CN118048338A - Sam类似物、sam依赖型甲基转移酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物催化技术领域，具体公开了SAM类似物、SAM依赖型甲基转移酶突变体及其应用。该SAM类似物具有式Ⅰ结构，可以利用MTases对活性分子进行氟乙基转移反应。其中，FEt‑SeAM可有效避免FEt‑SAM的氟乙基消除问题，更适用于受体底物的氟乙基化。本发明提供的甲基转移酶突变体相比野生型有效地提高了对氟乙基转移的催化活性。本发明还构建了基于SeAH/SAH的HMT‑MTase环酶级联反应体系，成功进行了O‑、N‑、S‑、C‑等亲核试剂的氟乙基化，相比现有化学合成技术具有操作简便，反应条件温和、环保，同时氟乙基供体FEt‑SeAM/FEt‑SAM可循环再生，显著提高了原子经济性和反应效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，尤其涉及SAM类似物、SAM依赖型甲基转移酶突变体及其应用。
背景技术
以甲基化为代表的烃基化反应会提高被修饰分子的生物活性或选择性，从而提高这些化合物的靶向性、安全性甚至生理效应，这在制药和农业工业中是一种广泛使用的策略，通过调整它们的结合亲和力，溶解度和代谢谱来改善候选药物和天然产物的药理学特性。目前，烃基化越来越成为药物结构修饰与改造的重要策略之一。
氟是一种独特的化学元素，具有最大的电负性和除氢外最小的原子半径，将烃基中的氢替换成氟，几乎不会影响其大小和形状，因此不会给催化系统带来空间上的负荷，但却极大的影响了分子的物理化学性质，如极性、酸碱性、偶极距、细胞渗透性、亲脂性以及稳定性等等。由于氟原子赋予分子独特的性质，在药物化学、农用化学和材料化学中具有重要作用。尤其是在药物中引入氟元素，可以提高生物利用度、增加对靶器官的选择性、降低药物的使用剂量，这些特殊的性质促进了含氟药物的快速发展，近年来对于氟化学的研究也日趋增多。氟存在于20-30％的药品和大约30％的农用化学品中，目前高端特种材料中近一半为含氟材料。因此，设计和开发含有氟原子或含氟官能团的各种化合物具有十分重要的研究价值，在化合物分子中的特定位置选择性地引入氟原子或含氟官能团更是目前合成含氟药物和含氟活性化合物的关键。
近年来，在传统的烃基化修饰基础上，进一步加强了对氟烃基化的研究。传统的合成烃基化方法有几个缺点，其反应底物对环境不友好(如烃基卤化物)，以及缺乏强大的区域选择性、化学选择性或立体选择性，在合成过程中往往能耗高，收率低。这些化学合成中固有的缺陷，对于进一步研究广泛的烃基化尤其是氟烃基化反应带来了挑战。同时，由于氟化试剂的缺失，也对氟烃基化研究的发展带来了限制。
与化学反应相比，生物催化反应具有选择性高、环境友好、反应条件温和等优点。随着生物催化剂的不断发现和酶催化领域的快速发展，利用酶催化替代传统的化学合成逐渐成为制药领域的显著趋势。对于酶催化的烃基化研究受启发于生物体自身天然的甲基化反应，即以辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)作为甲基供体，SAM依赖的甲基转移酶(MTases)利用SAM将许多分子甲基化，包括体内小分子代谢物、脂肪、蛋白质、DNA、RNA等。反应机理涉及亲核试剂对SAM亲电甲基取代基的极性SN2攻击，并生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)作为副产物。SAM以及SAM依赖的MTases是自然界中应用最广泛的生物催化系统，MTases在自然界中普遍存在，并且在体外已证明其具有广泛的底物范围。近年来，对于SAM类似物(如将甲基替换为乙基、丙基、芳基或其他长链烃基等)的研究拓宽了这一生物催化系统的底物宽泛性和功能多样性，也为利用该策略进行氟烃基化反应带来了机遇与挑战。
由于SAM及其类似物特殊的锍鎓结构使其存在固有的化学不稳定性。在pH 7.5-10.0和37℃条件下，以三种不同的方式降解。它在硫的作用下发生外消旋，形成非对映体(R,S)。在pH值高于3时，它经历分子内环化生成5’-脱氧-5’-甲硫腺苷(MTA)和L-高丝氨酸内酯，这是SAM极其类似物分解的主要途径。当pH值高于7时，它在C5’处发生去质子化，导致腺嘌呤的消除和S-核糖基甲硫氨酸的产生。
