CN118064516A - 一种利用低共熔溶剂提高苷元转化效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用低共熔溶剂提高苷元转化效率的方法，属于绿色提取技术领域。本发明所述的利用低共熔溶剂提高苷元转化效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：将山奈酚‑3‑O‑芸香糖苷、低共熔溶剂溶液、芦丁降解酶溶液混合均匀，进行酶解反应，得到酶解液；之后纯化，得到苷元山奈酚；其中，低共熔溶剂溶液中低共熔溶剂为甜菜碱‑乙二醇、氯化胆碱‑尿素、氯化胆碱‑苹果酸、氯化胆碱‑尿素‑乙酰胺中的一种。本发明的方法绿色高效，且制备的苷元山奈酚产率高，达到45％以上；纯度高，达到95％以上。

Description

一种利用低共熔溶剂提高苷元转化效率的方法

技术领域

本发明涉及一种利用低共熔溶剂提高苷元转化效率的方法，属于绿色提取技术领域。

背景技术

黄酮类化合物通常连接糖基，以黄酮糖苷的形式存在，小部分以游离态(苷元)的形式存在。通常，黄酮糖苷的生理活性低于黄酮苷元，并且黄酮苷元比其对应的糖苷化合物具有更高的生物利用率。人体实验表明，黄酮苷元比黄酮糖苷具有更高的生物效价。很多文献也报道了黄酮糖苷的体外抗氧化活性、糖苷酶抑制活性远低于对应的苷元。因此，高效生产制备黄酮苷元具有更为明显的意义。

目前，黄酮苷元主要的制备方法为酸水解法、高压水解法以及酶催化法。其中，酸水解法污染性高，并且杂质成分；而高压水解法反应条件苛刻，同时也容易生成小分子杂质，不易于后续的苷元纯化分离。酶催化法反应条件温和，区域选择性强，广泛应用于苷元的制备过程。但是，酶催化法受底物浓度限制很大，当底物浓度大于2mg/mL，会产生大量沉淀，导致在后续合成反应过程中反应效率低下，不利于工业化应用。

低共熔溶剂作为一种新型绿色溶剂，对于脂溶性成分有高度溶解性。基于上述特性，低共熔溶剂被广泛用于食品、中草药等原料中活性化合物的提取工艺(如多酚、类胡萝卜素等)，但是对于催化制备黄酮苷元的应用，目前尚无报道。

发明内容

[技术问题]

采用以普通水介质和酶辅助催化制备苷元山奈酚的方法，溶解性不佳，酶活性不高，导致产率、纯度较低；

低共熔溶剂并未用于合成苷元山奈酚。

[技术方案]

为了解决上述问题，本发明采用特定的原料(山奈酚-3-O-芸香糖苷)、特定的低共熔溶剂溶液、特定的芦丁降解酶溶液混合进行酶解，得到苷元山奈酚；本发明的方法绿色高效，且制备的苷元山奈酚产率、纯度高。

本发明的第一个目的是提供一种利用低共熔溶剂提高苷元转化效率的方法，包括如下步骤：

将山奈酚-3-O-芸香糖苷、低共熔溶剂溶液、芦丁降解酶溶液混合均匀，进行酶解反应，得到酶解液；之后纯化，得到苷元山奈酚；

其中，低共熔溶剂溶液中低共熔溶剂为甜菜碱-乙二醇、氯化胆碱-尿素、氯化胆碱-苹果酸、氯化胆碱-尿素-乙酰胺中的一种。

在本发明的一种实施方式中，甜菜碱-乙二醇中甜菜碱、乙二醇的摩尔比为1：1-2。

在本发明的一种实施方式中，氯化胆碱-尿素中氯化胆碱、尿素的摩尔比为1：1.5-2.5。

在本发明的一种实施方式中，氯化胆碱-苹果酸中氯化胆碱、苹果酸的摩尔比为1：0.5-1.5。

在本发明的一种实施方式中，氯化胆碱-尿素-乙酰胺中氯化胆碱、尿素、乙酰胺的摩尔比为1：0.5-1.5：0.5-1.5。

在本发明的一种实施方式中，山奈酚-3-O-芸香糖苷、低共熔溶剂溶液、芦丁降解酶溶液的用量比为1g：3-45mL：0.5-1.5mL。

在本发明的一种实施方式中，低共熔溶剂溶液的溶剂为水，体积分数为15-25％。

在本发明的一种实施方式中，芦丁降解酶溶液是将芦丁降解酶粉末溶解至水中配制得到，浓度为0.5-1.5mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，芦丁降解酶的酶活为15-30U/mg；芦丁降解酶的制备方法为：脱脂苦荞粉与乙酸缓冲液混匀，提取过夜，冷冻离心，上清即为芦丁降解酶粗酶液；之后分离、提取、浓缩、干燥，得到芦丁降解酶。

