CN118021754A - 无针注射器和脂质纳米颗粒的给药系统 - Google Patents
无针注射器和脂质纳米颗粒的给药系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118021754A CN118021754A CN202211414849.4A CN202211414849A CN118021754A CN 118021754 A CN118021754 A CN 118021754A CN 202211414849 A CN202211414849 A CN 202211414849A CN 118021754 A CN118021754 A CN 118021754A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lipid
- branched
- integers
- mrna
- linear
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 175
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 93
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 93
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 32
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 76
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 claims description 69
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Natural products C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 39
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims description 30
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 30
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 26
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 15
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 12
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 11
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 11
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 9
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 9
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 claims description 7
- 125000000027 (C1-C10) alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000000923 (C1-C30) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000000739 C2-C30 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 6
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims description 5
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 claims description 5
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 5
- BBGNINPPDHJETF-UHFFFAOYSA-N 5-heptadecylresorcinol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC1=CC(O)=CC(O)=C1 BBGNINPPDHJETF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010053584 alpha-Globins Proteins 0.000 claims description 4
- WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N cholesteryl hemisuccinate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)CCC(O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N 0.000 claims description 4
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N sitosterol Natural products CC=C(/CCC(C)C1CC2C3=CCC4C(C)C(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1)C(C)C NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 4
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 claims description 4
- HKJAWHYHRVVDHK-UHFFFAOYSA-N 15,16,17-trihydroxyhentriacontane-14,18-dione Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)C(O)C(O)C(O)C(=O)CCCCCCCCCCCCC HKJAWHYHRVVDHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BVKFQEAERCHBTG-UHFFFAOYSA-N 17,18,19-trihydroxypentatriacontane-16,20-dione Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)C(O)C(O)C(O)C(=O)CCCCCCCCCCCCCCC BVKFQEAERCHBTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N UNPD88870 Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)=CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000005192 partition Methods 0.000 claims description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 3
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940032091 stigmasterol Drugs 0.000 claims description 3
- HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N stigmasterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N 0.000 claims description 3
- 235000016831 stigmasterol Nutrition 0.000 claims description 3
- BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N stigmasterol Natural products CCC(C=CC(C)C1CCCC2C3CC=C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KZJWDPNRJALLNS-VPUBHVLGSA-N (-)-beta-Sitosterol Natural products O[C@@H]1CC=2[C@@](C)([C@@H]3[C@H]([C@H]4[C@@](C)([C@H]([C@H](CC[C@@H](C(C)C)CC)C)CC4)CC3)CC=2)CC1 KZJWDPNRJALLNS-VPUBHVLGSA-N 0.000 claims description 2
- CSVWWLUMXNHWSU-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-ethyl-5alpha-cholest-22-en-3beta-ol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 CSVWWLUMXNHWSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WCGUUGGRBIKTOS-GPOJBZKASA-N (3beta)-3-hydroxyurs-12-en-28-oic acid Chemical compound C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CC[C@@H](C)[C@H](C)[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C WCGUUGGRBIKTOS-GPOJBZKASA-N 0.000 claims description 2
- 125000003837 (C1-C20) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000006274 (C1-C3)alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000006649 (C2-C20) alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- WCNYVTLGUXBXLV-UHFFFAOYSA-N 13,14,15-trihydroxyheptacosane-12,16-dione Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)C(O)C(O)C(O)C(=O)CCCCCCCCCCC WCNYVTLGUXBXLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XLGVHAQDCFITCH-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropanamide Chemical compound NC(=O)C(O)CO XLGVHAQDCFITCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KLEXDBGYSOIREE-UHFFFAOYSA-N 24xi-n-propylcholesterol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CCC)C(C)C)C1(C)CC2 KLEXDBGYSOIREE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OILXMJHPFNGGTO-NRHJOKMGSA-N Brassicasterol Natural products O[C@@H]1CC=2[C@@](C)([C@@H]3[C@H]([C@H]4[C@](C)([C@H]([C@@H](/C=C/[C@H](C(C)C)C)C)CC4)CC3)CC=2)CC1 OILXMJHPFNGGTO-NRHJOKMGSA-N 0.000 claims description 2
- QOGYZOKOLILRBY-XXIQNXCHSA-N C(O)CN.P(=O)(O)(O)OC[C@@H](COC(CCCCCCCCCCCCC)=O)OC(CCCCCCCCCCCCC)=O Chemical compound C(O)CN.P(=O)(O)(O)OC[C@@H](COC(CCCCCCCCCCCCC)=O)OC(CCCCCCCCCCCCC)=O QOGYZOKOLILRBY-XXIQNXCHSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003358 C2-C20 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- SGNBVLSWZMBQTH-FGAXOLDCSA-N Campesterol Natural products O[C@@H]1CC=2[C@@](C)([C@@H]3[C@H]([C@H]4[C@@](C)([C@H]([C@H](CC[C@H](C(C)C)C)C)CC4)CC3)CC=2)CC1 SGNBVLSWZMBQTH-FGAXOLDCSA-N 0.000 claims description 2
- LPZCCMIISIBREI-MTFRKTCUSA-N Citrostadienol Natural products CC=C(CC[C@@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC[C@H]4[C@H](C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)C(C)C LPZCCMIISIBREI-MTFRKTCUSA-N 0.000 claims description 2
- ARVGMISWLZPBCH-UHFFFAOYSA-N Dehydro-beta-sitosterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)CCC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 ARVGMISWLZPBCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 claims description 2
- BTEISVKTSQLKST-UHFFFAOYSA-N Haliclonasterol Natural products CC(C=CC(C)C(C)(C)C)C1CCC2C3=CC=C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C BTEISVKTSQLKST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 2