卤化物甲基转移酶(Halide methyltransferase,HMT),是一类可以直接催化卤代烷烃试剂和SAH产生SAM及其类似物的酶，不同来源的HMT催化转移烃基的能力不同，尤其对于比甲基体积更大的非天然官能团。Chen等人研究了来自Aspergillus fungus种属的AclHMT的结构(Chen Q,et al.Mol.Catal.2023,550,113533.),并构建了三种突变体(W27F，W27F/P8L,W27F/P8L/V265W)来增强其对S-腺苷-L-乙硫氨酸(SAE)形成的催化活性。这三种突变体的活性都高于野生型的AclHMT，尤其是W27F/P8L/V265W，它催化形成SAE的活性是野生型的38.7倍。Seebeck等人发现HMT可以从氟甲基碘化物(FMeI)和SAH生成S-腺苷-S-(氟甲基)-L-同型半胱氨酸(F-SAM)(SeebeckF P,et al.Angew.Chem.Int.Ed.2021,60,27178–27183)，但并未对其进行表征和鉴定。因为在生理条件下，F-SAM非常不稳定，快速水解为L-高丝氨酸内酯和5’-脱氧-5’-氟甲硫腺苷(F-MTA)，实验发现F-MTA仍旧不稳定，会继续分解为5’-脱氧-5’-硫代腺苷，甲醛和氟化物。这和天然SAM的分解模式不完全相同，其水解为MTA的速度更快，并且在水解为MTA的基础上进一步分解，这可能是引入氟原子后造成的。为了克服F-SAM的不稳定性达到氟甲基化亲核试剂的目的，他们创新性地采用了HMT-MTases级联反应体系，利用二级甲基转移酶将原位生成的F-SAM的氟甲基转移到N-、C-、O-等亲核试剂上。这种反应策略在他们之前的研究中就报导过(SeebeckF P,etal.Nat.Catal.2019,2,696-701)，证明了C-，N-和O-特异性MTases可以与HMT结合形成酶级联，只需要催化浓度的SAM，并使用甲基碘化物(MeI)作为化学计量甲基供体。这成功地克服了SAM固有的不稳定性，并且提高了原子经济性和反应效率。
除了氟甲基外，其他含氟官能团的SAM类似物也具有重要的研究价值。Liu等人使用相应的SAM类似物将3,3-二氟烯基和几个含氟苄基转移到万古霉素上(LiuW,etal.Org.Lett.2023,25,5650-5655)，这些类似物是由工程化的人源甲硫氨酸腺苷转移酶(hMAT2A)与MTase偶联制备的。他们也尝试利用相同的策略合成氟乙基SAM(FEt-SAM)并进行氟乙基转移，但没有检测到氟乙基化的产物，只检测到了微量的羟乙基化万古霉素，这表明了利用SAM类似物实现氟乙基化具有比较大的挑战。但氟乙基是一个重要的药效官能团，含氟乙基药物是具有抗敏感、抗炎等多种活性的重要药物，用于治疗鼻炎、支气管炎、哮喘等疾病。许多含的氟乙基的药物是PET-CT的诊断药物。此外，含氟乙基的19F探针在大型膜蛋白结构动力学的核磁共振研究中发挥着重要作用。因此，对氟乙基化反应的探究具有重要的研究意义。然而，现在的研究对于酶促合成含氟官能团的活性药物类似物尚少，氟乙基作为一种重要的含氟官能团，目前还没有酶促合成相关类似物的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种SAM类似物和SAM依赖型甲基转移酶突变体，并构建基于氟烃基SAM类似物的HMT-MTase环酶级联反应体系。本发明提供的FEt-SeAM和FEt-SAM可以利用MTases对活性分子进行氟乙基转移反应。其中，FEt-SeAM能够成功地避免氟乙基消除问题，更适宜用作多种MTases酶促氟乙基化反应的氟乙基供体。进一步的，本发明通过环酶级联反应原位生成FEt-SeAM的方式，减少了自身的分解，提高了反应效率。更进一步的，使用SAM依赖型甲基转移酶突变体用于活性分子的氟乙基化修饰，相比野生型甲基转移酶及其他转移酶突变体明显提高了氟乙基化反应产物的收率。
为达到以上目的，本发明采用的技术方案如下：
SAM依赖型甲基转移酶的突变体，其包括I6V、L160A、L160V、L160I、L160S中的一种或两种以上的突变位点，其野生型的氨基酸序列如GenBank:AAA26712.1或GenBank:AAF67508.2所示。
一些实施方案中，所述突变体为洋红霉素4-O-甲基转移酶DnrK突变体，其突变位点为L160A、L160V、L160I或L160S，其野生型的氨基酸序列如GenBank:AAA26712.1所示。
一些实施方案中，所述突变体为香豆素C-甲基转移酶NovO突变体，其突变位点为I6V，其野生型的氨基酸序列如GenBank:AAF67508.2所示。