在本发明的一种实施方式中，酶解反应是pH为4-8、20-50℃下反应1-60min。

在本发明的一种实施方式中，纯化是D101大孔树脂层析；其中，柱层析是上大孔吸附树脂D101柱层析，用水洗脱，丢弃前1.5-2倍柱体积水洗脱液，之后用2倍柱体积的乙醇水溶液(体积分数为80％)洗脱，浓缩，得到纯苷元山奈酚。

本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的苷元山奈酚。

本发明的第三个目的是本发明所述的苷元山奈酚在食品或药品领域的应用。

[有益效果]

(1)本发明采用的低共熔溶剂作为一种绿色溶剂，溶解性能更佳，并且能够避免常规有机试剂对于酶活的破坏。

(2)相对于苷元山奈酚常规的合成方法来说，本发明采用由甜菜碱-乙二醇构成的酶催化体系可将苷元山奈酚合成相对效率提高至170.76％。

(3)本发明中苷元山奈酚得率最大可达到常规体系的1.62倍。

(4)本发明制备的苷元山奈酚产率高，达到45％以上；纯度高，达到95％以上。

附图说明

图1是山奈酚-3-O-芸香糖苷在芦丁降解酶催化作用下水解成苷元山奈酚的作用机制图。

图2为实施例7所得苷元山奈酚的质谱信息图。

图3为实施例7经过甜菜碱-乙二醇体系酶反应后的质谱离子流图。

图4为对比例3中经过纯水体系酶反应后的质谱离子流图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

测试方法：

1、苷元山奈酚的定量方法：

仪器：超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱仪(UPLC-Q-TOF-MS，美国Waters公司)；色谱柱：CORTECS C18+(2.7μm，2.1×150mm)；

液相条件：A相：乙腈；B相：0.1％甲酸水；流速：0.3mL/min；柱温：45℃；

梯度洗脱程序：0min到0.5min内B相保持为97％，0.5min到10min内B相由97％变为45％，10min到10.5min内B相由45％变为100％，10min到12min B相保持100％,之后B相恢复至97％运行。

苷元山奈酚含量通过由标准曲线计算得到。

实施例中采用的原料：

山奈酚-3-O-芸香糖苷标准品购自由源叶生物科技有限公司；CAS码：17650-84-9；

芦丁降解酶：按照文献(张玉玮,李洁,袁勇,等.苦荞籽粒芦丁降解酶的纯化、酶学性质及部分一级结构分析.生物工程学报,2017,33(5):796-807)制备得到，酶活为20.84U/mg；

低共熔溶剂的制备：

氢键供体与氢键受体以适当的摩尔比(表1)混合放置在反应瓶中，在80℃下磁力搅拌，直至形成均匀的液体；

表1

实施例1

一种利用低共熔溶剂提高苷元转化效率的方法，包括如下步骤：

将100g山奈酚-3-O-芸香糖苷、400mL体积分数为20％的氯化胆碱-尿素(摩尔比1：2)水溶液、100mL 1mg/mL芦丁降解酶水溶液混合均匀，在pH为5、30℃进行酶解反应1min，(短时间看反应速率)，立即将反应物置于沸水浴中以终止酶促反应；

苷元山奈酚含量为反应完毕后体系中苷元山奈酚的浓度。

实施例2

调整实施例1中氯化胆碱-尿素(摩尔比1：2)为氯化胆碱-苹果酸(摩尔比1：1)，其他和实施例1保持一致。

实施例3

调整实施例1中氯化胆碱-尿素(摩尔比1：2)为氯化胆碱-尿素-乙酰胺(摩尔比1：1：1)，其他和实施例1保持一致。

实施例4

调整实施例1中氯化胆碱-尿素(摩尔比1：2)为甜菜碱-乙二醇(摩尔比1：2)，其他和实施例1保持一致。

对比例1

调整实施例1中氯化胆碱-尿素(摩尔比1：2)为表1中编号为5-25号的低共熔溶剂，其他和实施例保持一致。

对比例2

调整实施例1中氯化胆碱-尿素(摩尔比1：2)水溶液为纯水，其他和实施例1保持一致。

将得到的产物进行性能测试，测试结果如下：

表2

注：各低共熔溶剂处理组以空白组的相对合成效率来表示：

相对合成效率(％)＝低共熔溶剂处理组苷元山奈酚含量/空白组苷元山奈酚含量×100％。

从图1可以看出：低共熔溶剂为甜菜碱-乙二醇、氯化胆碱-尿素、氯化胆碱-苹果酸、氯化胆碱-尿素-乙酰胺的时候，相对合成效率在100％以上，其他的低共熔溶剂的相对合成效率较低，因此，后续选择甜菜碱-乙二醇、氯化胆碱-尿素、氯化胆碱-苹果酸、氯化胆碱-尿素-乙酰胺用于反应体系。