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 claims description 2
- OILXMJHPFNGGTO-ZRUUVFCLSA-N UNPD197407 Natural products C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)C=C[C@H](C)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-ZRUUVFCLSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 claims description 2
- MJVXAPPOFPTTCA-UHFFFAOYSA-N beta-Sistosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2C3CC=C4C(C)C(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C MJVXAPPOFPTTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N beta-sitosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2(C)C3CC=C4CC(O)CCC4C3CCC12C)C(C)C NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OILXMJHPFNGGTO-ZAUYPBDWSA-N brassicasterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-ZAUYPBDWSA-N 0.000 claims description 2
- 235000004420 brassicasterol Nutrition 0.000 claims description 2
- SGNBVLSWZMBQTH-PODYLUTMSA-N campesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](C)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 SGNBVLSWZMBQTH-PODYLUTMSA-N 0.000 claims description 2
- 235000000431 campesterol Nutrition 0.000 claims description 2
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 claims description 2
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 claims description 2
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 claims description 2
- 235000015500 sitosterol Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 claims description 2
- 229940096998 ursolic acid Drugs 0.000 claims description 2
- PLSAJKYPRJGMHO-UHFFFAOYSA-N ursolic acid Natural products CC1CCC2(CCC3(C)C(C=CC4C5(C)CCC(O)C(C)(C)C5CCC34C)C2C1C)C(=O)O PLSAJKYPRJGMHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 claims description 2
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 claims 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 27
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 13
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 11
- 229940126582 mRNA vaccine Drugs 0.000 description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002585 base Substances 0.000 description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 9
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JRNVZBWKYDBUCA-UHFFFAOYSA-N N-chlorosuccinimide Chemical compound ClN1C(=O)CCC1=O JRNVZBWKYDBUCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 6
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 description 5
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 229960003724 dimyristoylphosphatidylcholine Drugs 0.000 description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 5
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 4
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 4
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- LEHBURLTIWGHEM-UHFFFAOYSA-N pyridinium chlorochromate Chemical compound [O-][Cr](Cl)(=O)=O.C1=CC=[NH+]C=C1 LEHBURLTIWGHEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SDXQFSSGNUPJIG-HZJYTTRNSA-N (9Z,12Z)-2-chlorooctadeca-9,12-dien-1-ol Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCC(Cl)CO SDXQFSSGNUPJIG-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 3
- HXLZULGRVFOIDK-HZJYTTRNSA-N (9z,12z)-octadeca-9,12-dienal Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC=O HXLZULGRVFOIDK-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102220558444 Proteinase-activated receptor 2_N30A_mutation Human genes 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- HXLZULGRVFOIDK-UHFFFAOYSA-N linoleic aldehyde Natural products CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC=O HXLZULGRVFOIDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 2
- SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine zwitterion Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 0.000 description 2
- LVNGJLRDBYCPGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-distearoylphosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP([O-])(=O)OCC[NH3+])OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC LVNGJLRDBYCPGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RFVFQQWKPSOBED-PSXMRANNSA-N 1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCC RFVFQQWKPSOBED-PSXMRANNSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJFVSSZAOYLHEE-UHFFFAOYSA-N 2,3-di(dodecanoyloxy)propyl 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCC IJFVSSZAOYLHEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UOXJNGFFPMOZDM-UHFFFAOYSA-N 2-[di(propan-2-yl)amino]ethylsulfanyl-methylphosphinic acid Chemical compound CC(C)N(C(C)C)CCSP(C)(O)=O UOXJNGFFPMOZDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NEZDNQCXEZDCBI-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumylethyl 2,3-di(tetradecanoyloxy)propyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC NEZDNQCXEZDCBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001494 2-propynyl group Chemical group [H]C#CC([H])([H])* 0.000 description 2
- SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 6-amino-2-[[(e)-(3-formylphenyl)methylideneamino]carbamoylamino]-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5,8-disulfonic acid Chemical compound O=C1C(C2=3)=CC(S(O)(=O)=O)=CC=3C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(=O)N1NC(=O)N\N=C\C1=CC=CC(C=O)=C1 SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150077194 CAP1 gene Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101100245221 Mus musculus Prss8 gene Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 2
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 2
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 2
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- MMXKVMNBHPAILY-UHFFFAOYSA-N ethyl laurate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OCC MMXKVMNBHPAILY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- NUJOXMJBOLGQSY-UHFFFAOYSA-N manganese dioxide Chemical compound O=[Mn]=O NUJOXMJBOLGQSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- FIYYMXYOBLWYQO-UHFFFAOYSA-N ortho-iodylbenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1I(=O)=O FIYYMXYOBLWYQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037368 penetrate the skin Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 2
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- LRBKGRBLJIISAL-XZWUTKFBSA-N (2R,3S,4R,5R)-2-(hydroxymethyl)-5-[6-(methylamino)purin-9-yl]oxolane-3,4-diol Chemical compound CNC=1C=2N=CN([C@H]3[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)C2N=CN1.CNC=1C=2N=CN([C@H]3[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)C2N=CN1 LRBKGRBLJIISAL-XZWUTKFBSA-N 0.000 description 1
- HVPUUBKTSZTLGO-JNECXHHRSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1.O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HVPUUBKTSZTLGO-JNECXHHRSA-N 0.000 description 1
