CN118063625A - 用于肥胖相关疾病治疗的基因药物 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种用于治疗肥胖的基因药物。本公开揭示了一种基于胰高血糖素样肽1(GLP‑1)和骨钙素(OC)联合治疗的基因疗法,使用rAAV作为载体用于肥胖的治疗的组合物及应用。本公开创新性使用rAAV作为载体,可在体内长期稳定表达。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,尤其涉及一种基于GLP-1和OC联合治疗的基因疗法,例如使用AAV作为载体用于肥胖的治疗的组合物及应用。
背景技术
肥胖症被世界卫生组织定义为:可损害健康的异常或过量脂肪累积,受遗传和环境多因素作用而导致的慢性代谢性疾病。自1975年以来,全球肥胖症患病率几乎翻了三倍。在美国,超过三分之二的人面临超重或肥胖问题,其中患有肥胖症的成年人与青少年分别大于30%和20%。《中国居民营养与慢性病状况报告(2020年)》显示,我国超过一半成人超重/肥胖,6~17岁、6岁以下儿童和青少年超重/肥胖率分别达到19.0%和10.4%。
全球沿用的肥胖标准是根据体重指数(BMI)判定,其中25kg/m2≤BMI<30kg/m2为超重,BMI≥30kg/m2为肥胖。与正常体重相比,BMI为30-34.9kg/m2的个体死亡的风险升高40%以上,并且BMI>40kg/m2时,相对死亡率增加至100%。肥胖除了本身会影响健康外,还会增加Ⅱ型糖尿病(T2D)和心血管疾病(CVD)等并发症的发病率。肥胖会增加心理、神经、肺、胃肠道、肾脏、肌肉骨骼和内分泌疾病的患病率,例如肥胖会增加食道癌、结肠癌和直肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌和肾癌的患病率并增加患病后的死亡风险,据估计,所有癌症诊断中有4-9%可归因于体内脂肪过多。肥胖使多种疾病的治疗变得复杂,因为它降低了患者治愈的可能性或延长了多种疾病治愈的时间,并且肥胖与多种恶性疾病的预后治疗效果较差相关。肥胖还与寿命缩短有关,患有肥胖的人群寿命平均缩短5-20年,具体缩短的寿命年限取决于患有肥胖的时间、超重程度和是否出现相关合并症。
据估计,肥胖对现代医疗保健系统造成的经济负担相当大,仅在美国,每年就有超过1900亿美元用于与肥胖相关的疾病。全球随着超重或肥胖的人口不断增加,预计2060年,因超重或肥胖问题造成的经济影响将占全球GDP的3%以上。
肥胖的临床管理主要有三个方面:生活方式干预、减肥药物和减重手术。人们最初首选的是生活方式干预,包括控制饮食和增加运动量,但这一短期干预对于长期减肥来说难以实现,并且体重易反复,较易影响肥胖人群情绪。目前,减肥手术,包括胃旁路手术,是唯一真正成功的治疗严重肥胖的方法。然而,由于成本、减肥外科医生的短缺、副作用和并发症,胃旁路手术不是在人群水平上治疗常见肥胖的一个选择。相反,通过减肥药物的人工干预达成减肥作用的方式备受关注,例如使用减肥药利拉鲁肽和司美格鲁肽注射液增加胰高血糖素样肽1(GLP-1)等体内含量,被证明对肥胖具有显著的治疗效果。
胰高血糖素样肽1(GLP-1)是由37个氨基酸组成的多肽,由胰高血糖素分解而产生。胰高血糖素(GCG)基因在胰腺、小肠和大脑中受同一个启动子调控表达,GCG基因表达产物为前胰高血糖素原,切除信号肽后变成胰血高糖素原。胰高血糖素原在各组织中经过选择性加工产生多种多肽,激素原转化酶将胰高血糖素原分子分割成大小不同的肽段,包括含肠高糖素相关胰多肽(GRPP,氨基酸片段1-30)、胰高血糖素(氨基酸片段33-61)、胃泌酸调节素(OXM,氨基酸片段33-69)、胰高血糖素样肽1(GLP-1,氨基酸片段72-107/108)、胰高血糖素样肽2(GLP-2,氨基酸片段126-158)。胰高血糖素原在胰岛α细胞主要的加工产物是GCG,在肠道L细胞中主要加工产物是GLP-1。
GLP-1在人体内以两种活性形式存在,GLP-1(7-36酰胺)和GLP-1(7-37)。在胰腺中,GLP-1和GLP-1R相互作用激活腺苷酸环化酶(AC),AC可刺激ATP转化为环磷酸腺苷(cAMP),从而增加cAMP的浓度。cAMP进一步激活蛋白激酶A(PKA)和Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子4(RAPGEF4)。激活的PKA可以关闭ATP依赖的K+通道,使细胞膜去极化,同时也激活电压依赖的Ca2+流入和动作电位的产生。此外,PKA还可以通过激活三磷酸肌醇(IP3)促进Ca2+释放。激活的RAPGEF4可进一步激活Ras蛋白1和磷脂酶C,从而激活IP3和甘油二酯(DAG)通路,促进Ca2+的释放。所有这些途径最终导致细胞内Ca2+浓度升高,促进线粒体合成ATP,并通过胞吐作用将胰岛素颗粒释放到血液中抑制胰高血糖素分泌,降低血糖含量,调节脂肪代谢。同时GLP-1还可以延缓胃排空的速度,使人食欲下降,并可直接作用于中枢神经使人体产生饱胀感,从而达到减轻体重的效果。除了GLP-1被指出具有良好的代谢调节作用外,瘦素、脂联素和骨钙素等也被证明参与体内血糖等代谢途径。
骨钙素(osteocalcin,OC)又名骨γ-羧基谷氨酸包含蛋白(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins,BGLAP或BGP),是一种由造骨细胞合成的结构蛋白,在最近几年中,越来越多研究表明骨是一种内分泌器官,并通过分泌多种骨源激素影响各种器官和组织。骨分泌的骨钙素可以作用于胰腺、脂肪、肌肉、睾丸、大脑等器官,参与动物体内能量代谢、雄性生殖、大脑发育等生理过程。给正常小鼠持续注射重组骨钙素蛋白,小鼠胰腺中β细胞增多,胰岛素分泌增加,脂联素表达增加,小鼠的体重、脂肪的质量降低,血浆中甘油三酯水平也降低。此外,给小鼠间歇注射未羧化的骨钙素能增加其骨骼中线粒体的数量,增强能量代谢,抵制肥胖。
