CN118059059A - 一种脂质纳米颗粒的冻干制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脂质纳米颗粒的冻干制剂。通过采用本发明的可电离脂质分子形成脂质纳米颗粒，由所述脂质纳米颗粒制成冻干制剂，可以使所述脂质纳米颗粒长期稳定保存于制剂中，并在复建后保持原有脂质纳米颗粒的物化性质(粒径、多分散性指数、电动电位和包封率等)，保证给药时活性分子的递送效率和效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药制剂技术领域，具体涉及一种脂质纳米颗粒的冻干制剂。
背景技术
不同类型的核酸制剂正被研发用于治疗各种重大疾病如传染性疾病、癌症、罕见病等。该类核酸制剂包括：DNA、反义核酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)、适配体(aptamer)、核酶(ribozyme)等。其中，mRNA疫苗在安全性、快速制备和免疫原性方面具有颠覆性的优势。基于mRNA修饰和递送工具的发展，一旦获得病毒抗原序列，可在数周内迅速设计和制造具有临床规模的mRNA疫苗，可以实现标准化生产，使其在应对大流行暴发方面非常具有吸引力。且mRNA疫苗不存在减毒疫苗潜在的逆转危险；不存在灭活疫苗的恢复突变问题。在免疫原性上，mRNA疫苗能够诱导B细胞和T细胞免疫应答，能引起免疫记忆效果，传递更多有效抗原，并且能一次表达多个抗原。此外，mRNA只需要穿过细胞膜在细胞质中就可以高效表达抗原蛋白；mRNA没有基因整合到基因组中的风险。再次，mRNA被翻译成蛋白质后易被降解，其瞬时表达的特性不仅确保了mRNA药物的安全性，而且使其剂量可控，避免了疫苗药物长期暴露引起的抗原免疫耐受(对特定抗原无反应的状态)。
但是，一方面核酸制剂带负电而且多数分子量较大很难直接进入细胞内，另一方面，RNA不稳定，在引入体内的过程中极易被核酸酶降解，从而失去生物功能。因此，开发高效安全并且通用的核酸递送系统，以及适应的给药制剂形式，是核酸药物转化过程中亟待解决的问题。
目前，核酸的递送方法中，较为成熟的核酸递送载体是脂质纳米颗粒(LNP)，该类脂质制剂的主要成分包括：阳离子/可电离脂质、辅助型脂质、胆固醇和聚乙二醇-脂质结合物。在这四种脂质成分中，阳离子脂质带电荷的头部能够与带负电的核酸结合，同时也能与细胞膜上的磷脂分子结合，在核酸包裹和膜融合过程中都发挥着关键的作用。脂质纳米颗粒是由脂质分子经过分子间作用力自主装形成的，其作为药物在给予受试者前，是否能在制剂中稳定存在，对于保证其治疗有效性是至关重要的。因此开发包含脂质纳米颗粒的稳定制剂，对于以脂质纳米颗粒为药物载体形式的药物而言非常关键。
发明内容
脂质纳米颗粒(LNP)的制剂稳定性是包括mRNA疫苗在内的药物开发中面临的主要挑战之一。以mRNA疫苗为例，其不稳定性主要表现为物理不稳定性(mRNA-LNP聚集/融合)和化学不稳定性(LNP组分的氧化、mRNA的泄露和水解)。通过去除mRNA疫苗制剂中的水分使制剂干燥，降低冻融的风险和化学反应活性，进而实现提升mRNA疫苗稳定性的目的。
本发明的发明人通过研究，获得了一种新型可电离脂质化合物，其可用于递送核酸分子(包括mRNA)，并且在通过调配构成脂质纳米颗粒的其他脂质的种类及其含量，并配合适当的辅料，制备成脂质纳米颗粒冻干制剂，所述冻干制剂能够稳定保存，并在复建(也称复溶)后保持原有脂质纳米颗粒的物化性质(粒径、多分散性指数、电动电位和包封率等)，保证给药时活性分子的递送效率和效果。
本发明提供一种脂质纳米颗粒的冻干制剂。
所述冻干制剂中，脂质纳米颗粒中包含：式I的可电离阳离子脂质分子，或进一步含有其他脂质分子。所述其他脂质分子可以是本领域中用于构建脂质纳米颗粒已知或常规使用的脂质分子，包括但不限于中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子。
根据本发明，所述式I的可电离脂质化合物结构式为其中：
Q为其中，R8、R9为彼此独立的选自经取代或未取代的直链C1-10亚烷基；R7为氢，卤素，-OH，直链或支链C1-20烷基，直链或支链C2-20烯基，直链或支链C2-20炔基，或-CH2CH(OH)R5，或所述取代的取代基团为卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基；
R1、R2、R3、R4可以相同或不同，各自独立的选自氢，经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基，所述烷基、烯基或炔基的1个或1个以上C原子任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换，或-CH2CH(OH)R5；所述取代的取代基团选自卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基；
条件是，R1、R2、R3、R4中至少一个为
R5选自氢，经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基，所述烷基、烯基或炔基的1个或1个以上C原子任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换；所述取代的取代基团选自卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基；
R6选自氢，C1-3烷基，C1-3烷氧基，-OH；
n选自1～8的整数，m选自0～8的整数，n和m彼此独立，可以相同也可以不同；
当R1、R2、R3、R4中至少两个为时，每个所述基团中的n和m彼此独立，可以相同也可以不同。
优选，Q为其中：x和y可以相同或者不同，独立地选自1～8的整数；R7定义和前述相同；优选，x或y相同或不同，选自1～3的整数，例如为1、2或3；优选，R7为直链或支链C1-4烷基，例如为甲基、乙基、正丙基、正丁基等。
在本发明的优选实施方式中，R6为-OH。
在本发明的优选实施方式中，n选自4～8的整数，m选自4～8的整数。
在本发明的优选实施方式中，所述式I化合物为下式A、B、C或D：
其中每个n1都彼此独立，可以相同或不同，每个n1选自1～8的整数，每个m1都彼此独立，可以相同或不同，每个m1选自0～8的整数；优选，每个n1选自4～8的整数，每个m1选自4～8的整数；优选，每个n1都彼此相同，每个m1都彼此相同。
其中每个n2都彼此独立，可以相同或不同，每个n2选自1～8的整数，每个m2都彼此独立，可以相同或不同，每个m2选自0～8的整数；优选，每个n2选自4～8的整数，每个m2选自4～8的整数；优选，每个n2都彼此相同，每个m2都彼此相同。
其中每个n3都彼此独立，可以相同或不同，每个n3选自1～8的整数，每个m3都彼此独立，可以相同或不同，每个m3选自0～8的整数；优选，每个n3选自4～8的整数，每个m3选自4～8的整数；优选，每个n3都彼此相同，每个m3都彼此相同。
其中每个n4都彼此独立，可以相同或不同，每个n4选自1～8的整数，每个m4都彼此独立，可以相同或不同，每个m4选自0～8的整数；优选，每个n4选自4～8的整数，每个m4选自4～8的整数；优选，每个n4都彼此相同，每个m4都彼此相同。
在本发明的一些具体实施方式中，所述式I化合物选自表1所示的以下化合物：
表1
优选，所述式I化合物是
在本发明的一个实施方式中，所述脂质纳米颗粒中包含式I的可电离阳离子脂质分子、中性脂质分子、胆固醇类脂质分子和PEG化的脂质分子。
根据本发明，所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子30-60mol％的式I的脂质分子，优选32-55mol％，例如可以为30mol％，31mol％，32mol％，33mol％，34mol％，35mol％，36mol％，37mol％，38mol％，39mol％，40mol％，41mol％，42mol％，43mol％，44mol％，45mol％，46mol％，47mol％，48mol％，49mol％，50mol％，51mol％，52mol％，53mol％，54mol％，55mol％等，进一步优选34-46mol％。
根据本发明，所述中性脂质分子是不带电脂质分子或两性离子型脂质分子，例如磷脂酰胆碱类化合物，或/和磷脂酰乙醇胺类化合物。