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 125000000530 1-propynyl group Chemical group [H]C([H])([H])C#C* 0.000 description 1
- OXOWTLDONRGYOT-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)butanoic acid Chemical compound CN(C)CCCC(O)=O OXOWTLDONRGYOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WDNZYZQNVCYYON-JNECXHHRSA-N 4-amino-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidin-2-one Chemical compound CC=1C(=NC(N([C@H]2[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)C1)=O)N.CC=1C(=NC(N([C@H]2[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)C1)=O)N WDNZYZQNVCYYON-JNECXHHRSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027241 Adenylyl cyclase-associated protein 1 Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000004364 Benzylated hydrocarbon Substances 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000953921 Brassica rapa Broccoletto Group Species 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077333 CAP1-6D Proteins 0.000 description 1
- 101150014715 CAP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 238000006646 Dess-Martin oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010073753 Fear of injection Diseases 0.000 description 1
- 101710189104 Fibritin Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034013 Gamma-glutamyl phosphate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001133924 Homo sapiens Gamma-glutamyl phosphate reductase Proteins 0.000 description 1
- 101000823778 Homo sapiens Y-box-binding protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 101100260872 Mus musculus Tmprss4 gene Proteins 0.000 description 1
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCZKTUCDHDAAGU-UHFFFAOYSA-L N1=CC=CC=C1.[Cr](=O)(=O)(Cl)Cl Chemical compound N1=CC=CC=C1.[Cr](=O)(=O)(Cl)Cl WCZKTUCDHDAAGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 102220537314 Protein NDRG2_N30E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000019485 Safflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220590324 Spindlin-1_D80A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220590628 Spindlin-1_L18F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M [(2r)-3-acetyloxy-2-hydroxypropyl] 2-aminoethyl phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCCN CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001508 asparagines Chemical class 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- SIPUZPBQZHNSDW-UHFFFAOYSA-N bis(2-methylpropyl)aluminum Chemical compound CC(C)C[Al]CC(C)C SIPUZPBQZHNSDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004369 butenyl group Chemical group C(=CCC)* 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000009388 chemical precipitation Methods 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000005354 coacervation Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000010485 coping Effects 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- NKLCNNUWBJBICK-UHFFFAOYSA-N dess–martin periodinane Chemical compound C1=CC=C2I(OC(=O)C)(OC(C)=O)(OC(C)=O)OC(=O)C2=C1 NKLCNNUWBJBICK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006735 epoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002140 halogenating effect Effects 0.000 description 1
- 230000026030 halogenation Effects 0.000 description 1
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 1
- CMYGERBJJJPWHH-UHFFFAOYSA-N heptacosane-13,14,15-triol Chemical compound CCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)CCCCCCCCCCCC CMYGERBJJJPWHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000012280 lithium aluminium hydride Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- HYSQEYLBJYFNMH-UHFFFAOYSA-N n'-(2-aminoethyl)-n'-methylethane-1,2-diamine Chemical compound NCCN(C)CCN HYSQEYLBJYFNMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFIGICHILYTCJF-UHFFFAOYSA-N n'-methylethane-1,2-diamine Chemical compound CNCCN KFIGICHILYTCJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003136 n-heptyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001298 n-hexoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 125000001971 neopentyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- KOZCGIRYBYLSKC-UHFFFAOYSA-N nonatriacontane-19,20,21-triol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCCCC KOZCGIRYBYLSKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002924 oxiranes Chemical class 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 125000004368 propenyl group Chemical group C(=CC)* 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010031970 prostasin Proteins 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000003030 reporter gene method Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011336 routine blood sampling Methods 0.000 description 1
- 102220033185 rs62646881 Human genes 0.000 description 1
- 235000005713 safflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003813 safflower oil Substances 0.000 description 1
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 1
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012321 sodium triacetoxyborohydride Substances 0.000 description 1
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000002328 sterol group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明提供给了一种包括无针注射装置和含有脂质纳米颗粒的药物制剂的组合或给药系统。通过采用本发明的可电离脂质分子形成脂质纳米颗粒,由所述脂质纳米颗粒制成的制剂,能够稳定存在于无针注射递送系统中,并在无针注射过程中保持其粒径、多分散性指数、电动电位和包封率基本不变,无针注射给药后仍能保持优异的核酸分子递送效果,且提高疫苗的免疫效果。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种无针注射器和脂质纳米颗粒的给药系统,以及适于经由无针注射器给药的脂质纳米颗粒制剂。
背景技术
相比于传统灭活疫苗、减毒疫苗以及多肽疫苗的研发周期长、生产工艺复杂,mRNA疫苗具有一旦获得病毒抗原序列,可在数周内迅速设计和制造具有临床规模的mRNA疫苗,实现标准化生产,使其在应对传染性疾病的大流行暴发方面非常具有吸引力。此外,mRNA疫苗不存在减毒疫苗潜在的逆转危险以及灭活疫苗的恢复突变问题,并且在免疫原性上,mRNA疫苗能够诱导B细胞和T细胞免疫应答,引起免疫记忆效果,能一次表达多个抗原和传递更多有效抗原。基于现有理论,mRNA只需要穿过细胞膜在细胞质中就可以高效表达抗原蛋白,没有基因整合到基因组中的风险。再者,mRNA被翻译成蛋白质后易被降解,其瞬时表达的特性不仅确保了mRNA药物的安全性,而且使其剂量可控,避免了疫苗药物长期暴露引起的抗原免疫耐受。因此,mRNA疫苗在安全性、快速制备和免疫原性方面具有颠覆性的优势。
mRNA的递送系统不同于传统疫苗,目前主要是依靠脂质纳米颗粒的形式。脂质纳米颗粒是由脂质分子经过自主装形成的,核酸位于颗粒内部,保护核酸避免被核酸酶降解,并且促进细胞摄取。由于脂质分子之间是分子间作用力,作用力弱于共价键和离子键,以脂质纳米颗粒为递送载体的mRNA疫苗是否能使用无针注射,或者开发出能适用于无针注射的脂质纳米颗粒以及相应的mRNA疫苗,将有利于mRNA疫苗的接种和使用。
发明内容
本发明的发明人通过研究,获得了一种新型可电离脂质化合物,其可用于递送核酸分子(包括mRNA),并且在通过调配构成脂质纳米颗粒的其他脂质的种类及其含量,并配合适当的辅料,制备而成的脂质纳米颗粒制剂,能够稳定存在于无针注射递送系统中,并在无针注射过程中保持其粒径、多分散性指数、电动电位和包封率基本不变,无针注射给药后能保持核酸分子的递送效果,且提高疫苗的免疫效果。
本发明提供一种组合或给药系统,其包含无针注射装置和药物制剂。
所述组合或给药系统可以是试剂盒或给药套装等形式,无针注射装置和药物制剂可以分别独立包装存在于试剂盒或给药套装中,也可以将药物制剂预灌装在无针注射装置中。
所述药物制剂是包含脂质纳米颗粒的组合物,该药物制剂可以是液体制剂形式也可以是固体制剂形式。当是固体制剂形式时,在注射前要用生理可接受的注射用溶剂将其复建(也称复溶)为液体形式。所述复建过程可以在无针注射装置之外进行,也可以在无针注射装置内进行。所述固体制剂形式可以是经由冻干或喷雾干燥技术等制备而成,在本发明的一个实施方式中,所述固体制剂形式是冻干制剂。
所述液体制剂中或者固体制剂复溶后的液体制剂中,所述脂质纳米颗粒的粒径为1nm~1000nm,优选为20-500nm,更优选为45-300nm,进一步优选为60-300nm;所述脂质纳米颗粒的分性指数≤0.5,优选多分性指数≤0.3;所述脂质纳米颗粒的电动电位在-45~60mV,优选为-45~50mV。在本发明的一些实施方式中,所述脂质纳米颗粒的粒径在45-300nm,多分性指数≤0.5,电动电位在-45~50mV;优选,所述脂质纳米颗粒的粒径在60-300nm,多分散性指数≤0.3,电动电位在-45~50mV。
当所述药物制剂为冻干制剂时,其中进一步含有冻干保护剂。所述冻干保护剂可以是本领域中常用的冻干保护剂,包括但不限于蔗糖、海藻糖和麦芽糖,可以是蔗糖、海藻糖和麦芽糖中的一种或任意两种的混合物或三种的混合物。在本发明的一个实施方式中,所述冻干保护剂是蔗糖。所述冻干保护剂的含量占冻干制剂复溶后液体制剂的5-30w/v%,优选为5-20w/v%。