由于GLP-1具有可以抑制肠胃蠕动和胃液分泌、减缓胃排空以抑制食欲、还可直接作用于中枢神经使人体产生饱胀感等作用,使得GLP-1在医疗界具有远大的前景,众多研究者以此为靶点不断寻求新的降糖、减重药物。例如诺和诺德已被批准适用于减重的利拉鲁肽和司美格鲁肽均为GLP-1类药物,这两种药物为注射类药物,利拉鲁肽注射频率为每天一次,司美格鲁肽为一周一次,然而由于频繁的药物注射以及腹泻、恶心、肠梗阻等胃肠系统疾病等副作用增加了患者的负担,且停药后若不注重改变生活方式复发率较高。并且为了更好的达到降糖、减重的效果,不少针对GLP-1、GIP或GCG等多靶点的研究不断出现新的进展,例如礼来研发的首款获批的GIP/GLP-1受体双重激动剂-替尔泊肽,它在与司美格鲁肽的头对头试验中(NCT03987919),表现出了比司美格鲁肽更为优秀的降糖和减重的能力。例如司美格鲁肽等多肽类药物都存在体内半衰期短,需要反复注射的问题,这样会对肥胖患者造成身心健康的损害,腺相关病毒(AAV)等基因治疗的方法有待成为解决这一难题的突破点。
腺相关病毒(AAV)最早于20世纪60年代中期从实验室腺病毒(AdV)制剂中发现,随后很快就在人体组织中被发现。由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低,能高效长期表达外源基因等特点,使其成为基因递送的重要工具之一。应用AAV载体治疗疾病已经有了很多成功的先例,2009年,AAV2的病毒载体实现RPE65的过表达有效治疗了雷伯氏先天性黑蒙症;2011年,AAV8的病毒载体对血友病也显示出一定的疗效。近年来,AAV载体作为给药系统,在脊髓性肌萎缩症、α抗胰蛋白酶缺乏、糖尿病、血友病以及癌症等疾病中的研究也在不断深入。目前国际上用于治疗脊髓性肌萎缩症的Zolgensma(AAV9)、遗传性视网膜疾病的Luxturna(AAV2)、脂蛋白酯酶缺乏遗传病的Glybera(AAV1)、AADC缺乏症的Upstaza(AAV2)、血友病A的Roctavian(AAV5)、血友病B的EtranaDez(AAV5)和杜氏肌营养不良的Elevidys(AAVrh74)7款基因治疗药物已被批准上市。由此可以看出AAV基因治疗的潜力巨大。
腺相关病毒(AAV)是单链DNA病毒,长度约为4.7kb。其最重要结构是两端的反向末端重复序列(Inverted terminal repeat,ITR)结构。此外两个开放阅读框分别是编码衣壳蛋白的Cap基因,以及AAV基因组复制和包装相关的Rep基因。其中Cap基因编码三个蛋白,分别是VP1、VP2和VP3。Cap基因的作用是产生完整的衣壳蛋白并赋予其活性,为其提供感染宿主时必不可少的支撑位点,最终实现病毒基因组的包装。而Rep基因的主要作用是进行编码Rep40、52、68、78四个非结构蛋白,为AAV的复制以及包装提供基础。目前,AAV载体从亲代病毒中获得时,要去除所有的病毒元件然后插入整合相关的目的基因元件,一方面可以最大化重组AAV携带的目的基因的容量(4.7kb),另一方面减小体内递送基因时产生的免疫原性和细胞毒性,目标基因不插入细胞的染色体中,以独立于染色体外DNA附加体的形式游离在细胞核中,在体内长期表达外源目的基因。AAV载体由于其安全性好、免疫原性低、宿主细胞范围广、能感染分裂和非分裂细胞,成为现阶段世界范围内应用最广的基因递送载体。
肥胖症治疗药物中,利拉鲁肽和司美格鲁肽注射液经常会在患者中引起胃肠消化系统不良反应,并且停药后不注意饮食控制及运动易造成体重反弹。药物还会随着代谢而迅速被清除,因此需要经常注射以维持治疗效果,长期治疗增加了患者的经济负担,且重复注射会增加患者的痛苦和发生不良反应的可能性。
尽管在肥胖症治疗方面,特别是在使用GLP1R激动剂的情况下,GLP1RA多肽类药物已取得良好进展,目前用于肥胖治疗的药物都需要频繁注射给药,基因治疗药物可以解决频繁注射给药的难题,且截止目前还没有批准用于肥胖症治疗的基因治疗药物,并且使用GLP-1与骨钙素联用的基因疗法是一种新的治疗方法,可以减少患者用药次数和不良反应的发生。基于基因治疗产品具有持续作用的优势,因此我们希望开发针对肥胖的高效治疗药物。
发明内容
一方面,本公开提供了一种融合多肽,其包括:i)胰高血糖素样肽1(GLP-1)和ii)骨钙素(OC),所述GLP-1和OC相连接。
在一些实施方式中,所述GLP-1包含如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列(HX2EGTFTSDX10SX12X13LX15X16X17X18AX20X21FX23X24WLX27X28G X30 X31),
其中X2是A、G或S,X10是V或K,X12是K、E、R或S,X13是K或Y,X15是D或E,X16是S、G或E,X17是E、R、Q或K,X18是R、S或A,X20是R、K或Q,X21是D或E,X23是V或I,X24是A或Q,X27是E或V,X28是A或K,X30是G或R,和X31是G或不存在。
在一些实施方式中,所述融合多肽结合胰高血糖素受体和/或结合GLP-1受体如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述OC包含由式M1-Za-M2表示的肽,其中Za选自如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-70位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-69位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-87位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-77位氨基酸序列、或SEQ ID NO:3中第64-97位氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述OC包含由式M1-Za-M2表示的肽,其中Za选自由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方式中,M1、M2各自独立地为具有不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基的多肽区段或者不存在。