实验表明，相比野生型甲基转移酶，本发明提供的上述突变体明显提高了氟乙基化反应产物的收率。
本发明还提供了生物材料，包括：
1)编码本发明所述突变体的核酸；
2)包含1)所述核酸的表达盒；
3)包含1)所述核酸或2)所述表达盒的重组载体；
4)转染或转化3)所述重组载体的宿主。
本发明所述的突变体可以由化学合成法获得，也可通过生物合成法获得，所述生物合成法包括：构建本发明4)所示的宿主，培养，获得突变体。采用表达
本发明还提供了氟烃基SAM类似物，其具有式Ⅰ所示结构：
其中，X为硫或硒；
R为氟取代的C2～C10饱和或不饱和的直链或支链烃基。
一些实施方案中，所述C2～C10饱和或不饱和的直链或支链烃基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基等。
一些具体实施例中，所述SAM类似物具有如下任一所示结构：
本发明合成两种新的SAM类似物，FEt-SAM和FEt-SeAM，这两种化合物都可以通过化学法合成并分离得到纯品，同时也可以由HMT酶促反应得到，但是在酶反应体系条件下，发生不同程度的分解。
本发明证明了HMT生成FEt-SAM和FEt-SeAM的能力，通过使用HMT原位生成FEt-SeAM，创建了基于SeAH的HMT-MTase环酶级联反应，并成功地实现了O-，N-，S-和C-亲核试剂的酶促氟乙基化。
本发明还提供了SAM类似物作为受体底物氟烃基化的供体的应用。
所述受体底物为本领域常见的活性分子药物，包括但不限于蛋白、核酸或小分子化合物等，本发明的具体实施例中为洋红霉素、香豆素。
本发明还提供了对受体底物进行酶促氟烃基化的方法，将SAM类似物和受体底物在本发明所述突变体的催化作用下进行反应，得到氟烃基化的受体产物。
进一步的，所述SAM类似物为本发明式I所示的SAM类似物。
本发明还提供一种氟烃基化的环酶级联反应，在同一体系中同时进行步骤1～2)：
1)通过卤素甲基转移酶催化式II所示的SAH类似物与氟烃基碘代试剂进行反应生成式I所示的SAM类似物；
2)式I所示的SAM类似物与受体底物在甲基转移酶的作用下反应，获得氟烃基化的受体产物和式II所示的SAH类似物；
其中，步骤2)获得式II所示的SAH类似物循环用于步骤1)的反应；
所述氟烃基碘代试剂中的烃基为C2～从C10的直链或支链烃基。
一些优选实施方案中，所述SAM依赖型甲基转移酶为本发明所述的突变体。
本发明中，所述卤素甲基转移酶优选为卤素甲基转移酶突变体。一些具体实施例中，具体为AclHMT(W27F/P8L或者W27F/P8L/V265W)突变体。
本发明基于蛋白结构分析，对MTases进行改造，获得了五种SAM依赖型甲基转移酶突变体DnrKL160A、DnrKL160V、DnrKL160I、DnrKL160S、NovO I6V，并设计合成了新的氟乙基供体——式I所示的SAM类似物(如FEt-SAM和FEt-SeAM)。实验结果显示，本发明提供的突变体可以参与HMT-MTase环酶级联反应用于活性分子的氟乙基化修饰，明显提高了氟乙基化产物的收率，本发明提供的SAM类似物FEt-SeAM成功地避免了FEt-SAM的氟乙基消除问题，稳定性较高，满足利用MTases进行氟乙基转移反应的条件。结果表明，本发明提供的SAM类似物及SAM依赖型甲基转移酶适用于活性分子的氟乙基化修饰，与现有的化学法合成法相比，酶促反应操作简便，反应条件温和、环保，同时环酶级联反应通过循环再生氟乙基供体FEt-SeAM或FEt-SAM，大大提高了原子经济性和反应效率。为制备药物氟乙基类似物提供了新的途径。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的氟烃基SAM类似物、SAM依赖型甲基转移酶突变体及其参与的基于SeAH的HMT-Mtase环酶级联反应进行详细描述。
本发明所涉及的技术方案包括氟乙基SAM类似物的合成、基于SeAH的HMT-MTase环酶级联反应，对活性分子进行氟乙基化结构修饰、基于蛋白结构模型设计酶突变体，使其能够接受并进行氟乙基转移反应。
一.化学法和酶法合成FEt-SAM和FEt-SeAM的方法
1.化学法合成方案