磷脂酰胆碱类化合物的结构如式E所示：磷脂酰乙醇胺类化合物的结构如式F所示：其中Ra、Rb、Rc、Rd独立的选自直链或支链的C1-30烷基，直链或支链的C2-30烯基，优选为直链或支链的C10-30烷基，直链或支链的C10-30烯基，例如CH3(CH2)17CH2-、CH3(CH2)15CH2-、CH3(CH2)13CH2-、CH3(CH2)11CH2-、CH3(CH2)9CH2-、CH3(CH2)7CH2-、CH3(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7-、CH3(CH2)7-CH＝CH-(CH2)9-。
中性脂质分子的实例包括但不限于5-十七基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它们的组合。
在一个实施方案中，中性脂质分子可选自由以下组成的组：二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。在另一个实施方案中，中性脂质分子可为二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在另一个实施方案中，中性脂质分子可为二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)。
根据本发明，中性脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为5-30mol％，例如8-20mo l％，例如可以为8mol％，9mol％，10mol％，11mol％，12mol％，13mol％，14mol％，15mol％，16mol％，17mol％，18mol％，19mol％，20mol％，进一步优选9-16mol％。
根据本发明，胆固醇类脂质分子是指甾醇以及含有甾醇部分的脂质，包括但不限于胆固醇，5-十七基间苯二酚，粪甾醇，谷甾醇，麦角甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜子甾醇，番茄次碱，番茄碱，熊果酸，α-生育酚及其混合物、胆固醇半琥珀酸酯。在一个实施方案中，胆固醇类脂质分子为胆固醇(CHOL)。在一个实施方案中，胆固醇类脂质分子为胆固醇半琥珀酸酯。
根据本发明，胆固醇类脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为30-50mol％，例如可以为30mol％，31mol％，32mol％，33mol％，34mol％，35mol％，36mol％，37mol％，38mol％，39mol％，40mol％，41mol％，42mol％，43mol％，44mol％，45mol％，46mol％，47mol％，48mol％，49mol％，50mol％等，优选35-50mol％，进一步优选37-49mol％。
根据本发明，PEG化的脂质分子包含脂质部分和基于PEG的聚合物部分。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可表示为“脂质部分-PEG-数均分子量”或者“PEG-脂质部分”或者“PEG-数均分子量-脂质部分”，所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二棕榈酰甘油、二硬脂酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二棕榈酰甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；PEG的数均分子量为约130至约50,000，例如约150至约30,000，约150至约20,000，为约150至约15,000，为约150至约10,000，为约150至约6,000，为约150至约5,000，为约150至约4,000，为约150至约3,000，为约300至约3,000，为约1,000至约3,000，为约1,500至约2,500，例如约2000。
在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰甘油酰胺和PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DMG-PEG2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DSG-PEG2000)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(DMA-PEG2000)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSA-PEG2000)。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为DMG-PEG2000。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可为DSG-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为DSPE-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为DMA-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为C-DMA-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为DSA-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为PEG2000-C11。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可为PEG2000-C14。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可为PEG2000-C16。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可为PEG2000-C18。
根据本发明，PEG化的脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为0.4-10mol％，例如0.5-5mol％，例如可以为0.4mol％，0.5mol％，0.6mol％，0.7mol％，0.8mol％，0.9mol％，1.0mol％，1.1mol％，1.2mol％，1.3mol％，1.4mol％，1.5mol％，1.6mol％，1.7mol％，1.8mol％，1.9mol％，2.0mol％，2.1mol％，2.2mol％，2.3mol％，2.4mol％，2.5mol％，2.6mol％，2.7mol％，2.8mol％，2.9mol％，3.0mol％，3.1mol％，3.2mol％，3.3mol％，3.4mol％，3.5mol％，3.6mol％，3.7mol％，3.8mol％，3.9mol％，4.0mol％，4.1mol％，4.2mol％，4.3mol％，4.4mol％，4.5mol％，4.6mol％，4.7mol％，4.8mol％，4.9mol％，5.0mol％等，进一步优选1.3-2.7mol％。
在本发明的一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒中含有式C所示的脂质分子，中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子，其中：
式C其中每个n3都彼此独立，可以相同或不同，每个n3选自1～8的整数，每个m3都彼此独立，可以相同或不同，每个m3选自0～8的整数；优选，每个n3选自4～8的整数，每个m3选自4～8的整数；优选，每个n3都彼此相同，每个m3都彼此相同；更优选为式C所示的可电离阳离子脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为32-55mol％，优选为34-46mol％。
中性脂质分子选自式E所示的磷脂酰胆碱类化合物式F所示的磷脂酰乙醇胺类化合物其中Ra、Rb、Rc、Rd独立的选自直链或支链的C10-30烷基，直链或支链的C10-30烯基，优选为CH3(CH2)17CH2-、CH3(CH2)15CH2-、CH3(CH2)13CH2-、CH3(CH2)11CH2-、CH3(CH2)9CH2-、CH3(CH2)7CH2-、CH3(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7-、CH3(CH2)7-CH＝CH-(CH2)9-。中性脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为8-20mol％，优选为9-16mol％。
