或者一些标准核苷酸可以取代本领域已知的任何修饰的核苷酸。
探针对中的第二探针(本文中也称为“引物探针”)包含识别表观转录组RNA修饰的部分(即，存在于特定感兴趣RNA上的转录后修饰)。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含肽。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含适体。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含小分子。在某些实施方案中，第二探针通过包括生物素-链霉亲和素相互作用的机制结合表观转录组修饰。识别表观转录组RNA修饰的探针的部分可以是蛋白质(例如，抗体或抗体变体，或任何其他能够结合特定表观转录组修饰的蛋白质)。在一些实施方案中，蛋白质是PAPG。在某些实施方案中，PAPG识别并结合识别表观转录组RNA修饰的抗体。在一些实施方案中，识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。例如，第二探针可包含二抗，并且一抗可用于结合表观转录组RNA修饰。然后，第二探针上的二抗识别与表观转录组RNA修饰结合的一抗。参见，例如图1。在某些实施方案中，识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含抗体(例如，二抗)或抗体变体。当识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分是二抗时，该二抗可以结合识别表观转录组RNA修饰的一抗。在一些实施方案中，一抗是抗m6A抗体、抗m1A抗体、抗假尿苷抗体、抗m6Am抗体、抗m7G抗体、抗ac4C抗体、抗Nm抗体或抗m5C抗体。其他表观转录组修饰包括Kumar,S.et al.,Frontiers in Cell andDevelopmental Biology.9(2021)；和Harcourt,E.M.et al.,Nature.541,339-346(2017)中描述的那些。本公开还考虑使用能够结合本文所述探针上的表观转录组RNA修饰的任何试剂来代替抗体。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质是m6A-特异性YTH结构域蛋白或其一部分。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含抗体或抗体变体。
除了识别表观转录组RNA修饰的部分之外，第二探针还包含与第一探针的一部分互补的部分。在本文提供的探针对中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在每个探针组上可以是相同的。在一些实施方案中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在每个探针对上是唯一的。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3-20、约4-19、约5-18、约6-17、约7-16、约8-15、约9-14、约10-13或约11-12个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。
在一些实施方案中，第二探针的每个部分通过任选的接头连接。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，接头是非核苷酸接头(例如，氨基酸、化学接头、聚合物等)。在一些实施方案中，探针对中的第二探针包含以下结构:
5’-[识别表观转录组RNA修饰的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[代表第二探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。
本文提供的探针对中的第一探针(本文也称为“挂锁”探针)包括与第二探针互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约3-20、约4-19、约5-18、约6-17、约7-16、约8-15、约9-14、约10-13或约11-12个核苷酸。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。在某些实施方案中，与第二探针互补的第一探针的寡核苷酸部分在第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
本文提供的探针对中的第一探针还包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10-30、约11-29、约12-28、约13-27、约14-26、约15-25、约16-24、约17-23、约18-22或约19-21个核苷酸。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或多于30个核苷酸。
本文公开的探针对中的第一探针还包含由特定核苷酸序列组成的寡核苷酸条形码序列。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。本文所述的寡核苷酸探针的条形码可以包含用于鉴定感兴趣的RNA的基因特异性序列(即，已被至少一种表观转录组修饰修饰的RNA)。
本公开考虑了第一寡核苷酸探针的部分以任何顺序的排列。在一些实施方案中，第一探针的每个部分通过任选的接头连接。在一些实施方案中，任选的接头是核苷酸接头。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，任选的接头包含除核苷酸之外的其他类型的接头(例如，化学接头、肽接头等)。在一些实施方案中，第一探针包含以下结构:
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-3’；
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-3’；或者
5’-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[代表第一探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。在一些实施方案中，第一探针和/或第二探针的任何寡核苷酸部分包含DNA。
本公开还提供了用于分析本文所述的表观转录组RNA修饰的方法和系统中的探针组。在一个方面，本公开提供了探针对，其包括第一探针(本文也称为“挂锁”探针)和第二探针(本文也称为“夹板”探针)以及第三探针(本文也称为“引物”探针)，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
本文描述的探针组中的所有探针可以任选地在每个所提及的组分之间具有不同核苷酸长度的间隔区或接头，或者寡核苷酸探针的组分可以直接彼此连接(即，通过磷酸二酯键)。本文描述的所有探针可以包含标准核苷酸，或者一些标准核苷酸可以取代本领域已知的任何修饰的核苷酸。
探针组中的第二探针(本文也称为“夹板探针”)包含识别表观转录组RNA修饰的部分(即，存在于特定感兴趣的RNA上的转录后修饰)。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含肽。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含适体。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含小分子。在某些实施方案中，第二探针通过包括生物素-链霉亲和素相互作用的机制结合表观转录组修饰。识别表观转录组RNA修饰的探针的部分可以是蛋白质(例如，抗体或抗体变体，或任何其他能够结合特定表观转录组修饰的蛋白质)。在某些实施方案中，蛋白质是PAPG。在一些实施方案中，识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。例如，第二探针可包含二抗，并且一抗可用于结合表观转录组RNA修饰。然后，第二探针上的二抗识别与表观转录组RNA修饰结合的一抗。参见，例如图1。在另一个实例中，第二探针可以包含蛋白质PAPG，其可以结合与表观转录组RNA修饰结合的抗体。在一些实施方案中，PAPG识别并结合抗体，并且该抗体识别并结合表观转录组RNA修饰。在某些实施方案中，识别表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含抗体(例如，二抗)或抗体变体。在一些实施方案中，二抗识别并结合一抗，该一抗识别并结合表观转录组RNA。细胞可以在与一个或多个探针对接触之前或之后与一抗接触。在某些实施方案中，细胞在与一个或多个探针对接触之前与一抗接触。在一些实施方案中，一抗是抗m6A抗体、抗m1A抗体、抗假尿苷抗体、抗m6Am抗体、抗m7G抗体、抗ac4C抗体、抗Nm抗体或抗m5C抗体。本公开还考虑使用能够直接结合本文所述探针上的表观转录组RNA修饰的任何试剂来代替一抗。在一些实施方案中，结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分直接包含蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质是m6A特异性YTH结构域蛋白。在一些实施方案中，直接结合表观转录组RNA修饰的第二探针的部分包含抗体或抗体变体。
在一些实施方案中，探针组的第二探针还包含聚合阻断剂。聚合阻断剂可以是能够阻止在本文所述方法的步骤(c)的滚环扩增中使用第二寡核苷酸探针作为引物的任何部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂位于第二寡核苷酸探针的3’末端。聚合阻断剂可以是例如防止聚合酶使用第二寡核苷酸探针作为聚合引物的任何化学部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂是包含封闭的3’羟基的核酸残基(例如，在3’羟基上包含氧保护基)。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替3’羟基的氢。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替3’羟基的任何化学部分，所述化学部分防止添加另外的核苷酸。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含反向核酸残基。在一些实施方案中，聚合阻断剂是反向腺苷、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟苷或尿苷残基。在某些实施方案中，聚合阻断剂是反向胸腺嘧啶残基。
除了识别表观转录组RNA修饰的部分之外，第二探针还包含与第一探针的一部分互补的部分。在本文提供的探针组中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在每个探针组上可以是相同的。在一些实施方案中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在第一探针和第二探针中的每一个上是唯一的。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3-20、约4-19、约5-18、约6-17、约7-16、约8-15、约9-14、约10-13或约11-12个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。
在一些实施方案中，第二探针的每个部分通过任选的接头连接。在一些实施方案中，任选的接头是核苷酸接头。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，本文描述的探针组中的第二探针包含以下结构:
5’-[识别表观转录组RNA修饰的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[代表第二探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。
本文描述的探针组中的第一探针(本文也称为“挂锁”探针)包括与第二探针互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约4-20、约5-19、约6-18、约7-17、约8-16、约9-15、10-14或约11-13个核苷酸。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。在某些实施方案中，与第二探针互补的第一探针的寡核苷酸部分在第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
本文公开的探针组中的第一探针还包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10-30、约11-29、约12-28、约13-27、约14-26、约15-25、约16-24、约17-23、约18-22或约19-21个核苷酸。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或多于30个核苷酸。
本文公开的探针组中的第一探针还包含由特定核苷酸序列组成的寡核苷酸条形码序列。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。本文所述的寡核苷酸探针的条形码可以包含用于鉴定感兴趣的RNA的基因特异性序列(即，已被至少一种特定表观转录组修饰修饰的RNA)。
本公开考虑了第一寡核苷酸探针的部分以任何顺序的排列。在一些实施方案中，第一探针的一部分通过任选的接头连接至另一部分。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针包含以下结构:
5’-[与第二探针互补的部分]-[寡核苷酸条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第三探针互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[代表第一探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。在一些实施方案中，构成本文提供的探针组的探针的任何寡核苷酸部分包含DNA。
本文提供的探针组中的第三探针(也称为“引物探针”)包含与感兴趣的RNA互补的部分和与探针组中的第一探针互补的部分。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第三探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第三探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第三探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第三探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
在某些实施方案中，探针组的第三探针包含以下结构:
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[代表第一探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。
本公开还提供了用于分析本文所述的RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的方法和系统中的探针组。在一个方面，本公开提供了探针对，其包括第一探针(本文也称为“挂锁”探针)和第二探针(本文也称为“夹板”探针)以及第三探针(本文也称为“引物”探针)，其中:
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
用于分析RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的探针组中的第二探针(本文也称为“夹板探针”)包含识别RNA结合蛋白的部分(即，在RNA上引入表观转录组修饰的酶)。在一些实施方案中，结合RNA结合蛋白的第二探针的部分包含肽。在一些实施方案中，结合RNA结合蛋白的第二探针的部分包含适体。在一些实施方案中，结合RNA结合蛋白的第二探针的部分包含小分子。在某些实施方案中，第二探针通过包括生物素-链霉亲和素相互作用的机制结合RNA结合蛋白。识别RNA结合蛋白的探针的部分可以是蛋白质(例如，抗体或抗体变体，或任何其他能够结合特定RNA结合蛋白的蛋白质)。在一些实施方案中，识别RNA结合蛋白的第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。例如，第二探针可包含二抗，并且一抗可用于结合RNA结合蛋白。然后第二探针上的二抗识别与RNA结合蛋白结合的一抗。参见，例如图13A和13C。在某些实施方案中，识别RNA结合蛋白的第二探针的部分包含抗体(例如，二抗)或抗体变体。在一些实施方案中，二抗识别并结合一抗，该一抗识别RNA结合蛋白。细胞可以在与一个或多个探针对接触之前或之后与一抗接触。在某些实施方案中，细胞在与一个或多个探针对接触之前与一抗接触。本公开还考虑使用能够识别并直接结合本文所述探针上的RNA结合蛋白的任何试剂来代替一抗。在一些实施方案中，直接结合RNA结合蛋白的第二探针的部分包含蛋白质。在一些实施方案中，直接结合RNA结合蛋白的第二探针的部分包含抗体或抗体变体。
在一些实施方案中，探针组的第二探针还包含聚合阻断剂。聚合阻断剂可以是能够阻止在本文所述方法的步骤(c)的滚环扩增中使用第二寡核苷酸探针作为引物的任何部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂位于第二寡核苷酸探针的3’末端。聚合阻断剂可以是例如防止聚合酶使用第二寡核苷酸探针作为聚合引物的任何化学部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂是包含封闭的3’羟基的核酸残基(例如，在3’羟基上包含氧保护基)。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替3’羟基的氢。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替3’羟基的任何化学部分，所述化学部分防止添加另外的核苷酸。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含反向核酸残基。在一些实施方案中，聚合阻断剂是反向腺苷、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟苷或尿苷残基。在某些实施方案中，聚合阻断剂是反向胸腺嘧啶残基。
除了识别RNA结合蛋白的部分之外，第二探针还包含与第一探针的一部分互补的部分。在本文提供的探针组中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在每个探针组上可以是相同的。在一些实施方案中，第一探针和第二探针的彼此互补的部分在第一探针和第二探针中的每一个上是唯一的。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3-20、约4-19、约5-18、约6-17、约7-16、约8-15、约9-14、约10-13或约11-12个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第二探针的部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。
在一些实施方案中，第二探针的每个部分通过任选的接头连接。在一些实施方案中，任选的接头是核苷酸接头。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，探针组的第二探针包含以下结构:
5’-[识别RNA结合蛋白的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[代表第二探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。
用于分析本文所述的RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用的方法中使用的探针组中的第一探针(本文中也称为“挂锁”探针)包括与第二探针互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约4-20、约5-19、约6-18、约7-17、约8-16、约9-15、10-14或约11-13个核苷酸。在一些实施方案中，与第二探针的一部分互补的第一探针的部分的长度为约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。在某些实施方案中，与第二探针互补的第一探针的寡核苷酸部分在第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
本文公开的用于分析RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的方法中使用的探针组中的第一探针还包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10-30、约11-29、约12-28、约13-27、约14-26、约15-25、约16-24、约17-23、约18-22或约19-21个核苷酸。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或多于30个核苷酸。
本文公开的探针组中的第一探针还包含由特定核苷酸序列组成的寡核苷酸条形码序列。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。本文所述的寡核苷酸探针的条形码可以包含用于鉴定感兴趣的RNA的基因特异性序列(即，由至少一种RNA结合蛋白结合的RNA)。
本公开考虑了第一寡核苷酸探针的部分以任何顺序的排列。在一些实施方案中，第一探针的一部分通过任选的接头连接至另一部分。在某些实施方案中，任选的接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针包含以下结构:
5’-[与第二探针互补的部分]-[寡核苷酸条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第三探针互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，
其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[代表第一探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。在一些实施方案中，构成本文提供的探针组的探针的任何寡核苷酸部分包含DNA。
本文提供的用于分析RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的方法中使用的探针组中的第三探针(也称为“引物探针”)包含与感兴趣的RNA互补的部分和与探针组中的第一探针互补的部分。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第三探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。在一些实施方案中，与感兴趣的RNA互补的第三探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第三探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。在一些实施方案中，与第一探针的一部分互补的第三探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
在某些实施方案中，探针组的第三探针包含以下结构:
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[代表第一探针的两个部分之间的直接连接(即，磷酸二酯键)。
本文描述的所有探针可以任选地在每个所提及的组分之间具有不同核苷酸长度的间隔区或接头，或者寡核苷酸探针的组分可以直接彼此连接(即，通过磷酸二酯键)。本文描述的所有探针可以包含标准核苷酸，或者一些标准核苷酸可以取代本领域已知的任何修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供了构成本文所述的多个探针对或探针组的多个探针。在某些实施方案中，多个探针中的每个探针对或每个探针组包含与不同的感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，多个探针包括超过1、超过2、超过3、超过4、超过5、超过10、超过20、超过30、超过40、超过50、超过100、超过200、超过500、超过1000、超过2000、或超过3000个探针对或探针组。
在一些方面，本公开提供了包含多个本文所述的任何探针组的文库。在一些方面，本公开提供了包含多个本文提供的任何探针对的文库。在一些方面，本公开提供了包含来自本文提供的探针组或探针对的多个第一探针、来自本文提供的探针组或探针对的多个第二探针、或来自本文提供的探针组的多个第三探针的文库。
试剂盒
本公开还提供了试剂盒。一方面，所提供的试剂盒可包含本文所述的一个或多个探针。在一些实施方案中，该试剂盒包含本文所述的任何探针对或探针组，或多个探针对或探针组。在某些实施方案中，该试剂盒包含超过1、超过2、超过3、超过4、超过5、超过10、超过20、超过30、超过40、超过50、超过100、超过200、超过500、超过1000、超过2000、或超过3000个探针对或探针组。在一些实施方案中，该试剂盒还可以包含容器(例如，小瓶、安瓿、瓶子和/或分配器包装，或其他合适的容器)。该试剂盒还可以包含用于进行对照实验的细胞。在一些实施方案中，该试剂盒还可以包含用于进行本文公开的方法的其他试剂(例如，酶例如连接酶或聚合酶、如本文所述的胺修饰的核苷酸、一抗、二抗、缓冲液和/或用于制备聚合物基质(例如，聚丙烯酰胺基质)的试剂和单体)。在一些实施方案中，该试剂盒可用于分析细胞中的表观转录组RNA修饰。在一些实施方案中，该试剂盒还可用于分析未修饰的RNA以及表观转录组修饰的RNA(即，该试剂盒还包括用于分析未修饰的感兴趣的RNA的探针对)。在一些实施方案中，该试剂盒可用于分析细胞中RNA结合蛋白与RNA之间的相互作用。在一些实施方案中，该试剂盒可用于诊断受试者的疾病。在一些实施方案中，该试剂盒可用于筛选能够调节一种或多种RNA的表观转录组修饰的试剂。在一些实施方案中，该试剂盒可用于诊断受试者的疾病或病症。在一些实施方案中，该试剂盒可用于治疗受试者的疾病或病症。在某些实施方案中，本文描述的试剂盒还包括使用该试剂盒的说明书。
系统
一方面，本公开提供了用于分析细胞中表观转录组RNA修饰的系统。在一些实施方案中，这样的系统包括：
a)一个细胞(或在多个细胞中，例如，在完整的组织中)；
b)一个或多个探针对，其包含第一探针(即，“挂锁探针”)和第二探针(即，“引物探针”)，其中:
i)第一探针包含与第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列(例如，用于鉴定每种感兴趣的RNA的独特序列，例如通过如本文所讨论的SEDAL测序)；和
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；和
d)计算机。
在一些实施方案中，本公开提供的系统包括：
a)细胞；
b)一个或多个探针组，其包含第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；和
d)计算机。
在一些实施方案中，本公开提供的系统包括：
a)细胞；
b)一个或多个探针组，其包含第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)第一探针包含与第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及与第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)第三探针包含与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；和
d)计算机。
本文描述的任何探针(即，探针对)可用于本公开所考虑的系统中。在一些实施方案中，表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6Am)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。在某些实施方案中，表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。
在一些实施方案中，系统还包括在计算机上运行的软件。在一些实施方案中，该系统还可以包括其他试剂(例如，酶例如连接酶或聚合酶、如本文所述的胺修饰的核苷酸、一抗、二抗、缓冲液和/或用于制备聚合物基质(例如，聚丙烯酰胺基质)的试剂和单体)。
实施例
实施例1:表观转录组原位单细胞分析
已经开发了一系列单细胞多组学技术，涵盖从染色体结构到细胞表面蛋白质展示的广泛离散信息。本文描述的表观转录组RNA修饰的单细胞分析方法在单细胞多组学技术领域中是独特的，因为其具有显著的多功能性和适应不同用途的能力。各种化学和生物技术工具，包括RNA-水凝胶交联、代谢标记、DNA条形码和原位测序与本文所述的方法相结合，以高通量方式检测表观转录组RNA修饰。本文描述的方法可用于理解RNA修饰并促进对与表观转录组修饰相关的人类疾病的理解。
转录组的化学修饰在RNA活性、加工(例如，前体mRNA的)、稳定性、输出和翻译的调节中起着至关重要的作用。这些细胞RNA的化学修饰多种多样且普遍存在，为调节基因表达提供了另外的复杂性。表观转录组学已在第二代测序中得到探索，但为了加深对RNA修饰的理解，需要一种策略来研究天然细胞环境中修饰的RNA的空间排列，并且以多重和高通量的方式。本文描述的方法通过使用将RNA修饰结合部分(例如，RNA修饰结合抗体)与寡核苷酸引物缀合的探针来解决这两个问题。因此，可以使用探针上存在的寡核苷酸条形码序列顺序来解码和鉴定具有特定表观转录组修饰的RNA的身份(图1)。