将SAH/SeAH(1当量)溶于乙酸(200μL)和甲酸(200μL)中。在0℃下加入FEtI(30当量)，用铝箔包裹使其避光。将AgClO4(10当量)溶于100μL乙酸和100μL甲酸中，在0℃下加入到上述溶液中。该混合物在0℃下搅拌30分钟，然后转移到室温。室温反应12小时后，将混合物在冰浴中冷却至0℃，然后加入与初始反应相同体积的FEtI(30当量)，并按相同方式补加AgClO4(10当量)。0℃搅拌30min后，转至室温继续反应12h，再次补充加入FEtI和AgClO4，FEtI和AgClO4共补加三次。反应溶液用提前预冷的0.1％甲酸水溶液淬灭，离心过滤去除AgI沉淀。用等体积的预冷无水乙醚萃取反应液，去除反应体系中过量的FEtI。利用旋蒸除去与水溶液混溶的少量无水乙醚后，利用制备型HPLC在CH3CN/H2O中进行纯化，收集纯化的样品经冷冻真空干燥后得到白色粉末状固体。
反应式如下：
2.酶法合成方案
本发明还构建了AclHMT(W27F/P8L,W27F/P8L/V265W)突变体，经过实验比较，这两种突变体催化氟乙基的活性明显高于野生型AclHMT，尤其是W27F/P8L/V265W。将纯化的AclHMT(W27F/P8L/V265W)(终浓度200μM)，SAH/SeAH(终浓度1.0mM)，FEtI(终浓度2.5mM)充分混合于50mM PBS(pH7.6)的溶液中，30℃水浴反应1h。反应结束后向反应液中加入等体积10％ TFA用于淬灭反应。淬灭后的反应样品用高速冷冻离心机在4℃、12000rpm条件下离心30min，将上清液用针孔过滤器对样品进行过滤，滤液经分析型HPLC在CH3CN/H2O中进行分析检测。
反应式如下：
二.基于SeAH的HMT-MTase环酶级联反应
由于酶促合成的FEt-SAM和FEt-SeAM在反应体系中存在不同程度的分解，但Se原子的引入成功避免了氟乙基的消去问题，并且由于Se-C键较弱，SAM的硒类似物(SeAM)是比SAM更好的烃基供体，因此FEt-SeAM反应活性更强。于是采用基于SeAH的HMT-MTase环酶级联反应，以达到对活性分子氟乙基化结构修饰的目的。
将纯化的AclHMT(W27F/P8L/V265W)(终浓度40μM)，MTases(终浓度80μM)，SeAH(终浓度100μM)，FEtI(终浓度2.5mM)，受体底物(终浓度1.0mM)于50mM PBS(pH 7.6)或其他缓冲液的溶液中，30℃水浴反应。反应结束后向反应液中加入等体积10％ TFA用于淬灭反应。淬灭后的反应样品用高速冷冻离心机在4℃、12000rpm下离心30min，取上清液经分析型HPLC在CH3CN/H2O中进行分析检测。
MT-MTase环酶级联反应的通式如下：
三、基于蛋白结构模型设计酶突变体
本发明在PDB蛋白结构数据库搜索需要查找的MTases，其结构中一般包含辅因子SAH或SAM，可以辅助查找活性口袋的位置。分析活性口袋周围可能影响反应活性的关键氨基酸残基，尤其是SAM甲基附近的残基将其突变为结构比天然氨基酸更小的残基，例如丙氨酸。利用Autodock-Vina将突变后的蛋白结构与FEt-SeAM进行分子对接，验证该突变与野生型相比对于引入较大的氟乙基具有更好的空间结构。采用上述的HMT-MTase环酶级联反应方案，验证突变体的反应活性。
在优选的具体实施方式中，HMT优选用AclHMT，MTases优选用MppJ、DnrK、NovO。aclhmt基因来源种属为Aspergillus clavatus，mppj基因来源种属为Streptomyceshygroscopicus，dnrk基因来源种属为Streptomyces peucetius，novo基因来源种属为Streptomyces niveus。aclhmt、mppj、dnrk、novo基因由生物公司合成，并经BL21(DE3)密码子优化后构建在带有Kanamycin抗性基因的pET28a(+)载体上，最终得到pET28a(+)-AclHMT，pET28a(+)-MppJ，pET28a(+)-DnrK和pET28a(+)-NovO质粒。DnrK采用其最佳突变体L160A，NovO采用其最佳突变体I6V。AclHMT的表达纯化参照文献(Hammer S C,etal.Angew.Chem.Int.Ed.2021,60,5554–5560)所述。MppJ的表达纯化参照文献(LiT L,etal.Chembiochem.2009,10,2480-2487)所述。DnrK(L160A)的表达纯化参照文献(Thorson JS,etal.ACS Chem.Biol.2016,11,2484–2491)所述。NovO(I6V)的表达纯化参照文献(Burley G A,et al.Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,17583-17588)所述。
