CN118048328A - 双酶系统联合催化产生r型原小檗碱型化合物的方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了双酶系统联合催化产生R型原小檗碱型化合物的方法。本发明的发明人通过基因筛选、异源表达、酶促反应技术手段筛选得到一个高度立体选择性的可逆酶系统，该系统包括CySDR1和CySDR2两个短链脱氢酶，可逆介导小檗碱型化合物与R型原小檗碱型化合物的相互转化，即催化产生R型原小檗碱型化合物。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及双酶系统联合催化产生R型原小檗碱型化合物的方法。
背景技术
罂粟科紫堇属延胡索(Corydalis yanhusuo)的干燥块茎，具有活血、行气、止痛的功效，用于治疗胸胁、脘腹疼痛、胸痹心痛、经闭痛经、产后瘀阻、跌扑肿痛。延胡索的主要次生代谢物及有效成分为生物碱类化合物，目前从延胡索中鉴定的BIA类生物碱已超过60种，包括原小檗碱类、小檗碱类、原阿片碱类、阿朴啡类、1-苄基异喹啉类、苯骈菲啶类及其他类。
在生物合成途径上，原小檗碱型化合物的生物合成途径获得较大进展。首先由去甲乌药碱合酶NCS催化多巴胺和4-HPAA两分子间形成C-C键生成(S)-Norcoclaurine，再经过甲基转移酶和P450酶生成重要中间体(S)-Reticuline，生物黄素氧化酶BBE催化(S)-Reticuline形成(S)-Scoulerine。由于BBE有严格的底物专一性，对R型底物几乎不能催化，因此目前已知的生物合成途径所产生的原小檗碱型化合物均为S型(C14位构型)。而延胡索等紫堇属植物中普遍存在着S型和R型原小檗碱型化合物，如延胡索甲素即为R型原小檗碱型化合物。关于原小檗碱型化合物R构型的形成从1990s便已引起国际关注。1991年，德国慕尼黑大学的W.Bauer和M.H.Zenk通过体内和体外实验证明了紫堇属植物Corydalis cava中存在一个高度立体选择性的可逆酶系统，证明小檗碱型与原小檗碱型化合物的转化是R构型产生的原因，也是延胡索甲素化合物生物合成途径中的重要步骤，然而该可逆系统涉及的基因一直尚未表征。
发明内容
本发明的目的是生产R型原小檗碱型化合物。
本发明首先保护CySDRs蛋白组合，可为CySDRs蛋白组合一、CySDRs蛋白组合二、CySDRs蛋白组合三或CySDRs蛋白组合四。
CySDRs蛋白组合一可由CySDR2蛋白和CySDR1蛋白组成。
CySDRs蛋白组合二可由CySDR2蛋白和CySDR3蛋白组成。
CySDRs蛋白组合三可由CySDR2蛋白和CySDR4蛋白组成。
CySDRs蛋白组合四可由CySDR2蛋白和CySDR5蛋白组成。
所述CySDR1蛋白可为(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)将SEQ ID NO:6所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与催化小檗碱型化合物相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO:6由269个氨基酸残基组成。
为了使(a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:6所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tagII | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述(a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述(a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述CySDR2蛋白可为(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的蛋白质；
(b2)在(b1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(b3)将SEQ ID NO:7所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与催化二氢小檗碱型化合物相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO:7由275个氨基酸残基组成。
为了使(b1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:7所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
上述(b3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述(b3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述(b3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述CySDR3蛋白可为(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的蛋白质；
(c2)在(c1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(c3)将SEQ ID NO:8所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与催化小檗碱型化合物相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO:8由301个氨基酸残基组成。
为了使(b1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:8所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