该方法的实用性通过检测最丰富和最普遍的RNA修饰之一，N6-甲基腺苷(m6A)，mRNA加工、翻译和降解中重要的表观转录组标志物来证明。在细胞中检测到m6A修饰的β-肌动蛋白转录本(图2A-2D)。β-肌动蛋白是m6A修饰的细胞中常见且丰富的mRNA。原始图像显示，与若干阴性对照(图2B-2D)相比，可以看到与β-肌动蛋白mRNA相对应的信号(图2A)。
实施例2：完整组织中的RNA修饰的原位单细胞分析
最近的证据表明，RNA修饰不仅是微妙的结构修饰剂，而且还是活跃的基因调节剂3。特别是，mRNA修饰(例如，N6-甲基腺苷)几乎影响RNA转录本从出生到死亡的生命周期的每一步，包括剪接、核输出、存储、细胞定位、翻译和衰变3。然而，目前尚不清楚为什么mRNA修饰是非化学计量的。对于给定基因，许多修饰位点并未100％标记，并且许多RNA去修饰酶动态调整修饰状态。需要新的方法来确定这些对比鲜明的RNA修饰状态在mRNA行为中发挥什么作用，而这一点会被批量采样严重混淆。目前还不清楚mRNA修饰如何影响细胞内mRNA的亚细胞位置。鉴于mRNA修饰的非化学计量性质，至少有两种可能的假设:在单个细胞内，具有不同修饰状态的mRNA具有不同的时空特性，以精确控制蛋白质产生的位置和持续时间；或者明显的非化学计量是混合不同细胞状态和细胞类型的结果，因为之前的测量都是对数百万个细胞进行的。最后，mRNA修饰的作用在不同细胞类型和状态之间的差异也是未知的。大量表观转录组测序结果表明，不同的器官具有不同的表观转录组特征，这些特征在不同的发育和疾病阶段会发生变化3。此外，考虑到任何给定器官内细胞类型的多样性，需要单细胞表观转录组测序方法来揭示细胞类型特异性修饰模式。剖析这种多样性将使我们能够更深入地了解表观转录组通路。
目前的批量表观转录组测序方法有许多局限性，包括它们需要数百万个细胞作为输入材料。这导致单分子化学计量和单细胞敏感性的丧失。此外，在空间关系必不可少的应用，例如发育通路和神经元组织中，解离的组织样品是不够的5。目前，RNA修饰的成像方法可以一次仅靶向一个基因，也可以在不区分基因身份的情况下检测所有修饰位点。值得注意的是，许多修饰的RNA是作为大基因组被调节。因此，有必要同时测量至少数百个修饰基因(最好是转录组范围内的)用于有意义的数据分析。
总的来说，本文描述的方法代表了具有空间分辨率的单细胞表观转录组分析的变革工具箱。这样的系统在多种生物过程中具有广泛的应用。鉴于RNA修饰在所有真核细胞和在细胞核内复制的RNA病毒之间共享，RNA修饰在癌症、免疫学、RNA病毒学等领域得到了积极的研究。此外，这些修饰的空间分布在神经科学、干细胞分化和发育生物学等领域可能很重要。本文描述的方法也有可能提供大脑的综合转录组学和表观转录组学空间细胞分析，这些分析无法通过现有的方法和新的科学知识描绘出RNA修饰如何调节不同细胞类型的细胞功能以及单细胞事件如何共同影响组织功能。除了m6A，还有其他类型的mRNA修饰(例如，1-甲基腺苷、假尿苷等)可以使用类似的策略进行处理。此外，tRNA有大量不同的修饰3。越来越多的证据表明，它们还可以影响蛋白质翻译以响应各种信号、压力和人类疾病3,5。
N6-甲基腺苷(m6A)是存在于所有高等真核生物的信使RNA中最普遍的内部修饰。这种修饰是非化学计量的，由m6A甲基转移酶复合物METTL3/14(“writers”)来安装，其缺乏对脊椎动物来说是致命的；其存在进一步由影响发育、生育力和营养代谢的m6A脱甲基酶(ALKBH5/FTO；“erasers”)动态调节3。m6A结合蛋白家族，YTHDF和YTHDC，特异性识别m6A修饰的mRNA并调节mRNA剪接、输出、翻译和降解12,13。总之，m6A调节蛋白赋予基因表达快速响应和可控的蛋白质产生，这在干细胞分化和动物发育过程中至关重要3,14。
大量啮齿类动物的m6A测序表明，m6A在全脑转录组中普遍存在，修饰数千个编码基因和数百个非编码基因(图6)15,16。动物中m6A通路的研究表明，m6A调节神经元功能，包括皮质生成、小鼠中脑中的多巴胺能信号传导、果蝇的飞行和运动行为、成年小鼠的神经发生以及小鼠的轴突再生。m6A的上调已被观察到随大脑成熟、行为体验和记忆形成发生，这表明m6A积累和大脑活动之间存在联系6。除了正常的生理过程外，m6A丰度和m6A甲基转移酶和去甲基酶的遗传变异与注意力缺陷/多动障碍(ADHD)、重度抑郁症(MDD)、成瘾、癫痫和神经变性有关17。
尽管早期发现了m6A与大脑功能之间的关联，然而，在这种关联和机制之间还存在着巨大的知识差距。单细胞RNA测序揭示了数百种分子定义的细胞类型18，而批量m6A-seq在单细胞水平上掩盖了m6A表观转录组的潜在多样性。例如，m6A去甲基化酶FTO经由中纹状体前额叶区域的多巴胺信号传导奖励回路调节奖励行为19，这表明m6A依赖性基因调控在特定的神经元细胞类型中可能更强，并且偏向于特定的神经回路。此外，许多与大脑相关的研究直接承认并利用了从细胞培养物中的m6A发现的分子机制来解释小鼠的表型。这种方法可能存在问题，因为m6A通路涉及多种酶和结合蛋白，它们的不同组合可能会导致截然不同的功能结果。而且，这样的体外实验消除了大部分这些细胞行为的背景依赖性。因此，非常需要直接研究感兴趣的动物模型中的m6A表观转录组以解释行为表型，而不是使用体外细胞培养模型。总而言之，很明显，完整组织中原位m6A-seq的缺乏是一个重要的限制，本文描述的方法解决了这些问题。
用于3D-m6A-seq的方法是利用m6A特异性结合剂、邻近扩增和原位RNA测序开发的(图7)：(1)m6A-结合剂(抗m6A抗体或生化纯化的m6A特异性YTH结构域蛋白12,13)与DNA引物缀合并用于对感兴趣的样品进行染色；(2)然后使用DNA挂锁探针与m6A位点附近的RNA序列杂交。先前获得的来自批量m6A-seq的m6A位点为这些探针的设计提供信息，这些探针的文库允许高度多重靶向数千个m6A位点；(3)挂锁探针通过RNA模板DNA连接酶环化(例如，SplintR)；(4)然后接近m6A位点的环化DNA探针通过滚环扩增(RCA，数千个串联重复)来扩增，而那些靠近未甲基化位点的探针由于缺乏与环化所需的m6A结合剂附接的互补引物而无法扩增；(5)每个挂锁探针含有5碱基或更长的条形码来编码基因身份(>1000个基因)和另一个1碱基条形码来编码转录本内的m6A位点同一性(5轮测序允许每个转录本最高达20个位点；>99％的m6A修饰的基因具有每个转录本<20个位点；和(6)基因同一性和m6A位点同一性分别通过6轮组合SEDAL测序和5轮顺序SEDAL测序读出11。这种3D-m6A-seq的结果是通过基因身份、3D坐标和m6A峰的数量/位置解析的单个RNA分子的集合。这些数据可以直接可视化和分析，以亚细胞分辨率(大约150-400nm空间分辨率，这取决于DNA扩增子的大小和光学极限11)揭示基因表达的空间分布。细胞体染色(例如，尼氏染色法)和细胞分割后，RNA可以归属于每个细胞。然后可以分析数据，同时进行细胞类型分类，评估单细胞基因表达变异和m6A甲基化状态。
先前的研究基于以下证据已经建立了m6A和神经活动之间的紧密联系:(1)活性调节基因(ARG)和突触RNA是m6A修饰的；(2)m6A通路的破坏损害神经可塑性和长期记忆的形成；和(3)当动物参与特定类型的行为(恐惧、奖励、压力等)时，总m6A丰度会发生变化。本文所公开的方法有助于在亚细胞分辨率下进一步剖析全局神经刺激过程中m6A的时空模式。3D-m6A-seq可用于研究两种最成熟的生物系统，用于神经活动的分子水平研究:原代神经元细胞培养物的氯化钾(KCl)去极化和小鼠的暗/光调节(图8)11。可以在刺激前后的一系列时间点收集样品，追踪m6A表观转录组在响应全局神经元刺激时的时空动态和单细胞多样性，评估m6A RNA在立即早期基因(IEG)和晚应答基因(LRG)中的分布。
在获得单细胞解析的m6A模式后，可以进一步确定形成这种模式的基因调控机制。可以采用两种方法来解决这个问题：(1)将单细胞m6A模式与m6A相关蛋白(甲基转移酶、去甲基化酶和结合蛋白)的表达水平进行综合分析，生成哪些蛋白与表达和m6A模式中的变化相关的假设；(2)细胞类型特异性基因扰动(敲低或过表达)实验，确定哪些因素能够影响不同细胞类型的表观转录组基因表达调控。
现有的批量表观转录组测序方法需要数百万个细胞作为输入材料，缺乏单分子化学计量、单细胞灵敏度和空间分辨率。目前的RNA修饰成像方法一次只能靶向一个基因，或者在不区分基因身份的情况下检测所有修饰位点。RNA修饰的3D原位测序能够以前所未有的分辨率和精度同时、高度多重地绘制表观转录组:具有完整生物组织中数千个基因的单分子化学计量和3D坐标。
实施例3：单细胞表观转录组学的三维原位分析
转录组是将信息从上游基因组传递到下游蛋白质组的关键机制，调节许多细胞过程。近年来，单细胞RNA测序和空间转录组技术已成功绘制了各种生物样品的转录组，揭示了各种系统中复杂的细胞间异质性。然而，转录组中嵌入了RNA序列之外的另外的信息。这些另外的信息被称为外转录组，即包括mRNA上的化学修饰如N6-甲基腺苷(m6A)以及与其相关的RNA结合蛋白(RBP)，它们在调节mRNA生命周期的几乎每个阶段都是至关重要的，包括mRNA合成、易位、翻译和降解。了解表观转录组的空间分辨、单细胞特征对于更全面地了解mRNA在不同细胞类型和状态中的调节至关重要。此外，人们对m6A的亚细胞分布以及这些模式如何与m6A的调节作用相关联知之甚少。本公开描述了原位m6A作图(m6A-map)的方法，这是一种用于以亚细胞分辨率对m6A进行三维(3D)原位分析的尖端技术平台。该方法用于在亚细胞水平上生成基于成像的单细胞描述，目的是为m6A的空间分布提供新的视角。从基础研究的角度来看，这种方法可以推广到帮助理解其他RNA修饰、它们相关的RBP及其相互作用。将m6A-map应用于完整组织也有助于鉴定病因和理解与异常的m6A水平相关的疾病和障碍的发展。
为了更好地了解不同的细胞状态和类型，已经开发了多种单细胞和空间转录组分析方法来绘制转录组水平的异质性，但这些工具仅描述细胞状态，而不是揭示异质转录组背后的机制。因此，表观基因组和表观转录组需要在单细胞水平上以空间分辨率进行研究，因为它们包括负责调节mRNA生命周期每个阶段的核酸携带的附加信息。
在所有的表观转录组修饰中，m6A是最丰富的，可以说是mRNA上最重要的修饰，据报道，m6A可以调节mRNA的翻译效率、稳定性、易位和剪接(图9A)。此外，m6A还参与许多组织水平的生物过程，包括学习和记忆、癌症进展和神经变性。因此，不同的细胞很可能表现出异质性m6A甲基化并利用m6A以不同的方式调节它们的转录组。
然而，表观转录组学研究中单细胞分辨率的缺乏掩盖了生物组织中m6A模式的异质性并削弱了剖析m6A如何在不同细胞类型中调节基因表达的能力。到目前为止，关于m6A在不同细胞类型和状态下如何调节mRNA，以及亚细胞分布模式如何与m6A的调节作用相关联，我们知之甚少(图9B)。例如，细胞类型/状态特异性m6A甲基化组究竟是什么，基于m6A甲基化组是否可以将相同的细胞类型划分为颗粒亚型，m6A-mRNA和非m6A-mRNA在亚细胞水平和组织水平上是否表现出不同的定位，异质m6A如何影响不同细胞类型中RNA生命周期的不同动力学，以及许多其他此类问题仍未得到解答(图9C)。
此前，已经开发了各种工具来定性和定量地检测m6A修饰，但没有一种工具可以同时提供高通量和单细胞、单碱基和空间分辨率。本公开描述了m6A-map(m6A的原位单细胞作图)，一种新的克服了先前方法的上述局限性，并在亚细胞分辨率上解析了m6A甲基化组的方法(图9D)。
HeLa细胞的方法设计和开发(m6A-map v1)
首先，将两组三部分探针(每个探针组包括引物和5’磷酸化、独特条形码的挂锁探针)与每个假定的m6A位点旁边的mRNA区域原位杂交。为了实现敏感和特异性的m6A检测，m6A识别与寡核苷酸探针(探针组中的第三探针)的募集相关联。PAPG，一种特异性识别抗体Fc区的嵌合蛋白，与寡核苷酸缀合(图10B)。寡核苷酸作为夹板探针，用于原位近距离连接挂锁探针。这样，只有具有m6A的位点才会将其相应的挂锁探针进行环化。此外，为了克服自发荧光和光学散射，采用原位滚环扩增(RCA)对环化的挂锁探针进行扩增。为了在多轮测序和分离过程中保留扩增子的位置并稳定细胞结构，在RCA反应中加入氨基烯丙基-dUTP，使扩增产物(扩增子)通过伯胺基团官能化，然后通过甲基丙烯酸N-羟基丁二酰亚胺酯(MA-NHS)进一步丙烯酰化，并嵌入聚丙烯酰胺水凝胶网络中。最后，对挂锁探针上的条形码进行原位测序，实现最多达数千个基因的多重性(图10A)。细胞培养和组织中单个m6A位点(ACTB和MALAT1)的检测已经表明，抗m6A组中的信号富集程度是非特异性IgG对照组的15-30倍(图10C和10E)。
在上述工作流程中，PAPG可被替换为二抗。可以使用例如SiteClick抗体标记试剂盒将二抗缀合至寡核苷酸(图11A)。m6A-map v1用兔二抗进行测试(图11B)。还测试了不依赖于抗体的生物素化-YTH-链霉亲和素-寡核苷酸检测方案(图10D)。
该方法还可以通过多种方式进行优化。例如：(1)探针的最佳位置是在距离感兴趣的m6A位点10nt处；(2)可以在杂交混合物中加入rRNA阻断探针，其可以与含有m6A位点的rRNA序列杂交，以减少来自rRNA m6A位点的m6A信号，该信号是假阳性的；和(3)在杂交之前将mRNA锚定在水凝胶上，然后进行蛋白酶处理，可以使抗体更好地扩散到样品中(例如，优先与RNA反应的EDC可用于将可聚合的柄附着在RNA上)。
Hela细胞的方法设计和开发(m6A-map v2)
虽然m6A-map v1只能检测m6A修饰的RNA，而不能检测未甲基化的RNA，但同时检测甲基化和未甲基化的RNA是非常有价值的，考虑到以下几点:(1)利用标志物基因表达对细胞状态或细胞类型进行分类；(2)估计m6A化学计量，以区分来自某个基因的较高m6A信号是由于较高的表达水平还是较高的m6A分数；(3)甲基化RNA与非甲基化RNA差异定位的比较；和(4)与其他原位测序数据的整合。一种更新的方法，m6A-map v2，为了解决这个问题而设计。第二次杂交之前的步骤与m6A-map v1相同。第一次RCA后，使用STARmap探针进行第二次杂交，其允许检测非m6A RNA，然后连接和第二次RCA (图12A)。如果已经有DNA扩增子附着在RNA上，则第二次RCA将无法发生，因为第一个DNA扩增子已占据了大部分可用空间(图12B)。从而可以分别定量m6A和非m6A RNA，并计算m6A RNA的分数。细胞培养中单个m6A位点(ACTB和MALAT1)处的m6A分数的定量已显示(图12C和12D)。不同细胞周期的m6A分数确实存在差异，并且m6A RNA和非m6ARNA表现出明显的亚细胞定位。
Hela细胞的方法设计和开发(RBP-RNA作图)
除了m6A外，RBP-RNA相互作用是表观转录组的另一个关键方面，因为大多数mRNA修饰经由各种RBP的差异结合来实现其功能。尽管已经开发了多种单细胞RBP-RNA相互作用组作图方法，但这些方法要么专门用于检测核糖体-mRNA相互作用，要么需要转染外源基因构建体。此外，它们无法保留细胞的空间位置和RBP-RNA相互作用的亚细胞位置。
此外，m6A根据环境有时具有相互矛盾的功能，主要原因是它可能被不同的读取器rbp结合，从而触发完全不同的下游通路。多重检测方法对于解释来说是理想的。因此，我们开发了原位多路复用RBP-RNA作图技术，该技术包括将寡核苷酸缀合的抗体信息传递到挂锁探针上，然后对传递的条形码信息进行原位测序(图13A)。单一RBP-RNA作图的可行性已经得到证实(图13B)，下一步是复用该方法(图13C)。这种方法可用于确定表观转录组和RBP-RNA相互作用如何促进细胞状态/类型特异性转录组调节和组织功能。在Hela细胞中进行100个基因检测作为概念验证研究