所述药物制剂中,脂质纳米颗粒中包含:式I的可电离阳离子脂质分子,或进一步包含其他脂质分子。所述其他脂质分子可以是本领域中用于构建脂质纳米颗粒已知或常规使用的脂质分子,包括但不限于中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子。
根据本发明,所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子30-60mol%的式I的脂质分子,优选32-55mol%,进一步优选34-46mol%。
根据本发明,所述脂质纳米颗粒中可以含有占其总体脂质分子5-30mol%的中性脂质分子,优选8-20mol%,进一步优选9-16mol%。
根据本发明,所述脂质纳米颗粒中可以含有占其总体脂质分子30-50mol%的胆固醇类脂质分子,优选35-50mol%,进一步优选37-49mol%。
根据本发明,所述脂质纳米颗粒中可以含有占其总体脂质分子0.4-10mol%的PEG化的脂质分子,优选0.5-5mol%,进一步优选1.3-2.7mol%。
根据本发明,所述药物制剂进一步包含活性成分,所述活性成分可以是小分子化合物、核酸、蛋白质、多肽等。所述活性成分位于脂质纳米颗粒中。在本发明的一个实施方式中,所述活性成分是核酸,包括但不限于mRNA、siRNA、shRNA、microRNA、DNA、cDNA等。
根据本发明,当活性成分为核酸时,所述药物制剂中脂质纳米颗粒的脂质分子的总质量与核酸的质量之比为5-20:1。
根据本发明,当活性成分为核酸时,所述液体制剂中或者固体制剂复溶后的液体制剂中,核酸的含量为1-1000μg/ml,例如可以是10μg/ml,50μg/ml,60μg/ml,70μg/ml,80μg/ml,90μg/ml,100μg/ml,150μg/ml,200μg/ml,250μg/ml,300μg/ml,350μg/ml,400μg/ml,450μg/ml,500μg/ml,600μg/ml,700μg/ml,800μg/ml,900μg/ml等。
根据本发明,所述式I的可电离脂质化合物结构式为其中:
Q为其中,R8、R9为彼此独立的选自经取代或未取代的直链C1-10亚烷基;R7为氢,卤素,-OH,直链或支链C1-20烷基,直链或支链C2-20烯基,直链或支链C2-20炔基,或-CH2CH(OH)R5,或/>所述取代的取代基团为卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基;
R1、R2、R3、R4可以相同或不同,各自独立的选自氢,经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基,经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基,经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基,所述烷基、烯基或炔基的1个或1个以上C原子任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换,或-CH2CH(OH)R5;所述取代的取代基团选自卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基;
条件是,R1、R2、R3、R4中至少一个为
R5选自氢,经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基,经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基,经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基,所述烷基、烯基或炔基的1个或1个以上C原子任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换;所述取代的取代基团选自卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基;
R6选自氢,C1-3烷基,C1-3烷氧基,-OH;
n选自1~8的整数,m选自0~8的整数,n和m彼此独立,可以相同也可以不同;
当R1、R2、R3、R4中至少两个为时,每个所述基团中的n和m彼此独立,可以相同也可以不同。
优选,Q为其中:x和y可以相同或者不同,独立地选自1~8的整数;R7定义和前述相同;优选,x或y相同或不同,选自1~3的整数,例如为1、2或3;优选,R7为直链或支链C1-4烷基,例如为甲基、乙基、正丙基、正丁基等。
在本发明的优选实施方式中,R6为-OH。
在本发明的优选实施方式中,n选自4~8的整数,m选自4~8的整数。
在本发明的优选实施方式中,所述式I化合物为下式A、B、C或D:
其中每个n1都彼此独立,可以相同或不同,每个n1选自1~8的整数,每个m1都彼此独立,可以相同或不同,每个m1选自0~8的整数;优选,每个n1选自4~8的整数,每个m1选自4~8的整数;优选,每个n1都彼此相同,每个m1都彼此相同。
其中每个n2都彼此独立,可以相同或不同,每个n2选自1~8的整数,每个m2都彼此独立,可以相同或不同,每个m2选自0~8的整数;优选,每个n2选自4~8的整数,每个m2选自4~8的整数;优选,每个n2都彼此相同,每个m2都彼此相同。
其中每个n3都彼此独立,可以相同或不同,每个n3选自1~8的整数,每个m3都彼此独立,可以相同或不同,每个m3选自0~8的整数;优选,每个n3选自4~8的整数,每个m3选自4~8的整数;优选,每个n3都彼此相同,每个m3都彼此相同。
其中每个n4都彼此独立,可以相同或不同,每个n4选自1~8的整数,每个m4都彼此独立,可以相同或不同,每个m4选自0~8的整数;优选,每个n4选自4~8的整数,每个m4选自4~8的整数;优选,每个n4都彼此相同,每个m4都彼此相同。
在本发明的一些具体实施方式中,所述式I化合物选自表1所示的以下化合物:
表1
/>
/>
/>
/>
优选,所述式I化合物是
在本发明的一个实施方式中,所述脂质纳米颗粒中包含式I的可电离阳离子脂质分子、中性脂质分子、胆固醇类脂质分子和PEG化的脂质分子。
根据本发明,式I的脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为30-60mol%,例如32-55mol%,例如可以为30mol%,31mol%,32mol%,33mol%,34mol%,35mol%,36mol%,37mol%,38mol%,39mol%,40mol%,41mol%,42mol%,43mol%,44mol%,45mol%,46mol%,47mol%,48mol%,49mol%,50mol%,51mol%,52mol%,53mol%,54mol%,55mol%等。
根据本发明,所述中性脂质分子是不带电脂质分子或两性离子型脂质分子,例如磷脂酰胆碱类化合物,或/和磷脂酰乙醇胺类化合物。
磷脂酰胆碱类化合物的结构如式E所示:磷脂酰乙醇胺类化合物的结构如式F所示:/>其中Ra、Rb、Rc、Rd独立的选自直链或支链的C1-30烷基,直链或支链的C2-30烯基,优选为直链或支链的C10-30烷基,直链或支链的C10-30烯基,例如CH3(CH2)17CH2-、CH3(CH2)15CH2-、CH3(CH2)13CH2-、CH3(CH2)11CH2-、CH3(CH2)9CH2-、CH3(CH2)7CH2-、CH3(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-、CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)7-CH=CH-(CH2)9-。
中性脂质分子的实例包括但不限于5-十七基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它们的组合。
在一个实施方案中,中性脂质分子可选自由以下组成的组:二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。在另一个实施方案中,中性脂质分子可为二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在另一个实施方案中,中性脂质分子可为二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)。
根据本发明,中性脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为5-30mol%,例如8-20mol%,例如可以为8mol%,9mol%,10mol%,11mol%,12mol%,13mol%,14mol%,15mol%,16mol%,17mol%,18mol%,19mol%,20mol%。
根据本发明,胆固醇类脂质分子是指甾醇以及含有甾醇部分的脂质,包括但不限于胆固醇,5-十七基间苯二酚,粪甾醇,谷甾醇,麦角甾醇,菜油甾醇,豆甾醇,菜子甾醇,番茄次碱,番茄碱,熊果酸,α-生育酚及其混合物、胆固醇半琥珀酸酯。在一个实施方案中,胆固醇类脂质分子为胆固醇(CHOL)。在一个实施方案中,胆固醇类脂质分子为胆固醇半琥珀酸酯。
根据本发明,胆固醇类脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为30-50mol%,例如可以为30mol%,31mol%,32mol%,33mol%,34mol%,35mol%,36mol%,37mol%,38mol%,39mol%,40mol%,41mol%,42mol%,43mol%,44mol%,45mol%,46mol%,47mol%,48mol%,49mol%,50mol%等。
根据本发明,PEG化的脂质分子包含脂质部分和基于PEG的聚合物部分。在一些实施方案中,PEG化的脂质分子可表示为“脂质部分-PEG-数均分子量”或者“PEG-脂质部分”或者“PEG-数均分子量-脂质部分”,所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰胺,选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二棕榈酰甘油、二硬脂酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二棕榈酰甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺;PEG的数均分子量为约130至约50,000,例如约150至约30,000,约150至约20,000,为约150至约15,000,为约150至约10,000,为约150至约6,000,为约150至约5,000,为约150至约4,000,为约150至约3,000,为约300至约3,000,为约1,000至约3,000,为约1,500至约2,500,例如约2000。
在一些实施方案中,PEG化的脂质分子可选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰甘油酰胺和PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DMG-PEG2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DSG-PEG2000)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(DMA-PEG2000)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSA-PEG2000)。在一个实施方案中,PEG化的脂质分子可为DMG-PEG2000。在一些实施方案中,PEG化的脂质分子可为DSG-PEG2000。在一个实施方案中,PEG化的脂质分子可为DSPE-PEG2000。在一个实施方案中,PEG化的脂质分子可为DMA-PEG2000。在一个实施方案中,PEG化的脂质分子可为C-DMA-PEG2000。在一个实施方案中,PEG化的脂质分子可为DSA-PEG2000。在一个实施方案中,PEG化的脂质分子可为PEG2000-C11。在一些实施方案中,PEG化的脂质分子可为PEG2000-C14。在一些实施方案中,PEG化的脂质分子可为PEG2000-C16。在一些实施方案中,PEG化的脂质分子可为PEG2000-C18。
根据本发明,PEG化的脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为0.4-10mol%,例如0.5-5mol%,例如可以为0.4mol%,0.5mol%,0.6mol%,0.7mol%,0.8mol%,0.9mol%,1.0mol%,1.1mol%,1.2mol%,1.3mol%,1.4mol%,1.5mol%,1.6mol%,1.7mol%,1.8mol%,1.9mol%,2.0mol%,2.1mol%,2.2mol%,2.3mol%,2.4mol%,2.5mol%,2.6mol%,2.7mol%,2.8mol%,2.9mol%,3.0mol%,3.1mol%,3.2mol%,3.3mol%,3.4mol%,3.5mol%,3.6mol%,3.7mol%,3.8mol%,3.9mol%,4.0mol%,4.1mol%,4.2mol%,4.3mol%,4.4mol%,4.5mol%,4.6mol%,4.7mol%,4.8mol%,4.9mol%,5.0mol%等。
在本发明的一些实施方式中,所述脂质纳米颗粒中含有式C所示的脂质分子,中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子,其中:
式C其中每个n3都彼此独立,可以相同或不同,每个n3选自1~8的整数,每个m3都彼此独立,可以相同或不同,每个m3选自0~8的整数;优选,每个n3选自4~8的整数,每个m3选自4~8的整数;优选,每个n3都彼此相同,每个m3都彼此相同;更优选为式C所示的可电离阳离子脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为32-55mol%,优选为34-46mol%。
中性脂质分子选自式E所示的磷脂酰胆碱类化合物式F所示的磷脂酰乙醇胺类化合物/>其中Ra、Rb、Rc、Rd独立的选自直链或支链的C10-30烷基,直链或支链的C10-30烯基,优选为CH3(CH2)17CH2-、CH3(CH2)15CH2-、CH3(CH2)13CH2-、CH3(CH2)11CH2-、CH3(CH2)9CH2-、CH3(CH2)7CH2-、CH3(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-、CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)7-CH=CH-(CH2)9-。中性脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为8-20mol%,优选为9-16mol%。
胆固醇类脂质分子选自胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯。胆固醇类脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为30-50mol%,优选为35-50mol%,更优选为37-49mol%。
