CN118063549A

CN118063549A - 一种美容功能多肽及其制备方法和在化妆品中的用途

Info

Publication number: CN118063549A
Application number: CN202410288905.7A
Authority: CN
Inventors: 潘建强; 潘庭
Original assignee: Zhongshan Huanya Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhongshan Huanya Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-03-14
Filing date: 2024-03-14
Publication date: 2024-05-24

Abstract

本发明公开了一种具有美容功能的多肽、制备方法及其在化妆品中的用途，属于多肽和化妆品领域。本发明以对虾为原料，通过中性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解，分离纯化得到具有美白、抗皱和抗氧化功能的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示。相比于传统的化学合成法和提取法，本发明制备的美容多肽更加高效、安全、环保，其在药物以及化妆品领域具有良好的应用前景。

Description

一种美容功能多肽及其制备方法和在化妆品中的用途

技术领域

本申请涉及多肽领域和化妆品领域，具体涉及具有美容功能的多肽及其制备方法和在化妆品中的应用。

背景技术

黑色素一般对于保护人体免受紫外线的辐射起到重要作用，紫外线能够激活酪氨酸酶的活性，在氧化酪氨酸或者3，4-二羟苯丙氨酸后，经过一连串化学反应形成黑色素。黑色素生成后能够减少紫外线产生的自由基，减少自由基对正常细胞的毒害作用。黑色素过多的形成会使皮肤变黑，局部生成过多会导致黄褐斑和雀斑，他们都是皮肤病。酪氨酸酶是合成黑色素过程中的关键酶，阻断黑色素生成的一种有效途径就是抑制酪氨酸酶的活性。

市场常见的酪氨酸酶抑制剂包括曲酸、熊果苷、对苯二酚、光甘草定、谷胱甘肽和曲酸等，这些化合物具有较好的抗氧化，抑制黑色素生成的能力，但在较长的时间广泛大量的使用，有一定致癌性或导致黑色素细胞死亡，会出现使用过程中“越用越黑”，被皮肤吸收后会还原产生对苯二酚，产生诸多的副作用。此外，随着上世纪化学合成工业的发展，化学合成的化妆品曾占据了化妆品市场的主导地位，但是化学制品的不安全性和污染性都令人担忧，人们更希望得到安全无刺激的、无污染的天然化妆品。

肽(Peptide)即小分子的蛋白质，是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，是蛋白质的结构和功能片段。小分子肽能透过皮肤屏障并被吸收，具有特殊生理活性的肽还能在本质上改善皮肤的一系列问题，具有很好的美容效果。在皮肤的自然老化和护理过程中，多肽起着重要的作用，如细胞增殖、细胞迁移、血管发生、色素形成和蛋白质合成及调控等。目前，已有多种多肽被应用于美容产品中，以达到抗自由基氧化、抗皱、美白、抗水肿、消炎修复和促进胶原蛋白合成等功能，小分子肽在解决此类问题上提供了一个实际可行且前景广阔的解决方案。

国内海洋产品加工目前大多停留在初级加工阶段，由于资源利用率低，加工过程产生的下脚料浪费等原因造成资源浪费，甚至是环境污染。对虾中含有大量蛋白质，且其组成均衡，利用现代生物技术对其中的蛋白质资源进行深加工，合理的选用酶类等，通过工艺优化将使得具有美容功效的美容多肽研究具有更广阔的前景。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种具有美容功能的多肽及其制备方法和用途。

为实现以上目的，本申请提供以下技术方案：

本发明提供一种具有美容功能的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1-3所示。

本发明提供一种美容功能多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜的对虾清洗干净，去除虾头和虾壳，取虾尾肉洗净沥干，置于绞肉机中绞成肉糜，得对虾肉糜；

(2)按照重量比向所得鳄鱼肉糜中加入2～8倍的水，然后在90～95℃水浴中保温10～15min，再于分散均质机匀浆3～5min，得对虾肉匀浆液；

(3)调节步骤(2)所得的对虾肉匀浆液的pH为6.5～7.5，煮沸15-30分钟，冷却至室温后加入复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中同时进行超声处理；