为了进一步证明m6A-map可以以高通量的方式检测多个m6A位点，对基于荧光泛素化的细胞周期指标(FUCCI)HeLa细胞进行100个基因检测。同时进行空间转录组分析(STARmap)和m6A-map v1。对不同厂商的抗体进行检测，以选择检测效率最高的抗体。细胞核用DAPI染色，而细胞体用Flamingo染色，内质网(ER)用刀豆球蛋白A染色，这使得三个中等表达的管家基因(HMBS、MRPL19和PGK1)的探针实现可视化。观察到与IgG对照一致的抗m6A信号富集(图14)，进一步验证了方法优化中实现的信噪比(SNR)。来自m6A-map v1 100个基因数据集的发现
对m6A-map v1的原位测序数据和FUCCI成像数据通过去卷积、斑点查找、读取分配、细胞和亚细胞分割、对准、滤波和归一化进行预处理。m6A-map的读取数低于STARmap(图15A和15C)。Invitrogen RM362抗m6A抗体实现了最佳信噪比(SNR)，对于大多数基因的SNR达到了25(图15B)。两种抗m6A抗体之间测量的m6A化学计量的相关性(m6A-map中的读数/STARmap中的读数)紧密相关，验证了该方法的稳健性(图15D)。不同基因的m6A化学计量与其表达水平呈轻微负相关，这表明m6A主要促进mRNA的衰变(图15E)。该方法可用于半定量评估相对m6A化学计量，显示了与文献报道的一些代表性基因的化学计量呈正相关(图15F和15H)。
为了评估m6A生物学并获得更多的生物学见解，分析了m6A与非m6AmRNA的亚细胞分布模式。研究发现，具有更多m6A沉积的mRNA沉积往往更容易定位于细胞质，证实了m6A促进核出口的生物学功能(图16A)。受m6A沉积强烈影响的基因包括许多与翻译相关的基因，如EEF2、SRP19和MRPL20，这表明m6A可能对翻译相关蛋白的高效产生很重要。YTHDC1靶向mRNA可能表现出对用于核出口的m6A更高的依赖性。
还对数据集进行了细胞周期分析。对每个细胞的FUCCI荧光强度进行定量，以确定不同细胞的细胞周期阶段(图16B)。计算每个基因在不同细胞周期阶段的m6A化学计量。发现许多基因表现出细胞周期依赖的m6A波动。SMAD3，一种与转录调控相关的基因，被证明在G1和S中具有较高的m6A化学计量，但在G2M中较低，这与文献中的结果一致(Fei,Q.et al.,YTHDF2promotes mitotic entry and is regulated by cell cycle mediators.PLoSBiol 18,e3000664(2020))。还发现其他基因，包括SON，在S和G1中具有更高的m6A化学计量，但在G2M中较低，而一些基因例如MALAT1在G2M和G1中具有较高的m6A化学计量，但在S中较低。
讨论
总之，一种新型策略，m6A-map，可用于在单细胞中以亚细胞分辨率测量数百或数千m6A基因座，并以半定量方式评估每个基因座的相对化学计量。m6A-map可用于发现与表观转录组相关的全新生物学见解，例如不同的表观转录组状态是否影响RNA的亚细胞定位，表观转录组如何表现出细胞间的异质性，以及m6A水平是否在不同的细胞周期阶段波动。本文所描述的方法是探索细胞培养和组织样品的m6A原位生物学的通用工具。
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本申请涉及各种已发布的专利、已公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，所有这些均通过引用并入本文。如果任何并入的参考文献与本说明书之间存在冲突，则以本说明书为准。另外，属于现有技术的本发明的任何特定实施方案可以被明确地排除在任何一个或多个实施方案之外。因为这样的实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使本文没有明确阐述排除，它们也可以被排除。本发明的任何特定实施方案可以出于任何原因从任何实施方案中排除，无论是否与现有技术的存在相关。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的具体实施方案的许多等效物。本文描述的本实施方案的范围并不旨在限于以上描述，而是如所附实施方案中阐述的。本领域的普通技术人员将理解，可以对本描述进行各种改变和修改而不脱离如以下权利要求中所定义的本发明的精神或范围。
Claims (338)
1.用于分析细胞中表观转录组RNA修饰的方法，所述方法包括：
a)使所述细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置。
2.权利要求1所述的方法，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6A)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。
3.权利要求1所述的方法，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含蛋白质。
6.权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质包含PAPG。
7.权利要求6所述的方法，其进一步包括使所述细胞与识别表观转录组RNA修饰的抗体接触，其中所述识别表观转录组RNA修饰的抗体被PAPG识别并结合。
8.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含抗体或抗体变体。
9.权利要求8所述的方法，其中所述抗体是二抗。
10.权利要求9所述的方法，其进一步包括使所述细胞与一抗接触，所述一抗识别所述表观转录组RNA修饰并被所述第二探针的二抗识别。
11.权利要求10所述的方法，其中所述细胞在与所述一个或多个探针对接触之前与所述一抗接触。
12.权利要求10或11所述的方法，其中所述一抗是抗m6A抗体、抗m1A抗体、抗假尿苷抗体、抗m6Am抗体、抗m7G抗体、抗ac4C抗体、抗Nm抗体或抗m5C抗体。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含直接结合所述表观转录组RNA修饰的试剂。
14.权利要求13所述的方法，其中所述直接结合所述表观转录组RNA修饰的试剂包含蛋白质。
15.权利要求14所述的方法，其中所述蛋白质是m6A特异性YTH结构域蛋白。
16.权利要求13所述的方法，其中所述直接结合所述表观转录组RNA修饰的试剂包含抗体或抗体变体。
17.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述第二探针还包含聚合阻断剂。
18.权利要求17所述的方法，其中所述聚合阻断剂位于第二探针的3’末端。
19.权利要求17或18所述的方法，其中所述聚合阻断剂包含反向核酸残基。
20.权利要求19所述的方法，其中所述反向核酸残基是反向胸腺嘧啶残基。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。
22.权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。
23.权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸探针和所述第三寡核苷酸探针与所述感兴趣的RNA的不同部分互补。
24.权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述第一探针包含以下结构:
5’-[与第二探针互补的部分]-[寡核苷酸条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第三探针互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，其中]-[的每个实例表示任选的接头。
25.权利要求1-24中任一项所述的方法，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-14或11-13个核苷酸。
26.权利要求1-25中任一项所述的方法，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
27.权利要求1-26中任一项所述的方法，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分在所述第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
28.权利要求1-27中任一项所述的方法，其中与所述第三探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
29.权利要求1-28中任一项所述的方法，其中与所述第三探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
30.权利要求1-29中任一项所述的方法，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
31.权利要求1-30中任一项所述的方法，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
32.权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别表观转录组RNA修饰的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，其中]-[表示任选的接头。
33.权利要求1-32中任一项所述的方法，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第二探针的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
34.权利要求1-33中任一项所述的方法，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第二探针的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
35.权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述第三探针包含以下结构：
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，
其中]-[表示任选的接头。
36.权利要求1-35中任一项所述的方法，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第三探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
37.权利要求1-36中任一项所述的方法，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第三探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
38.权利要求1-37中任一项所述的方法，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第三探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
39.权利要求1-38中任一项所述的方法，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第三探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
40.用于分析细胞中表观转录组RNA修饰的方法，所述方法包括：
a)使所述细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包括第一探针和第二探针，其中:
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列；和
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置。
41.权利要求40所述的方法，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6A)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。
42.权利要求41所述的方法，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。
43.权利要求40-42中任一项所述的方法，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。
44.权利要求40-43中任一项所述的方法，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含蛋白质。
45.权利要求44所述的方法，其中所述蛋白质包含PAPG。
46.权利要求45所述的方法，其进一步包括使所述细胞与识别表观转录组RNA修饰的抗体接触，其中所述识别表观转录组RNA修饰的抗体被PAPG识别并结合。
47.权利要求40-46中任一项所述的方法，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含抗体或抗体变体。
48.权利要求47所述的方法，其中所述抗体是二抗。
49.权利要求48所述的方法，其进一步包括使所述细胞与一抗接触，所述一抗识别所述表观转录组RNA修饰并被所述第二探针的二抗识别。
50.权利要求49所述的方法，其中所述细胞在与所述一个或多个探针对接触之前与所述一抗接触。
51.权利要求49或50所述的方法，其中所述一抗是抗m6A抗体、抗m1A抗体、抗假尿苷抗体、抗m6Am抗体、抗m7G抗体、抗ac4C抗体、抗Nm抗体或抗m5C抗体。
52.权利要求40-42中任一项所述的方法，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含直接结合所述表观转录组RNA修饰的试剂。
53.权利要求52所述的方法，其中所述直接结合所述表观转录组RNA修饰的试剂包含蛋白质。
54.权利要求53所述的方法，其中所述蛋白质是m6A特异性YTH结构域蛋白。
55.权利要求52所述的方法，其中所述结合所述表观转录组RNA修饰的试剂包含抗体或抗体变体。
56.权利要求40-55中任一项所述的方法，其中与所述第二探针互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约3-20、约4-19、约5-18、约6-17、约7-16、约8-15、约9-14、约10-13或约11-12个核苷酸。
57.权利要求40-56中任一项所述的方法，其中与所述第二探针互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10个、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。
58.权利要求40-57中任一项所述的方法，其中与所述第二探针互补的所述第一探针的寡核苷酸部分在所述第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
59.权利要求40-58中任一项所述的方法，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10-30、约11-29、约12-28、约13-27、约14-26、约15-25、约16-24、约17-23、约18-22或约19-21个核苷酸。