胆固醇类脂质分子选自胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯。胆固醇类脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为30-50mol％，优选为35-50mol％，更优选为37-49mol％。
PEG化的脂质分子表示为“脂质部分-PEG-数均分子量”，所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二棕榈酰甘油、二硬脂酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二棕榈酰甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；PEG的数均分子量为130～50,000，例如150～30,000，150～20,000，150～15,000，150～10,000，150～6,000，150～5,000，150～4,000，150～3,000，300～3,000，1,000～3,000，1,500～2,500，约2000。PEG化的脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为0.5-5mol％，优选为1.3-2.7mol％。
在本发明的一个实施方式中，所述中性脂质分子是DOPE和/或DSPC。
在本发明的一个实施方式中，所述PEG化的脂质分子是DMG-PEG2000和/或DSPE-PEG2000。
根据本发明，所述冻干制剂进一步包含活性成分，所述活性成分可以是小分子化合物、核酸、蛋白质、多肽等。所述活性成分位于脂质纳米颗粒中。在本发明的一个实施方式中，所述活性成分是核酸，包括但不限于mRNA、siRNA、shRNA、microRNA、DNA、cDNA等。
根据本发明，当活性成分为核酸时，所述冻干制剂中脂质纳米颗粒中脂质分子的总质量与核酸的质量之比为5-20:1。
根据本发明，当活性成分为核酸时，所述核酸在冻干制剂复溶后的液体制剂中的含量为1-1000μg/ml，例如可以是10μg/ml，50μg/ml，60μg/ml，70μg/ml，80μg/ml，90μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml，250μg/ml，300μg/ml，350μg/ml，400μg/ml，450μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml等。
在本发明的一个实施方式中，所述药物制剂的活性成分是mRNA。
根据本发明，所述mRNA从5’端至3’端包含5’UTR，开放阅读框(ORF)，3’UTR和poly-A尾。所述mRNA还可以进一步包含5’帽结构。
根据本发明，所述帽结构可以是Cap1结构，Cap2结构或Cap3结构。在本发明的一个实施方式中，所述帽结构是Cap1结构。
根据本发明，所述5’UTR可以包含β-珠蛋白或α-珠蛋白的5’UTR或其同源物、片段。在本发明的一些实施方式中，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:1所示的β-珠蛋白的5’UTR核苷酸序列至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述5’UTR包含SEQ IDNO:1所示的β-珠蛋白的5’UTR核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述5'UTR还包含Kozak序列。在本发明的一个实施方式中，所述Kozak序列为GCCACC。
根据本发明，所述3’UTR可以包含β-珠蛋白或α-珠蛋白的3’UTR或其同源物、片段，或片段的组合。在本发明的一些实施方式中，所述3’UTR包含与SEQ ID NO:2所示α2-珠蛋白3’UTR的片段至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列。在本发明的另一些实施方式中，所述3’UTR包含2个首尾相连的与SEQ ID NO:2所示的α2-珠蛋白3’UTR的片段至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述3’UTR包含2个首尾相连的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
根据本发明，所述poly-A尾的长度可以为50-200个核苷酸，优选为100-150个核苷酸，例如110-120个核苷酸，例如约110个核苷酸，约120个核苷酸，约130个核苷酸，约140个核苷酸，约150个核苷酸。
根据本发明，所述开放阅读框是编码肽或蛋白的核酸序列，所述肽或蛋白可以是抗原、结构蛋白、调节蛋白、激素、神经递质、生长调节因子、分化因子、基因表达调控因子、DNA相关蛋白、酶、血清蛋白、受体等等。抗原蛋白包括但不限定于肿瘤抗原、病原体衍生的抗原、变应原等。
在本发明的一些实施方案中，所述开放阅读框(ORF)是编码2019-nCov的S蛋白或其突变体的开放阅读框(ORF)，所述2019-nCov可以是病毒的野生株或突变株。
所述冻干制剂复溶后形成的液体制剂中，所述脂质纳米颗粒的粒径在1-1000nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～60mV；优选为，粒径在20-500nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～60mV；进一步优选为，粒径在45-300nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～50mV；更优选为，粒径在60-300nm，多分散性指数≤0.3，电动电位在-45～50mV。
发明人通过研究发现，冻干制剂复溶后的液体制剂中的脂质纳米颗粒的粒径会比冻干前的粒径有所增大，增大的范围通常不会超过100nm，推测原因可能是冻干过程中和/或复溶过程中存在脂质纳米颗粒的融合等。因此可以根据复溶后制剂中所要求的的脂质纳米颗粒的粒径大小，来调整冻干前制剂中脂质纳米颗粒的粒径。
所述冻干制剂中进一步含有冻干保护剂。所述冻干保护剂可以是本领域中常用的冻干保护剂，包括但不限于蔗糖、海藻糖和麦芽糖。在本发明的一些实施方式中，所述冻干保护剂是蔗糖、海藻糖和麦芽糖中的一种或任意两种的混合物或三种的混合物。在本发明的一个实施方式中，所述冻干保护剂是蔗糖。所述冻干保护剂的含量占冻干制剂复溶后的液态制剂的5-30w/v％，优选为8-15w/v％，例如5.5w/v％，6w/v％，6.5w/v％，7w/v％，7.5w/v％，8w/v％，8.5w/v％，9w/v％，9.5w/v％，10w/v％，10.5w/v％，11w/v％，11.5w/v％，12w/v％，12.5w/v％，13w/v％，13.5w/v％，14w/v％，14.5w/v％，15w/v％，15.5w/v％，16w/v％，16.5w/v％，17w/v％，17.5w/v％，18w/v％，18.5w/v％，19w/v％，19.5w/v％，20w/v％，20.5w/v％，21w/v％，21.5w/v％，22w/v％，22.5w/v％，23w/v％，23.5w/v％，24w/v％，24.5w/v％，25w/v％，25.5w/v％，26w/v％，26.5w/v％，27w/v％，27.5w/v％，28w/v％，28.5w/v％，29w/v％，29.5w/v％等。
所述冻干制剂中进一步含有缓冲盐。所述缓冲盐可以是本领域中常用的缓冲盐，包括但不限于Tris，Hepe，EDTA，柠檬酸-柠檬酸盐，乙酸-乙酸盐，磷酸盐-磷酸氢盐，碳酸盐-碳酸氢盐等。所述缓冲盐的含量占冻干制剂复溶后的液体制剂的0.05-1w/v％，优选为0.1-0.5w/v％。冻干制剂复溶后的液体制剂的pH值可以为4-9。对于静脉注射用液体制剂，通常更优选pH为6-8。对于非静脉注射用液体制剂，例如肌肉注射用，可以容忍相对较宽的pH值。