在一些实施方式中,OC选自如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-70位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-69位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-87位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-77位氨基酸序列、或SEQ ID NO:3中第64-97位氨基酸序列。
在一些实施方式中,其中所述融合多肽包含信号肽序列和/或标签肽,优选地,所述信号肽序列位于N-末端,更优选地,所述信号肽包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述GLP-1和OC可选择地由连接体序列连接,优选地,所述连接体序列包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或者包含如(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列,其中n为大于0的整数。
在一些实施方式中,所述的融合多肽包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与其具有85%以上、90%以上、95%以上、或99%以上同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述的融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在一些实施方式中,所述融合多肽特征在于:所述融合特异性结合人GLP-1受体(GLP-1Rs)和G蛋白耦联受体C家族6组成员A(GPRC6A)的结合位点。
在另一方面,本公开提供了一种多核苷酸,其编码本公开中所述的融合多肽。
在一些实施方式中,所述编码融合蛋肽的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或与其具有85%以上、90%以上、95%以上、或99%以上同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中,所述编码融合多肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一方面,本公开提供了一种载体,其编码本公开中所述的多核苷酸。在一些实施方式中,所述载体选自腺相关病毒AAV载体、腺病毒载体、RNA病毒载体、慢病毒载体和牛痘病毒载体中的至少一种。
在另一方面,本公开提供了一种宿主细胞,其包含如本公开中所述的多核苷酸或如本公开中所述的载体。
在另一方面,本公开提供了一种AAV颗粒,其包含如本公开中所述的AAV载体。
在另一方面,本公开提供了一种药物组合物,其包含本公开中所述的融合多肽、本公开中所述的多核苷酸、本公开中所述的载体、本公开中所述的宿主细胞、本公开中所述的AAV颗粒中的至少一种,以及药学上可接受的载体。
在一些实施方式中,其中所述腺相关病毒外壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9中的至少一种。
在一些实施方式中,所述药物组合物适于静脉注射、皮下注射、肌肉注射、唾液腺注射或脾脏注射。
在另一方面,本公开提供了本公开中所述的融合多肽、本公开中所述的多核苷酸、本公开中所述的载体、本公开中所述的宿主细胞、本公开中所述的AAV颗粒、或本公开中所述的药物组合物在制备用于在受试者中治疗肥胖相关疾病的药物中的用途。
在一些实施方式中,所述肥胖相关疾病选自糖尿病、胰岛素抵抗综合征、脂肪营养不良、非酒精性脂肪性肝炎、心血管疾病、多囊性卵巢综合征、代谢综合征、高甘油三酯血症、高胆固醇、动脉粥样硬化和冠心病中的一种或多种。
在另一方面,本公开提供了一种核酸构建体组合物,其包括第一核酸和第二核酸,其中所述第一核酸包含编码胰高血糖素样肽1(GLP-1)的多核苷酸,所述第二核酸包含编码骨钙素(OC)的多核苷酸,所述多核苷酸在不同的表达框中,或者在同一个表达框中。
在另一方面,本公开提供了一种载体,其包括本公开中所述的核酸构建体组合物。
在另一方面,本公开提供了一种载体组合,其包括第一载体和第二载体,其中所述第一载体包含编码胰高血糖素样肽1(GLP-1)的多核苷酸,所述第二载体包含编码骨钙素(OC)的多核苷酸。
在另一方面,本公开提供了一种药物组合物,其包括第一多肽和第二多肽,其中所述第一多肽包含胰高血糖素样肽1(GLP-1),所述第二多肽包含骨钙素(OC)。
在一些实施方式中,本公开中所述的核酸构建体组合物、本公开中所述的载体、本公开中所述的载体组合物、本公开中所述的药物组合物,其中所述GLP-1包含如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列(HX2EGTFTSDX10SX12X13LX15X16X17X18AX20X21FX23X24WLX27X28GX 30X31),其中X2是A、G或S,X10是V或K,X12是K、E、R或S,X13是K或Y,X15是D或E,X16是S、G或E,X17是E、R、Q或K,X18是R、S或A,X20是R、K或Q,X21是D或E,X23是V或I,X24是A或Q,X27是E或V,X28是A或K,X30是G或R,和X31是G或不存在;
所述OC包含由式M1-Za-M2表示的肽,其中Za选自如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-70位氨基酸序列、SEQ IDNO:3中第64-69位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-87位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-77位氨基酸序列、或SEQ ID NO:3中第64-97位氨基酸序列;或者所述OC包含由式M1-Za-M2表示的肽,其中Za选自由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方式中,OC选自如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-70位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-69位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-87位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-77位氨基酸序列、或SEQ ID NO:3中第64-97位氨基酸序列。