60.权利要求40-59中任一项所述的方法，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或多于30个核苷酸。
61.权利要求40-60中任一项所述的方法，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。
62.权利要求40-61中任一项所述的方法，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。
63.权利要求40-62中任一项所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针的每个部分通过任选的接头连接。
64.权利要求63所述的方法，其中所述任选的接头的每个实例独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸长。
65.权利要求40-64中任一项所述的方法，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-3’；
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-3’；或者
5’-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，
其中]-[的每个实例包含任选的接头。
66.权利要求40-65中任一项所述的方法，其中所述第二探针包括以下结构：
5’-[识别表观转录组RNA修饰的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，
其中]-[的每个实例包含任选的接头。
67.权利要求40-66中任一项所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针的寡核苷酸部分包含DNA。
68.权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的RNA是信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)或核糖体RNA(rRNA)。
69.权利要求1-68中任一项所述的方法，其中表观转录组RNA修饰在多个细胞中同时进行分析。
70.权利要求69所述的方法，其中所述表观转录组RNA修饰在超过10个细胞、超过20个细胞、超过50个细胞、超过100个细胞、超过200个细胞、超过300个细胞、超过400个细胞、超过500个细胞或超过1000个细胞中同时进行分析。
71.权利要求70所述的方法，其中所述细胞包含多种细胞类型。
72.权利要求71所述的方法，其中所述细胞类型选自由以下组成的组：干细胞、祖细胞、神经元细胞、星形胶质细胞、树突细胞、内皮细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、肌肉细胞、心肌细胞、间充质细胞、上皮细胞、免疫细胞、肝细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、造血细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、脂肪细胞和神经元。
73.权利要求1-72中任一项所述的方法，其中所述细胞存在于完整组织内。
74.权利要求73所述的方法，其中所述完整组织是固定的组织样品。
75.权利要求73或74所述的方法，其中所述组织是上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织。
76.权利要求1-75中任一项所述的方法，其中同时分析超过1个、超过2个、超过3个、超过4个、超过5个、超过10个、超过20个、超过30个、超过40个、超过50个、超过100个、超过200个、超过500个、超过1000个、超过2000个或超过3000个RNA的表观转录组。
77.权利要求1-76中任一项所述的方法，其中多种不同的表观转录组修饰在所述细胞中同时进行分析。
78.权利要求1-77中任一项所述的方法，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列是用于鉴定感兴趣的RNA的基因特异性序列。
79.权利要求1-78中任一项所述的方法，其中所述测序步骤包括进行通过动态退火和连接的误差减少的测序(SEDAL)。
80.权利要求1-79中任一项所述的方法，其中所述测序步骤重复两次、三次、四次、五次或多于五次。
81.权利要求1-80中任一项所述的方法，其中所述聚合物基质是水凝胶。
82.权利要求81所述的方法，其中所述水凝胶是聚乙烯醇水凝胶、聚乙二醇水凝胶、聚丙烯酸酯水凝胶或聚丙烯酰胺水凝胶。
83.权利要求1-82中任一项所述的方法，其中进行滚环扩增的所述步骤进一步包括提供胺修饰的核苷酸，其中将所述胺修饰的核苷酸掺入所述一个或多个串联的扩增子中。
84.权利要求83所述的方法，其中将所述一个或多个串联的扩增子嵌入所述聚合物基质中的步骤包括使所述一个或多个扩增子的胺修饰的核苷酸与丙烯酸N-羟基丁二酰亚胺酯反应并使所述一个或多个串联的扩增子与所述聚合物基质共聚。
85.权利要求1-84中任一项所述的方法，其进一步包括分析所述细胞内的另外的分子。
86.权利要求85所述的方法，其中所述另外的分子是未修饰的RNA、DNA、蛋白质、碳水化合物或脂质。
87.权利要求85或86所述的方法，其中所述另外的分子是未修饰的RNA。
88.权利要求87所述的方法，其中所述未修饰的RNA通过以下方式进行分析：
a)使所述细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中:
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列和与未修饰的感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分；和
ii)所述第二探针包含与所述未修饰的感兴趣的RNA互补的部分和与所述第一探针的一部分互补的部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中每个未修饰的感兴趣的RNA的身份和位置。
89.权利要求1-88中任一项所述的方法，其进一步包括通过将细胞的表观转录组RNA修饰分析与包含各种细胞类型的表观转录组RNA修饰分析的参考数据进行比较来确定所述被分析的细胞的细胞类型。
90.权利要求1-89中任一项所述的方法，其进一步包括过表达或敲除所述细胞中的一个或多个基因以确定所述一个或多个基因是否参与所述感兴趣的RNA的表观转录组修饰。
91.权利要求1-90中任一项所述的方法，其进一步包括在多个时间点的重复步骤(a)-(e)以分析所述细胞中随时间的表观转录组RNA修饰。
92.用于分析细胞中RNA结合蛋白与一种或多种感兴趣的RNA之间的相互作用的方法，所述方法包括：
a)使所述细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中由RNA结合蛋白结合的每个感兴趣的RNA的身份和位置。
93.权利要求92所述的方法，其中所述RNA结合蛋白包含YTH家族蛋白(例如，YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1或YTHDC2)、IGF2BP家族蛋白(例如，IGF2BP1、IGF2BP2或IGF2BP3)或FMR1。
94.权利要求92或93所述的方法，其中识别所述RNA结合蛋白的所述第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。
95.权利要求92-94中任一项所述的方法，其中识别所述RNA结合蛋白的所述第二探针的部分包含蛋白质。
96.权利要求95所述的方法，其进一步包括使所述细胞与识别RNA结合蛋白的抗体接触，其中所述识别RNA结合蛋白的抗体被所述蛋白质识别并结合。
97.权利要求92-94中任一项所述的方法，其中识别所述RNA结合蛋白的所述第二探针的部分包含抗体或抗体变体。
98.权利要求97所述的方法，其中所述抗体是二抗。
99.权利要求98所述的方法，其进一步包括使所述细胞与一抗接触，所述一抗识别所述RNA结合蛋白并被所述第二探针的二抗识别。
100.权利要求99所述的方法，其中所述细胞在与所述一个或多个探针对接触之前与所述一抗接触。
101.权利要求92-100中任一项所述的方法，其中识别所述RNA结合蛋白的所述第二探针的部分包含直接结合所述RNA结合蛋白的试剂。
102.权利要求101所述的方法，其中所述直接结合所述RNA结合蛋白的试剂包含蛋白质。
103.权利要求101所述的方法，其中所述直接结合所述RNA结合蛋白的试剂包含抗体或抗体变体。
104.权利要求92-103中任一项所述的方法，其中所述第二探针还包含聚合阻断剂。
105.权利要求104所述的方法，其中所述聚合阻断剂位于第二探针的3’末端。
106.权利要求104或105所述的方法，其中所述聚合阻断剂包含反向核酸残基。
107.权利要求106所述的方法，其中所述反向核酸残基是反向胸腺嘧啶残基。
108.权利要求92-107中任一项所述的方法，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。
109.权利要求92-108中任一项的方法，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。
110.权利要求92-109中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸探针和第三寡核苷酸探针与所述感兴趣的RNA的不同部分互补。
111.权利要求92-110中任一项所述的方法，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[寡核苷酸条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第三探针互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，其中]-[的每个实例包含任选的接头。
112.权利要求92-111中任一项所述的方法，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
113.权利要求92-112中任一项所述的方法，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
114.权利要求92-113中任一项所述的方法，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分在所述第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
115.权利要求92-114中任一项的方法，其中与所述第三探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
116.权利要求92-115中任一项的方法，其中与所述第三探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
117.权利要求92-116中任一项所述的方法，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
118.权利要求92-117中任一项所述的方法，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
119.权利要求92-118中任一项所述的方法，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别RNA结合蛋白的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，其中]-[包含任选的接头。
120.权利要求92-119中任一项所述的方法，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第二探针的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
121.权利要求92-120中任一项所述的方法，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第二探针的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
122.权利要求92-121中任一项所述的方法，其中所述第三探针包含以下结构：
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，其中]-[包含任选的接头。
123.权利要求92-122中任一项所述的方法，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第三探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
124.权利要求92-123中任一项所述的方法，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第三探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
125.权利要求92-124中任一项所述的方法，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第三探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
126.权利要求92-125中任一项所述的方法，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第三探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
127.权利要求92-126中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的RNA是信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)或核糖体RNA(rRNA)。
128.权利要求92-127中任一项所述的方法，其中RNA结合蛋白和感兴趣的RNA之间的相互作用在多个细胞中同时进行分析。
129.权利要求128所述的方法，其中RNA结合蛋白和感兴趣的RNA之间的相互作用在超过10个细胞、超过20个细胞、超过50个细胞、超过100个细胞、超过200个细胞、超过300个细胞、超过400个细胞、超过500个细胞或超过1000个细胞中同时进行分析。
130.权利要求129所述的方法，其中所述细胞包含多种细胞类型。
131.权利要求130所述的方法，其中所述细胞类型选自由以下组成的组：干细胞、祖细胞、神经元细胞、星形胶质细胞、树突细胞、内皮细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、肌肉细胞、心肌细胞、间充质细胞、上皮细胞、免疫细胞、肝细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、造血细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、脂肪细胞和神经元。