所述冻干制剂中进一步含有渗透压调节剂。所述渗透压调节剂可以是本领域中常用的渗透压调节剂，包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖、磷酸盐、枸橼酸盐等。所述渗透压调节剂的用量使得冻干制剂复溶后的液体制剂为0.5～3个等渗浓度的溶液。对于静脉注射用液体制剂，通常更优选为0.9～1.5个等渗浓度的溶液。对于非静脉注射用液体制剂，例如肌肉注射用，其等渗浓度范围可以在较大范围内被身体容忍，一般可以是0.5～3个等渗浓度的溶液。
在使用前，可以采用本领域已知的方法，通过使用注射用溶液将所述冻干制剂复溶成液态制剂，然后进行注射给药。所述注射用溶液可以是注射用水、0.9％注射用氯化钠溶液、或者注射用葡萄糖溶液。
本发明上述序列的列表：
所述脂质纳米颗粒可使用所属领域中已知的任何方法来制备。这些方法包括(但不限于)单一和双重乳液溶剂蒸发、溶剂萃取、相分离、纳米沉淀、微流控、简单和复杂凝聚以及所属领域的普通技术人员熟知的其它方法。
在某些实施例中，所述脂质纳米颗粒上还可以修饰上靶向分子，使其成为靶向剂而能靶向特定细胞、组织或器官。靶向分子可包括在脂质纳米颗粒中或可仅位于其表面上。靶向分子可为蛋白质、肽、糖蛋白、脂质、小分子、核酸等，其实例包括(但不限于)抗体、抗体片段、低密度脂蛋白(LDL)、转铁蛋白(transferrin)、脱唾液酸糖蛋白(asialycoprotein)、受体配体、唾液酸、适体等。
可以采用本领域已知的冻干技术，在获得包含本发明所述脂质纳米颗粒的液态组合物后，制备本发明的冻干制剂。
在本发明的一些实施方式中，制备含有脂质纳米颗粒的液体组合物的方法包括：1)制备含有式I化合物、中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子的有机相；2)制备含有活性成分的水相；3)将有机相和水相进行混合，制备脂质纳米颗粒混悬液；4)将所述混悬液浓缩后，加入冻干保护剂，或进一步加入缓冲盐和/或渗透压调节剂。所述步骤1)中，优选，使用无水乙醇或乙醇的水溶液作为溶剂。所述步骤2)中，优选使用水作为溶剂。所述步骤3)中，优选有机相和水相的体积比为1:2～4。
在本发明中，步骤4)中浓缩得到的混悬液在加入冻干保护剂等物质后，就是冻干前液体制剂，其体积与冻干制剂复溶后形成的液体制剂的体积优选是相同的，这样，加入到混悬液中的冻干保护剂、缓冲盐和/或渗透压调节剂等辅料的含量，与冻干制剂复溶后形成的液体制剂中各物质的含量是相同的。
在本发明的一些实施方式中，冻干制剂的制备方法包括预冻、一次干燥和二次干燥。优选所述预冻为-40℃至-60℃保持1-12h；所述一次干燥为在真空度为0.02mbar-0.4mbar条件下，-30℃至-55℃保持10-80h；所述二次干燥为在真空度为0.02mbar-0.4mbar条件下，4℃至20℃保持10-30h。
获得干燥制剂的方法有很多，比如烘干、喷雾干燥等，但这些方法都是在0℃以上或更高的温度下进行，容易造成LNP产品体积缩小、脂质氧化，进而导致样本活性降低。冷冻干燥是把液态制剂预先降温冻结成固态，然后在真空条件下使冻结的水分以水蒸气的形态从固态制剂中升华出去，因此对热敏性的物质、易氧化的物质特别适用；此外，在冷冻干燥过程中，微生物的生长和活性酶的作用无法进行，故能保持原有性状，提高干粉的稳定性。由于在冻结状态下进行干燥，制剂药品的体积几乎不发生变化，能够保持原有结构，不发生浓缩现象；干燥后的物质疏松多孔，加水后迅速完全溶解，立即恢复原来的性状。
可采用本领域已知的方法制备mRNA。在本发明的一些实施方式中，可以人工合成编码mRNA的核酸序列，将该序列克隆到载体中，构建体外转录用质粒。将构建的质粒转化到宿主菌中培养扩增，提取质粒。将提取的质粒使用限制性内切酶酶切消化成线性分子。以制备的线性化质粒分子为模板，使用体外转录法制备mRNA。可以在体外转录过程中添加帽结构类似物，直接得到具有帽结构的mRNA；也可以在体外转录结束后，使用加帽酶和二甲基转移酶给mRNA添加上帽结构。可采用本领域常规的方法纯化得到的mRNA，例如化学沉淀法、磁珠法、亲和层析法等。
本发明的可电离脂质化合物可以采用本领域已有的方法进行合成，例如，使一当量或一当量以上的胺与一当量或一当量以上的环氧基封端化合物在合适的条件下反应形成。可电离脂质化合物的合成是在有或无溶剂的情况下进行，并且所述合成可在25-100℃范围内的较高温度下进行。可任选纯化制得的可电离脂质化合物。举例来说，可纯化可电离脂质化合物的混合物，得到特定的可电离脂质化合物。或可纯化混合物，得到特定立体异构体或区域异构体。所述环氧化物可以商业购买，或者合成制备。
在本发明的一些实施方式中，本发明的可电离脂质化合物可以采用如下的一般制备方法进行制备。
式A、B、C或D
步骤1：还原
在还原剂的存在下，将化合物A1的羧基还原成羟基以获得化合物A2。还原剂的实例包括但不限于氢化铝锂、二异丁基氢化铝等。反应所用溶剂的实例包括但不限于醚类(如乙醚、四氢呋喃和二氧六环等)，卤代烃(如氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷等)，烃类(如正戊烷、正己烷、苯和甲苯等)，及这些溶剂的两种或以上形成的混合溶剂。
步骤2：氧化
在氧化剂的存在下，将化合物A2的羟基氧化成醛基以获得化合物A3。氧化剂的实例包括但不限于2-碘酰基苯甲酸(IBX)、氯铬酸吡啶(PCC)、二氯铬酸吡啶盐(PDC)、戴斯-马丁氧化剂、二氧化锰等。反应所用溶剂的实例包括但不限于卤代烃(如氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷等)，烃类(如正戊烷、正己烷、苯和甲苯等)，腈类(例如乙腈等)，及这些溶剂的两种或以上形成的混合溶剂。
步骤3：卤代-还原
首先在酸性条件下，将化合物A3的醛α-氢与卤代试剂发生卤代反应以获得α-卤代醛中间体，然后在还原剂存在下，将α-卤代醛的醛基还原成羟基以获得化合物A4。提供酸性条件的实例包括但不限于DL-脯氨酸。卤代试剂的实例包括但不限于N-氯代丁二酰亚胺(NCS)和N-溴代丁二酰亚胺(NBS)。还原剂的实例包括但不限于硼氢化钠、氰基硼氢化钠和三乙酰氧基硼氢化钠。
步骤4：环氧化
将化合物A4在碱的存在下进行分子内的亲核取代反应以获得环氧化合物A5。碱的实例包括但不限于碱金属的氢氧化物或氢化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾和氢化钠。反应所用溶剂的实例包括但不限于二氧六环和水的混合物。
步骤5：开环反应
使化合物A5与胺(例如N,N-二(2-氨基乙基)甲胺)发生开环反应以获得最终化合物。反应用溶剂的实例包括但不限于乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷、己烷、甲苯、乙醚等。
所述制备方法中的原料A1可以商购也可以采用常规方法合成。
本发明的可电离脂质分子结构中含有两个相邻的顺式双键，使其在后续应用于递送系统包裹活性物质(例如核酸如mRNA)时，具有较高的包封率，较好的细胞转染率；此外，在制备脂质纳米颗粒时，得到的脂质纳米颗粒粒径更均匀。本发明的可电离脂质化合物尤其适合于制备实心结构的纳米颗粒。
如本文中所使用，术语“烷基”是指从含有1到30个碳原子的烃部分通过去除单个氢原子得到的饱和烃基。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基和正十二烷基。
术语“烯基”表示从具有至少一个碳-碳双键的烃部分通过去除单个氢原子得到的单价基团。烯基包括例如例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。
术语“炔基”是指从具有至少一个碳-碳三键的烃通过去除单个氢原子得到的单价基团。代表性炔基包括乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。
术语“烷氧基”是指如前文所定义的烷基通过氧原子连接于母体分子。烷氧基的实例包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、新戊氧基和正己氧基。
术语“卤基”和“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。
术语“经取代”(无论前面是否存在术语“任选地”)和“取代基”是指将一个官能团变为另一个官能团的能力，条件是维持所有原子的价数。当任何特定结构中的一个以上位置可经一个以上选自指定群组的取代基取代时，所述取代基可在每一位置相同或不同。