为了深入地研究并成功地进行氟乙基化反应，本发明通过化学法合成了两种氟乙基SAM类似物，FEt-SAM和Se代的FEt-SAM(FEt-SeAM)，并对它们的稳定性进行探究，以验证是否满足利用MTases进行氟乙基转移反应的条件。研究发现，引入Se原子后很好地解决了由于S原子电负性造成的F原子与去质子化H共同消去的问题。同时，本发明证明HMT可以催化氟乙基碘代试剂(FEtI)和SAH或Se代的SAH(SeAH)产生FEt-SAM和FEt-SeAM。同时，本发明还开发了基于SeAH的HMT-MTase环酶级联反应，可以在催化量的原料SeAH存在下实现FEt-SeAM类似物的循环再生以及对活性分子高效地氟乙基化反应。此外，本发明通过对MTases的理性设计改造，使得更多的MTases可以适用于环酶级联反应，开发了一种可以广泛适用的氟乙基化反应的方案，为制备药物氟乙基类似物提供了新的途径。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：FEt-SAM的化学法合成
称取SAH(10mg,26μmol)于10ml圆底烧瓶，加入乙酸(200μL)和甲酸(200μL)使其搅拌溶解，密封，冰浴下搅拌脱气并充换氮气(N2)。在0℃下用注射器滴加FEtI(68μL,780μmol)，用铝箔包裹反应瓶使其避光。称取AgClO4(54mg,260μmol)溶于100μL乙酸和100μL甲酸中，在0℃下用注射器滴加到上述溶液中。该混合物在0℃下搅拌30分钟，然后转移到室温。室温反应12小时后，将混合物在冰浴中冷却至0℃，然后加入与初始反应相同体积的FEtI(68μL,780μmol)，并按与之前相同方式补加AgClO4(54mg,260μmol)。0℃搅拌30min后，转至室温继续反应12h，再次补充加入FEtI和AgClO4，FEtI和AgClO4共补加三次，每次补加后继续在室温反应12h。反应结束后，反应溶液用提前预冷的0.1％甲酸水溶液淬灭，离心过滤去除AgI沉淀。用等体积的预冷无水乙醚萃取反应液三次，去除反应体系中过量的FEtI。利用旋蒸除去与水溶液混溶的少量无水乙醚后，利用制备型HPLC经反相C18柱色谱SHIMADZUC18(250mm×4.6mm,5μm)进行纯化，流动相A为H2O+1‰TFA，流动性B为CH3CN+1‰TFA。洗脱方式梯度洗脱，流速为3mL/min，进样量为5mL，检测波长为254nm与215nm双波长检测，洗脱程序为0-6min0％B,6-30min 0-48％B,30-33min 48-90％B,33-39min 90％B,39-39.01min90％-0％B,39.01-45min 0％B。收集纯化的样品经冷冻真空干燥后得到白色粉末状固体(3.1mg,产率28％)。目标产物1H NMR(600MHz,D2O)δ8.39(d,J＝1.2Hz,2H),6.12(s,1H),4.93(s,1H),4.85(s,2H),4.63–4.48(m,2H),4.15–3.98(m,3H),3.88(d,J＝27.1Hz,2H),3.76–3.61(m,2H),2.52–2.30(m,2H).19F NMR(564MHz,D2O)δ-217.15-–-217.54(m).LCMS(ESI)calcd.for C16H24FN6O5S+[M]+431.1507,obsd.431.1436。
反应式如下：
实施例2：FEt-SeAM的化学法合成
根据化学合成FEt-SAM的相同的方法和步骤，用SeAH合成FEt-SeAM。利用制备型HPLC经反相C18柱色谱SHIMADZU C18(250mm×4.6mm,5μm)进行纯化，流动相A为H2O+1‰TFA，流动性B为CH3CN+1‰TFA。洗脱方式梯度洗脱，流速为3mL/min，进样量为5mL，检测波长为254nm与215nm双波长检测，洗脱程序为0-6min 0％B,6-30min 0-48％B,30-33min48-90％B,33-39min 90％B,39-39.01min 90％-0％B,39.01-45min 0％B。收集纯化的样品经冷冻真空干燥后得到白色粉末状固体(2.3mg,产率19％)。LCMS(ESI)calcd.forC16H24FN6O5Se+[M]+479.0952,obsd.479.1049.