在另一方面,本公开提供了本公开中所述的核酸构建体组合物、本公开中所述的载体、本公开中所述的载体组合物、本公开中所述的药物组合物在制备用于在受试者中治疗肥胖相关疾病的药物中的用途。
在一些实施方式中,其中所述肥胖相关疾病选自糖尿病、胰岛素抵抗综合征、脂肪营养不良、非酒精性脂肪性肝炎、心血管疾病、多囊性卵巢综合征、代谢综合征、高甘油三酯血症、高胆固醇、动脉粥样硬化和冠心病中的一种或多种。
在另一方面,本公开提供了本公开中所述的核酸构建体组合物的制备方法,包括以下步骤:
a.分别在胰高血糖素样肽1(GLP-1)和骨钙素(OC)的N端加上分泌信号肽和/或标签肽;
b.将所述GLP-1和OC可选择地由连接体序列连接或不由连接体序列连接;
c.根据人密码子偏好设计核苷酸序列,并在5’端引入酶切位点诸如BamH I酶切位点,在3’端引入酶切位点诸如EcoR V酶切位点;
d.获得包含编码GLP-1和信号肽和/或标签肽的第一多核苷酸和包含编码OC和信号肽和/或标签肽的第二多核苷酸,其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸在不同的表达框中,或者在同一个表达框中。
附图说明
参考下述附图,本发明可以被更完全地理解。
图1示出了XMF1、XMF2、XMF3、XMF4和XMF5的结构示意图和载体信息。图1A示出了XMF1的结构示意图,图1B示出XMF2的载体信息;图1C示出XMF3的载体信息,图1D示出XMF4的载体信息,图1E示出XMF5的载体信息。
图2示出了糖耐实验评估XMF1、XMF2和XMF3通过颈部皮下注射对野生型C57BL/6J小鼠调节血糖能力的影响。
图3示出了糖耐实验评估XMF1、XMF2和XMF3对肥胖模型小鼠调节血糖能力的影响。
图4示出了糖耐实验评估XMF4、XMF5和XMF3对肥胖模型小鼠调节血糖能力的影响。
具体实施方式
下面关于本公开的描述仅仅旨在说明本公开的各种不同的实施方式。因此,所讨论的特定修改不应被解释为对本公开范围的限制。对本领域技术人员来说,显然可以在不脱离本公开范围的情况下做出各种不同的等效、改变和修改方案,并且应当理解这些等效实施方式将被包含在本文中。本文引用的包含出版物、专利和专利申请在内的所有参考文献均通过引用整体并入本文。
除非另有限定,本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
本发明所用术语“融合多肽”是指可操作地相互连接的两个或多个肽、多肽或蛋白质。本申请中所述融合多肽是指胰高血糖素样肽1(GLP-1)的功能片段和骨钙素(OC)的功能片段通过氨基酸连接体序列直接连接,在一些实施方式中,所述融合蛋白中GLP-1的功能片段和OC的功能片段的次序可以变化。例如,在一些实施方式中,所述GLP-1的功能片段的C-末端被融合(直接或间接地)于所述分子的OC的功能片段的N-末端。在一些实施方式中,GLP-1的功能片段的N-末端被融合(直接或间接地)于所述分子的OC的功能片段的C-末端。在一些实施方式中,提供的是分离的融合多肽,其包括第一多肽和第二多肽,其中所述第一多肽包含胰高血糖素样肽1(GLP-1),所述第二多肽包含骨钙素(OC)。在一些实施方式中,融合多肽形成二聚体或多聚体。在一些实施方式中,本发明的融合多肽包含信号肽序列和/或标签肽,优选地,所述信号肽序列位于N-末端,更优选地,所述信号肽包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。所述融合多肽特异性结合人GLP-1受体(GLP-1Rs)和G蛋白耦联受体C家族6组成员A(GPRC6A)的结合位点。本发明所用术语“功能片段”是指两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的活性肽,在人体内起重要生理作用,发挥生理功能。在一些实施方式中,本发明的融合多肽包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与其具有85%以上、90%以上、95%以上、或99%以上同一性的氨基酸序列,
本文所述的“GLP-1”是指包含GLP-1或GLP-1的功能片段,GLP-1是由37个氨基酸组成的多肽,由胰高血糖素分解而产生,特异性结合人GLP-1受体(GLP-1Rs)和G蛋白耦联受体C家族6组成员A(GPRC6A)的结合位点。在一些实施方式中,所述GLP-1包含如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列(HX2EGTFTSDX10SX12X13LX15X16X17X18AX20X21FX23X24WLX2 7X28G X30X31),其中X2是A、G或S,X10是V或K,X12是K、E、R或S,X13是K或Y,X15是D或E,X16是S、G或E,X17是E、R、Q或K,X18是R、S或A,X20是R、K或Q,X21是D或E,X23是V或I,X24是A或Q,X27是E或V,X28是A或K,X30是G或R,和X31是G或不存在。在一些实施方式中,所述融合多肽结合胰高血糖素受体和/或结合GLP-1受体如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