PEG化的脂质分子表示为“脂质部分-PEG-数均分子量”,所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰胺,选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二棕榈酰甘油、二硬脂酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二棕榈酰甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺;PEG的数均分子量为130~50,000,例如150~30,000,150~20,000,150~15,000,150~10,000,150~6,000,150~5,000,150~4,000,150~3,000,300~3,000,1,000~3,000,1,500~2,500,约2000。PEG化的脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为0.5-5mol%,优选为1.3-2.7mol%。
在本发明的一些实施方式中,式C所示的脂质分子、中性脂质分子、胆固醇和PEG化的脂质分子摩尔比为45:15:38.5:1.5。
在本发明的一个实施方式中,式C脂质分子为化合物II-37。
在本发明的一个实施方式中,所述中性脂质分子是DOPE和/或DSPC。
在本发明的一个实施方式中,所述PEG化的脂质分子是DMG-PEG2000和/或DSPE-PEG2000。
在本发明的一个实施方式中,所述药物制剂的活性成分是mRNA。
根据本发明,所述mRNA从5’端至3’端包含5’UTR,开放阅读框(ORF),3’UTR和poly-A尾。所述mRNA还可以进一步包含5’帽结构。
根据本发明,所述帽结构可以是Cap1结构,Cap2结构或Cap3结构。在本发明的一个实施方式中,所述帽结构是Cap1结构。
根据本发明,所述5’UTR可以包含β-珠蛋白或α-珠蛋白的5’UTR或其同源物、片段。在本发明的一些实施方式中,所述5’UTR包含与SEQ ID NO:6所示的β-珠蛋白的5’UTR核苷酸序列至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或约100%同源性的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中,所述5’UTR包含SEQ IDNO:6所示的β-珠蛋白的5’UTR核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中,所述5'UTR还包含Kozak序列。在本发明的一个实施方式中,所述Kozak序列为GCCACC。
根据本发明,所述3’UTR可以包含β-珠蛋白或α-珠蛋白的3’UTR或其同源物、片段,或片段的组合。在本发明的一些实施方式中,所述3’UTR包含与SEQ ID NO:7所示α2-珠蛋白3’UTR的片段至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或约100%同源性的核苷酸序列。在本发明的另一些实施方式中,所述3’UTR包含2个首尾相连的与SEQ ID NO:7所示的α2-珠蛋白3’UTR的片段至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或约100%同源性的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中,所述3’UTR包含2个首尾相连的SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
根据本发明,所述poly-A尾的长度可以为50-200个核苷酸,优选为100-150个核苷酸,例如110-120个核苷酸,例如约110个核苷酸,约120个核苷酸,约130个核苷酸,约140个核苷酸,约150个核苷酸。
根据本发明,所述开放阅读框是编码肽或蛋白的核酸序列,所述肽或蛋白可以是抗原、结构蛋白、调节蛋白、激素、神经递质、生长调节因子、分化因子、基因表达调控因子、DNA相关蛋白、酶、血清蛋白、受体等等。抗原蛋白包括但不限定于肿瘤抗原、病原体衍生的抗原、变应原等。
在本发明的一些实施方案中,所述开放阅读框(ORF)是编码2019-nCov的S蛋白或其突变体的开放阅读框(ORF),所述2019-nCov可以是病毒的野生株或突变株。在本发明的一个实施方案中,所述2019-nCov的S蛋白突变体的核酸序列是与SEQ ID NO:8所示核苷酸序列至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或约100%同源性的核苷酸序列。该ORF翻译后的S蛋白突变体的氨基酸序列是由从N端向C端直接连接的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成。在本发明的一个具体实施方式中,所述S蛋白突变体的开放阅读框(ORF)的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在本发明的一个实施方案中,所述mRNA包含与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或约100%同源性的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中,所述mRNA包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
根据本发明,所述mRNA中的一个或多个核苷酸可以是经修饰的。例如,所述mRNA中的一个或多个核苷酸(例如所有核苷酸)可以各自独立替换为天然存在的核苷酸类似物或人工合成的核苷酸类似物,例如选自假尿苷(pseudouridine)、2-硫尿苷(2-thiouridine)、5-甲基尿苷(5-methyluridine)、5-甲基胞苷(5-methylcytidine)、N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine)、N1-甲基假尿苷(N1-methylpseudouridine)等。
可采用本领域已知的方法制备mRNA。在本发明的一些实施方式中,可以人工合成编码mRNA的核酸序列,将该序列克隆到载体中,构建体外转录用质粒。将构建的质粒转化到宿主菌中培养扩增,提取质粒。将提取的质粒使用限制性内切酶酶切消化成线性分子。以制备的线性化质粒分子为模板,使用体外转录法制备mRNA。可以在体外转录过程中添加帽结构类似物,直接得到具有帽结构的mRNA;也可以在体外转录结束后,使用加帽酶和二甲基转移酶给mRNA添加上帽结构。可采用本领域常规的方法纯化得到的mRNA,例如化学沉淀法、磁珠法、亲和层析法等。
本发明中的2019-nCov的S蛋白突变体是亲本S蛋白发生氨基酸突变产生的。在本发明的一个实施方式中,所述亲本S蛋白是2019-nCoV B1.351突变毒株的S蛋白,2019-nCoVB1.351突变毒株的S蛋白与2019-nCoV野生株的S蛋白相比具有以下突变:L18F,D80A,D215G,L242_244L del,R246I,K417N,E484K,N501Y,D614G,A701V(所述位点以SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的位置来定位描述)。在本发明中,S蛋白突变体和亲本S蛋白的氨基酸位置均以野生型S蛋白的氨基酸序列为描述依据,野生型S蛋白的氨基酸序列在本发明中标示为SEQ ID NO:1。
本发明所述S蛋白突变体至少包含胞外域,其胞外域相对于亲本S蛋白的胞外域包含如下位置的氨基酸突变:F817P、A892P、A899P、A942P、和KV986_987PP以及将682-685位氨基酸RRAR突变为GSAS;以及不包含S蛋白的跨膜域和胞质尾;在胞外区的C端直接融合辅助形成三聚体的结构域T4 Fibritin Foldon Trimerization Motif。所述S蛋白突变体包含从N端向C端直接连接的SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
本发明的序列列表:
/>
/>
/>
/>
/>
/>
所述脂质纳米颗粒可使用所属领域中已知的任何方法来制备。这些方法包括(但不限于)喷雾干燥、单一和双重乳液溶剂蒸发、溶剂萃取、相分离、纳米沉淀、微流控、简单和复杂凝聚以及所属领域的普通技术人员熟知的其它方法。
可以采用本领域已知的冻干技术,在获得包含本发明所述脂质纳米颗粒的液态组合物后,制备本发明的冻干制剂。
在本发明的一些实施方式中,制备含有脂质纳米颗粒的液体组合物的方法包括:1)制备含有式I化合物、中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子的有机相;2)制备含有活性成分的水相;3)将有机相和水相进行混合,制备脂质纳米颗粒混悬液;任选进一步包括:4)将所述混悬液浓缩后,加入冻干保护剂。所述步骤1)中,优选,使用无水乙醇或乙醇的水溶液作为溶剂。所述步骤2)中,优选使用水作为溶剂。所述步骤3)中,优选有机相和水相的体积比为1:2~4。
在本发明的一些实施方式中,冻干制剂的制备方法包括预冻、一次干燥和二次干燥。优选所述预冻为-40℃至-60℃保持1-8h;所述一次干燥为在真空度为0.02mbar-0.4mbar条件下,-30℃至-55℃保持10-80h;所述二次干燥为在真空度为0.02mbar-0.4mbar条件下,4℃至20℃保持10-30h。
在使用前,可以采用本领域已知的方法,通过使用注射用溶液将所述冻干制剂复溶成液态制剂,然后进行注射给药。所述注射用溶液可以是注射用水、0.9%注射用氯化钠溶液、或者注射用葡萄糖溶液。
在某些实施例中,所述脂质纳米颗粒上还可以修饰上靶向分子,使其成为靶向剂而能靶向特定细胞、组织或器官。靶向分子可包括在脂质纳米颗粒中或可仅位于其表面上。靶向分子可为蛋白质、肽、糖蛋白、脂质、小分子、核酸等,其实例包括(但不限于)抗体、抗体片段、低密度脂蛋白(LDL)、转铁蛋白(transferrin)、脱唾液酸糖蛋白(asialycoprotein)、受体配体、唾液酸、适体等。
所述药物制剂还可以进一步包含其他药学上可接受的载体,例如缓冲剂、抗氧化剂、pH调节剂、等渗调节剂等。
根据本发明,所述无针注射装置包括注射器本体和动力源,可以是本领域已知的各种无针注射装置,包括但不限于国内外无针注射器厂家生产上市的各产品(例如Needlefree injection technology-An overview,Tejaswi R.Kale等,INNOVATIONS inpharmacy,2014,5(1)中介绍的产品);或者CN114917431A、CN113975539A、CN113975540A、CN113975545A、CN113975546A、CN111558112A、CN111558113A、CN110812617A、CN109432553A、CN109432554A、CN108853648A、CN107812281A、CN104147666A、CN103495241A、CN102846472A、CN102652848A、CN102247637A、CN102125712A等专利申请中记载的无针注射装置。这些文献和专利申请公开的内容全文引入本申请中。
通常,无针注射装置(也可称为“无针注射器”)包括三个主要组成部分:药管、推动器和动力源。动力源部件可以是例如弹簧或气动装置,通过调节动力源的参数以实现提供不同的注射压力的目的。推动器例如推杆,为动力传递装置,将动力源的推力传递给药液。药管为药液存贮及与人体接触的部件,经一系列力的传递后药液被注射到人体内。药管的药液射出孔径也是调节注射到体内的注射力的一个可变因素。附图13示例了本领域中常见的无针注射器的原理性结构示意图。
无针注射的原理是,动力源通过推动器向位于药管内的药液施加压力,药管内药液受到压力后从位于药管另一端的微孔射出。通过调整动力源施加的压力,从微孔射出的液流将具有不同的能量。根据压强的计算公式P=F/S可知,受力增大同时受力面减小将会使得压强增大,最后微孔内射出的液流会具有很高的速度及压强,作用在皮肤表面上时,其对表皮产生的压力足以穿透皮肤。通过调整动力源的压力和/或微孔孔径,可使得从微孔内射出的液流能够穿透皮肤到达皮下的不同深度。
本发明药物制剂可以承受12MPa~25MPa甚至更高的注射压强,且所述注射压强足以使本发明药物制剂中的LNP颗粒进入动物或人体的皮下、皮内或肌肉。因此只要能提供高于10MPa注射压强的无针注射装置都可用于本发明,例如可以提供至少包括12MPa~25MPa范围的注射时压强的无针注射装置,组成本发明的组合或给药系统。在本发明的一个实施方式中,所述无针注射器的注射液出口直径为0.1-0.3mm,例如0.12mm、0.14mm、0.15mm、0.18mm、0.25mm、0.28mm、0.3mm等。
在本发明的一个实施方式中,所述无针注射装置是弹簧压力型无针注射装置,其动力源是弹簧。
在本发明的一个实施方式中,所述无针注射装置是气动压力型无针注射装置,其动力源是气动装置。
使用无针注射器注射时,注射器与皮肤的夹角可以调整,可以为90°~10°,例如80°、70°、60°、50°、45°、40°、30°、20°等,优选为90°~70°。通常而言,小于90°注射相比于垂直注射有利于降低皮肤的层级阻力,更利于LNP进入皮下、皮内或肌肉。
本发明还提供一种治疗方法,所述治疗方法是使用本发明的组合或给药系统,通过无针注射装置给予有需要的患者本发明的药物制剂。根据本发明中药物制剂活性成分的不同,所述治疗方法治疗的目地不同,包括但不限于疫苗注射以实现针对抗原的免疫,例如对病原体的免疫或肿瘤免疫等。
本发明还提供本发明的药物制剂在制备用于无针注射给药的药物中的用途,本发明的药物制剂和无针注射装置联合在制备用于无针注射给药的药物中的用途,本发明的组合或给药系统在制备用于无针注射给药的药物中的用途。所述药物包括但不限于预防或治疗性药物,例如疫苗(针对病原体的疫苗或肿瘤疫苗)等。无针注射给药的药物特别适用于“恐针”受试者,避免其因惧怕针头而拒绝接种疫苗等预防或治疗的处理。
本发明的可电离脂质化合物可以采用本领域已有的方法进行合成,例如,使一当量或一当量以上的胺与一当量或一当量以上的环氧基封端化合物在合适的条件下反应形成。可电离脂质化合物的合成是在有或无溶剂的情况下进行,并且所述合成可在25-100℃范围内的较高温度下进行。可任选纯化制得的可电离脂质化合物。举例来说,可纯化可电离脂质化合物的混合物,得到特定的可电离脂质化合物。或可纯化混合物,得到特定立体异构体或区域异构体。所述环氧化物可以商业购买,或者合成制备。
在本发明的一些实施方式中,本发明的可电离脂质化合物可以采用如下的一般制备方法进行制备。
式A、B、C或D
步骤1:还原
在还原剂的存在下,将化合物A1的羧基还原成羟基以获得化合物A2。还原剂的实例包括但不限于氢化铝锂、二异丁基氢化铝等。反应所用溶剂的实例包括但不限于醚类(如乙醚、四氢呋喃和二氧六环等),卤代烃(如氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷等),烃类(如正戊烷、正己烷、苯和甲苯等),及这些溶剂的两种或以上形成的混合溶剂。
步骤2:氧化
在氧化剂的存在下,将化合物A2的羟基氧化成醛基以获得化合物A3。氧化剂的实例包括但不限于2-碘酰基苯甲酸(IBX)、氯铬酸吡啶(PCC)、二氯铬酸吡啶盐(PDC)、戴斯-马丁氧化剂、二氧化锰等。反应所用溶剂的实例包括但不限于卤代烃(如氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷等),烃类(如正戊烷、正己烷、苯和甲苯等),腈类(例如乙腈等),及这些溶剂的两种或以上形成的混合溶剂。
步骤3:卤代-还原