132.权利要求92-131中任一项所述的方法，其中所述细胞存在于完整组织内。
133.权利要求132所述的方法，其中所述完整组织是固定的组织样品。
134.权利要求132或133所述的方法，其中所述组织是上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织。
135.权利要求92-134中任一项所述的方法，其中同时分析RNA结合蛋白与超过1个、超过2个、超过3个、超过4个、超过5个、超过10个、超过20个、超过30个、超过40个、超过50个、超过100个、超过200个、超过500个、超过1000个、超过2000个或超过3000个感兴趣的RNA之间的相互作用。
136.权利要求92-135中任一项所述的方法，其中RNA结合蛋白和感兴趣的RNA之间的多种不同的相互作用在所述细胞中同时进行分析。
137.权利要求92-136中任一项所述的方法，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列是用于鉴定感兴趣的RNA的基因特异性序列。
138.权利要求92-137中任一项所述的方法，其中所述测序步骤包括进行通过动态退火和连接的误差减少的测序(SEDAL)。
139.权利要求92-138中任一项所述的方法，其中所述测序步骤重复两次、三次、四次、五次或多于五次。
140.权利要求92-139中任一项所述的方法，其中所述聚合物基质是水凝胶。
141.权利要求140所述的方法，其中所述水凝胶是聚乙烯醇水凝胶、聚乙二醇水凝胶、聚丙烯酸酯水凝胶或聚丙烯酰胺水凝胶。
142.权利要求92-141中任一项所述的方法，其中进行滚环扩增的所述步骤进一步包括提供胺修饰的核苷酸，其中将所述胺修饰的核苷酸掺入所述一个或多个串联的扩增子中。
143.权利要求142所述的方法，其中将所述一个或多个串联的扩增子嵌入所述聚合物基质中的步骤包括使所述一个或多个扩增子的胺修饰的核苷酸与丙烯酸N-羟基丁二酰亚胺酯反应并使所述一个或多个串联的扩增子与所述聚合物基质共聚。
144.权利要求92-143中任一项所述的方法，其进一步包括分析所述细胞内另外的分子。
145.权利要求144所述的方法，其中所述另外的分子是RNA、DNA、蛋白质、碳水化合物或脂质。
146.权利要求92-145中任一项所述的方法，其进一步包括通过将细胞的RNA-RBP相互作用分析与包含各种细胞类型的RNA-RBP分析的参考数据进行比较来确定所述被分析的细胞的细胞类型。
147.用于诊断受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
a)使取自受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；
其中所述细胞中的表观转录组RNA修饰分析相对于一种或多种非患病细胞的差异指示所述受试者患有所述疾病或病症。
148.用于诊断受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
a)使取自受试者的细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列；和
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；
其中所述细胞中的表观转录组RNA修饰分析相对于一种或多种非患病细胞的差异指示所述受试者患有所述疾病或病症。
149.用于诊断受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
a)使取自受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中由RNA结合蛋白结合的每个感兴趣的RNA的身份和位置；
其中所述细胞中的RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用分析相对于一种或多种非患病细胞的差异指示所述受试者患有所述疾病或病症。
150.权利要求147-149中任何一项所述的方法，其中所述一种或多种非患病细胞中的所述表观转录组RNA修饰，或所述一种或多种非患病细胞中的所述RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用，作为对照实验与取自所述受试者的细胞一起进行分析。
151.权利要求147-149中任一项所述的方法，其中所述一种或多种非患病细胞中的所述表观转录组RNA修饰的分析，或所述一种或多种非患病细胞中的所述RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用的分析包含参考数据。
152.权利要求147或148所述的方法，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6A)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。
153.权利要求147或148所述的方法，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。
154.权利要求149所述的方法，其中所述RNA结合蛋白是YTH家族蛋白(例如，YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1或YTHDC2)、IGF2BP家族蛋白(例如，IGF2BP1、IGF2BP2或IGF2BP3)或FMR1。
155.权利要求147-154中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝病、脾病、肺病、血液病、神经学疾病、精神疾病、胃肠(GI)道疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢紊乱、免疫紊乱、中枢神经系统(CNS)紊乱或心血管疾病。
156.权利要求147-155中任一项所述的方法，其中所述细胞存在于组织中。
157.权利要求156所述的方法，其中所述组织是上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织。
158.权利要求156或157所述的方法，其中所述组织是取自受试者的组织样品。
159.权利要求158所述的方法，其中所述受试者是非人实验动物。
160.权利要求158所述的方法，其中所述受试者是人。
161.用于筛选能够调节一种或多种RNA的表观转录组修饰的试剂的方法，所述方法包括：
a)使正在用或已经用候选试剂处理的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；
其中，在存在所述候选试剂的情况下所述细胞中表观转录组RNA修饰的分析，相对于不存在所述候选试剂的情况下的差异指示所述候选试剂调节表观转录组RNA修饰。
162.用于筛选能够调节一种或多种RNA的表观转录组修饰的试剂的方法，所述方法包括：
a)使正在用或已经用候选试剂处理的细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列；和
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；
其中，在存在所述候选试剂的情况下所述细胞中表观转录组RNA修饰的分析，相对于不存在所述候选试剂的情况下的差异指示所述候选试剂调节表观转录组RNA修饰。
163.用于筛选能够调节RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用的试剂的方法，所述方法包括：
a)使取自受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；和
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中由RNA结合蛋白结合的每个感兴趣的RNA的身份和位置；
其中，在存在所述候选试剂的情况下RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用的分析，相对于不存在所述候选试剂的情况下的差异指示所述候选试剂调节RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用。
164.权利要求161或162所述的方法，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6A)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。
165.权利要求161或162所述的方法，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。
166.权利要求163所述的方法，其中所述RNA结合蛋白是YTH家族蛋白(例如，YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1或YTHDC2)、IGF2BP家族蛋白(例如，IGF2BP1、IGF2BP2或IGF2BP3)或FMR1。
167.权利要求161-166中任一项所述的方法，其中所述候选试剂是小分子、蛋白质、肽、核酸、脂质或碳水化合物。
168.权利要求161-167中任一项所述的方法，其中所述候选试剂是已知的药物或FDA批准的药物。
169.权利要求167或168所述的方法，其中所述蛋白质是抗体或抗体变体。
170.权利要求167或168所述的方法，其中所述核酸是mRNA、反义RNA、miRNA、siRNA、RNA适体、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)或反义寡核苷酸(ASO)。
171.权利要求161-170中任一项所述的方法，其中调节一种或多种RNA的表观转录组修饰与减少、缓解或消除疾病或病症的症状相关联。
172.权利要求171所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝病、脾病、肺病、血液病、神经学疾病、精神疾病、胃肠(GI)道疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢紊乱、免疫紊乱、中枢神经系统(CNS)紊乱或心血管疾病。
173.用于治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
a)使取自受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；和
f)如果观察到所述细胞中表观转录组RNA修饰分析相对于一种或多种非患病细胞的差异，则对所述受试者施用所述疾病或病症的治疗。
174.用于治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
a)使取自所述受试者的细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列；和
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中每个表观转录组修饰的感兴趣的RNA的身份和位置；和
f)如果观察到所述细胞中表观转录组RNA修饰分析相对于一种或多种非患病细胞的差异，则对所述受试者施用所述疾病或病症的治疗。
175.用于治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
a)使取自受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中:
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’末端和3’末端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联的扩增子；
d)将所述一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；
e)对嵌入所述聚合物基质中的所述串联的扩增子或其一部分进行测序，以确定所述细胞中由RNA结合蛋白结合的每个感兴趣的RNA的身份和位置；和
f)如果观察到所述细胞中RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用分析相对于一种或多种非患病细胞的差异，则对所述受试者施用所述疾病或病症的治疗。
176.权利要求173-175中任一项所述的方法，其中一种或多种非患病细胞中的一种或多种RNA的表观转录组修饰，或者一种或多种非患病细胞中的RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用，作为对照实验同时进行分析。
177.权利要求173-175中任一项所述的方法，其中一种或多种非患病细胞中的一种或多种RNA的表观转录组修饰分析，或一种或多种非患病细胞中的RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用分析，包含参考数据。
178.权利要求173-177中任一项所述的方法，其中所述治疗包括施用治疗剂、手术或放射疗法。
179.权利要求173-178中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是小分子、蛋白质、肽、核酸、脂质或碳水化合物。
180.权利要求173-179中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是已知的药物或FDA批准的药物。
181.权利要求179或180所述的方法，其中所述蛋白质是抗体或抗体变体。
182.权利要求179或180所述的方法，其中所述核酸是mRNA、反义RNA、miRNA、siRNA、RNA适体、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)或反义寡核苷酸(ASO)。
183.权利要求173-182中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝病、脾病、肺病、血液病、神经学疾病、精神疾病、胃肠(GI)道疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢紊乱、免疫紊乱、中枢神经系统(CNS)紊乱或心血管疾病。
184.探针对，其包括第一探针和第二探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列；和
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
185.权利要求184所述的探针对，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6A)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。
186.权利要求184所述的探针对，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。
187.权利要求184-186中任一项所述的探针对，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。