所述“OC”是指来源于骨钙素的或从骨钙素衍生的能够调节能量代谢的多肽及其变体,骨钙素是一种由造骨细胞合成的结构蛋白,其可以作用于胰腺、脂肪、肌肉、睾丸、大脑等器官,参与动物体内能量代谢、雄性生殖、大脑发育等生理过程。在一些实施方式中,所述OC包含由式M1-Za-M2表示的肽,其中Za选自如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、SEQ IDNO:3中第52-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-70位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-69位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-87位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-77位氨基酸序列、或SEQ ID NO:3中第64-97位氨基酸序列。在一些实施方式中,所述OC包含由式M1-Za-M2表示的肽,其中Za选自由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40组成的组的氨基酸序列。在一些实施方式中,M1、M2各自独立地为具有不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基的多肽区段或者不存在。在一些实施方式中,OC选自如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-70位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-69位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-87位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-77位氨基酸序列、或SEQ ID NO:3中第64-97位氨基酸序列。
所述“连接体序列”的实例在本领域是已知的,并且包含例如(Gly4Ser)、(Gly4Ser)2、(Gly4Ser)3、(Gly3Ser)4、(SerGly4)、(SerGly4)2、(SerGly4)3和(SerGly4)4。连接序列还可包含“天然”连接序列,也被称为内源性连接序列。在一些实施方式中,所述连接体序列包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或者包含如(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列,其中n为大于0的整数。
本文所用的术语“载体”是指运输、转导和在靶细胞表达被包含的外源目的基因(例如本发明所述的多核苷酸)的分子工具,所述工具提供合适的在靶细胞中起始转录的核苷酸序列,即启动子。载体其包括分离的核酸,并且其可以用于递送分离的核酸至细胞内部。众多载体在本领域是已知的,包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。因而,术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物,例如,聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
本文使用的“表达载体”是指包括重组多核苷酸的载体,所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件;用于表达的其它元件可以由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的并入重组多核苷酸的那些,比如质粒(例如,裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如,仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。本文所述的载体选自腺相关病毒AAV载体、腺病毒载体、RNA病毒载体、慢病毒载体和牛痘病毒载体中的至少一种。在一些实施方式中,本发明所述的载体包括编码本公开中所述的融合多肽的多核苷酸,所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或与其具有85%以上、90%以上、95%以上、或99%以上同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中,本发明所述的载体是指一种载体组合,其包括第一载体和第二载体,其中所述第一载体包含编码胰高血糖素样肽1(GLP-1)的多核苷酸,所述第二载体包含编码骨钙素(OC)的多核苷酸。
除非另外规定,本文使用的“编码”某蛋白的核酸分子或某蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包括简并形式(Degeneracy)并且编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。该核苷酸序列还可以包括一个或多个内含子。
如本文所用,术语“治疗”是指向受试者施用有效量的具有根据本文所述的方法离体改变的靶基因的多核苷酸序列的细胞,以使得所述受试者具有所述疾病的至少一种症状的减少或所述疾病的改善,例如,有益的或所需的临床结果。出于本公开的目的,有益的或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和,以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解),无论是可检测的或是不可检测的。治疗可指与未接受治疗情况下的预期存活期相比,延长存活期。因此,本领域的技术人员意识到治疗可改善疾病状况,但可能不是疾病的完全治愈。如本文所用,术语“治疗”包括预防。或者,治疗在疾病的进展减少或停止的情况下是“有效的”。“治疗”还可意指与在未接受治疗情况下的预期存活期相比,延长存活期。需要治疗的病人包括已经被诊断具有与多核苷酸序列的表达相关的病症,以及由于遗传易感性或其他因素可能发展这种病症。