术语“药学上可接受的载体”指任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂等，包括但不限于糖，诸如乳糖、海藻糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；明胶；滑石；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；表面活性剂，诸如吐温80(Tween 80)；缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液；着色剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂等。
医药学中的等渗溶液是指与血浆渗透压相等的溶液。在本发明中，以血浆渗透压为1个等渗浓度。
“和/或”将被视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此，在诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
“包括”和“包含”具有相同的含义，旨在是开放的并且允许但不要求包括额外的元件或步骤。当在本文中使用术语“包括”或“包含”时，因此也包括和公开了术语“由......组成”和/或“基本上由……组成”。
在本说明书和权利要求书中，核苷酸通过其通常接受的单字母代码来指代。除非另有说明，否则核苷酸序列以5'至3'方向从左向右书写。核碱基在本文中由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的通常已知的单字母符号表示。技术人员将理解，本文公开的密码子中的T碱基存在于DNA中，而T碱基在相应RNA中将被U碱基取代。例如，本文公开的DNA形式的密码子-核苷酸序列，例如载体或体外翻译(IVT)模板，其T碱基在其相应的转录mRNA中转录为U碱基。在这一方面，密码子优化的DNA序列(包含T)和它们相应的mRNA序列(包含U)都被认为是本公开的密码子优化的核苷酸序列。本领域技术人员还将理解，可以通过用非天然碱基替换一个或多个碱基来产生等同的密码子图谱。
术语“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”可互换使用，并且是指连续的核酸序列。序列可以是单链或双链的DNA或RNA，例如mRNA。
“编码…的核苷酸序列”是指编码多肽的核酸(例如，mRNA或DNA分子)编码序列。编码序列可以进一步包括与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，所述调控元件包括能够指导在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中的表达的启动子和多腺苷酸化信号。
“约”：在整个说明书和权利要求中与数值结合使用的术语“约”表示本领域技术人员熟悉和可接受的准确度区间。通常，这种精确度的区间为±10％。
同源性：如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间的总体相关性，例如，在核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或在多肽分子之间。通常，术语“同源性”意味着两个分子之间的进化关系。因此，两个同源的分子将具有共同的进化祖先。在本公开的背景下，术语同源性包括同一性和相似性。
在一些实施方案中，如果分子中至少25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的单体是相同的(完全相同的单体)或相似(保守置换)，聚合物分子被认为是彼此“同源的”。术语“同源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体单体保守性。例如，可以通过以进行最佳比较目的比对两个序列来进行两个多核苷酸序列的百分同一性的计算(例如，可以在第一和第二核酸序列之一或两个中引入空位用于最佳比对和非相同的序列可以对于比较目的放弃。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可被认为是等同的。
合适的软件程序可从各种来源获得，并用于蛋白质和核苷酸序列两者的比对。例如，Bl2seq，Needle，Stretcher，Water或Matcher等。
术语“编码区”和“编码区域”是指多核苷酸中的开放阅读框(ORF)，其在表达时产生多肽或蛋白质。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指一个或多个以下事件：(1)从DNA序列产生mRNA模板(例如，通过转录)；(2)mRNA转录物的加工(例如，通过剪接，编辑，5'帽形成和/或3'末端加工)；(3)将mRNA翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
术语“蛋白突变体”或“多肽突变体”是指其氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列突变体可在氨基酸序列内的某些位置具有置换、缺失和/或插入等。通常，突变体与天然或参考序列将具有至少约50％的同一性，至少约60％的同一性，至少约70％的同一性，至少约80％的同一性，至少约90％的同一性，至少约95％的同一性，至少约99％的同一性。
附图说明
图1脂质纳米颗粒制剂冻存后复融、冻干后复建转染细胞的荧光素酶蛋白表达量统计。
图2脂质纳米颗粒制剂冻存后复融、冻干后复建转染细胞的荧光素酶蛋白表达量统计。
图3以Firefly Luc为报告蛋白，不同的体外转录载体制备的mRNA在细胞内蛋白表达量的统计图。
图4可电离脂质II-37和C14-113分别形成的包裹mRNA的LNP的细胞转染效率对比。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。所述生物学实验方法都是本领域已知的实验方法，或者可以按照所用试剂盒的说明指引进行操作。
实施例1可电离脂质Ⅱ-37的合成
亚麻油醇(a2)的合成：在0℃下，向950mL四氢呋喃中加入LiAlH4(7.20g)、亚麻油酸(50g,a1)，之后混合物在25℃下搅拌2h。薄层色谱法(TLC)显示反应完成后，向反应液依次加入水(7.2mL)，NaOH水溶液(7.2mL，质量分数为15％)和水(21.6mL)淬灭，并加入适量Na2SO4搅拌15分钟后通过布氏漏斗过滤并用乙酸乙酯洗涤滤饼，收集滤液并蒸发浓缩，得到目标产物亚麻油醇(a2)47.4g。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.27-5.44(m,4H),3.63(t,J＝6.63Hz,2H),2.77(t,J＝6.44Hz,2H),1.97-2.12(m,4H),1.57-1.63(m,1H),1.20-1.46(m,18H),0.83-0.95(m,3H)
(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醛(a3)的合成：在室温下，向170mL乙腈中加入亚麻油醇(25.0g，a2)和2-碘酰基苯甲酸(39.4g)，之后混合物在85℃下搅拌4h。反应液通过布氏漏斗过滤并用二氯甲烷洗涤滤饼，收集滤液并蒸发浓缩，得到目标产物(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醛(a3)24.0g。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.76(t,J＝1.76Hz,1H),5.25-5.43(m,4H),2.76(t,J＝6.17Hz,2H),2.41(td,J＝7.33,1.87Hz,2H),2.04(q,J＝6.84Hz,4H),1.56-1.68(m,2H),1.22-1.36(m,14H),0.88(t,J＝6.73Hz,3H)