188.权利要求184-187中任一项所述的探针对，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含蛋白质。
189.权利要求188所述的探针对，其中所述蛋白质包括PAPG。
190.权利要求189所述的探针对，其中PAPG识别并结合识别表观转录组RNA修饰的抗体。
191.权利要求184-187中任一项所述的探针对，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含抗体或抗体变体。
192.权利要求191所述的探针对，其中所述抗体是二抗。
193.权利要求192所述的探针对，其中所述二抗结合识别所述表观转录组RNA修饰的一抗。
194.权利要求193所述的探针对，其中所述一抗是抗m6A抗体。
195.权利要求184-194中任一项所述的探针对，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含直接结合所述表观转录组RNA修饰的试剂。
196.权利要求195所述的探针对，其中所述直接结合所述表观转录组RNA修饰的试剂包含蛋白质。
197.权利要求196所述的探针对，其中所述蛋白质是m6A特异性YTH结构域蛋白。
198.权利要求197所述的探针对，其中所述直接结合所述表观转录组RNA修饰的试剂包含抗体或抗体变体。
199.权利要求184-198中任一项所述的探针对，其中与所述第二探针互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约3-20、约4-19、约5-18、约6-17、约7-16、约8-15、约9-14、约10-13或约11-12个核苷酸。
200.权利要求184-199中任一项所述的探针对，其中与所述第二探针互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。
201.权利要求184-200中任一项所述的探针对，其中与所述第二探针互补的所述第一探针的寡核苷酸部分在所述第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
202.权利要求184-201中任一项所述的探针对，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10-30、约11-29、约12-28、约13-27、约14-26、约15-25、约16-24、约17-23、约18-22或约19-21个核苷酸。
203.权利要求184-202中任一项所述的探针对，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或多于30个核苷酸。
204.权利要求184-203中任一项所述的探针对，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。
205.权利要求184-204中任一项所述的探针对，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、或约10个核苷酸。
206.权利要求184-205中任一项所述的探针对，其中所述第一探针和所述第二探针的每个部分通过任选的接头连接。
207.权利要求206所述的探针对，其中所述任选的接头的每个实例独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸长。
208.权利要求184-207中任一项所述的探针对，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-3’；
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-3’；或者
5’-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，
其中]-[的每个实例包含任选的接头。
209.权利要求184-208中任一项所述的探针对，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别表观转录组RNA修饰的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，
其中]-[的每个实例包含任选的接头。
210.权利要求184-209中任一项所述的探针对，其中所述第一探针和所述第二探针的寡核苷酸部分包含DNA。
211.探针组，包括第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
212.权利要求211所述的探针组，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6A)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。
213.权利要求211所述的探针组，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。
214.权利要求211-213中任一项所述的探针组，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。
215.权利要求211-214中任一项所述的探针组，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含蛋白质。
216.权利要求215所述的探针组，其中所述蛋白质包含PAPG。
217.权利要求216所述的探针组，其中PAPG识别并结合识别表观转录组RNA修饰的抗体。
218.权利要求211-214中任一项所述的探针组，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含抗体或抗体变体。
219.权利要求218所述的探针组，其中所述抗体是二抗。
220.权利要求219所述的探针组，其中所述二抗识别一抗，所述一抗识别所述表观转录组RNA修饰。
221.权利要求220所述的探针组，其中所述细胞在与所述一个或多个探针对接触之前与所述一抗接触。
222.权利要求220或221所述的探针组，其中所述一抗是抗m6A抗体、抗m1A抗体、抗假尿苷抗体、抗m6Am抗体、抗m7G抗体、抗ac4C抗体、抗Nm抗体或抗m5C抗体。
223.权利要求211-222中任一项所述的探针组，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含直接结合所述表观转录组RNA修饰的试剂。
224.权利要求223所述的探针组，其中所述直接结合所述表观转录组RNA修饰的试剂包含蛋白质。
225.权利要求224所述的探针组，其中所述蛋白质是m6A特异性YTH结构域蛋白。
226.权利要求223所述的探针组，其中所述直接结合所述表观转录组RNA修饰的试剂包含抗体或抗体变体。
227.权利要求211-226中任一项所述的探针组，其中所述第二探针还包含聚合阻断剂。
228.权利要求227所述的探针组，其中所述聚合阻断剂位于第二探针的3’末端。
229.权利要求227或228所述的探针组，其中所述聚合阻断剂包含反向核酸残基。
230.权利要求229所述的探针组，其中所述反向核酸残基是反向胸腺嘧啶残基。
231.权利要求211-230中任一项所述的探针组，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。
232.权利要求211-231中任一项所述的探针组，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、或约10个核苷酸。
233.权利要求211-232中任一项所述的探针组，其中所述第一寡核苷酸探针和所述第三寡核苷酸探针与所述感兴趣的RNA的不同部分互补。
234.权利要求211-233中任一项所述的探针组，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[寡核苷酸条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第三探针互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，其中]-[的每个实例表示任选的接头。
235.权利要求211-234中任一项所述的探针组，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
236.权利要求211-235中任一项所述的探针组，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
237.权利要求211-236中任一项所述的探针组，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分在所述第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
238.权利要求211-237中任一项所述的探针组，其中与所述第三探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
239.权利要求211-238中任一项所述的探针组，其中与所述第三探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个核苷酸。
240.权利要求211-239中任一项所述的探针组，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
241.权利要求211-240中任一项所述的探针组，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
242.权利要求211-241中任一项所述的探针组，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别表观转录组RNA修饰的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，其中]-[表示任选的接头。
243.权利要求211-242中任一项所述的探针组，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第二探针的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
244.权利要求211-243中任一项所述的探针组，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第二探针的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
245.权利要求211-244中任一项所述的探针组，其中所述第三探针包含以下结构：
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，其中]-[表示任选的接头。
246.权利要求211-245中任一项所述的探针组，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第三探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
247.权利要求211-246中任一项所述的探针组，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第三探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
248.权利要求211-247中任一项所述的探针组，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第三探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
249.权利要求211-248中任一项所述的探针组，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第三探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
250.探针组，包括第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
251.权利要求250所述的探针组，其中所述RNA结合蛋白包含YTH家族蛋白(例如，YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1或YTHDC2)、IGF2BP家族蛋白(例如，IGF2BP1、IGF2BP2或IGF2BP3)或FMR1。
252.权利要求250或251所述的探针组，其中识别所述RNA结合蛋白的所述第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。
253.权利要求250-252中任一项所述的探针组，其中识别所述RNA结合蛋白的所述第二探针的部分包含蛋白质。
254.权利要求253所述的探针组，其中所述蛋白质识别并结合识别RNA结合蛋白的抗体。
255.权利要求250-252中任一项所述的探针组，其中识别所述RNA结合蛋白的所述第二探针的部分包含抗体或抗体变体。
256.权利要求255所述的探针组，其中所述抗体是二抗。
257.权利要求256所述的探针组，其中所述二抗识别一抗，所述一抗识别所述RNA结合蛋白。
258.权利要求257所述的探针组，其中所述细胞在与所述一个或多个探针对接触之前与所述一抗接触。
259.权利要求250-258中任一项所述的探针组，其中识别所述RNA结合蛋白的所述第二探针的部分包含直接结合所述RNA结合蛋白的试剂。
260.权利要求259所述的探针组，其中所述直接结合所述RNA结合蛋白的试剂包含蛋白质。
261.权利要求259所述的探针组，其中所述直接结合所述RNA结合蛋白的试剂包含抗体或抗体变体。
262.权利要求250-261中任一项所述的探针组，其中所述第二探针还包含聚合阻断剂。
263.权利要求262所述的探针组，其中所述聚合阻断剂位于第二探针的3’末端。
264.权利要求262或263所述的探针组，其中所述聚合阻断剂包含反向核酸残基。
265.权利要求264所述的探针组，其中所述反向核酸残基是反向胸腺嘧啶残基。
266.权利要求250-265中任一项所述的探针组，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。
267.权利要求250-266中任一项所述的探针组，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。
268.权利要求250-267中任一项所述的探针组，其中所述第一寡核苷酸探针和所述第三寡核苷酸探针与所述感兴趣的RNA的不同部分互补。
269.权利要求250-268中任一项所述的探针组，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[寡核苷酸条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第三探针互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，其中]-[的每个实例包含任选的接头。
270.权利要求250-269中任一项所述的探针组，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