(4)酶解结束后，酶解反应液在90～95℃保温5～20min进行灭酶处理，然后冷却至室温；

(5)取步骤(4)的室温酶解反应液在5000-10000rpm离心15-30min，收集上清，抽滤冻干，得对虾酶解产物；

(6)依次采用截留分子量为10kDa、3kDa膜过滤系统对(5)中的对虾酶解产物进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到不同分子量的多肽，包括≥10000Da，3000-10000Da，≤3000Da等组分。

(7)收集步骤(6)不同分子量的多肽，再经过SP-650M离子交换柱进行分离，再用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱峰在215nm下进行测量；利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，收集组分，透析脱盐，冻干备用，得到高纯度的美容多肽；

(8)利用质谱仪对美容多肽交替进行一级质谱和二级质谱，借助软件分析，得到六个肽段氨基酸序列SEQ ID NO.1-3如下表所示。

进一步地，在步骤(3)中，按照复合蛋白酶与对虾肉糜的质量比为1∶500～800的比例向对虾肉匀浆液中加入复合蛋白酶。

进一步地，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶组成。

进一步地，中性蛋白酶：胰蛋白酶：风味蛋白酶：木瓜蛋白酶之间的质量比为1-5∶1-5∶1-5∶1-5。

进一步地，所述中性蛋白酶：胰蛋白酶：风味蛋白酶：木瓜蛋白酶之间的质量比为1∶3∶1∶2。

进一步地，步骤(3)的酶解条件为：酶解温度50℃、酶解时间为4h。

本发明还提供一种化妆品，所述化妆品包含美容功能多肽。

本发明提供多肽在制备美白、除皱和抗氧化的化妆品中的用途，所述化妆品还包括化妆品领域能够接受的基质。

进一步地，所述基质包括乳化剂、助乳化剂、皮肤调理剂、增白剂、着色剂、保湿剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、芳香剂、润肤剂、抗粉刺剂、成膜剂、增稠剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂或紫外线吸收剂中的至少一种。

进一步地，所述化妆品包括但不限于洗面奶、爽肤水、啫喱、乳液、膏霜、眼霜、面膜、精华、气雾或喷雾。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明涉及的美容功能的多肽及其制备方法和应用，其既具备高效酪氨酸酶抑制活性，又具备促成纤维细胞增殖以及抗氧化衰老保护正常细胞的功能，同时短肽序列能控制在一个较低的生产成本和很好的生物相容性。相比于传统的化学合成法和提取法，生物法制备美容肽更加高效、安全、环保，所述多肽在制备抗氧化、美白、抗皱药物以及化妆品中具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请多肽对酪氨酸酶的抑制效果。

图2为本申请多肽促成纤维细胞增殖效果。

具体实施方式

以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例1美容功能多肽的制备

(2)按照重量比向所得鳄鱼肉糜中加入5倍的水，然后在95℃水浴中保温15min，再于分散均质机匀浆5min，得对虾肉匀浆液；

(3)调节步骤(2)所得的对虾肉匀浆液的pH为7.0，煮沸20分钟，冷却至室温后，按照复合蛋白酶与对虾肉糜的质量比为1∶600的比例向对虾肉匀浆液中加入复合蛋白酶在50℃下酶解4h，酶解过程中同时进行超声处理；所述复合蛋白酶的组成为中性蛋白酶：胰蛋白酶：风味蛋白酶：木瓜蛋白酶之间的质量比为1∶3∶1∶2。

(4)酶解结束后，酶解反应液在95℃保温100min进行灭酶处理，然后冷却至室温；

(5)取步骤(4)的室温酶解反应液在6000rpm离心30min，收集上清，抽滤冻干，得对虾酶解产物；

(6)依次采用截留分子量为10kDa、3kDa膜过滤系统对(5)中的对虾酶解产物进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到不同分子量的多肽，包括≥10000Da、3000-10000Da、≤3000Da等组分。