反应式如下：
实施例3：AclHMT(W27F/P8L/V265W)和MppJ级联催化产生氟乙基化苯丙酮酸(FEt-Ppy)
将纯化的AclHMT(W27F/P8L/V265W)(终浓度40μM)，苯丙酮酸C-甲基转移酶MppJ(终浓度80μM)，SeAH(终浓度100μM)，FEtI(终浓度2.5mM)，MgCl2(终浓度4mM)，DTT(终浓度2mM)，苯丙酮酸(Ppy，终浓度1.0mM)于100μl含有50mM HEPES(pH 8.0)的溶液中，30℃水浴反应。反应结束后向反应液中加入等体积10％ TFA用于淬灭反应。淬灭后的反应样品用高速冷冻离心机在4℃、12000rpm下离心30min，取上清液在分析型HPLC经反相C18色谱柱SHIMADZU C18(150mm×4.6mm,2.5μm)进行分析。同反应体系下扩大规模用于制备目标产物，用制备型HPLC经反相C18柱色谱SHIMADZU C18(250mm×4.6mm,5μm)进行纯化，流动相A为H2O+1‰TFA，流动性B为CH3CN+1‰TFA。洗脱方式梯度洗脱，流速为3mL/min，进样量为5mL，检测波长为254nm与280nm双波长检测，洗脱程序为0-3min0％B,3-21min 0-15％B,21-35min 15-35％B,35-50min 75-90％B,50-50.01min 90-100％ B,50.01-53min 100％ B,53-53.01min 100-0％ B,53.01-60min 0％B。收集纯化的样品经冷冻真空干燥后得到产物(5mg,产率60％)。1H NMR(600MHz,CD3OD)δ7.38–7.16(m,5H),4.64(t,J＝7.5Hz,1H),4.35-–4.00(m,1H),3.28-–3.16(m,1H),2.59–2.33(m,1H),2.25-1.83(m,1H).19F NMR(564MHz,CD3OD)δ-221.35(tdd,J＝47.9,32.5,15.0Hz).19F NMR(564MHz,CD3OD)δ-222.04(tdd,J＝47.8,30.3,19.8Hz).LCMS(ESI)calcd.for C11H11FO3[M-H]1-209.0619,obsd.209.0722。从19F NMR可以看出，得到的产物是两种异构体的混合物，其比例为2:1，说明MppJ对于接受氟乙基生成产物的立体选择性为67％。
反应式如下：
实施例4AclHMT(W27F/P8L/V265W)和DnrK突变体级联催化产生氟乙基化洋红霉素
在Dnrk(PDB:7phd)的SAM结合晶体结构中，在SAM甲基附近有一个保守的关键氨基酸L160，L160与甲基之间的距离为由于氟乙基比甲基大，因此必须增加活性袋的空间以容纳氟乙基。因此，本实施例构建了L160A/V/I/S 4个突变体，并对其活性进行了测试。所有四个突变体都比野生型DnrK具有更高的活性，L160A突变体表现出最好的活性。
将纯化的AclHMT(W27F/P8L/V265W)(终浓度40μM)，洋红霉素4-O-甲基转移酶变体DnrK(L160A)(终浓度80μM)，SeAH(终浓度100μM)，FEtI(终浓度2.5mM)，洋红霉素(终浓度1.0mM)于100μl含有50mMTris-HCl(pH8.0)的溶液中，30℃水浴反应。反应结束后向反应液中加入等体积10％TFA用于淬灭反应。淬灭后的反应样品用高速冷冻离心机在4℃、12000rpm下离心30min，取上清液在分析型HPLC经反相C18色谱柱SHIMADZU C18(150mm×4.6mm,2.5μm)进行分析。同反应体系下扩大规模用于制备目标产物，用制备型HPLC经反相C18柱色谱SHIMADZU C18(250mm×4.6mm,5μm)进行纯化，流动相A为H2O+1‰TFA，流动性B为CH3CN+1‰TFA。洗脱方式梯度洗脱，流速为3mL/min，进样量为5mL，检测波长为215nm与254nm双波长检测，洗脱程序为0-3min 0％B,3-20min 0-14％B,20-29min 14-56％B,29-48min 56-75％B,48-48.01min 75％-95％B,48.01-51min 95％B,51-51.01min 95-0％B,51.01-59min 0％B。