(9Z,12Z)-2-氯代-十八碳-9,12-二烯-1-醇(a4)的合成：在0℃下，向246mL乙腈中加入(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醛(43.0g，a3)，DL-脯氨酸(5.62g)和N-氯代丁二酰亚胺，然后在0℃下搅拌2h。反应完成后，用无水乙醇(246mL)稀释反应液，再加入硼氢化钠(8.8g)，之后在0℃下搅拌4h。向反应混合物中加水(120mL)淬灭，并用甲基叔丁基醚萃取，合并有机相后用饱和食盐水洗涤，硫酸钠干燥之后过滤、蒸发浓缩，得到目标产物(9Z,12Z)-2-氯代-十八碳-9,12-二烯-1-醇(a4,46g)，直接用于下一步。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.25-5.51(m,4H),3.97-4.07(m,1H),3.79(dd,J＝12.01,3.63Hz,1H),3.59-3.70(m,1H),2.67-2.90(m,2H),1.96-2.15(m,5H),1.64-1.82(m,1H),1.20-1.49(m,15H),0.89(br t,J＝6.75Hz,3H)
2-[(7Z,10Z)-十六碳烷-7,10-二烯]环氧乙烷(a5)的合成：在室温下，向450mL1,4-二氧六环中加入(9Z,12Z)-2-氯代-十八碳-9,12-二烯-1-醇(45g，a4)和氢氧化钠水溶液(120g氢氧化钠溶于585mL水)，滴加完毕后混合物在35℃下搅拌2h。TLC显示反应完成后，反应液通过分液漏斗分离，并用饱和食盐水洗涤，硫酸钠干燥后过滤并蒸发浓缩，然后通过快速过柱法用石油醚/乙酸乙酯洗脱来纯化残余物，得到目标产物2-[(7Z,10Z)-十六碳烷-7,10-二烯]环氧乙烷(a5)29.11g。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.27-5.46(m,4H),2.87-2.98(m,1H),2.70-2.85(m,3H),2.46(dd,J＝5.00,2.75Hz,1H),1.94-2.21(m,4H),1.24 -1.58(m,17H),0.78-1.00(m,3H)
Ⅱ-37的合成：在室温下，向10mL乙醇中加入2-[(7Z,10Z)-十六碳烷-7,10-二烯]环氧乙烷(5g)和N,N-二(2-氨基乙基)甲胺(739mg)，之后混合物在90℃下搅拌36h。反应液蒸发浓缩，然后通过快速过柱法用二氯甲烷/甲醇洗脱来纯化残余物，得到粗产物II-37(4g)。再次通过快速过柱法用二氯甲烷/甲醇纯化目标产物，得到II-37(2.2g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.27-5.44(m,12H),3.48-3.79(m,3H),2.63-3.00(m,12H),2.16-2.61(m,12H),2.05(q,J＝6.80Hz,12H),1.18-1.57(m,51H),0.89(t,J＝6.88Hz,9H)
ESI-MS：m/z 910.8[M+H]+,911.8[M+2H]+,912.8[M+3H]+
可电离脂质有两个主要作用：结合核酸和允许核酸分子在细胞中释放。脂质的pKa是一个重要因素，因为脂质需要在低pH值下带正电荷才能与核酸结合，但在中性pH值下不带电荷，才能使形成的LNP不会引起毒性。通过TNS染料结合试验测定可电离脂质Ⅱ-37的pKa在6.81。
实施例2
准确称取化合物II-37、DSPC、CHOL、DMG-PEG2000，将每种脂质于适当容器中，无水乙醇或95％乙醇充分溶解备用。按照II-37/DSPC/CHOL/DMG-PEG2000＝45:10:43.5:1.5(摩尔比)，将脂质溶液按比例混合均匀，作为有机相，将cy5-luciferase mRNA配置成水溶液(以纯水为溶剂)为水相pH＝4。
水相与有机相体积比例为3:1混合，在微流控平台(PNI Ignite)上制备得到纳米颗粒混悬液。将得到的纳米颗粒悬浮液经100KDa超滤离心管离心过滤，纯化浓缩，将浓缩后的液体加入蔗糖，使蔗糖的质量体积百分比浓度为10％，加入氯化钠使其质量体积百分比浓度为0.9％，调节pH为7.0，进行冻存及冻干。
其中，冻干工艺包括预冻、一次干燥及二次干燥。预冻温度为-55℃，温度保持10小时。一次干燥温度为-50℃，保持60小时，真空压力为0.08mbar。二次干燥温度为10℃保持24h，真空度为0.2mbar。
冻存的方法为将前述含有蔗糖的浓缩液体直接放入-80℃冰箱冻存。
将冻存脂质纳米颗粒(LNP-mRNA)进行溶化后检测，冻干样品用水复溶(使蔗糖的质量体积百分比浓度为10％)后检测，检测指标包括采用激光纳米粒度仪检测的粒径(Diameter)、PDI、电位(Zeta Pttential)，采用多功能酶标仪结合RiboGreen RNA试剂盒检测的包封率(EE)。制备得到的脂质纳米颗粒理化质控数据如表所示：
从表中可以看到所获得冻存和冻干纳米颗粒PDI均小于0.2，粒径小于200nm，表面电位在25-50mV,包封率均大于95％。此外，冻干复溶后纳米颗粒粒径比冻干前增加约90nm，包封率无明显变化。
将样品转染到293T细胞中，使用Dual-LumiTM双荧光素酶报告基因检测试剂盒(at#RG088S，购自上海碧云天生物技术有限公司)检测荧光素酶。
结果如图1所示。图中“cy5-luc-mRNA-LNP-冻存”、“cy5-luc-mRNA-LNP-冻干”分别代表包裹cy5-luciferase mRNA的LNP冻存样品、LNP冻干样品体外表达得到的对应蛋白，“Nagative control”为阴性对照。在相同mRNA的转染量下，冻干样品和冻存样品的蛋白表达量无明显差异，表明本发明的冻干工艺对脂质纳米颗粒的理化性质以及包封和递送能力没有影响。
实施例3
准确称取化合物II-37、DSPC、CHOL、DMG-PEG2000，将每种脂质于适当容器中，无水乙醇或95％乙醇充分溶解备用。按照II-37/DSPC/CHOL/DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5(摩尔比)，将脂质溶液按比例混合均匀，作为有机相，将luciferase mRNA配置成水溶液(以纯水为溶剂)为水相pH＝4。
水相与有机相体积比例为3:1混合，在微流控平台(PNI Ignite)上制备得到纳米颗粒混悬液。将得到的纳米颗粒悬浮液经100KDa超滤离心管离心过滤，纯化浓缩，将浓缩后的液体加入蔗糖，使蔗糖的质量体积百分比浓度为10％，加入氯化钠使其质量体积百分比浓度为0.9％，调节pH为7.0，进行冻存及冻干。
其中，冻干工艺包括预冻、一次干燥及二次干燥，预冻温度为-55℃，温度保持10小时。一次干燥温度为-45℃，保持50小时，真空压力为0.06mbar。二次干燥温度为10℃保持12h，真空度为0.2mbar。
冻存工艺为将前述含有蔗糖的浓缩液体直接放入-80℃冰箱冻存。
将冻存脂质纳米颗粒(LNP-mRNA)进行溶化后检测，冻干样品用水复溶(使蔗糖的质量体积百分比浓度为10％)后检测，检测指标包括采用激光纳米粒度仪检测的粒径(Diameter)、PDI、电位(Zeta Pttential)，采用多功能酶标仪结合RiboGreen RNA试剂盒检测的包封率(EE)。制备得到的脂质纳米颗粒理化质控数据如表所示：
| 样本信息 | 粒径(nm) | PDI | Zeta电位((mV)) | 包封率％ |
| luc-mRNA-LNP-新鲜 | 81.194 | 0.191 | 29.81 | 98.48 |
| luc-mRNA-LNP-冻存 | 88.946 | 0.192 | 33.37 | 98.38 |
| luc-mRNA-LNP-冻干 | 176.170 | 0.179 | 34.47 | 98.35 |
从表中可以看到所获得冻存和冻干纳米颗粒PDI均小于0.2，粒径小于200nm，表面电位在25-40mV,包封率均大于95％。此外，冻干复溶后纳米颗粒粒径比冻干前增加约80nm，包封率无明显变化。
将样品转染到A375细胞中，使用Dual-LumiTM双荧光素酶报告基因检测试剂盒(at#RG088S，购自上海碧云天生物技术有限公司)检测荧光素酶。
结果如图2所示。图中“luc-mRNA-LNP-冻存-1μg”、“luc-mRNA-LNP-冻干-1μg”“luc-mRNA-LNP-冻存-0.5μg”、“luc-mRNA-LNP-冻干-0.5μg”分别代表luciferase mRNA的LNP冻存样品1μg、包裹luciferase mRNA的LNP冻干样品1μg、luciferase mRNA的LNP冻存样品0.5μg、包裹luciferase mRNA的LNP冻干样品0.5μg，mRNA转染量不同情况下，体外表达得到的对应蛋白。在相同mRNA的转染量下，冻干样品和冻存样品的蛋白表达量无明显差异，表明本发明的冻干工艺对脂质纳米颗粒的理化性质以及包封和递送能力没有影响。
实施例4本发明IVT载体的效率对比实验