首先在酸性条件下,将化合物A3的醛α-氢与卤代试剂发生卤代反应以获得α-卤代醛中间体,然后在还原剂存在下,将α-卤代醛的醛基还原成羟基以获得化合物A4。提供酸性条件的实例包括但不限于DL-脯氨酸。卤代试剂的实例包括但不限于N-氯代丁二酰亚胺(NCS)和N-溴代丁二酰亚胺(NBS)。还原剂的实例包括但不限于硼氢化钠、氰基硼氢化钠和三乙酰氧基硼氢化钠。
步骤4:环氧化
将化合物A4在碱的存在下进行分子内的亲核取代反应以获得环氧化合物A5。碱的实例包括但不限于碱金属的氢氧化物或氢化物,例如氢氧化钠、氢氧化钾和氢化钠。反应所用溶剂的实例包括但不限于二氧六环和水的混合物。
步骤5:开环反应
使化合物A5与胺(例如N,N-二(2-氨基乙基)甲胺)发生开环反应以获得最终化合物。反应用溶剂的实例包括但不限于乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷、己烷、甲苯、乙醚等。
所述制备方法中的原料A1可以商购也可以采用常规方法合成。
本发明的可电离脂质分子结构中含有两个相邻的顺式双键,使其在后续应用于递送系统包裹活性物质(例如核酸如mRNA)时,具有较高的包封率,较好的细胞转染率;此外,在制备脂质纳米颗粒时,得到的脂质纳米颗粒粒径更均匀,更稳定。本发明的可电离脂质化合物尤其适合于制备实心结构的纳米颗粒。
如本文中所使用,2019-nCov和SARS-CoV-2具有相同含义。
术语“烷基”是指从含有1到30个碳原子的烃部分通过去除单个氢原子得到的饱和烃基。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基和正十二烷基。
术语“烯基”表示从具有至少一个碳-碳双键的烃部分通过去除单个氢原子得到的单价基团。烯基包括例如例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。
术语“炔基”是指从具有至少一个碳-碳三键的烃通过去除单个氢原子得到的单价基团。代表性炔基包括乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。
术语“烷氧基”是指如前文所定义的烷基通过氧原子连接于母体分子。烷氧基的实例包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、新戊氧基和正己氧基。
术语“卤基”和“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。
术语“经取代”(无论前面是否存在术语“任选地”)和“取代基”是指将一个官能团变为另一个官能团的能力,条件是维持所有原子的价数。当任何特定结构中的一个以上位置可经一个以上选自指定群组的取代基取代时,所述取代基可在每一位置相同或不同。
术语“药学上可接受的载体”指任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂等,包括但不限于糖,诸如乳糖、海藻糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉;纤维素和其衍生物,诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素;明胶;滑石;油,诸如花生油、棉籽油、红花油、橄榄油、玉米油和大豆油;二醇,诸如丙二醇;酯,诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯;缓冲剂,诸如磷酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液;着色剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂等。
“和/或”将被视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此,在诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地,在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个:A、B和C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A(单独);B(单独);和C(单独)。
“包括”和“包含”具有相同的含义,旨在是开放的并且允许但不要求包括额外的元件或步骤。当在本文中使用术语“包括”或“包含”时,因此也包括和公开了术语“由......组成”和/或“基本上由……组成”。
在本说明书和权利要求书中,核苷酸通过其通常接受的单字母代码来指代。除非另有说明,否则核苷酸序列以5'至3'方向从左向右书写。核碱基在本文中由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的通常已知的单字母符号表示。技术人员将理解,本文公开的密码子中的T碱基存在于DNA中,而T碱基在相应RNA中将被U碱基取代。例如,本文公开的DNA形式的密码子-核苷酸序列,例如载体或体外翻译(IVT)模板,其T碱基在其相应的转录mRNA中转录为U碱基。在这一方面,密码子优化的DNA序列(包含T)和它们相应的mRNA序列(包含U)都被认为是本公开的密码子优化的核苷酸序列。本领域技术人员还将理解,可以通过用非天然碱基替换一个或多个碱基来产生等同的密码子图谱。
术语“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”可互换使用,并且是指连续的核酸序列。序列可以是单链或双链的DNA或RNA,例如mRNA。
“编码…的核苷酸序列”是指编码多肽的核酸(例如,mRNA或DNA分子)编码序列。编码序列可以进一步包括与调控元件可操作地连接的起始和终止信号,所述调控元件包括能够指导在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中的表达的启动子和多腺苷酸化信号。
在本说明书和权利要求书中,使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。除非另有说明,氨基酸序列以氨基至羧基取向从左至右书写。
“约”:在整个说明书和权利要求中与数值结合使用的术语“约”表示本领域技术人员熟悉和可接受的准确度区间。通常,这种精确度的区间为±10%。
为了便于参照,本发明的S蛋白突变体使用如下命名规则描述:原始氨基酸:位置:取代氨基酸。根据该命名规则,例如在第30位天冬酰胺被丙氨酸取代表示为:Asn30Ala或N30A;在相同位置缺失天冬酰胺表示为:Asn30*或N30*;插入另一氨基酸残基,例如赖氨酸,表示为:Asn30AsnLys或N30NK;缺失连续的一段氨基酸残基,例如缺失氨基酸残基242-244,表示为(242-244)*或Δ(242-244)或242_244del;如果与其它S蛋白亲本相比,S蛋白突变体含有“缺失”且在该位置含有插入,则表示为:*36Asp或*36D,表示在第36位缺失同时插入天冬氨酸。当在给定位置可插入一个或多个可选择的氨基酸残基时,表示为:N30A,E,或N30A或N30E。
同源性:如本文所用,术语“同源性”是指聚合物分子之间的总体相关性,例如,在核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或在多肽分子之间。通常,术语“同源性”意味着两个分子之间的进化关系。因此,两个同源的分子将具有共同的进化祖先。在本公开的背景下,术语同源性包括同一性和相似性。
在一些实施方案中,如果分子中至少25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%的单体是相同的(完全相同的单体)或相似(保守置换),聚合物分子被认为是彼此“同源的”。术语“同源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。
同一性:如本文所用,术语“同一性”是指聚合物分子之间,例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体单体保守性。例如,可以通过以进行最佳比较目的比对两个序列来进行两个多核苷酸序列的百分同一性的计算(例如,可以在第一和第二核酸序列之一或两个中引入空位用于最佳比对和非相同的序列可以对于比较目的放弃。当比较DNA和RNA时,胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可被认为是等同的。
合适的软件程序可从各种来源获得,并用于蛋白质和核苷酸序列两者的比对。例如,Bl2seq,Needle,Stretcher,Water或Matcher等。
术语“编码区”和“编码区域”是指多核苷酸中的开放阅读框(ORF),其在表达时产生多肽或蛋白质。
“可操作地连接”是指两个或更多个分子,构建体,转录物,实体,部分等之间的功能性连接。
结构域:如本文所用,当提及多肽时,术语“结构域”是指具有一个或多个可识别的结构或功能特征或性质(例如,结合能力,用作蛋白质-蛋白质相互作用的位点)的多肽的基序。
表达:如本文所用,核酸序列的“表达”是指一个或多个以下事件:(1)从DNA序列产生mRNA模板(例如,通过转录);(2)mRNA转录物的加工(例如,通过剪接,编辑,5'帽形成和/或3'末端加工);(3)将mRNA翻译成多肽或蛋白质;和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
术语“蛋白突变体”或“多肽突变体”是指其氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。与天然或参考序列相比,氨基酸序列突变体可在氨基酸序列内的某些位置具有置换、缺失和/或插入等。通常,突变体与天然或参考序列将具有至少约50%的同一性,至少约60%的同一性,至少约70%的同一性,至少约80%的同一性,至少约90%的同一性,至少约95%的同一性,至少约99%的同一性。
附图说明
图1使用RNA 6000 nano chip在2100生物分析仪上分析B1.351 mRNA完整性结果。
图2ELISA法检测核酸转染CHO-K1细胞后上清中S蛋白表达水平。
图3ELISA法检测用II-37制成的纳米颗粒包封本发明mRNA转染细胞后上清中S蛋白表达水平。
图4不同压力无针注射LNP-mRNA在距离注射器出口不同位置的速度。
图5不同压力和角度无针注射LNP-mRNA后LNP-mRNA粒径大小分布状况。
图6不同压力和角度无针注射LNP-mRNA后LNP-mRNA各项理化指数变化趋势。
图7冷冻电镜下不同压力无针注射LNP-mRNA后LNP-mRNA颗粒外观状态。
图8大鼠通过无针和有针注射方式免疫不同剂量新冠mRNA疫苗后对D614G变异株特异的结合抗体诱导情况。
图9大鼠通过无针和有针注射方式免疫不同剂量新冠mRNA疫苗后对OmicronBA.1变异株有效的中和抗体诱导情况。
图10通过无针方式在两次免疫中同时对大鼠不同部位两次注射相同剂量新冠mRNA疫苗后对D614G变异株特异的结合抗体诱导情况。
图11新西兰兔通过无针和有针注射方式两次免疫新冠mRNA疫苗后血清对OmicronBA.5活病毒的中和情况。
图12可电离脂质II-37和C14-113分别形成的包裹mRNA的LNP的细胞转染效率对比。
图13无针注射器的原理性结构示意图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解,下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明,而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过已知方法制备。所述生物学实验方法均是本领域已知的实验方法,或者可以根据使用的试剂盒的说明书指引进行操作。
实施例1可电离脂质II-37的合成
亚麻油醇(a2)的合成:在0℃下,向950mL四氢呋喃中加入LiAlH4(7.20g)、亚麻油酸(50g,a1),之后混合物在25℃下搅拌2h。薄层色谱法(TLC)显示反应完成后,向反应液依次加入水(7.2mL),NaOH水溶液(7.2mL,质量分数为15%)和水(21.6mL)淬灭,并加入适量Na2SO4搅拌15分钟后通过布氏漏斗过滤并用乙酸乙酯洗涤滤饼,收集滤液并蒸发浓缩,得到目标产物亚麻油醇(a2)47.4g。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.27-5.44(m,4H),3.63(t,J=6.63Hz,2H),2.77(t,J=6.44Hz,2H),1.97-2.12(m,4H),1.57-1.63(m,1H),1.20-1.46(m,18H),0.83-0.95(m,3H)
(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醛(a3)的合成:在室温下,向170mL乙腈中加入亚麻油醇(25.0g,a2)和2-碘酰基苯甲酸(39.4g),之后混合物在85℃下搅拌4h。反应液通过布氏漏斗过滤并用二氯甲烷洗涤滤饼,收集滤液并蒸发浓缩,得到目标产物(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醛(a3)24.0g。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.76(t,J=1.76Hz,1H),5.25-5.43(m,4H),2.76(t,J=6.17Hz,2H),2.41(td,J=7.33,1.87Hz,2H),2.04(q,J=6.84Hz,4H),1.56-1.68(m,2H),1.22-1.36(m,14H),0.88(t,J=6.73Hz,3H)
(9Z,12Z)-2-氯代-十八碳-9,12-二烯-1-醇(a4)的合成:在0℃下,向246mL乙腈中加入(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醛(43.0g,a3),DL-脯氨酸(5.62g)和N-氯代丁二酰亚胺,然后在0℃下搅拌2h。反应完成后,用无水乙醇(246mL)稀释反应液,再加入硼氢化钠(8.8g),之后在0℃下搅拌4h。向反应混合物中加水(120mL)淬灭,并用甲基叔丁基醚萃取,合并有机相后用饱和食盐水洗涤,硫酸钠干燥之后过滤、蒸发浓缩,得到目标产物(9Z,12Z)-2-氯代-十八碳-9,12-二烯-1-醇(a4,46g),直接用于下一步。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.25-5.51(m,4H),3.97-4.07(m,1H),3.79(dd,J=12.01,3.63Hz,1H),3.59-3.70(m,1H),2.67-2.90(m,2H),1.96-2.15(m,5H),1.64-1.82(m,1H),1.20-1.49(m,15H),0.89(br t,J=6.75Hz,3H)
2-[(7Z,10Z)-十六碳烷-7,10-二烯]环氧乙烷(a5)的合成:在室温下,向450mL1,4-二氧六环中加入(9Z,12Z)-2-氯代-十八碳-9,12-二烯-1-醇(45g,a4)和氢氧化钠水溶液(120g氢氧化钠溶于585mL水),滴加完毕后混合物在35℃下搅拌2h。TLC显示反应完成后,反应液通过分液漏斗分离,并用饱和食盐水洗涤,硫酸钠干燥后过滤并蒸发浓缩,然后通过快速过柱法用石油醚/乙酸乙酯洗脱来纯化残余物,得到目标产物2-[(7Z,10Z)-十六碳烷-7,10-二烯]环氧乙烷(a5)29.11g。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.27-5.46(m,4H),2.87-2.98(m,1H),2.70-2.85(m,3H),2.46(dd,J=5.00,2.75Hz,1H),1.94-2.21(m,4H),1.24-1.58(m,17H),0.78-1.00(m,3H)