(8)利用质谱仪对美容多肽交替进行一级质谱和二级质谱，借助软件分析，得到三个肽段氨基酸序列SEQ ID NO.1-3如下表所示。

所述多肽委托上海生工进行合成后备用。

实施例2抗氧化效果

(1)DPPH自由基清除能力的测定

利用DPPH自由基清除率测定法研究抗氧化多肽。配制浓度1×10^-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。将2mL，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液加入到含有2mL的0mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM浓度的三种多肽溶液的洁净试管中，混匀。室温下放置30min后，于517nm处测定吸光度,吸光值越小，表明自由基清除能力越强。

清除率(％)＝[1-(A_i-A_j)/A₀]×100％，其中，A₀为2mL，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2mL的样品溶剂，空白对照；A_i为2mL，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2mL的多肽溶液；A_j为2mL的无水乙醇+2mL的样品。

(2)ABTS自由基清除活性的测定

以去离子水将ABTS溶解，使ABTS浓度达到7mmol/L，加入过硫酸钾，使过硫酸钾的浓度为2.45mmol/L。之后将该溶液在室温下置于暗处过夜12～16h。将生成的ABTS自由基溶液用磷酸缓冲液(PBS，0.2mol/L，pH 7.4)稀释，使其在734nm下的吸光值为0.70。取0.1ml的0mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM三种多肽溶液与2.9ml ABTS自由基液混合，摇匀30s，暗处反应10min，然后在734nm下测定反应液的吸光值。以蒸馏水代替水解液作空白。

清除率(％)＝(A₀-A_j)/A₀×100％，其中，A₀为2.9mL ABTS试剂与0.1mL蒸馏水混合液的吸光值；A_j为2.9mL ABTS试剂与0.1mL酶解液混合液的吸光值。结果如表所示。

从上表的结果可以看出，获得的SEQ ID NO.1-3的多肽均具有显著的清除DPPH和ABTS自由基的能力。

实施例3不同浓度的多肽对酪氨酸酶的抑制效果

将L酪氨酸饱和溶解在PBS缓冲液中，L-酪氨酸含量约为0.4mg/ml，分别加入浓度为0mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM的三种多肽溶液，在37℃孵育十分钟后，各加入37℃预热的2KU单位的酪氨酸酶，反应24小时后，分别测量475nm处的光吸收值，该OD₄₇₅nm代表黑色素的含量。其中，浓度为0mM的多肽实验作为对照组，测得对照组OD₄₇₅nm。其中，浓度为0mM、0.8mM、1.6mM、3.2mM、6.4mM的多肽实验作为实验组，测得实验组OD₄₇₅nm。

酪氨酸酶的抑制率％＝(对照组OD₄₇₅nm-实验组OD₄₇₅nm)/对照组OD₄₇₅nm x 100％。结果如图1所示，本申请多肽具有明显的酪氨酸酶抑制活性，具有明显的美白效果。

实施例4促成纤维细胞增殖作用

将BALB/c 3T3细胞接种于96孔细胞培养板中(5000个细胞/孔)，37℃，5％CO₂细胞培养箱培养24h；换用DMEM无血清培养基继续培养12h；分别加浓度为0mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM的三种多肽溶液以及PBS(阴性对照组)，继续培养48～72h；每孔加入10μLCCK-8试剂，37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育2h后取出；用酶标仪读取96孔板在450nm和630nm的吸光值，以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果。

促细胞增殖率＝(实验组OD₄₅₀nm-阴性对照组OD₄₅₀nm)/阴性对照组OD₄₅₀nm×100％。结果如图2所示，本申请多肽具有明显的促细胞增殖活性，具有明显的抗皱效果。