收集纯化的样品经冷冻真空干燥后得到洋红色固体产物(7.1mg,产率84％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ7.58(s,1H),7.33(s,2H),5.40(s,1H),4.93(s,1H),4.72(s,1H),4.35(d,J＝30.0Hz,2H),4.23(q,J＝6.6Hz,1H),3.81(d,J＝2.8Hz,1H),3.71–3.49(m,2H),2.80(d,J＝18.1Hz,1H),2.61(d,J＝18.2Hz,1H),2.41(s,3H),2.19(d,J＝14.6Hz,1H),2.06(s,1H),1.96(s,2H),1.27(d,J＝6.4Hz,3H).19F NMR(564MHz,D2O)δ-221.81(tt,J＝47.4,30.0Hz).13C NMR(100MHz,D2O)δ215.05,185.75,162.79,159.33,155.50,153.92,136.42,133.82,133.65,120.52,119.73,119.15,110.42,110.30,98.89,82.22(d,1JCF＝166.0Hz),75.94,71.99,68.71(d,JCF＝17.1Hz),66.85,66.15,62.40,46.64,34.78,31.33,27.55,24.18,15.59.LCMS(ESI)calcd.for C28H30FNO10[M+H]1+560.1927,obsd.560.1903。
反应式如下：
按照上述方法采用洋红霉素4-O-甲基转移酶变体DnrKL160V、L160I、L160S三个突变体进行反应，获得的洋红色固体产物(氟乙基化洋红霉素)产率依次为20％、7％、45％。
实施例5：AclHMT(W27F/P8L/V265W)和NovO(I6V)级联催化产生氟乙基化香豆素
当野生型香豆素C-甲基转移酶NovO与HMT级联发生氟乙基转移反应时，只有少量转化为氟乙基化的产物和F与质子消去得到的乙烯基副产物。
虽然NovO没有与SAM结合的晶体结构，但在NovO与SAH结合的结构的活性位点发现了一个保守的异亮氨酸残基(I6)(PDB:5mgz.1)。NovO的I6对应于Dnrk中的Leu残基，可能与SAM的甲基相互作用。因此，可以用更小的氨基酸取代异亮氨酸残基，构建了三个NovO突变体I6A/V/S。结果表明，尽管I6A和I6S突变体都失去了接受氟乙基生成产物的活性，无目标产物生成，但I6V突变体显著提高了氟乙基化反应的活性。
将纯化的AclHMT(W27F/P8L/V265W)(终浓度40μM)，香豆素C-甲基转移酶NovO变体NovO(I6V)(终浓度80μM)，SeAH(终浓度100μM)，FEtI(终浓度2.5mM)，香豆素(终浓度1.0mM)于100μl含有50mMPBS(pH 6.5)的溶液中，30℃水浴反应。反应结束后向反应液中加入等体积10％ TFA用于淬灭反应，将淬灭的反应液真空冷冻干燥，然后用20％DMSO溶液进行复溶。样品用高速冷冻离心机在4℃、12000rpm下离心30min，取上清液在分析型HPLC经反相C18色谱柱SHIMADZU C18(150mm×4.6mm,2.5μm)进行分析。同反应体系下扩大规模用于制备目标产物，用制备型HPLC经反相C18柱色谱SHIMADZU C18(250mm×4.6mm,5μm)进行纯化，流动相A为H2O+1‰TFA，流动性B为CH3CN+1‰TFA。洗脱方式梯度洗脱，流速为3mL/min，进样量为5mL，检测波长为254nm与310nm双波长检测，洗脱程序为0-3min 0％ B,3-21min 0-15％ B,21-35min 15-35％ B,35-50min 75-90％B,50-50.01min 90-100％ B,50.01-53min 100％B,53-53.01min 100-0％ B,53.01-60min 0％ B。收集纯化的样品经冷冻真空干燥后得到白色固体产物(3.8mg,产率28％)。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.79(s,1H),10.69(s,1H),9.43(s,1H),8.01(d,J＝7.0Hz,2H),7.66(d,J＝8.7Hz,1H),7.59(d,J＝14.8Hz,1H),7.52(t,J＝7.7Hz,2H),6.92(d,J＝8.7Hz,1H),4.64(t,J＝6.8Hz,1H),4.56(t,J＝6.8Hz,1H),3.15(dt,J＝20.4,6.8Hz,2H).19F NMR(564MHz,DMSO-d6)δ-213.90(tt,J＝47.7,31.6Hz).LCMS(ESI)calcd.for C18H14FNO5[M+H]1+344.0929,obsd.344.0902。
反应式如下：
实施例6以SAH为底物，AclHMT(W27F/P8L/V265W)和烟酰胺N甲基转移酶NNMT级联催化产生氟乙基化烟酰胺