II-37的合成:在室温下,向10mL乙醇中加入2-[(7Z,10Z)-十六碳烷-7,10-二烯]环氧乙烷(5g)和N,N-二(2-氨基乙基)甲胺(739mg),之后混合物在90℃下搅拌36h。反应液蒸发浓缩,然后通过快速过柱法用二氯甲烷/甲醇洗脱来纯化残余物,得到粗产物II-37(4g)。再次通过快速过柱法用二氯甲烷/甲醇纯化目标产物,得到II-37(2.2g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.27-5.44(m,12H),3.48-3.79(m,3H),2.63-3.00(m,12H),2.16-2.61(m,12H),2.05(q,J=6.80Hz,12H),1.18-1.57(m,51H),0.89(t,J=6.88Hz,9H)
ESI-MS:m/z 910.8[M+H]+,911.8[M+2H]+,912.8[M+3H]+
可电离脂质有两个主要作用:结合核酸和允许核酸分子在细胞中释放。脂质的pKa是一个重要因素,因为脂质需要在低pH值下带正电荷才能与核酸结合,但在中性pH值下不带电荷,才能使形成的LNP不会引起毒性。通过TNS染料结合试验测定可电离脂质II-37的pKa在6.81。
实施例2B1.351 mRNA的制备及其翻译
1.人工合成能够编码前述SEQ ID No.8所示mRNA的核酸序列,将该序列克隆到pUC57-kana载体的T7启动子后面,所述载体在之前经过改造,已含有能够编码SEQ ID NO:6、Kozak序列、2个首尾相连的SEQ ID NO:7、polyA尾的序列。编码前述SEQ ID NO:8所示mRNA的核酸序列克隆在Kozak序列和2个首尾相连SEQ ID NO:7之间的多克隆位点上,构建体外转录用质粒。
2.将构建的质粒转化到大肠杆菌Dh5a中,培养扩增,提取质粒。
3.将提取的质粒使用紧邻着polyA尾后面的限制性内切酶SpeI酶切消化成线性分子。
4.以制备的线性化质粒分子为模板,使用体外转录法(Thermo公司的体外转录试剂盒A45975)制备mRNA,所述mRNA的序列如SEQ ID NO:9所示,以下将所述mRNA简称为B1.351mRNA,由该mRNA翻译后获得的是本发明S蛋白突变体,其氨基酸序列从N端向C端为直接连接的SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在体外转录结束后,使用加帽酶和二甲基转移酶给mRNA添加上CAP1的帽结构。
5.mRNA的纯化:得到的mRNA原液使用亲和层析法纯化。
6.mRNA的质控:将制备出来的mRNA,使用RNA 6000 nano chip在2100生物分析仪上分析mRNA完整性,结果如图1所示,转录mRNA条带单一,无明显降解。
另外,通过限制性内切酶HindIII和EcoRI从商品化的质粒pCMV3-spike上切下Spike片段,插入到IVT1载体的HindIII和EcoRI位点之间(载体IVT1为在商业化载体psp73的基础上改造而来,在载体psp73酶切位点XhoI/NdeI处插入polyA尾长度为64个A),得到IVT1-spike质粒。再对该质粒进行点突变,得到IVT1-spike-D614G质粒,以该质粒为模板,体外转录得到spike-D614G mRNA,表达包含D614G突变的全长S蛋白。
7.B1.351 mRNA细胞水平表达检测:以CHO-K1细胞系为表达体系,使用Lipofectamine Messenger MAX Reagent(Invitrogen,Cat#1168-027)将mRNA转染,培养48h后,收集细胞培养上清,采用检测S蛋白的酶联免疫法检测试剂盒,检测S蛋白表达水平,以评判mRNA可否翻译成蛋白。结果如图2所示。图2中,“spike DNA”为商品化的质粒pCMV3-spike(采购自义翘神州公司),表达全长野生型S蛋白;“spike-D614G mRNA”为前述表达包含D614G突变的全长S蛋白的mRNA,“spike B1.351 mRNA”为前述B1.351 mRNA,表达的是本发明所述的S蛋白突变体,结果表明本发明的mRNA可以在细胞内高表达出S蛋白突变体。
实施例3包含核酸的脂质纳米颗粒组合物的制备
准确称取化合物II-37、DSPC、CHOL、DMG-PEG2000,将每种脂质置于称量瓶或离心管中,无水乙醇充分溶解备用。将各脂质按II-37:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000的脂质摩尔配比为:45:15:38.5:1.5混合均匀,作为有机相,将实施例2制备的B1.351mRNA配置成水溶液(以纯水为溶剂)作为水相pH=4。
水相和有机相的体积比为3:1混合,在微流控平台(PNI Ignite)上制备得到脂质纳米颗粒混悬液。将得到的脂质纳米颗粒悬浮液经100KDa超滤离心管进行纯化浓缩,将浓缩后的液体加入蔗糖,进行分装,并进行冻干处理,样品编号为tri02101-R-LNP-22043001。
将制备所得脂质纳米颗粒冻干粉复溶后,用激光纳米粒度仪测粒径、PDI、电位,用紫外分光光度计结合RiboGreen RNA试剂盒测包封率(%),结果如下。
样品编号 | PDI | 直径(nm) | Zeta电位(mV) | 包封率(%) |
tri02101-R-LNP-22043001 | 0.15 | 202.1 | 43 | 95.5 |
将其中一部分样本按照实施例2的方式转染细胞CHO,并通过Elisa/流式细胞术检测蛋白表达量以评估细胞转染率。细胞转染结果见图3:“tri02101-R-LNP-22043001”是上述对应配方包载实施例2的B1.351 mRNA,“lipoMax mRNA”是用lipoMaxTM包载实施例2的B1.351mRNA。从图3中可以看到基于II-37所获得的包载核酸的脂质纳米颗粒转染细胞48小时后,通过ELISA检测均可检测到有抗原蛋白表达,其细胞转染效率比商品化的lipoMaxTM更好。
实施例4本发明LNP对无针注射的适用性研究
本发明中以北京快舒尔医疗技术有限公司的QS-P-01型无针注射器为无针注射装置的实例,进行研究。
首先,使用大鼠和新西兰兔的动物模型,使用QS-P-01型无针注射器将蓝色墨水用不同压力注射入动物模型中。根据解剖观察,无针注射入大鼠皮下、肌肉和新西兰兔肌肉的最佳压力分别为200N,240N和320N,根据所用无针注射器的活塞直径换算后,对应的压强分别为约10MPa、约12MPa和约16MPa。
随后,使用本发明实施例3制备的包载B1.351 mRNA的LNP冻干制剂,用注射用水复建后,装填入QS-P-01型无针注射器中,研究LNP在无针注射中的使用情况。
1、在240N,320N,420N和490N的压力施加下,本发明实施例3制备的LNP通过无针注射装置出口的速度分别为141.8m/s,165.7m/s,182.0m/s和202.3m/s。如图4所示,呈现出射出速度与压力正相关的关系,表明本发明LNP的稳定性好,能耐受高压力的冲击。
2、在无针注射器240N,320N,420N和490N的压力施加下,以无针注射器和皮肤之间的不同角度进行注射后,虽然LNP的粒径分布有所分散,但LNP的粒径大小仍主要保持在120-240nm之间,以45°注射相比于垂直注射,对LNP粒径的影响更小,如图5所示;多分散性指数≤0.3,电动电位保持在30-45mV,mRNA包封率≥80%,与冻干复融或有针注射后LNP-mRNA颗粒的理化指数相比无明显差异,如图6所示。冷冻电镜显示LNP颗粒在320N和490N无针注射后其外观和状态和有针注射保持一致,如图7所示。
根据所用无针注射器的活塞直径换算后,240N,320N,420N和490N的压力对应压强分别为约12MPa、约16MPa、约20MPa、约25MPa。上述结果进一步证明,本发明LNP的稳定性好,能耐受高压力的冲击。在注射时,倾斜角度能够减小层级阻力,有利于通过注射操作进一步保护LNP在无针注射中的完整性。
实施例5免疫学实验
使用10-12周龄新西兰兔,6-8周龄(SD)IGS大鼠进行免疫学实验。
特异性IgG结合抗体检测(ELISA法),主要用于检测外周血中结合免疫原的总抗体浓度。采用间接ELISA法检测免疫动物血浆中SARS-CoV-2特异性IgG抗体含量。将5μg/mLSARS-CoV-2的D614G抗原蛋白包被在酶标板,2-8℃条件下包被过夜。用2% BSA-TBST封闭后加入稀释后的动物血浆孵育1h。然后加入HRP偶联山羊抗鼠/猴的二抗在室温条件下孵育30-45min,PBST洗涤5次。抗大鼠免疫球蛋白F(ab)2-HRP二抗(中国生物有限公司,北京,中国)或抗兔免疫球蛋白Fc-HRP二抗(杰克逊免疫研究,西格罗夫,美国宾夕法尼亚州),最终浓度为80ng/mL室温孵育1h。平板洗涤5次后用TMB显色后加入终止液终止反应,在450nm波长下测量吸光度确定抗体含量。抗体滴度定义为使OD450比未免疫小鼠血清样本的背景值高2.1倍的最高血清稀释比。
假病毒法检测中和抗体水平(报告基因),用于评估中和含有D614G以及BA.1Spike蛋白的假病毒的抗体水平。对于中和抗体的定量测定,我们使用了携带萤火虫荧光素酶基因的SARS-CoV-2假病毒PsV-Luc-Spike。SARS-CoV-2假病毒由中国生物细胞技术公司(北京,中国)生产。Huh-7细胞来源于中国培养组织收集中心(CCTCC,中国)。荧光素酶检测系统(E1501)和被动裂解5×缓冲液(E1941)购自Promega(Madison,WI,USA)。取疫苗注射前后不同时间点的动物的血浆样本,所有样本在使用前56℃水浴30min热灭活后连续稀释,用200TCID50/孔假病毒在37℃孵育1小时(5%的二氧化碳培养箱),并与2×104的Huh-7细胞共培养20h测定Relative light unit(RLU)来评估荧光素酶活性。抑制率的计算公式为Inhibition(%)=(Postive RLU-Sample RLU)/(Postive RLU-Negative RLU)×100%。中和抗体滴度(50%inhibitory dilution,NAT50)定义为与阳性孔相比RLU降低了50%的血清稀释倍数,抑制率大于50%的定义为中和抗体阳性。
活病毒中和法检测中和抗体水平,采用活病毒感染后细胞病变法,评估血样中抗体中和活病毒的能力。
1、采用实施例3制备的包载B1.351 mRNA的LNP冻干制剂作为疫苗,通过无针和有针注射分别对大鼠各进行了两次免疫,两次免疫间隔21天,剂量组设置为mRNA 5μg和mRNA10μg。每组大鼠8只,无针注射使用北京快舒尔医疗技术有限公司QS-P-01型无针注射器,使用240N的压力,垂直注射入肌肉,有针注射采用肌肉注射,两组的注射部位相同。
在第二次免疫后的第7天和第14天进行采血,并对样品使用ELISA法进行结合抗体检测和假病毒中和分析。对比无针和有针,同剂量组下的血清样本中新冠D614G突变株的特异性结合抗体水平保持一致,如图8所示;对Omicron BA.1突变株有效的中和抗体水平也无显著性差异,如图9所示。
2、采用实施例3制备的包载B1.351 mRNA的LNP冻干制剂作为疫苗,通过无针注射对大鼠进行两次免疫,两次免疫间隔21天,5μg和10μg剂量组每组8只大鼠,注射部位均为一个位置,另设置5μg+5μg的剂量组3只大鼠,注射部位为左腿和右腿肌肉,每个部位注射剂量均为5μg。所用注射器和注射方式同第1点。
在第二次免疫后的第7天和第14天进行采血使用ELISA法分析,两个部位各注射5μg的样本中对新冠D614G突变株特异的结合抗体水平与同一部位接种5μg或者10μg剂量组的保持一致,但组间差异明显减小,结果如图10所示。
3、采用实施例3制备的包载B1.351 mRNA的LNP冻干制剂作为疫苗,通过无针和有针注射分别对新西兰兔各进行了两次免疫,两次免疫间隔21天,剂量设置为mRNA 10μg。每组兔子4只,无针注射使用北京快舒尔医疗技术有限公司QS-P-01型无针注射器,使用320N的压力,垂直注射入肌肉,有针注射采用肌肉注射,两组的注射部位相同。在第二次免疫后的第7天进行常规采血,用于活病毒攻毒实验。对比无针和有针,无针组样本中对新冠Omicron BA.5突变株有效的中和抗体水平明显高于有针组样本,结果如图11所示。
上述动物实验结果表明,本发明的LNP组分及其形成的制剂能协同抵抗无针注射器激发的高速射流压力,保持LNP的结构不变,进而保持完整的LNP包载mRNA的结构不变,使其能顺利进入到皮下或肌肉组织中。而相较有针注射,无针注射能进一步分散LNP-mRNA颗粒,促进其和免疫细胞的接触,进而诱导出等效或更显著的免疫应答反应。
实施例6
II-37和商业化可电离阳离子脂质分子MC3的效果对比
MC3的分子式为:4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂。
按照类似实施例3所述的方法,分别使用II37和MC3制备脂质纳米颗粒,具体摩尔配比为:II-37:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000=45:15:38.5:1.5;MC3:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000=45:15:38.5:1.5;N/P比为5:1。
制备得到的脂质纳米颗粒理化质控数据如下表所示:
样本信息 | 粒径(nm) | PDI | Zeta电位(mV) | 包封率(%) |
mRNA-LNP(II-37) | 154.58 | 0.1068 | 22.07 | 90.5 |
mRNA-LNP(MC3) | 234.08 | 0.1259 | 2.44 | 40.7 |
由上表可见,II-37制备的脂质纳米颗粒包封率高达90.5%,远高于MC3的脂质纳米颗粒,并且粒径更小更均一,电位更高。
将制备的脂质纳米颗粒转染细胞CHO-K1,在转染的mRNA量相同的情况下,II-37制备的脂质纳米颗粒携带mRNA转染细胞之后,细胞中蛋白表达量远远高于MC3的,说明II-37制成的脂质纳米颗粒的细胞转染效率很高。
II-37和其结构类似物分子C14-113的对比
C14-113的结构式为:
按照类似实施例3所述的方法,分别使用II37和C14-113制备脂质纳米颗粒,具体摩尔配比为:II-37:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000=45:15:38.5:1.5;C14-113:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000=45:15:38.5:1.5;N/P比为10:1。
制备得到的脂质纳米颗粒理化质控数据如下表所示:
样本信息 | 粒径(nm) | PDI | Zeta电位 |
mRNA-LNP(II-37-LNP) | 136.68 | 0.14 | 20.07 |
mRNA-LNP(C14-113-LNP) | 152.65 | 0.12 | 24.1 |
用多功能酶标仪(BioTek,型号为SLXFATS)荧光素报告基因法来检测制备的LucRNA-LNP HEK293T细胞的转染效率,转染的LucRNA量分别为0.5μg、1.0μg、2.0μg。体外转录LucRNA的方法如下:HEK293T细胞铺板,细胞密度为2.5×105个细胞/mL,当细胞融合度为30%-50%进行转染。转染48h后使用多功能酶标仪检测蛋白表达量。阴性对照为不添加LucRNA-LNP的细胞培养基。结果如图12所示,在转染的mRNA量相同的情况下,II-37(图中以II-37-LNP表示)制备的脂质纳米颗粒携带mRNA转染细胞之后,细胞中蛋白表达量远远高于C14-113的,说明II-37制成的脂质纳米颗粒的细胞转染效率很高。