上述(c3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述(c3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述(c3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述CySDR4蛋白可为(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的蛋白质；
(d2)在(d1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(d3)将SEQ ID NO:9所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与催化小檗碱型化合物相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO:9由271个氨基酸残基组成。
为了使(d1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:9所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
上述(d3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述(d3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述(d3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述CySDR5蛋白可为(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的蛋白质；
(e2)在(e1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(e3)将SEQ ID NO:10所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与催化小檗碱型化合物相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO:10由270个氨基酸残基组成。
为了使(e1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:10所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
上述(e3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述(e3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述(e3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:5所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还保护编码上述任一所述CySDRs蛋白组合的核酸分子。
所述编码上述任一所述CySDR1蛋白的核酸分子可为如下(A1)或(A2)或(A3)的DNA分子：
(A1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(A2)在严格条件下与(A1)限定的DNA分子杂交且编码上述任一所述CySDR1蛋白的DNA分子；
(A3)与(A1)或(A2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码上述任一所述CySDR1蛋白的DNA分子。
所述编码上述任一所述CySDR2蛋白的核酸分子可为如下(B1)或(B2)或(B3)的DNA分子：
(B1)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码上述任一所述CySDR2蛋白的DNA分子；
(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码上述任一所述CySDR2蛋白的DNA分子。
所述编码上述任一所述CySDR3蛋白的核酸分子可为如下(C1)或(C2)或(C3)的DNA分子：
(C1)核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA分子；
(C2)在严格条件下与(C1)限定的DNA分子杂交且编码上述任一所述CySDR3蛋白的DNA分子；
(C3)与(C1)或(C2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码上述任一所述CySDR3蛋白的DNA分子。
所述编码上述任一所述CySDR4蛋白的核酸分子可为如下(D1)或(D2)或(D3)的DNA分子：
(D1)核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的DNA分子；
(D2)在严格条件下与(D1)限定的DNA分子杂交且编码上述任一所述CySDR4蛋白的DNA分子；
(D3)与(D1)或(D2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码上述任一所述CySDR4蛋白的DNA分子。
所述编码上述任一所述CySDR5蛋白的核酸分子可为如下(E1)或(E2)或(E3)的DNA分子：
(E1)核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的DNA分子；
(E2)在严格条件下与(E1)限定的DNA分子杂交且编码上述任一所述CySDR5蛋白的DNA分子；
(E3)与(E1)或(E2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码上述任一所述CySDR5蛋白的DNA分子。
上述任一所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO:1由810个核苷酸组成，SEQ ID NO:2由828个核苷酸组成，SEQ IDNO:3由906个核苷酸组成，SEQ ID NO:4由816个核苷酸组成，SEQ ID NO:5由813个核苷酸组成。SEQ ID NO:1的核苷酸编码SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。SEQ ID NO:2的核苷酸编码SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。SEQ ID NO:3的核苷酸编码SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。SEQ ID NO:4的核苷酸编码SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。SEQ ID NO:5的核苷酸编码SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明编码蛋白质(上述任一所述CySDR1蛋白、上述任一所述CySDR2蛋白、上述任一所述CySDR3蛋白、上述任一所述CySDR4蛋白或上述任一所述CySDR5蛋白)的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明所述蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码蛋白质(上述任一所述CySDR1蛋白、上述任一所述CySDR2蛋白、上述任一所述CySDR3蛋白、上述任一所述CySDR4蛋白或上述任一所述CySDR5蛋白)的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
本发明还保护含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
所述重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO:1所示的CySDR1基因，得到的重组质粒。所述重组载体具体可为实施例提及的重组质粒pET32a-CySDR1。
所述重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO:2所示的CySDR2基因，得到的重组质粒。所述重组载体具体可为实施例提及的重组质粒pET32a-CySDR2。
所述重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO:3所示的CySDR3基因，得到的重组质粒。所述重组载体具体可为实施例提及的重组质粒pET32a-CySDR3。
所述重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO:4所示的CySDR4基因，得到的重组质粒。所述重组载体具体可为实施例提及的重组质粒pET32a-CySDR4。
所述重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO:5所示的CySDR5基因，得到的重组质粒。所述重组载体具体可为实施例提及的重组质粒pET32a-CySDR5。
所述重组微生物可为将上述任一所述重组载体导入出发微生物，得到重组微生物。所述出发微生物为大肠杆菌或农杆菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述重组微生物具体可为将重组质粒pET32a-CySDR1、重组质粒pET32a-CySDR2、重组质粒pET32a-CySDR3、重组质粒pET32a-CySDR4或重组质粒pET32a-CySDR5导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到的重组大肠杆菌。
本发明还保护上述任一所述CySDRs蛋白组合一或编码上述任一所述CySDRs蛋白组合一的核酸分子在催化小檗碱型化合物与R型原小檗碱型化合物相互转化中的应用。
本发明还保护上述任一所述CySDRs蛋白组合二、上述任一所述CySDRs蛋白组合三或上述任一所述CySDRs蛋白组合四或编码上述任一所述CySDRs蛋白组合二、上述任一所述CySDRs蛋白组合三或上述任一所述CySDRs蛋白组合四的核酸分子在催化小檗碱型化合物还原生成R型原小檗碱型化合物中的应用。
本发明还保护上述任一所述CySDR2蛋白或编码上述任一所述CySDR2蛋白的核酸分子在催化二氢小檗碱型化合物生成R型原小檗碱型化合物中的应用。
本发明还保护上述任一所述CySDR2蛋白或编码上述任一所述述CySDR2蛋白的核酸分子在催化R型原小檗碱型化合物生成二氢小檗碱型化合物或小檗碱型化合物中的应用。
本发明还保护上述任一所述CySDR1蛋白或编码上述任一所述CySDR1蛋白的核酸分子在催化小檗碱型化合物还原生成二氢小檗碱型化合物中的应用。
上述任一所述的应用中，所述小檗碱型化合物可为巴马汀。
上述任一所述的应用中，所述R型原小檗碱型化合物可为R型延胡索乙素。
上述任一所述的应用中，所述二氢小檗碱型化合物为二氢巴马汀。
本发明的发明人通过基因筛选、异源表达、酶促反应技术手段筛选得到一个高度立体选择性的可逆酶系统，该系统涉及CySDR1和CySDR2两个短链脱氢酶，可逆介导小檗碱型化合物与R型原小檗碱型化合物的相互转化(如巴马汀与R型延胡索乙素的相互转化)。具体的，CySDR1催化巴马汀还原生成二氢巴马汀，CySDR2催化二氢巴马汀生成R型延胡索乙素；CySDR2可进一步催化R型延胡索乙素可逆反应氧化生成巴马汀。此外，从延胡索中克隆得到的CySDR3、CySDR4和CySDR5也参与到该氧化还原过程中，即CySDR3，CySDR4、CySDR5分别与CySDR2组合可催化巴马汀还原生成R型延胡索乙素。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1的实验结果。
图2为CyPalR1粗酶和CyPalR2粗酶以巴马汀Palmatine为底物的酶促反应产物的UPLC-TOF分析。
图3为CyPalR1粗酶和CyPalR2粗酶以巴马汀Palmatine为底物的酶促反应产物的HPLC构型分析。
图4为CyPalR2粗酶以二氢巴马汀Dihydropalmatine为底物的酶促反应产物的UPLC-TOF分析。
图5为CyPalR2粗酶以R型延胡索乙素(R-tetrahydropalmatine)为底物的酶促氧化反应产物UPLC-TOF分析。
图6为CyPalR1粗酶和CyPalR2粗酶以巴马汀Palmatine为底物的酶促反应时间变化分析。
图7为CyPalR2粗酶分别与CySDR3、CySDR4和CySDR5的混合粗酶以巴马汀Palmatine为底物的酶促反应产物UPLC-TOF分析。
图8为CySDR1蛋白和CySDR2蛋白构成双酶系统联合催化巴马汀与R型延胡索乙素的相互转化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的延胡索来源于江西千山农林开发有限公司的中药材种植基地。
实施例1、CySDRs蛋白的克隆、表达与纯化
一、CySDRs蛋白及其编码基因(即CySDRs基因)的克隆
本发明的发明人提取延胡索叶和块茎的RNA，之后送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行高通量测序，筛选高表达的短链脱氢酶的基因。最终，获得了CySDR1基因、CySDR2基因、CySDR3基因、CySDR4基因和CySDR5基因。
CySDR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。CySDR1基因编码SEQ ID NO:6所示的CySDR1蛋白。
CySDR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。CySDR2基因编码SEQ ID NO:7所示的CySDR2蛋白。
CySDR3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。CySDR3基因编码SEQ ID NO:8所示的CySDR3蛋白。
CySDR4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。CySDR4基因编码SEQ ID NO:9所示的CySDR4蛋白。
CySDR5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。CySDR5基因编码SEQ ID NO:10所示的CySDR5蛋白。
CySDR1基因、CySDR2基因、CySDR3基因、CySDR4基因和CySDR5基因总称为CySDRs基因。
CySDR1蛋白、CySDR2蛋白、CySDR3蛋白、CySDR4蛋白和CySDR5蛋白总称为CySDRs蛋白。
二、重组质粒的构建
1、重组质粒pET32a-CySDR1的构建
(1)提取延胡索叶的RNA，之后反转录，得到延胡索叶的cDNA。
(2)以延胡索叶的cDNA为模板，采用引物F1：5’
-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCAACCTGCACTCA-3’和引物R1：5’
-ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTCAGAAGGTACTAGTGATCG-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
进行PCR扩增的DNA聚合酶为PrimeStar HS DNA polymerase(Takara，R010B)。
反应程序为：95℃变性5min；98℃变性10sec，55℃退火15sec，72℃延伸2min，30个循环；70℃延伸10min。
(3)采用Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(TransGen，CU201)将步骤(2)回收的PCR扩增产物和原核表达载体pET32a(索莱宝公司，货号P3100)进行无缝拼接，得到重组质粒pET32a-CySDR1。
将重组质粒pET32a-CySDR1进行测序。测序结果表明，重组质粒pET32a-CySDR1含有SEQ ID NO：1所示的DNA分子。重组质粒pET32a-CySDR1表达CySDR1蛋白，CySDR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2、重组质粒pET32a-CySDR2的构建
按照上述步骤1，将引物F1替换为引物F2：5’-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCAACCATGGTGAAGAAGAC-3’，引物R1替换为引物R2：5’-ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTCAAAAACCTGCGGGAAATTG-3’，其它步骤均不变，得到重组质粒pET32a-CySDR2。
将重组质粒pET32a-CySDR2进行测序。测序结果表明，重组质粒pET32a-CySDR2含有SEQ ID NO：2所示的DNA分子。重组质粒pET32a-CySDR2表达CySDR2蛋白，CySDR2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
3、重组质粒pET32a-CySDR3的构建
按照上述步骤1，将引物F1替换为引物F3：5’-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGAATCTAAGTACCTTGAATC-3’，引物R1替换为引物R3：5’-ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTCAGAAGCGTCTAGTGGC-3’，其它步骤均不变，得到重组质粒pET32a-CySDR3。
将重组质粒pET32a-CySDR3进行测序。测序结果表明，重组质粒pET32a-CySDR3含有SEQ ID NO：3所示的DNA分子。重组质粒pET32a-CySDR3表达CySDR3蛋白，CySDR3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
4、重组质粒pET32a-CySDR4的构建
按照上述步骤1，将引物F1替换为引物F4：5’-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCAACCTGCTGCACCG-3’，引物R1替换为引物R4：5’-ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTAGAAAGTAGCAGTGATTGGGG-3’，其它步骤均不变，得到重组质粒pET32a-CySDR4。
将重组质粒pET32a-CySDR4进行测序。测序结果表明，重组质粒pET32a-CySDR4含有SEQ ID NO：4所示的DNA分子。重组质粒pET32a-CySDR4表达CySDR4蛋白，CySDR4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
5、重组质粒pET32a-CySDR5的构建
按照上述步骤1，将引物F1替换为引物F5：5’-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGACAGATCTGAATCGG-3’，引物R1替换为引物R5：5’-ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTCAAAAACGAGTAGCAACTTG-3’，其它步骤均不变，得到重组质粒pET32a-CySDR5。
将重组质粒pET32a-CySDR5进行测序。测序结果表明，重组质粒pET32a-CySDR5含有SEQ ID NO：5所示的DNA分子。重组质粒pET32a-CySDR5表达CySDR5蛋白，CySDR5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
将上述各个PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果见图1中A(M为DNA Marker，1-5依次为引物F1和引物R1扩增获得的PCR扩增产物、引物F2和引物R2扩增获得的PCR扩增产物、引物F3和引物R3扩增获得的PCR扩增产物、引物F4和引物R4扩增获得的PCR扩增产物、引物F5和引物R5扩增获得的PCR扩增产物)。
三、CySDRs蛋白的表达与纯化
1、将重组质粒pET32a-CySDR1导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。
2、将重组大肠杆菌单克隆接种于10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，得到培养菌液1；之后将1mL培养菌液1接种于100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养约3小时，得到OD600nm为0.6-0.8的培养菌液2。
3、将培养菌液2冷却，之后加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.5mM，17℃诱导16h，得到培养菌液3。
4、取培养菌液3，4℃、10000g离心15min，收集菌体。
5、将步骤4收集的菌体用10mL pH7.4、100mM Tris-HCl缓冲液重悬，得到菌悬液。
6、取步骤5得到的菌悬液，用超声破碎，之后12000rpm离心15min，收集上清液。上清液即为CySDR1粗酶。
按照上述步骤，将重组质粒pET32a-CySDR1分别替换为重组质粒pET32a-CySDR2、重组质粒pET32a-CySDR3、重组质粒pET32a-CySDR4、重组质粒pET32a-CySDR5和原核表达载体pET32a，其它步骤均不变，依次得到CySDR2粗酶、CySDR3粗酶、CySDR4粗酶、CySDR5粗酶和pET32a空载粗酶。
将pET32a空载粗酶、CySDR1粗酶、CySDR2粗酶、CySDR3粗酶、CySDR4粗酶和CySDR5粗酶进行SDS-PAGE电泳。
SDS-PAGE电泳结果见图1中B(M为蛋白Marker，p为pET32a空载粗酶，1-5依次为CySDR1粗酶、CySDR2粗酶、CySDR3粗酶、CySDR4粗酶和CySDR5粗酶)。
CySDR1粗酶命名为CyPalR1粗酶。CySDR2粗酶命名为CyPalR2粗酶。
实施例2、CySDRs蛋白以巴马汀(Palmatine)、二氢巴马汀(Dihydropalmatine)或R型延胡索乙素(R-tetrahydropalmatine)为底物的酶促反应产物的UPLC-TOF分析
Palmatine标准品为上海源叶生物科技有限公司的产品。Dihydropalmatine标准品为上海源叶生物科技有限公司的产品。Tetrahydropalmatine标准品为上海源叶生物科技有限公司的产品。
(S)-Tetrahydropalmatine标准品和(R)-Tetrahydropalmatine标准品均为加拿大TRC的产品。
一、CyPalR1粗酶和CyPalR2粗酶以巴马汀Palmatine为底物的酶促反应产物的UPLC-TOF分析
1、制备反应体系。
反应体系为506μL，由500μL蛋白液、1μL Palmatine母液(Palmatine浓度为10mM)和5μL NADPH母液(NADPH浓度为50mM)组成。
其中，“PalR1+PalR2”组的蛋白液由250μL CyPalR1粗酶和250μL CyPalR2粗酶组成。“PalR1”组的蛋白液由500μL CyPalR1粗酶组成。“PalR2”组的蛋白液由500μLCyPalR2粗酶组成。“pET32a”组的蛋白液由500μL pET32a空载粗酶组成；该组为阴性对照组。
2、取步骤1制备的反应体系，25℃、180rpm震荡反应15min。
3、完成步骤2后，加入500μL色谱级乙酸乙酯，先涡旋30sec，再超声提取15min，12000rpm离心15min。
4、完成步骤3后，吸取上层有机相(乙酸乙酯层)至新的EP管，N2吹干后，加入200μL色谱级甲醇复溶(涡旋振荡15sec)，12000rpm离心15min后，收集上清液。
5、用UPLC-QTOF-MS(Waters Technologies，Milford，MA，USA)检测步骤4收集的上清液、Palmatine标准品、Tetrahydropalmatine标准品和Dihydropalmatine标准品。色谱柱为T3柱(2.1mm×100mm，2.7μm)。流动相由A相和B相组成，A相为0.1％(v/v)甲酸水溶液，B相为0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；梯度为：0-6min，5％-30％B；6-12min，30％-60％B；12-13.5min，60％-90％B；13.5-15min，90％-5％B；15-17min，5％B。进样体积为1μL。柱温为35℃。流动相流速为0.5mL/min。电喷雾离子源(ESI)，在正离子模式下进行扫描并采集MS数据；扫描范围210～400。
6、用HPLC分别检测步骤4收集的上清液、(S)-Tetrahydropalmatine标准品和(R)-Tetrahydropalmatine标准品。色谱柱OD-RH(ODRHCD-PA020)(0.46cm×15cm×5μm)。流动相由A相和B相组成，A相为20mM乙酸铵溶液，B相为乙腈溶液；40％B等度洗脱。进样体积为100μL。柱温为35℃。流动相流速为0.7mL/min。
检测结果见图2(A为CyPalR1粗酶和CyPalR2粗酶催化巴马汀Palmatine的图示；B为CyPalR1粗酶和CyPalR2粗酶与pET32a空载粗酶催化巴马汀Palmatine反应产物色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为相对丰度，1对应的峰代表Palmatine，2对应的峰代表产物延胡索乙素Tetrahydropalmatine；3对应的峰代表中间体产物二氢巴马汀Dihydropalmatine；C为产物峰2(即延胡索乙素Tetrahydropalmatine)及标样(标准品2为延胡索乙素Tetrahydropalmatine标准品)二级质谱图，横坐标为质核比，纵坐标为相对丰度；D为中间体3(即二氢巴马汀Dihydropalmatine)及标样(标准品3为二氢巴马汀Dihydropalmatine标准品)二级质谱图，横坐标为质核比，纵坐标为相对丰度)和图3(CyPalR1粗酶和CyPalR2粗酶催化Palmatine反应产物的HPLC构型分析，横坐标为保留时间，纵坐标为紫外吸收度；1对应的峰代表R型延胡索乙素R-tetrahydropalmatine，2对应的峰代表S型延胡索乙素S-tetrahydropalmatine)。图2结果表明，CySDR1(PalR1)和CySDR2(PalR2)基因编码的蛋白联合催化小檗碱型化合物巴马汀Palmatine还原产生延胡索乙素tetrahydropalmatine，图3结果显示该产物的立体构型为R型；CySDR1(PalR1)单独催化巴马汀Palmatine产生极少量的化合物二氢巴马汀Dihydropalmatine。
二、CyPalR2粗酶以二氢巴马汀Dihydropalmatine为底物的酶促反应产物的UPLC-TOF分析
1、制备反应体系。
反应体系为506μL，由500μL蛋白液、1μL Dihydropalmatine母液(Dihydropalmatine浓度为10mM)和5μL NADPH母液(NADPH浓度为50mM)组成。
其中，“CyPalR1”组的蛋白液由500μL CyPalR1粗酶组成。“CyPalR2”组的蛋白液由500μL CyPalR2粗酶组成。“pET32a”组的蛋白液由500μL pET32a空载粗酶组成；该组为阴性对照组。
2、同步骤一中2。
3、同步骤一中3。
4、同步骤一中4。
5、同步骤一中5。
检测结果见图4(A为CyPalR2粗酶催化Dihydropalmatine的图示；B为CyPalR1粗酶、CyPalR2粗酶或pET32a空载粗酶催化Dihydropalmatine反应产物色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为相对丰度；1对应的峰代表底物Dihydropalmatine，2对应的峰代表产物Tetrahydropalmatine；C为产物峰2对应的化合物(Tetrahydropalmatine)及标样(标准品2为延胡索乙素Tetrahydropalmatine标准品)二级质谱图，横坐标为质核比，纵坐标为相对丰度)。结果表明，CySDR2(CyPalR2)催化二氢巴马汀Dihydropalmatine生成延胡索乙素Tetrahydropalmatine，而CySDR1(CyPalR1)没有该催化功能。
三、CyPalR2粗酶以R型tetrahydropalmatine为底物的氧化酶促反应产物UPLC-TOF分析
1、制备反应体系。
反应体系为511μL，由500μL蛋白液(CyPalR2粗蛋白)，1μL底物母液(底物浓度为10mM)和10μL NADP+母液(NADP+浓度为25mM)组成。
底物为R型延胡索乙素R-tetrahydropalmatine或S型延胡索乙素S-tetrahydropalmatine。
2、取步骤1制备的反应体系，25℃、180rpm震荡反应120min。
3、同步骤一中3。
4、同步骤一中4。
5、同步骤一中5。
检测结果见图5(A为CyPalR2粗酶催化R型tetrahydropalmatine氧化反应的图示；B为CyPalR2粗酶与pET32a空载粗酶催化R型tetrahydropalmatine与S-tetrahydropalmatine反应产物色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为相对丰度；1对应的峰代表底物R型延胡索乙素R-tetrahydropalmatine或S型延胡索乙素S-tetrahydropalmatine，2对应的峰代表产物Palmatine；C为产物峰所对应的化合物2(Palmatine)及标样(标准品2为Palmatine标准品)二级质谱图，横坐标为质核比，纵坐标为相对丰度)。结果表明，CySDR2(PalR2)在NADP+参与下催化R型延胡索乙素R-tetrahydropalmatine可逆反应氧化生成巴马汀，但不催化S型延胡索乙素s-tetrahydropalmatine发生该反应。
四、CyPalR1粗酶和CyPalR2粗酶以巴马汀Palmatine为底物的酶促反应时间变化分析。
实验重复三次，每次重复的步骤如下：
1、制备反应体系。
反应体系为506μL，由250μL CyPalR1粗酶、250μL CyPalR2粗酶、1μL Palmatine母液(Palmatine浓度为10mM)和5μL NADPH母液(NADPH浓度为50mM)组成。
2、将步骤1制备的反应体系放入金属浴，25℃、180rpm震荡反应0.5h、1h、2h、4h或8h。
3、同步骤一中3。
4、同步骤一中4。
5、同步骤一中5。
6、同步骤一中6。
检测结果见图6(A为CyPalR1粗酶和CyPalR2粗酶催化Palmatine的可逆现象图示；C为CyPalR1粗酶和CyPalR2粗酶以巴马汀Palmatine为底物的酶促反应时间变化UPLC-TOF分析色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为相对丰度；1对应的峰代表底物Palmatine，2对应的峰代表产物Tetrahydropalmatine；3对应的峰代表中间体二氢巴马汀Dihydropalmatine)。实验结果显示，反应时间为0.5h时，双酶系统催化巴马汀(Palmatine)产生的还原产物主要是四氢巴马汀(Tetrahydropalmatine)，伴随着少量的中间体二氢巴马汀(Dihydropalmatine)产生；随着反应时间增长，在1h、2h、4h这三个时间点，还原产物四氢巴马汀大幅度降低，中间体二氢巴马汀大幅提升，当反应时间延长到8小时时，反应产物和中间体完全消失。该实验结果体现出反应呈现可逆现象。
五、CyPalR2粗酶分别与CySDR3粗酶、CySDR4粗酶和CySDR5粗酶以Palmatine为底物的酶促反应产物UPLC-TOF分析
1、制备反应体系。
反应体系为506μL，由500μL蛋白液、1μL Palmatine母液(Palmatine浓度为10mM)和5μL NADPH母液(NADPH浓度为50mM)组成。
其中，“CySDR3+PalR2”组的蛋白液由250μL CySDR3粗酶和250μL CyPalR2粗酶组成。“CySDR4+PalR2”组的蛋白液由250μL CySDR4粗酶和250μL CyPalR2粗酶组成。“CySDR5+PalR2”组的蛋白液由250μL CySDR5粗酶和250μL CyPalR2粗酶组成。“PalR2”组的蛋白液由500μL CyPalR2粗酶组成。“pET32a”组的蛋白液由500μLpET32a空载粗酶组成；该组为阴性对照组。
2、同步骤一中2。
3、同步骤一中3。
4、同步骤一中4。
5、同步骤一中5。
检测结果见图7(A为CyPalR2粗酶和CySDR3粗酶组成的混合酶、CyPalR2粗酶和CySDR4粗酶组成的混合酶以及CyPalR2粗酶和CySDR5粗酶组成的混合酶催化Palmatine的图示；B为CyPalR2粗酶和CySDR3粗酶、CyPalR2粗酶和CySDR4粗酶、CyPalR2粗酶和CySDR5粗酶、CyPalR2粗酶与pET32a空载粗酶催化Palmatine反应产物色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为相对丰度，1对应的峰代表底物Palmatine，2对应的峰代表产物Tetrahydropalmatine标准品；C为A中三组混合酶的酶促反应产物2(即延胡索乙速Tetrahydropalmatine)及标样(即标准品峰2为Tetrahydropalmatine标准品)二级质谱图，横坐标为质核比，纵坐标为相对丰度)。结果表明，从延胡索中克隆得到的CySDR3、CySDR4和CySDR5也参与到该氧化还原过程中，即CySDR3、CySDR4、CySDR5分别与CySDR2(PalR2)组合可催化巴马汀还原生成延胡索乙素。
由此可见，CySDR1(PalR1)蛋白和CySDR2(PalR2)蛋白构成双酶系统，联合催化小檗碱型化合物巴马汀与R型原小檗碱型化合物R型延胡索乙素的相互转化(见图6和图8所示)。即CySDR1(PalR1)蛋白在NADPH参与下催化巴马汀还原生成二氢巴马汀(见图2)，CySDR2(PalR2)蛋白催化二氢巴马汀生成R型延胡索乙素(见图3、图4)，CySDR2(PalR2)蛋白可进一步在NADP+参与下逆向催化R型延胡索乙素氧化生成巴马汀(见图5)。此外，从延胡索中克隆得到的CySDR3蛋白、CySDR4蛋白和CySDR5蛋白也参与到该氧化还原过程中，即CySDR3蛋白、CySDR4蛋白、CySDR5蛋白分别与CySDR2(PalR2)蛋白组合可催化巴马汀还原生成延胡索乙素(见图7)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.CySDRs蛋白组合，为CySDRs蛋白组合一、CySDRs蛋白组合二、CySDRs蛋白组合三或CySDRs蛋白组合四；
CySDRs蛋白组合一由CySDR2蛋白和CySDR1蛋白组成；
CySDRs蛋白组合二由CySDR2蛋白和CySDR3蛋白组成；
CySDRs蛋白组合三由CySDR2蛋白和CySDR4蛋白组成；
CySDRs蛋白组合四由CySDR2蛋白和CySDR5蛋白组成；
CySDR1蛋白为(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)将SEQ ID NO:6所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与催化小檗碱型化合物相关的蛋白质；
CySDR2蛋白为(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的蛋白质；
(b2)在(b1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(b3)将SEQ ID NO:7所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与催化二氢小檗碱型化合物相关的蛋白质；
CySDR3蛋白为(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的蛋白质；
(c2)在(c1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(c3)将SEQ ID NO:8所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与催化小檗碱型化合物相关的蛋白质；
CySDR4蛋白为(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的蛋白质；
(d2)在(d1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(d3)将SEQ ID NO:9所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与催化小檗碱型化合物相关的蛋白质；
CySDR5蛋白为(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的蛋白质；
(e2)在(e1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(e3)将SEQ ID NO:10所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与催化小檗碱型化合物相关的蛋白质。
2.编码权利要求1所述CySDRs蛋白组合的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：
所述编码权利要求1中所述CySDR1蛋白的核酸分子为如下(A1)或(A2)或(A3)的DNA分子：
(A1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(A2)在严格条件下与(A1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中所述CySDR1蛋白的DNA分子；
(A3)与(A1)或(A2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1中所述CySDR1蛋白的DNA分子；
所述编码权利要求1中所述CySDR2蛋白的核酸分子为如下(B1)或(B2)或(B3)的DNA分子：
(B1)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中所述CySDR2蛋白的DNA分子；
(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1中所述CySDR2蛋白的DNA分子；
所述编码权利要求1中所述CySDR3蛋白的核酸分子为如下(C1)或(C2)或(C3)的DNA分子：
(C1)核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA分子；
(C2)在严格条件下与(C1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中所述CySDR3蛋白的DNA分子；
(C3)与(C1)或(C2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1中所述CySDR3蛋白的DNA分子；
所述编码权利要求1中所述CySDR4蛋白的核酸分子为如下(D1)或(D2)或(D3)的DNA分子：
(D1)核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的DNA分子；
(D2)在严格条件下与(D1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中所述CySDR4蛋白的DNA分子；
(D3)与(D1)或(D2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1中所述CySDR4蛋白的DNA分子；
所述编码权利要求1中所述CySDR5蛋白的核酸分子为如下(E1)或(E2)或(E3)的DNA分子：
(E1)核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的DNA分子；
(E2)在严格条件下与(E1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中所述CySDR5蛋白的DNA分子；
(E3)与(E1)或(E2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1中所述CySDR5蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
5.权利要求1中所述CySDRs蛋白组合一或编码所述权利要求1中所述CySDRs蛋白组合一的核酸分子在催化小檗碱型化合物与R型原小檗碱型化合物相互转化中的应用。
6.权利要求1中所述CySDRs蛋白组合二、CySDRs蛋白组合三或CySDRs蛋白组合四或编码所述权利要求1中所述CySDRs蛋白组合二、CySDRs蛋白组合三或CySDRs蛋白组合四的核酸分子在催化小檗碱型化合物还原生成R型原小檗碱型化合物中的应用。
7.权利要求1中所述CySDR2蛋白或编码权利要求1中所述CySDR2蛋白的核酸分子在催化二氢小檗碱型化合物生成R型原小檗碱型化合物中的应用。
8.权利要求1中所述CySDR2蛋白或编码权利要求1中所述CySDR2蛋白的核酸分子在催化R型原小檗碱型化合物生成二氢小檗碱型化合物或小檗碱型化合物中的应用。
9.权利要求1中所述CySDR1蛋白或编码权利要求1中所述CySDR1蛋白的核酸分子在催化小檗碱型化合物还原生成二氢小檗碱型化合物中的应用。
10.根据权利要求5至9任一所述的应用，其特征在于：
所述小檗碱型化合物为巴马汀；
所述R型原小檗碱型化合物为R型延胡索乙素；
所述二氢小檗碱型化合物为二氢巴马汀。
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