本实施例以Firefly Luc为报告蛋白，构建了不同的IVT载体用于在体外转录合成能够翻译Firefly Luc的mRNA，对比合成的不同序列特征的mRNA的翻译效率。
采用本领域常规的质粒载体构建技术，将Firefly Luc的编码序列克隆到相应载体的多克隆位点上，得到编号分别为IVT1，IVT2，IVT3和IVT4的载体，之后使用AM1344试剂盒依据前述载体体外转录制备得到对应的Firefly Luc mRNA样品。
载体IVT1～IVT4均为在商业化载体psp73的基础上改造而来，以下序列在载体psp73酶切位点XhoI/NdeI处插入，其中IVT1中没有添加UTR序列，polyA尾长度为64个A；IVT2中使用了SEQ ID NO:1所示的5’UTR和GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC的3’UTR序列(β珠蛋白的3’UTR序列)，polyA长度为120个A；IVT3中使用了SEQ ID NO:1所示的5’UTR和SEQ ID NO:2所示的3’UTR序列，polyA长度为120个A；IVT4中使用了SEQ ID NO:1所示的5’UTR和2个串联重复的SEQ ID NO:2所示的3’UTR序列，polyA长度为120个A。在上述5’UTR和3’UTR的序列中间插入包含常见酶切位点HindIII和EcoRI的多克隆位点，再将Firefly Luc的编码序列克隆到HindIII和EcoRI的多克隆位点中。所有载体均为金斯瑞公司使用基因合成的方法构建得到。
将每种Firefly Luc mRNA样品以Lipofectamine2000(cat#11668030，购自赛默飞世尔公司)为转染试剂，转染到CHO细胞中，使用Dual-LumiTM双荧光素酶报告基因检测试剂盒(at#RG088S，购自上海碧云天生物技术有限公司)检测荧光素酶。将Firefly Luc的DNA转入psicheck2质粒作为阳性对照(psicheck2质粒，cat#60908-6151，购自北京天恩泽基因科技有限公司)。具体如下：第一天，将CHO细胞种到96孔板，每孔1.5×104个细胞，使用F12K+10％FBS培养过夜；第二天，转染前将培养基换成无血清的F12K培养基，使用Lipofectamine2000，将mRNA或DNA转染到CHO细胞中；每孔使用的核酸量为100ng，脂质体用量为0.3μl，每孔总体积为100μl，过夜培养；第三天，将无血清培养基换成完全培养基(F12K+10％FBS)，继续培养24小时；第四天(转染后48小时)，检测Firefly Luc荧光值。
结果如图3所示。图中“DNA”是阳性对照(携带有Firefly Luc的DNA的psicheck2质粒)，“IVT1-Luc”、“IVT2-Luc”、“IVT3-Luc”、“IVT4-Luc”分别代表由IVT1，IVT2，IVT3和IVT4的载体体外转录得到的对应Firefly Luc mRNA，“Nagative control”为阴性对照。由图3可见，在相同mRNA的转染量下，IVT4-Luc的蛋白表达量远远高于其他三个mRNA，为其2-3倍，说明IVT4-Luc的稳定性好且翻译效率高。
实施例5
II-37和商业化可电离阳离子脂质分子MC3的效果对比
MC3的分子式为：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂。
按照实施例2类似的方法，分别使用II37和MC3制备脂质纳米颗粒，具体摩尔配比为：II-37:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；MC3:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；N/P比为5:1。
制备得到的脂质纳米颗粒理化质控数据如下表所示：
| 样本信息 | 粒径(nm) | PDI | Zeta电位 | 包封率 |
| mRNA-LNP(II-37) | 154.58 | 0.1068 | 22.07 | 90.5 |
| mRNA-LNP(MC3) | 234.08 | 0.1259 | 2.44 | 40.7 |
由上表可见，II-37制备的脂质纳米颗粒包封率高达90.5％，远高于MC3的脂质纳米颗粒，并且粒径更小更均一，电位更高。
将制备的脂质纳米颗粒转染细胞CHO-K1，在转染的mRNA量相同的情况下，II-37制备的脂质纳米颗粒携带mRNA转染细胞之后，细胞中蛋白表达量远远高于MC3的，说明II-37制成的脂质纳米颗粒的细胞转染效率很高。
II-37和其结构类似物分子C14-113的对比
C14-113的结构式为：
按照实施例2所述的类似方法，分别使用II37和C14-113制备脂质纳米颗粒，具体摩尔配比为：II-37:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；C14-113:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；N/P比为10:1。
制备得到的脂质纳米颗粒理化质控数据如下表所示：
| 样本信息 | 粒径(nm) | PDI | Zeta电位 |
| mRNA-LNP(II-37-LNP) | 136.68 | 0.14 | 20.07 |
| mRNA-LNP(C14-113-LNP) | 152.65 | 0.12 | 24.1 |
用多功能酶标仪(BioTek，型号为SLXFATS)荧光素报告基因法来检测制备的LucRNA-LNP HEK293T细胞的转染效率，转染的LucRNA量分别为0.5μg、1.0μg、2.0μg。体外转录LucRNA的方法如下：HEK293T细胞铺板，细胞密度为2.5×105个细胞/mL，当细胞融合度为30％-50％进行转染。转染48h后使用多功能酶标仪检测蛋白表达量。阴性对照为不添加LucRNA-LNP的细胞培养基。结果如图4所示，在转染的mRNA量相同的情况下，II-37(图中以II-37-LNP表示)制备的脂质纳米颗粒携带mRNA转染细胞之后，细胞中蛋白表达量远远高于C14-113的，说明II-37制成的脂质纳米颗粒的细胞转染效率很高。
实施例6更多LNP的制备示例
按照实施例2类似的制备方法，称取化合物II-37、DOPE、CHOL、DSPE-PEG2000、DSPC、DMG-PEG2000，按下表中的摩尔比例，在微流控平台上制备得到脂质纳米颗粒混悬液。将得到的脂质纳米颗粒悬浮液经100KDa超滤离心管离心过滤，纯化浓缩，将浓缩后的液体进行分装。将制备所得脂质纳米颗粒用激光纳米粒度仪测粒径、PDI、电位，用紫外分光光度计结合RiboGreen RNA试剂盒测包封率(％)，示例性结果如下。
适当调整制备工艺参数，还可获得以下粒径、PDI、电位和包封率的LNP。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种脂质纳米颗粒的冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂含有脂质纳米颗粒，所述所述脂质纳米颗粒中包含式I的可电离阳离子脂质分子，或进一步含有中性脂质分子、胆固醇类脂质分子和PEG化的脂质分子；
所述式I的可电离阳离子脂质分子，其中：
Q为其中，R8、R9为彼此独立的选自经取代或未取代的直链C1-10亚烷基；R7为氢，卤素，-OH，直链或支链C1-20烷基，直链或支链C2-20烯基，直链或支链C2-20炔基，或-CH2CH(OH)R5，或所述取代的取代基团为卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基；
R1、R2、R3、R4可以相同或不同，各自独立的选自氢，经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基，所述烷基、烯基或炔基的1个或1个以上C原子任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换，或-CH2CH(OH)R5；所述取代的取代基团选自卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基；
条件是，R1、R2、R3、R4中至少一个为