实施例5

一种利用低共熔溶剂提高苷元转化效率的方法，包括如下步骤：

将100g山奈酚-3-O-芸香糖苷、400mL体积分数为20％的甜菜碱-乙二醇(摩尔比1：2)水溶液、100mL 1mg/mL芦丁降解酶水溶液混合均匀，在pH为8、40℃进行酶解反应30min，得到酶解液；

将酶解液上大孔吸附树脂D101柱层析，用水洗脱，丢弃前2倍柱体积水洗脱液，之后用2倍柱体积乙醇水溶液(体积分数为80％)洗脱，浓缩后得到纯苷元山奈酚。

实施例6

调整实施例5中甜菜碱-乙二醇(摩尔比1：2)水溶液的体积分数为10％，其他和实施例5保持一致。

实施例7

调整实施例5中酶解的pH为4，其他和实施例5保持一致。

实施例8

调整实施例5中酶解的温度为25℃，其他和实施例5保持一致。

实施例9

调整实施例5中甜菜碱-乙二醇(摩尔比1：2)水溶液的用量为200mL，其他和实施例5保持一致。

对比例3

调整实施例5中甜菜碱-乙二醇(摩尔比1：2)水溶液为纯水，其他和实施例5保持一致。

对比例4

调整实施例5中甜菜碱-乙二醇(摩尔比1：2)水溶液为体积分数为20％的乙醇水溶液，其他和实施例5保持一致。

将得到的产物进行性能测试，测试结果如下：

表3

例	酶反应提取物中山奈酚含量(mg/mL)	山奈酚的质量(g)	纯山奈酚的纯度(％)
				实施例5	151.11	50.15	95.68
实施例6	138.53	45.28	96.63
				实施例7	166.78	55.95	95.26
实施例8	154.52	50.08	97.00
				实施例9	149.12	50.50	96.11
对比例3	109.28	34.32	96.38
				对比例4	118.12	40.23	93.26

图1是山奈酚-3-O-芸香糖苷在芦丁降解酶催化作用下水解成苷元山奈酚的作用机制图。

图2为实施例7所得苷元山奈酚的质谱信息图。从图2可以看出：实施例7制备得到的产物确实是苷元山奈酚，其他实施例和对比例得到的苷元山奈酚的质谱信息图与实施例7一致，证明本发明的体系制备得到的产物均为苷元山奈酚。

图3是经过甜菜碱-乙二醇体系酶反应后的质谱离子流图，图4经过纯水体系酶反应后的质谱离子流图，发现：图4的纯水体系能得到的山奈酚含量显著低于甜菜碱-乙二醇体系的山奈酚含量，说明低共熔体系能够有效提高苷元山奈酚的转化效率。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种利用低共熔溶剂提高苷元转化效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将山奈酚-3-O-芸香糖苷、低共熔溶剂溶液、芦丁降解酶溶液混合均匀，进行酶解反应，得到酶解液；之后纯化，得到苷元山奈酚；

其中，低共熔溶剂溶液中低共熔溶剂为甜菜碱-乙二醇、氯化胆碱-尿素、氯化胆碱-苹果酸、氯化胆碱-尿素-乙酰胺中的一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，甜菜碱-乙二醇中甜菜碱、乙二醇的摩尔比为1：1-2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氯化胆碱-尿素中氯化胆碱、尿素的摩尔比为1：1.5-2.5。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氯化胆碱-苹果酸中氯化胆碱、苹果酸的摩尔比为1：0.5-1.5。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氯化胆碱-尿素-乙酰胺中氯化胆碱、尿素、乙酰胺的摩尔比为1：0.5-1.5：0.5-1.5。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，山奈酚-3-O-芸香糖苷、低共熔溶剂溶液、芦丁降解酶溶液的用量比为1g：3-45mL：0.5-1.5mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶解反应是pH为4-8、20-50℃下反应1-60min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，芦丁降解酶溶液是将芦丁降解酶粉末溶解至水中配制得到，浓度为0.5-1.5mg/mL。

9.权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的苷元山奈酚。

10.权利要求9所述的苷元山奈酚在食品或药品领域的应用。