如本文所用的术语“肥胖相关疾病”是指由肥胖引起的相关疾病或与肥胖有关的疾病,最常发生的相关疾病包括内分泌疾病,例如糖尿病、心血管疾病,例如高血压、心绞痛、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、脑梗塞、深静脉血栓形成和肺栓塞、消化系统疾病,例如胰腺炎和肝病、感染性疾病,例如细菌感染、肌肉骨骼疾病,例如痛风、骨关节炎和背痛、呼吸系统疾病,例如哮喘、恶性疾病,例如肾癌、皮肤病,例如皮肤感染和湿疹、血液系统疾病,例如贫血、泌尿生殖系统疾病,例如肾功能衰竭、神经系统疾病,例如睡眠障碍。本文所述的肥胖相关疾病还包括胰岛素抵抗综合征、脂肪营养不良、非酒精性脂肪性肝炎、多囊性卵巢综合征、代谢综合征、高甘油三酯血症、高胆固醇、动脉粥样硬化和冠心病。
实施例
下面的实施例仅仅是说明性的,并且不打算以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1质粒载体的构建
1.1表达GLP1(7-37)和OC片段基因的AAV载体质粒的构建
根据NCBI上公布的GLP-1(Gene ID:NP002045.1)的GLP-1(7-37)氨基酸序列(SEQID NO:1)和OC(Gene ID:NP_954642.1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:3),在两个基因的N端分别加上分泌信号肽CD5-sp核苷酸序列(SEQ ID NO:6),两个片段用T2A连接核苷酸序列(SEQID NO:8),组成了结构为CD5-sp-GLP1(7-37)-T2A-CD5-sp-OC的开放阅读框,根据人密码子偏好设计核苷酸序列,并在5’端引入BamH I酶切位点,在3’端引入EcoR V酶切位点,命名为XMF1,其核苷酸序列为(SEQ ID NO:10)。
根据NCBI上公布的GLP-1(Gene ID:NP002045.1)的GLP-1(7-37)氨基酸序列(SEQID NO:1)和OC(Gene ID:NP_954642.1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:3),在两个基因的初始N端分别加上分泌信号肽CD5-sp核苷酸序列(SEQ ID NO:6),两个基因之间用T2A连接核苷酸序列(SEQ ID NO:8),组成了结构为CD5-sp-GLP1(7-37)-3(G4S)-GLP1(7-37)-3(G4S)-GLP1(7-37)-T2A-CD5-sp-OC的开放阅读框,根据人密码子偏好设计核苷酸序列,并在5’端引入BamH I酶切位点,在3’端引入EcoR V酶切位点,命名为XMF4,其核苷酸序列为(SEQ ID NO:17)。
1.2表达GLP1(7-37)基因的AAV载体质粒的构建
根据GLP-1(Gene ID:NP002045.1)的GLP-1(7-37)氨基酸序列(SEQ ID NO:1),在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp核苷酸序列(SEQ ID NO:6)组成了结构为CD5-sp-GLP1(7-37)的开放阅读框及GLP1(7-37)3倍体开放阅读框CD5-sp-GLP1(7-37)-3(G4S)-GLP1(7-37)-3(G4S)-GLP1(7-37),根据人密码子偏好设计核苷酸序列,并在5’端引入BamH I酶切位点,在3’端引入EcoR V酶切位点,分别命名为XMF2、XMF5,其核苷酸序列为(SEQ ID NO:12,19)。
1.3表达OC基因的AAV载体质粒的构建
根据OC(Gene ID:NP 954642.1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:3),N端加上分泌信号肽CD5-sp核苷酸序列(SEQ ID NO:6),组成了结构为CD5-sp+OC的开放阅读框,根据人密码子偏好设计核苷酸序列,并在5’端引入BamH I酶切位点,在3’端引入EcoR V酶切位点,命名为XMF3,其核苷酸序列为(SEQ ID NO:14)。(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成全基因。用BamH I/EcoR V双酶切ssAAV-CAG质粒,通过连接、转化及克隆筛选鉴定等常规分子生物学操作构建了XMF1/XMF2/XMF3/XMF4/XMF5载体,其结构示意图见图1。用无内毒素的质粒提取试剂盒(MN)获得高质量的质粒DNA备用。
实施例2 XMF1、XMF2、XMF3对C57BL/6J小鼠血糖调节能力的改善
2.1 IPGTT评估XMF1、XMF2、XMF3对野生型C57BL/6J小鼠血糖调节能力的影响
2.1.1 XMF1、XMF2、XMF3对野生型C57BL/6J小鼠分组与注射情况
SPF级8周雄性C57BL/6J小鼠39只(购自北京斯贝福生物技术有限公司),按照小鼠节律进行12小时光亮与黑暗交替光照,体重23g左右。对筛选合格的动物进行注射,处理见下表1:
表1
由于AAV注射后需要一定时间目的基因的表达才能达到稳定水平,各组于第1天(D1)进行颈部皮下注射病毒或PBS,在注射后第1周、2周,对小鼠进行IPGTT,评估对小鼠调节血糖浓度能力的影响。
2.1.2 IPGTT评估XMF1、XMF2、XMF3对野生型C57BL/6J小鼠的血糖调节能力
禁食过夜,16小时后腹腔注射2g/kg葡萄糖。在注射葡萄糖前后0、30、60、90和120分钟尾静脉采血,血液室温静置15分钟,3200rpm/分钟离心分离血清,使用葡萄糖检测试剂盒(碧云天)测量血清中血糖浓度。数据被用于生成曲线下面积(AUC)计算从0-120分钟葡萄糖浓度测量,将各实验组AUC与对应的PBS对照组AUC数值进行归一化处理,即AUCAAV/AUCPBS。结果见图2,归一化处理后结果显示,XMF1在注射2周后开始显著提高C57BL/6J小鼠对血糖浓度的调节能力。而XMF3组小鼠给药后血糖调节能力没有发生变化;XMF2组小鼠给药后第3周血糖调节能力有一定提升。并且在XMF1给药后对小鼠血糖浓度的调节能力优于XMF2、XMF3。
2.2 IPGTT评估XMF1、XMF2、XMF3对肥胖造模组C57BL/6J小鼠血糖调节能力的影响
2.2.1小鼠肥胖造模及XMF1、XMF2、XMF3对小鼠分组与注射情况