实施例5多肽的皮肤安全性评价

受试人群：年龄30-50岁之间，女性30人，男性30人，总计60人。10男10女一组，分为3组，分别测量SEQ ID NO.1-3的安全性。受试者皮肤健康，无皮肤病过敏史，符合受试者志愿入选标准。

试验方法：选用合格的斑贴器，以封闭式斑贴试验方法，将三种多肽溶液约0.20ml(1.0mM)分别滴于斑贴器内，外用专用胶带贴覆于受试者面部，24小时后去除试验品，分别于去除后0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，按照《化妆品卫生规范》中皮肤反应分级标准记录其结果。

试验结果：本试验60名受试者通过斑贴试验，在48小时内均未观察到皮肤不良反应或过敏反应，说明本发明的美容多肽对皮肤使用安全。

基于上述描述，本领域技术人员将理解，在不改变其技术精神和必要特征的情况下，可以以不同的具体形式实施本公开。因此，应该理解上述实施方式在所有方面不是限制性的，而是说明性的。本公开的范围由所附权利要求限制，而不是由它们前面的说明限制，且因此所有改变和修改落入权利要求的边界和范围内，或这种边界和范围的等同物因此意在被权利要求涵盖。

Claims

1.一种具有美容功能的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1-3所示。

2.根据权利要求1所述美容多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将新鲜的对虾清洗干净，去除虾头和虾壳，取虾尾肉洗净沥干，置于绞肉机中绞成肉糜，得对虾肉糜；

（2）按照重量比向所得鳄鱼肉糜中加入2～8倍的水，然后在90～95℃水浴中保温10～15min，再于分散均质机匀浆3～5min，得对虾肉匀浆液；

（3）调节步骤（2）所得的对虾肉匀浆液的pH为6.5～7.5，煮沸15-30分钟，冷却至室温后加入复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中同时进行超声处理；

（4）酶解结束后，酶解反应液在90～95℃保温5～20min进行灭酶处理，然后冷却至室温；

（5）取步骤（4）的室温酶解反应液在5000-10000rpm离心15-30min，收集上清，抽滤冻干，得对虾酶解产物；

（6）依次采用截留分子量为10kDa、3kDa膜过滤系统对（5）中的对虾酶解产物进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到不同分子量的多肽，包括≥10000 Da，3000-10000 Da，≤3000 Da等组分；

（7）收集步骤（6）不同分子量的多肽，再经过 SP-650M离子交换柱进行分离，再用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱峰在215nm下进行测量；利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，收集组分，透析脱盐，冻干备用，得到高纯度的美容多肽；

（8）利用质谱仪对美容多肽交替进行一级质谱和二级质谱，借助软件分析，得到权利要求1所述的多肽。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，按照复合蛋白酶与对虾肉糜的质量比为1∶500～800的比例向对虾肉匀浆液中加入复合蛋白酶。

4.根据权利要求2-3所述的制备方法，其特征在于，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其中，中性蛋白酶：胰蛋白酶：风味蛋白酶：木瓜蛋白酶之间的质量比为1-5∶1-5∶1-5∶1-5。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述中性蛋白酶：胰蛋白酶：风味蛋白酶：木瓜蛋白酶之间的质量比为1∶3∶1∶2。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）的酶解条件为：酶解温度50℃、酶解时间为4h。

7.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品包含权利要求1所述的多肽。

8.权利要求1所述的多肽及权利要求2-6所述制备方法获得的多肽在制备美白、除皱和抗氧化的化妆品中的用途，所述化妆品还包括化妆品领域能够接受的基质。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述基质包括乳化剂、助乳化剂、皮肤调理剂、增白剂、着色剂、保湿剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、芳香剂、润肤剂、抗粉刺剂、成膜剂、增稠剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂或紫外线吸收剂中的至少一种。

10.根据权利要求8-9所述的用途，其特征在于，所述化妆品包括但不限于洗面奶、爽肤水、啫喱、乳液、膏霜、眼霜、面膜、精华、气雾或喷雾。