R5选自氢，经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基，所述烷基、烯基或炔基的1个或1个以上C原子任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换；所述取代的取代基团选自卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基；
R6选自氢，C1-3烷基，C1-3烷氧基，-OH；
n选自1～8的整数，m选自0～8的整数，n和m彼此独立，可以相同也可以不同；
当R1、R2、R3、R4中至少两个为时，每个所述基团中的n和m彼此独立，可以相同也可以不同；
优选，Q为其中：x和y可以相同或者不同，独立地选自1～8的整数；优选，x或y相同或不同，选自1～3的整数；优选，R7为直链或支链C1-4烷基；
优选，R6为-OH；
优选，n选自4～8的整数，m选自4～8的整数；
优选，所述式I化合物为下式A、B、C或D：
其中每个n1都彼此独立，可以相同或不同，每个n1选自1～8的整数，每个m1都彼此独立，可以相同或不同，每个m1选自0～8的整数；优选，每个n1选自4～8的整数，每个m1选自4～8的整数；优选，每个n1都彼此相同，每个m1都彼此相同；
其中每个n2都彼此独立，可以相同或不同，每个n2选自1～8的整数，每个m2都彼此独立，可以相同或不同，每个m2选自0～8的整数；优选，每个n2选自4～8的整数，每个m2选自4～8的整数；优选，每个n2都彼此相同，每个m2都彼此相同；
其中每个n3都彼此独立，可以相同或不同，每个n3选自1～8的整数，每个m3都彼此独立，可以相同或不同，每个m3选自0～8的整数；优选，每个n3选自4～8的整数，每个m3选自4～8的整数；优选，每个n3都彼此相同，每个m3都彼此相同；
其中每个n4都彼此独立，可以相同或不同，每个n4选自1～8的整数，每个m4都彼此独立，可以相同或不同，每个m4选自0～8的整数；优选，每个n4选自4～8的整数，每个m4选自4～8的整数；优选，每个n4都彼此相同，每个m4都彼此相同。
2.如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子30-60mol％的式I的脂质分子，优选32-55mol％；
优选，所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子5-30mol％的中性脂质分子，优选8-20mol％；
优选，所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子30-50mol％的胆固醇类脂质分子，优选35-50mol％；
优选，所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子0.4-10mol％的PEG化的脂质分子，优选0.5-5mol％。
3.如权利要求1或2所述的冻干制剂，其特征在于，所述中性脂质分子选自磷脂酰胆碱类化合物，或/和磷脂酰乙醇胺类化合物；磷脂酰胆碱类化合物的结构如式E所示：磷脂酰乙醇胺类化合物的结构如式F所示：其中Ra、Rb、Rc、Rd独立的选自直链或支链的C1-30烷基，直链或支链的C2-30烯基，优选为直链或支链的C10-30烷基，直链或支链的C10-30烯基，优选为CH3(CH2)17CH2-、CH3(CH2)15CH2-、CH3(CH2)13CH2-、CH3(CH2)11CH2-、CH3(CH2)9CH2-、CH3(CH2)7CH2-、CH3(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7-、CH3(CH2)7-CH＝CH-(CH2)9-；
所述胆固醇类脂质分子选自胆固醇，5-十七基间苯二酚，粪甾醇，谷甾醇，麦角甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜子甾醇，番茄次碱，番茄碱，熊果酸，α-生育酚及其混合物、胆固醇半琥珀酸酯；
所述PEG化的脂质分子包含脂质部分和基于PEG的聚合物部分，表示为“脂质部分-PEG-数均分子量”，所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，优选为二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二棕榈酰甘油、二硬脂酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二棕榈酰甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；PEG的数均分子量为130～50,000。
4.如权利要求1-3任一项所述的冻干制剂，其特征在于，所述制剂进一步包含活性成分，所述活性成分位于脂质纳米颗粒中；
优选，所述活性成分是核酸；
优选，所述冻干制剂中脂质纳米颗粒中脂质分子的总质量与核酸的质量之比为5-20:1；
优选，所述核酸在冻干制剂复溶后的液体形式制剂中的含量为1-1000μg/ml。
5.如权利要求1-4任一项所述的冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂复溶后的液体形式制剂中，脂质纳米颗粒的粒径在1-1000nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～60mV；
优选，所述脂质纳米颗粒的粒径在20-500nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～60mV；
优选，所述脂质纳米颗粒的粒径在45-300nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～50mV；
优选，所述脂质纳米颗粒的粒径在60-300nm，多分散性指数≤0.3，电动电位在-45～50mV。
6.如权利要求1-5任一项所述的冻干制剂，其特征在于，进一步含有冻干保护剂，所述冻干保护剂的含量占冻干制剂复溶后的液体形式制剂的5-30w/v％；
优选，所述冻干制剂进一步含有缓冲盐，所述缓冲盐的含量占冻干制剂复溶后的液体形式制剂的0.05-1w/v％；
优选，所述冻干制剂进一步含有渗透压调节剂，所述渗透压调节剂的用量使得冻干制剂复溶后的液体形式制剂为0.5～3个等渗浓度的溶液。
7.如权利要求4-6任一项所述的冻干制剂，其特征在于，所述核酸是mRNA，优选所述mRNA从5’端至3’端包含5’UTR，开放阅读框，3’UTR和poly-A尾；优选，所述mRNA进一步包含5’帽结构；
优选，所述mRNA的5’UTR与SEQ ID NO:1所示的β-珠蛋白的5’UTR核苷酸序列至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列；
或者，优选，所述mRNA的3’UTR包含与SEQ ID NO:2所示α2-珠蛋白3’UTR的片段至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列；
或者，优选，所述mRNA的3’UTR包含2个首尾相连的与SEQ ID NO:2所示的α2-珠蛋白3’UTR的片段至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列。
8.权利要求1-7任一项所述冻干制剂的制备方法，其特征在于，将包含所述脂质纳米颗粒的液态组合物进行冻干；
优选，所述冻干包括预冻、一次干燥和二次干燥；
优选，所述预冻为-40℃至-60℃保持1-12h；
优选，所述一次干燥为在真空度为0.02mbar-0.4mbar条件下，-30℃至-55℃保持10-80h；
优选，所述二次干燥为在真空度为0.02mbar-0.4mbar条件下，4℃至20℃保持10-30h。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备含有脂质纳米颗粒的液体组合物的方法包括：1)制备含有式I化合物、中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子的有机相；2)制备含有活性成分的水相；3)将有机相和水相进行混合，制备脂质纳米颗粒混悬液；4)将所述混悬液浓缩后，加入冻干保护剂，或进一步加入缓冲盐和/或渗透压调节剂；
优选，所述步骤1)中使用无水乙醇或乙醇的水溶液作为溶剂；
优选，所述步骤2)中使用水作为溶剂；
优选，所述步骤3)中有机相和水相的体积比为1:2～4。
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