SPF级8周雄性C57BL/6J小鼠(购自北京斯贝福生物技术有限公司),按照小鼠节律进行12小时光亮与黑暗交替光照,体重23g左右。肥胖模型组采用45%高脂饲料喂养,喂养12周,造模结束后以模型组体重超过非造模小鼠平均体重的20%视为造模成功小鼠,对筛选合格的33只肥胖模型小鼠进行注射,处理见下表2:
表2
由于AAV注射后需要一定时间目的基因的表达才能达到稳定水平,各组于第1天(D1)进行颈部皮下注射病毒或PBS,在注射后第1周、2周、3周,对小鼠进行IPGTT,评估对小鼠调节血糖能力的影响。
2.2.2 IPGTT评估XMF1、XMF2、XMF3对肥胖模型C57BL/6J小鼠的血糖调节能力影响
禁食过夜,16小时后腹腔注射2g/kg葡萄糖。在注射葡萄糖前后0、30、60、90和120分钟尾静脉采血,血液室温静置15分钟,3200rpm/分钟离心分离血清,使用葡萄糖检测试剂盒(碧云天)测量血清中血糖浓度。数据被用于生成曲线下面积(AUC)计算从0-120分钟葡萄糖浓度测量。结果见图3,实验结果与野生型小鼠一致,即与PBS组相比,XMF1从第二周开始显著改善小鼠调节血糖的能力,并且XMF1优于XMF2和XMF3。
实施例3 IPGTT评估XMF4、XMF5、XMF3对肥胖造模组C57BL/6J对C57BL/6J小鼠血糖调节能力的影响
3.1小鼠肥胖造模及XMF4、XMF5、XMF3对小鼠分组与注射情况
按照实施例2.2.1中所述的方法对SPF级8周雄性C57BL/6J小鼠(购自北京斯贝福生物技术有限公司)进行造模,对筛选合格的肥胖模型小鼠进行注射,处理见下表3:
表3
各组于第1天(D1)进行颈部皮下注射病毒或PBS,在注射后第1周、2周、3周,对小鼠进行IPGTT,评估对小鼠调节血糖能力的影响。
3.2 IPGTT评估XMF4、XMF5、XMF3对肥胖模型C57BL/6J小鼠的血糖调节能力及体重的影响
禁食过夜,16小时后腹腔注射2g/kg葡萄糖。在注射葡萄糖前后0、30、60、90和120分钟尾静脉采血,血液室温静置15分钟,3200rpm/分钟离心分离血清,使用葡萄糖检测试剂盒(碧云天)测量血清中血糖浓度。数据被用于生成曲线下面积(AUC)计算从0-120分钟葡萄糖浓度测量。结果见图4,实验结果表明与PBS组相比,XMF4及XMF5从第一周开始显著改善小鼠调节血糖的能力,并且优于XMF3。
表4.序列信息
通过引用并入
本文中提到的每个专利和科学文献的全部内容为所有目的通过引用并入本文。
等同性
本发明可以以其他特定方式体现,而不背离其精神或本质特征。因此,上述实施方式在所有情况下应该被当作是说明性的,而不是对本文描述的发明的限制。因此,本发明的范围由随附的权利要求书而不是由上述描述指明,并打算将在权利要求书的等同性意义和范围之内的所有变化涵盖在其中。
Claims (28)
1.一种融合多肽,其包括:i)胰高血糖素样肽1(GLP-1)和ii)骨钙素(OC),所述GLP-1和OC相连接。
2.如权利要求1所述的融合多肽,其中所述GLP-1包含如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列(HX2EGTFTSDX10SX12X13LX15X16X17X18AX20X21FX23X24WLX27X28GX 30X31),
其中X2是A、G或S,X10是V或K,X12是K、E、R或S,X13是K或Y,X15是D或E,X16是S、G或E,X17是E、R、Q或K,X18是R、S或A,X20是R、K或Q,X21是D或E,X23是V或I,X24是A或Q,X27是E或V,X28是A或K,X30是G或R,和X31是G或不存在。
3.如权利要求1或2所述的融合多肽,其中所述融合多肽结合胰高血糖素受体和/或结合GLP-1受体如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的融合多肽,其中所述OC包含由式M1-Za-M2表示的肽,其中Za选自如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-100位氨基酸序列、SEQID NO:3中第52-70位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-69位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-87位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-77位氨基酸序列、或SEQ ID NO:3中第64-97位氨基酸序列,M1、M2各自独立地为具有不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基的多肽区段或者不存在。
5.如权利要求1至3中任一项所述的融合多肽,其中所述OC包含由式M1-Za-M2表示的肽,其中Za选自由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40组成的组的氨基酸序列。
6.如权利要求1至5中任一项所述的融合多肽,其中所述融合多肽包含信号肽序列和/或标签肽,优选地,所述信号肽序列位于N-末端,更优选地,所述信号肽包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
7.如权利要求1至6中任一项所述的融合多肽,所述GLP-1和OC可选择地由连接体序列连接,优选地,所述连接体序列包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或者包含如(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列,其中n为大于0的整数。
8.如权利要求1至7中任一项所述的融合多肽,其包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与其具有85%以上、90%以上、95%以上、或99%以上同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的融合多肽,其特征在于:所述融合特异性结合人GLP-1受体(GLP-1Rs)和G蛋白耦联受体C家族6组成员A(GPRC6A)的结合位点。