271.权利要求250-270中任一项所述的探针组，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
272.权利要求250-271中任一项所述的探针组，其中与所述第二探针的一部分互补的所述第一探针的部分在所述第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
273.权利要求250-272中任一项所述的探针组，其中与所述第三探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
274.权利要求250-273中任一项所述的探针组，其中与所述第三探针的一部分互补的所述第一探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个核苷酸。
275.权利要求250-274中任一项所述的探针组，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
276.权利要求250-275中任一项所述的探针组，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
277.权利要求250-276中任一项所述的探针组，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别RNA结合蛋白的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，其中]-[表示任选的接头。
278.权利要求250-277中任一项所述的探针组，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第二探针的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
279.权利要求250-278中任一项所述的探针组，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第二探针的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
280.权利要求250-279中任一项所述的探针组，其中所述第三探针包含以下结构：
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，其中]-[包含任选的接头。
281.权利要求250-280中任一项所述的探针组，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第三探针的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
282.权利要求250-281中任一项所述的探针组，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第三探针的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
283.权利要求250-282中任一项所述的探针组，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第三探针的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
284.权利要求250-283中任一项所述的探针组，其中与所述第一探针的一部分互补的所述第三探针的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
285.多个探针，其包含多个权利要求184-210中任一项所述的探针对或多个权利要求211-284中任一项所述的探针组，其中每个探针对或每个探针组包含与不同的感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。
286.权利要求285所述的多个探针，其中所述多个探针包含超过1、超过2、超过3、超过4、超过5、超过10、超过20、超过30、超过40、超过50、超过100、超过200、超过500、超过1000、超过2000、或超过3000个探针对或探针组。
287.试剂盒，其包含权利要求184-210中任一项所述的探针对或权利要求211-284中任一项所述的探针组。
288.权利要求287所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含多个权利要求184-210中任一项所述的探针对或多个权利要求211-284中任一项所述的探针组，其中每个探针对或每个探针组包含与不同的感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。
289.权利要求288所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含超过1、超过2、超过3、超过4、超过5、超过10、超过20、超过30、超过40、超过50、超过100、超过200、超过500、超过1000、超过2000、或超过3000个探针对或探针组。
290.权利要求287-289中任一项所述的试剂盒，其进一步包含细胞。
291.权利要求287-290中任一项所述的试剂盒，其进一步包含一种或多种酶。
292.权利要求291所述的试剂盒，其中所述一种或多种酶包含连接酶。
293.权利要求291或292所述的试剂盒，其中所述一种或多种酶包含聚合酶。
294.权利要求287-293中任一项所述的试剂盒，其进一步包含胺修饰的核苷酸。
295.权利要求287-294中任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于制备聚合物基质的试剂和单体。
296.用于分析细胞中的表观转录组RNA修饰的系统，其包括
a)细胞；
b)一个或多个探针对，所述探针对包含第一探针和第二探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及寡核苷酸条形码序列；和
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；和
d)计算机。
297.权利要求296所述的系统，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6A)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。
298.权利要求296所述的系统，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。
299.权利要求296-298中任一项所述的系统，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。
300.权利要求296-299中任一项所述的系统，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含抗体或抗体变体。
301.权利要求300所述的系统，其中所述抗体是二抗。
302.权利要求301所述的系统，其中所述二抗结合识别所述表观转录组RNA修饰的一抗。
303.权利要求302所述的系统，其中所述一抗是m6A抗体、抗m1A抗体、抗假尿苷抗体、抗m6Am抗体、抗m7G抗体、抗ac4C抗体、抗Nm抗体或抗m5C抗体。
304.权利要求296-303中任一项所述的系统，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述第二探针的部分包含结合所述表观转录组RNA修饰的试剂。
305.权利要求304所述的系统，其中所述结合所述表观转录组RNA修饰的试剂包含蛋白质。
306.权利要求305所述的系统，其中所述蛋白质是m6A特异性YTH结构域蛋白。
307.权利要求296-306中任一项所述的系统，其中与所述第二探针互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约3-20、约4-19、约5-18、约6-17、约7-16、约8-15、约9-14、约10-13或约11-12个核苷酸。
308.权利要求296-307中任一项所述的系统，其中与所述第二探针互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。
309.权利要求296-308中任一项所述的系统，其中与所述第二探针互补的所述第一探针的寡核苷酸部分在所述第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
310.权利要求296-309中任一项所述的系统，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10-30、约11-29、约12-28、约13-27、约14-26、约15-25、约16-24、约17-23、约18-22或约19-21个核苷酸。
311.权利要求296-310中任一项所述的系统，其中与所述感兴趣的RNA互补的所述第一探针的寡核苷酸部分的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或多于30个核苷酸。
312.权利要求296-311中任一项所述的系统，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1-10、约2-9、约3-8、约4-7或约5-6个核苷酸。
313.权利要求296-312中任一项所述的系统，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。
314.权利要求296-313中任一项所述的系统，其中所述第一探针和所述第二探针的每个部分通过任选的接头连接。
315.权利要求314所述的系统，其中所述任选的接头的每个实例独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸长。
316.权利要求296-315中任一项所述的系统，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-3’；
5’-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-3’；
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-3’；或者
5’-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’，
其中]-[的每个实例包含任选的接头。
317.权利要求296-316中任一项所述的系统，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别表观转录组RNA修饰的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’，
其中]-[的每个实例包含任选的接头。
318.权利要求296-317中任一项所述的系统，其中所述第一探针和所述第二探针的寡核苷酸部分包含DNA。
319.系统，其包括：
a)细胞；
b)一个或多个探针组，所述探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；和
d)计算机。
320.系统，其包括：
a)细胞；
b)一个或多个探针组，所述探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针的一部分互补的寡核苷酸部分、寡核苷酸条形码序列、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分以及
与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
ii)所述第二探针包含识别RNA结合蛋白的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；和
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；和
d)计算机。
321.探针，其包含识别表观转录组RNA修饰的部分和与另一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
322.权利要求321所述的探针，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷、N6,2’-O-二甲基腺苷(m6A)、7-甲基鸟苷(m7G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、2’-O-甲基化(Nm)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。
323.权利要求322所述的探针，其中所述表观转录组RNA修饰是N6-甲基腺苷(m6A)。
324.权利要求321-323中任一项所述的探针，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述探针的部分包含结合抗体或抗体变体的试剂。
325.权利要求321-324中任一项所述的探针，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述探针的部分包含抗体或抗体变体。
326.权利要求325所述的探针，其中所述抗体是二抗。
327.权利要求326所述的探针，其中所述二抗结合识别所述表观转录组RNA修饰的一抗。
328.权利要求327所述的探针，其中所述一抗是抗m6A抗体。
329.权利要求321-328中任一项所述的探针，其中识别所述表观转录组RNA修饰的所述探针的部分包含结合所述表观转录组RNA修饰的试剂。
330.权利要求329所述的探针，其中所述结合所述表观转录组RNA修饰的试剂包含蛋白质。
331.权利要求330所述的探针，其中所述蛋白质是m6A特异性YTH结构域蛋白。
332.权利要求331所述的探针，其中所述结合所述表观转录组RNA修饰的试剂包含抗体或抗体变体。
333.权利要求321-332中任一项所述的探针，其中与另一探针的一部分互补的所述探针的寡核苷酸部分的长度为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个核苷酸。
334.权利要求321-333中任一项所述的探针，其中与另一探针的一部分互补的所述探针的寡核苷酸部分在所述第一探针的5’末端和3’末端之间分裂。
335.权利要求321-334中任一项所述的探针，其中所述探针的每个部分通过任选的接头连接。
336.权利要求335所述的探针，其中所述任选的接头的每个实例独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸长。
337.权利要求321-336中任一项所述的探针，其中所述探针包含以下结构：
5’-[识别表观RNA修饰的部分]-[与另一个探针互补的部分]-3’，
其中]-[的每个实例包含任选的接头。
338.权利要求321-337中任一项所述的探针，其中所述探针的寡核苷酸部分包含DNA。
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