将纯化的AclHMT(W27F/P8L/V265W)(终浓度40μM)，烟酰胺N-甲基转移酶NNMT(终浓度80μM)，SAH(终浓度100μM)，FEtI(终浓度2.5mM)，烟酰胺(NCA，终浓度1.0mM)于100μl含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)的溶液中，30℃水浴反应。反应结束后向反应液中加入等体积10％ TFA用于淬灭反应。淬灭后的反应样品用高速冷冻离心机在4℃、12000rpm下离心30min，取上清液在分析型HPLC经反相C18色谱柱SHIMADZU C18(150mm×4.6mm,2.5μm)进行分析。结果表明，在该级联反应体系下有18％的底物转化为氟乙基化烟酰胺产物。1H NMR(600MHz,D2O)δ9.40(s,1H),9.11(d,J＝5.8Hz,1H),9.00(d,J＝8.2Hz,1H),8.29(t,J＝7.3Hz,1H),5.16–4.97(m,4H).19F NMR(564MHz,D2O)δ-223.69(tt,J＝46.3,26.9Hz).13CNMR(100MHz,D2O)δ165.67,147.08,144.94,144.66,134.03,128.51,81.59(d,1JCF＝170.3Hz),61.93(d,JCF＝18.9Hz).LCMS(ESI)calcd.for C8H10FN2O+[M]+169.0772,obsd.169.0838。
反应式如下：
对比例1
按照实施例4的方法，使用野生型的洋红霉素4-O-甲基转移酶DnrK进行环酶级联反应，结果发现，催化产生氟乙基化产物的活性非常弱，环酶级联反应HPLC几乎看不到明显产物峰，其氟乙基化洋红霉素的产率不足1％。
对比例2
按照实施例5的方法，使用野生型香豆素C-甲基转移酶NovO进行环酶级联反应，结果发现，白色固体产物即氟乙基化香豆素的产率仅为8％。
以上结果表明，本发明提供的基于SeAH/SAH的HMT-MTase环酶级联反应，可以在催化量的原料SeAH/SAH存在下实现FEt-SeAM/FEt-SAM类似物的循环再生以及对活性分子的氟乙基化反应，其中，本发明使用Se代替S获得的FEt-SeAM很好的避免了FEt-SAM的氟乙基消除产生乙烯基SAM的问题，因此FEt-SeAM在底物的氟乙基化反应中表现出了更好的活性。进一步地，相比野生型甲基转移酶和其他的突变体，利用本发明提供的甲基转移酶突变体能够明显提高产物的收率，更高效地实现了氟乙基化反应。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.SAM依赖型甲基转移酶的突变体，其特征在于，其包括I6V、L160A、L160V、L160I、L160S中的一种或两种以上的突变位点，其野生型的氨基酸序列如GenBank:AAA26712.1或GenBank:AAF67508.2所示。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的突变位点为L160A、L160V、L160I或L160S，其野生型的氨基酸序列如GenBank:AAA26712.1所示。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的突变位点为I6V，其野生型的氨基酸序列如GenBank:AAF67508.2所示。
4.生物材料，其特征在于，包括：
1)编码权利要求1～3任一项所述突变体的核酸；
2)包含1)所述核酸的表达盒；
3)包含1)所述核酸或2)所示表达盒的重组载体；
4)转染或转化3)所述重组载体的宿主。
5.氟烃基SAM类似物，其特征在于，其具有式Ⅰ所示结构：
其中，X为硫或硒；
R为氟取代的C2～C10饱和或不饱和的直链或支链烃基。
6.根据权利要求5所述的氟烃基SAM类似物，其特征在于，所述C2～C10饱和或不饱和的直链或支链烃基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。
7.根据权利要求5所述的氟烃基SAM类似物，其特征在于，具有如下任一所示结构：
8.权利要求5～7任一项所述的SAM类似物作为受体底物氟烃基化的供体的应用。
9.对受体底物进行酶促氟烃基化的方法，其特征在于，将SAM类似物和受体底物在权利要求1～3任一项所述的突变体的催化作用下进行反应，得到氟烃基化的受体产物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述SAM类似物为权利要求4～7任一项所述的SAM类似物。
11.一种氟烃基化的环酶级联反应，其特征在于，在同一体系中同时进行步骤1～2)：
1)通过卤素甲基转移酶催化式II所示的SAH类似物与氟烃基试剂进行反应生成式I所示的氟烃基SAM类似物；
式II；其中，X为硫或硒；
2)式I所示的氟烃基SAM类似物与受体底物在甲基转移酶的作用下反应，获得氟烃基化的受体产物和式II所示的SAH类似物；
其中，将步骤2)获得的式II所示的氟烃基SAH类似物循环用于步骤1)的反应；
所述氟烃基试剂中的烃基为C2～C10的直链或支链烃基。
12.根据权利要求11所述的环酶级联反应，其特征在于，所述SAM依赖型甲基转移酶为权利要求1～3任一项所述的突变体。
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