10.一种多核苷酸,其编码如权利要求1至9中任一项所述的融合多肽。
11.如权利要求10所述的多核苷酸,所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或与其具有85%以上、90%以上、95%以上、或99%以上同一性的核苷酸序列。
12.一种载体,其包括如权利要求10或11所述的多核苷酸。
13.如权利要求12所述的载体,其中所述载体选自腺相关病毒AAV载体、腺病毒载体、RNA病毒载体、慢病毒载体和牛痘病毒载体中的至少一种。
14.一种宿主细胞,其包含如权利要求10或11所述的多核苷酸或如权利要求12或13所述的载体。
15.一种AAV颗粒,其包含如权利要求13所述的AAV载体。
16.一种药物组合物,其包含如权利要求1至9中任一项所述的融合多肽、如权利要求10或11所述的多核苷酸、如权利要求12或13所述的载体、如权利要求14所述的宿主细胞、如权利要求15所述的AAV颗粒中的至少一种,
以及药学上可接受的载体。
17.如权利要求16所述的药物组合物,其中所述腺相关病毒外壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9中的至少一种。
18.如权利要求17所述的药物组合物,其中所述组合物适于静脉注射、皮下注射、肌肉注射、唾液腺注射或脾脏注射。
19.如权利要求1至9中任一项所述的融合多肽、如权利要求10或11所述的多核苷酸、如权利要求12或13所述的载体、如权利要求14所述的宿主细胞、如权利要求15所述的AAV颗粒、或如权利要求16所述的药物组合物在制备用于在受试者中治疗肥胖相关疾病的药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途,其中所述肥胖相关疾病选自糖尿病、胰岛素抵抗综合征、脂肪营养不良、非酒精性脂肪性肝炎、心血管疾病、多囊性卵巢综合征、代谢综合征、高甘油三酯血症、高胆固醇、动脉粥样硬化和冠心病中的一种或多种。
21.一种核酸构建体组合物,其包括第一核酸和第二核酸,其中所述第一核酸包含编码胰高血糖素样肽1(GLP-1)的多核苷酸,所述第二核酸包含编码骨钙素(OC)的多核苷酸,所述多核苷酸在不同的表达框中,或者在同一个表达框中。
22.一种载体,其包括如权利要求21所述的核酸构建体组合物。
23.一种载体组合,其包括第一载体和第二载体,其中所述第一载体包含编码胰高血糖素样肽1(GLP-1)的多核苷酸,所述第二载体包含编码骨钙素(OC)的多核苷酸。
24.一种药物组合物,其包括第一多肽和第二多肽,其中所述第一多肽包含胰高血糖素样肽1(GLP-1),所述第二多肽包含骨钙素(OC)。
25.如权利要求21所述的核酸构建体组合物、如权利要求22所述的载体、如权利要求23所述的载体组合物、如权利要求24所述的药物组合物,其中所述GLP-1包含如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列
(HX2EGTFTSDX10SX12X13LX15X16X17X18AX20X21FX23X24WLX27X28GX 30X31),
其中X2是A、G或S,X10是V或K,X12是K、E、R或S,X13是K或Y,X15是D或E,X16是S、G或E,X17是E、R、Q或K,X18是R、S或A,X20是R、K或Q,X21是D或E,X23是V或I,X24是A或Q,X27是E或V,X28是A或K,X30是G或R,和X31是G或不存在;
所述OC包含由式M1-Za-M2表示的肽,其中Za选自如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、SEQID NO:3中第52-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-70位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-69位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-100位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第62-90位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第52-87位氨基酸序列、SEQ ID NO:3中第64-77位氨基酸序列、或SEQ ID NO:3中第64-97位氨基酸序列;或者所述OC包含由式M1-Za-M2表示的肽,其中Za选自由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40组成的组的氨基酸序列,M1、M2各自独立地为具有不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基的多肽区段或者不存在。
26.如权利要求21所述的核酸构建体组合物、如权利要求22所述的载体、如权利要求23所述的载体组合物、如权利要求24所述的药物组合物在制备用于在受试者中治疗肥胖相关疾病的药物中的用途。
27.如权利要求26所述的用途,其中所述肥胖相关疾病选自糖尿病、胰岛素抵抗综合征、脂肪营养不良、非酒精性脂肪性肝炎、心血管疾病、多囊性卵巢综合征、代谢综合征、高甘油三酯血症、高胆固醇、动脉粥样硬化和冠心病中的一种或多种。
28.如权利要求21所述核酸构建体组合物的制备方法,包括以下步骤:
a.分别在胰高血糖素样肽1(GLP-1)和骨钙素(OC)的N端加上分泌信号肽和/或标签肽;
b.将所述GLP-1和OC可选择地由连接体序列连接或不由连接体序列连接;
c.根据人密码子偏好设计核苷酸序列,并在5’端和3’端引入酶切位点;
d.获得包含编码GLP-1和信号肽和/或标签肽的第一多核苷酸和包含编码OC和信号肽和/或标签肽的第二多核苷酸,其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸在不同的表达框中,或者在同一个表达框中。
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