实施例7更多LNP的制备示例
按照类似实施例3的制备方法,称取化合物II-37、DOPE、CHOL、DSPE-PEG2000、DSPC、DMG-PEG2000,按下表中的摩尔比例,在微流控平台上制备得到脂质纳米颗粒混悬液。将得到的脂质纳米颗粒悬浮液经100KDa超滤离心管离心过滤,纯化浓缩,将浓缩后的液体进行分装。将制备所得脂质纳米颗粒用激光纳米粒度仪测粒径、PDI、电位,用紫外分光光度计结合RiboGreen RNA试剂盒测包封率(%),示例性结果如下。
/>
适当调整制备工艺参数,还可获得以下粒径、PDI、电位和包封率的LNP。
以上,对本发明的实施方式进行了说明。但是,本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种组合或给药系统,其特征在于,包括无针注射装置和药物制剂,所述药物制剂是是液体制剂或固体制剂,含有脂质纳米颗粒,在液体制剂中或者固体制剂复溶后的液体制剂中,所述脂质纳米颗粒的粒径为1-1000nm,多分性指数≤0.5,电动电位在-45~60mV;优选,脂质纳米颗粒的粒径为45-300nm,多分性指数≤0.5,电动电位在-45~50mV;更优选,脂质纳米颗粒的粒径为60-300nm,多分散性指数≤0.3,电动电位在-45~50mV;
优选,所述药物制剂为冻干制剂时,其中进一步含有冻干保护剂,所述冻干保护剂的含量占冻干制剂复溶后液体制剂的5-30w/v%。
2.如权利要求1所述的组合或给药系统,其特征在于,所述药物制剂中,脂质纳米颗粒中包含:式I的可电离阳离子脂质分子,其中:
Q为其中,R8、R9为彼此独立的选自经取代或未取代的直链C1-10亚烷基;R7为氢,卤素,-OH,直链或支链C1-20烷基,直链或支链C2-20烯基,直链或支链C2-20炔基,或-CH2CH(OH)R5,或/>所述取代的取代基团为卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基;
R1、R2、R3、R4可以相同或不同,各自独立的选自氢,经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基,经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基,经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基,所述烷基、烯基或炔基的1个或1个以上C原子任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换,或-CH2CH(OH)R5;所述取代的取代基团选自卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基;
条件是,R1、R2、R3、R4中至少一个为
R5选自氢,经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基,经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基,经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基,所述烷基、烯基或炔基的1个或1个以上C原子任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换;所述取代的取代基团选自卤素、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基;
R6选自氢,C1-3烷基,C1-3烷氧基,-OH;
n选自1~8的整数,m选自0~8的整数,n和m彼此独立,可以相同也可以不同;
当R1、R2、R3、R4中至少两个为时,每个所述基团中的n和m彼此独立,可以相同也可以不同;
优选,Q为其中:x和y可以相同或者不同,独立地选自1~8的整数;优选,x或y相同或不同,选自1~3的整数;优选,R7为直链或支链C1-4烷基;
优选,R6为-OH;
优选,n选自4~8的整数,m选自4~8的整数;
优选,所述式I化合物为下式A、B、C或D:
其中每个n1都彼此独立,可以相同或不同,每个n1选自1~8的整数,每个m1都彼此独立,可以相同或不同,每个m1选自0~8的整数;优选,每个n1选自4~8的整数,每个m1选自4~8的整数;优选,每个n1都彼此相同,每个m1都彼此相同;
其中每个n2都彼此独立,可以相同或不同,每个n2选自1~8的整数,每个m2都彼此独立,可以相同或不同,每个m2选自0~8的整数;优选,每个n2选自4~8的整数,每个m2选自4~8的整数;优选,每个n2都彼此相同,每个m2都彼此相同;
其中每个n3都彼此独立,可以相同或不同,每个n3选自1~8的整数,每个m3都彼此独立,可以相同或不同,每个m3选自0~8的整数;优选,每个n3选自4~8的整数,每个m3选自4~8的整数;优选,每个n3都彼此相同,每个m3都彼此相同;
其中每个n4都彼此独立,可以相同或不同,每个n4选自1~8的整数,每个m4都彼此独立,可以相同或不同,每个m4选自0~8的整数;优选,每个n4选自4~8的整数,每个m4选自4~8的整数;优选,每个n4都彼此相同,每个m4都彼此相同;
优选,所述式I化合物是
3.如权利要求2所述的组合或给药系统,其特征在于,所述药物制剂中,脂质纳米颗粒中包含:式I的可电离阳离子脂质分子、中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子;
优选,所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子30-60mol%的式I的脂质分子,优选32-55mol%;
优选,所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子5-30mol%的中性脂质分子,优选8-20mol%;
优选,所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子30-50mol%的胆固醇类脂质分子,优选35-50mol%;
优选,所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子0.4-10mol%的PEG化的脂质分子,优选0.5-5mol%。
4.如权利要求3所述的组合或给药系统,其特征在于,所述中性脂质分子选自磷脂酰胆碱类化合物,或/和磷脂酰乙醇胺类化合物;磷脂酰胆碱类化合物的结构如式E所示:磷脂酰乙醇胺类化合物的结构如式F所示:其中Ra、Rb、Rc、Rd独立的选自直链或支链的C1-30烷基,直链或支链的C2-30烯基,优选为直链或支链的C10-30烷基,直链或支链的C10-30烯基,优选为CH3(CH2)17CH2-、CH3(CH2)15CH2-、CH3(CH2)13CH2-、CH3(CH2)11CH2-、CH3(CH2)9CH2-、CH3(CH2)7CH2-、CH3(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-、CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)7-CH=CH-(CH2)9-;
所述胆固醇类脂质分子选自胆固醇,5-十七基间苯二酚,粪甾醇,谷甾醇,麦角甾醇,菜油甾醇,豆甾醇,菜子甾醇,番茄次碱,番茄碱,熊果酸,α-生育酚及其混合物、胆固醇半琥珀酸酯;
所述PEG化的脂质分子包含脂质部分和基于PEG的聚合物部分,表示为“脂质部分-PEG-数均分子量”,所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰胺,优选为二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二棕榈酰甘油、二硬脂酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二棕榈酰甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺;PEG的数均分子量为130~50,000。
5.如权利要求1-4任一项所述的组合或给药系统,其特征在于,所述药物制剂进一步包含活性成分,所述活性成分位于脂质纳米颗粒中;
优选,所述活性成分是核酸;
优选,所述药物制剂中脂质纳米颗粒中的脂质分子的总质量与核酸的质量之比为5-20:1。
6.如权利要求5所述的组合或给药系统,其特征在于,所述核酸是mRNA,优选所述mRNA从5’端至3’端包含5’UTR,开放阅读框,3’UTR和poly-A尾;优选,所述mRNA进一步包含5’帽结构;
优选,所述mRNA的5’UTR与SEQ ID NO:6所示的β-珠蛋白的5’UTR核苷酸序列至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或约100%同源性的核苷酸序列;
或者,优选,所述mRNA的3’UTR包含与SEQ ID NO:7所示α2-珠蛋白3’UTR的片段至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或约100%同源性的核苷酸序列;
或者,优选,所述mRNA的3’UTR包含2个首尾相连的与SEQ ID NO:7所示的α2-珠蛋白3’UTR的片段至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或约100%同源性的核苷酸序列;
或者,优选,所述mRNA的开放阅读框编码2019-nCov的S蛋白或其突变体,所述2019-nCov是病毒的野生株或突变株;优选,所述mRNA的开放阅读框含有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
7.如权利要求1-6任一项所述的组合或给药系统,其特征在于,所述无针注射装置包括注射器本体和动力源;
优选,所述无针注射装置提供至少12MPa~25MPa的注射时压强;
优选,所述无针注射装置的注射液出口直径为0.1-0.3mm;
优选,所述无针注射装置是弹簧压力型或气动压力型无针注射装置。
8.如权利要求1-7任一项所述的组合或给药系统,其特征在于,所述组合或给药系统是试剂盒或给药套装,无针注射装置和药物制剂分别独立包装存在于试剂盒或给药套装中;或者,药物制剂预灌装在无针注射装置中。
9.权利要求1-8任一项所述的组合或给药系统在制备用于无针注射给药的药物中的用途。
10.权利要求1-6任一项中所述的药物制剂在制备用于无针注射给药的药物中的用途,或者,权利要求1-6任一项中所述的药物制剂和无针注射装置联合在制备用于无针注射给药的药物中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211414849.4A CN118021754A (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 无针注射器和脂质纳米颗粒的给药系统 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211414849.4A CN118021754A (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 无针注射器和脂质纳米颗粒的给药系统 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118021754A true CN118021754A (zh) | 2024-05-14 |
Family
ID=90999258
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211414849.4A Pending CN118021754A (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 无针注射器和脂质纳米颗粒的给药系统 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN118021754A (zh) |
-
2022
- 2022-11-11 CN CN202211414849.4A patent/CN118021754A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112480217B (zh) | 基于SARS-CoV-2的S抗原蛋白的疫苗和组合物 | |
CN110974954B (zh) | 一种用于增强核酸疫苗免疫效果的脂质纳米颗粒及其制备方法 | |
CN110714015B (zh) | 一种mRNA狂犬病疫苗 | |
CN113151312A (zh) | 新型冠状病毒SARS-CoV-2 mRNA疫苗及其制备方法和应用 | |
JP2018529738A (ja) | メッセンジャーリボ核酸薬物の治療投与のための方法 | |
CN115279743A (zh) | 用于核酸递送的可离子化脂质 | |
KR20220143684A (ko) | 신종 코로나바이러스 감염에 대한 mRNA 백신의 조성물 및 방법 | |
WO2022110099A1 (en) | Coronavirus vaccines and uses thereof | |
WO2023086961A1 (en) | Sars-cov-2 spike fused to a hepatitis b surface antigen | |
KR20240022610A (ko) | 다가 인플루엔자 백신 | |
US20230256082A1 (en) | Vaccine against human-pathogenic coronaviruses | |
WO2023056872A1 (zh) | 一种脂质纳米颗粒组合物以及由其制备的药物递送系统 | |
CN114277039A (zh) | 呼吸道合胞病毒mRNA疫苗及其制备方法和应用 | |
US20230174588A1 (en) | A vaccine against sars-cov-2 and preparation thereof | |
IL292989A (en) | Nucleic acid lipid particle vaccine enveloping human papillomavirus mrna | |
CN118021754A (zh) | 无针注射器和脂质纳米颗粒的给药系统 | |
CN118059222A (zh) | 一种2019-nCoV S蛋白的mRNA脂质纳米颗粒的冻干制剂 | |
EP4212173A1 (en) | Vaccine composition for chickenpox or varicella zoster and method of using same | |
CN118105475A (zh) | 2019-nCoV delta株S蛋白突变体的mRNA脂质纳米颗粒的冻干制剂 | |
CN118059059A (zh) | 一种脂质纳米颗粒的冻干制剂 | |
CN117624381A (zh) | 一种治疗性的HPV mRNA疫苗及其应用 | |
CN118108813A (zh) | 2019-nCoV Omicron株的S蛋白突变体及其基因工程化的mRNA | |
WO2024032611A1 (zh) | 一种脂质组合物 | |
WO2024017250A1 (zh) | 一种新型冠状病毒变异株的mRNA疫苗及其应用 | |
US20230310571A1 (en) | Human metapneumovirus vaccines |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |