CN118021766A - 一种亲水性多肽缓释微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种亲水性多肽缓释微球及其制备方法。本发明对现有技术下乳化溶剂挥发法进行了改进，开发了针对亲水性多肽的缓释微球的制备方法，使用低毒类有机溶剂，工艺简单，通过微球表观形貌、载药率、药物释放、稳定性等实验的测定，结果表明本发明所述方法制备的缓释微球，具有包封率高、载药量高、药物稳定性好、可进行辐照终端灭菌等优势，同时能够克服药物微球的突释现象并且可以实现不同时间的延迟释放，具有广阔的应用前景。

Description

一种亲水性多肽缓释微球及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，涉及疾病尤其是癌症的预防和治疗。具体而言，本发明涉及一种亲水性多肽缓释微球及其制备方法。
背景技术
多肽在包括细胞增殖分化、免疫防御、肿瘤病变等在内的生命活动过程中起着重要作用。目前全球上市的多肽药物有80多个，并有大量多肽药物在进行临床研究。多肽类药物具有独特的优势：活性高、特异性强、毒性较弱，在体内不易产生蓄积，与其他药物的相互作用比较少。不过多肽在体内的半衰期短，口服的生物利用率低，在很多适应症上需要多次重复注射，给医生和患者带了极大的不便。
例如，天然促性腺激素释放激素(GnRH)的多肽类似物亮丙瑞林、曲普瑞林、戈舍瑞林等，是治疗前列腺癌、乳腺癌、中枢性性早熟、子宫内膜异位症、女性不孕和子宫肌瘤等适应症的有效药物，不过此类药物半衰期很短，在体内极易降解，必须频繁给药才能取得疗效。另外，多肽疫苗目前已成为肿瘤免疫治疗研究的热点。肿瘤的发生、发展和治疗与机体免疫系统功能密切相关，伴随着肿瘤抗原、抗原递呈、T细胞识别机制的研究，发现抗肿瘤多肽疫苗能够通过肿瘤抗原多肽识别抗原递呈细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)，形成肽-MHC-T细胞受体复合物，从而引起相应的细胞毒性T淋巴细胞免疫反应，杀伤肿瘤。然而，疫苗的注射一般在完成第一剂后，需要在后续固定的时间点上重复多次注射加强针。目前已商品化的治疗性抗肿瘤多肽疫苗Provenge，需要每隔2周进行一次注射，总共注射3次才能达到疗效。多肽疫苗较长的治疗周期和多次重复注射也同样给医生和患者带来较大的不便，不能确保患者的依从性。针对以上这些问题，研究者提出使用长效缓释制剂，如微球制剂，来实现药物在注射后长时间的可控释放，从而避免多次的重复注射。
针对GnRH多肽类似物的微球研发，目前有多个聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球产品上市，能够实现1-6个月的缓释周期，不过均存在很多问题，如产品稳定性差不能进行终端灭菌，工艺复杂且需要无菌操作，微球的药物突释大生物利用率低，等等。而针对多肽疫苗，目前则还没有商品化技术和产品能够实现疫苗所需的脉冲式的药物释放。
美国专利US 2021/0205444 A1描述了一种聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微粒的制备方法，通过微注塑和3D打印技术，能够将药物注入到PLGA微颗粒的中心位置中，从而实现注射后药物不立刻释放，而是在10-90天后才延迟释放，从而可以通过混合不同延迟周期释放的微球来实现脉冲式的药物释放。不过该技术需要用到复杂的设备，成本高、技术难度大、产能极低，产业化难度高，目前仍处于实验室研究阶段。而传统的PLGA微球制备技术，如复乳法、熔融挤出法、喷雾干燥法、膜分离法、凝聚法、相分离法等，在制备过程中控制变量较多且可控性差，药物载药率和包封率相对较低，很大一部分药物会分布在微球表面及近表面，且由于固化过程中容易产生微孔结构，所包载的药物会存在突释以及较快的前期释放，很难实现疫苗所需的延迟释放或者脉冲式的药物释放。
本申请发明人的早期研究(中国专利文献CN 114588115 A)公开了一种改进的乳化溶剂挥发法制备PLGA缓释微球的方法，制备时向配制的油相溶液中加入药物颗粒或者药物水溶液，持续搅拌得到均匀的药物乳液或药物颗粒混悬体系，再向该体系加入反转相溶液，经乳化及相反转，得到半固化微球。该方法适用于曲安奈德、地塞米松等疏水性药物，无法用于制备亲水性药物微球。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术的不足，对现有技术下乳化溶剂挥发法进行了改进，开发了针对亲水性多肽的缓释微球的制备方法，提供了一种新型“相反转”法制备亲水性多肽-PLGA长效缓释微球。本发明采用降解性能优异的聚乳酸-羟基乙酸共聚物共聚物(PLGA)作为微球的基质材料，以醋酸曲普瑞林多肽药物为例，制备过程中选择合适的界面调节剂和表面活性剂等，通过调节油水两相的界面性质，并通过“相反转”一步法形成微球，最终获得粒径均一、载药率高、包封率高、稳定性好、可辐照灭菌的长效缓释微球，并且能够实现低突释持续缓慢释放以及不同时间长度的延迟释放。
本发明技术方案具体如下：
一种亲水性多肽缓释微球的制备方法，采用乳化溶剂挥发法，包括以下步骤：
(1)溶液配制：
配制内水相：将亲水性多肽溶解于去离子水中并调节pH3.0-7.0，得内水相溶液配制油相：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂中，形成澄清透明溶液，制得油相，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、甲酸乙酯，甲酸甲酯，乙酸甲酯，丁酮，四氢呋喃，丙酮，乙腈、二甲基亚砜中的一种或多种；
配制反转相：将界面反转调节剂A和B溶于去离子水中并调节pH3.0-7.0，优选5.0；所述界面反转调节剂A和B选自聚乙烯醇和甘露醇组合或者泊洛沙姆和甘露醇组合；
配制固化相：将表面活性剂溶于去离子水中，得到固化相；
(2)乳化：将步骤(1)配制的油相和内水相混合，优选通入高纯氮气，持续搅拌得到均匀的乳液；
(3)相反转：搅拌步骤(2)制得的乳液并加入反转相，经相反转得到半固化载药微球；
(4)固化：对步骤(3)制得的微球进行均匀分散，经过升温和减压，得到固化的缓释微球。
优选的，步骤(1)所述的内水相中亲水性多肽的质量百分浓度为10％-30％，优选17％；油相中PLGA质量百分浓度为20％-60％，优选40％；固化相中表面活性剂的质量百分浓度为0.1％-20％，优选为15％。
优选的，步骤(1)所述反转相溶液中界面调节剂A和界面调节剂B的质量比为1：9。进一步优选的，所述反转相溶液中界面调节剂A的质量百分浓度为1％，优选的，所述固化相中的表面活性剂选自吐温、PVA、泊洛沙姆中的一种或几种。
本发明所述的制备方法，优选步骤(2)乳化时间为5min-15min，优选5min。
优选的，内水相采用氢氧化钠、氢氧化钾、柠檬酸、冰乙酸等一种或多种溶液调节pH。
优选的，机械搅拌设备选择具有力矩搅拌功能的搅拌桨，搅拌速度优选为2000-4000rpm，优选2500rpm。
优选的，所述亲水性多肽为亮丙瑞林、曲普瑞林、戈舍瑞林或其药学上可成的盐。
本发明所述方法还包括进一步对步骤(4)得到的缓释微球分离、洗涤、浓缩、干燥的步骤。
以醋酸曲普瑞林为例，一个具体示例如下：
(1)溶液配制：将多肽醋酸曲普瑞林溶解于去离子水中并调节pH3.0-7.0，得内水相溶液；将PLGA溶解于有机溶剂(如乙酸乙酯)，得油相溶液；将界面调节剂A泊洛沙姆和界面调节剂B甘露醇溶解于去离子水中并调节pH3.0-7.0，得反转相溶液；将表面活性剂溶解于去离子水中，得固化相溶液。
(2)乳化：在恒温反应釜中，依次加入油相和内水相，并通入高纯氮气，对料液进行持续机械搅拌，当搅拌力矩达到一定数值后停止通氮气。
(3)相反转：通过蠕动泵往釜内加入反转相，载药微球迅速形成。
(4)固化：通过振动分散器对上述乳化的载药微球进行均匀分散，并加入固化相，固化一段时间后对反应釜进行加热，并通过隔膜泵进行减压，实现微球的完全固化。
(5)固液分离：固化完成后，将料液转移至固液分离器，进行搅拌过滤，并加入去离子水进行洗涤，最终抽滤达到初步干燥。
(6)冻干：洗涤和初步干燥完成后，将滤饼转移至冻干机中冻干，得到载药微球冻干粉。
优选的，利用隔膜泵通过抽真空方式实现微球的完全固化。具体固化步骤：
室温，抽真空到300-500mbarr，120分钟；升温到35-45℃，真空度维持在300-500mbarr，120分钟；维持在35-45℃，真空度上升至100-150mbarr，120分钟。
本发明另一目的在于提供一种亲水性多肽缓释微球，采用本发明所述的方法制备得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明对现有技术下乳化溶剂挥发法进行了改进，开发了针对亲水性多肽的缓释微球的制备方法，克服了现有技术下相反转法不适用于亲水性药物的缺陷。
2、传统复乳法一方面油相的PLGA浓度和粘度不能过高，不然在复乳制备过程中，即含有内水相的油相往外水相加入的过程中，容易形成不规则的大块沉淀，导致产率降低，另一方面通常需要两个反应釜，增加了无菌操作的难度。和传统复乳法相比，本发明所述方法“相反转”过程形成微球，即利用在外水相中加入界面反转调节剂，使得外水相往油相中快速加入的过程中，油相从连续相快速转变为分散相形成细乳，并将含有亲水性药物的内水相进行包裹，而且由于油相中具有较高的PLGA浓度和粘度，细乳很快进入半固态，使得油相内的绝大部分的药物被直接快速包封在微球内，包封率极高，且整个过程只需一个反应釜即可完成。
3、本发明所述的制备方法使用高粘度油相能大幅提高亲水性药物的包封率，对水溶性多肽的包封率可达85％以上，整体载药率可达8％左右，远高于市面上微球产品的载药率(～2％)。在相同的药物剂量下，极大的减低注射颗粒的体积，增加安全性和减低注射部位的副反应。
4、本发明制备的微球中的药物空间分布可控，可以实现零突释的药物缓释以及不同时间长度的延迟释放。
5、本发明制备的微球经辐照后，载药率和包封率未受影响、且无杂质产生，微球表现出十分优异的稳定性。可终端灭菌的特点能够大大的减低生产工艺的成本。
6、本发明工艺简单，制备的微球药物性能稳定，易于生产放大，实现产业化。
附图说明
图1为本发明的实施例1中实验3的载药微球光镜图。
图2为本发明的实施例4中实验17的载药微球光镜图。
图3为本发明的实施例5中实验累计释放曲线对比图。
图4为本发明的实施例6中实验累计释放曲线对比图。
图5为本发明的实施例7中实验累计释放曲线对比图。
图6为本发明的实施例8中实验累计释放曲线对比图。
图7为本发明的实施例9中实验累计释放曲线对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。但所举实例不作为对本发明的限定。
实施例1传统复乳法制备醋酸曲普瑞林缓释微球
参照表1，采用传统复乳法制备醋酸曲普瑞林缓释微球，具体步骤如下：
(1)溶液配制：
1)配制内水相：称取一定量的醋酸曲普瑞林溶解于去离子水中，待溶解备用。
2)配制油相：称取一定量的PLGA溶解于有机溶剂中，待溶解备用。
3)配制外水相：将一定量的表面活性剂溶解于去离子水中，待溶解备用。
(2)初乳制备：
在机械搅拌下，往反应釜1内加入油相和含有药物的内水相，高速搅拌进行乳化，完成初乳的制备。
(3)复乳制备：
将上述初乳转移到含有外水相的反应釜2中，搅拌形成复乳。
(4)固化：对上述复乳进行低速搅拌3h，使有机溶剂挥发、微球固化。
(5)固液分离：固化结束后，进行固液分离、离心、洗涤，得到浓缩微球。
(6)冻干：洗涤和初步干燥完成后，将浓缩微球转移至冻干机冻干，得到载药微球冻干粉。各实验组结果如表1所示。
表1
通过上述实验1-5对比分析可知，传统复乳法制备药物微球，不论是改变表面活性剂的的种类、油相PLGA的浓度、药物和PLGA的质量比，制备出的微球载药率和包封率均偏低，载药率不超过2.2％。以实验3为例，常规方法制备的微球光镜图如图1所示。
实施例2参照中国专利文献CN 114588115 A相反转法制备醋酸曲谱瑞林微球
参照表2，采用早期公开的相反转方法制备醋酸曲谱瑞林微球，具体步骤如下：
(1)溶液配制：
1)配制油相：称取5g PLGA溶解于有机溶剂乙酸乙酯中，待溶解备用。
2)配制反转相：分别称取一定量的双组分界面调节剂溶于去离子水中，并通过柠檬酸和氢氧化钠调节pH为7.0，待溶解备用。
3)配制固化相：将一定量的表面活性剂泊洛沙姆溶解于去离子水中，泊洛沙姆的质量百分浓度为5％。
(2)乳化：选取不锈钢反应釜，往釜内加入油相和药物粉末颗粒。合上釜盖，并按照一定的气体流速通入高纯氮气进行持续吹扫。启动具有力矩检测功能的搅拌桨，以一定的固定的速率对料液进行机械搅拌10-15min。
(3)相反转：在保持搅拌速率不变的情况下，停止氮气的吹扫，然后通过蠕动泵按照一定的流速往釜内加入反转相。载药微球迅速形成。
(4)固化：将上一步形成的微球转移至第二反应釜，通过振动分散器对微球进行均匀分散，并加入固化相，促进有机溶剂的置换。半小时后，对反应釜进行加热，并通过隔膜泵进行减压，从而更进一步实现有机溶剂的移除和微球的完全固化。
(5)固液分离：固化完成后，将料液转移至固液分离器，进行搅拌过滤，并加入去离子水进行洗涤，最终在搅拌下进行抽滤直至达到初步干燥。
(6)冻干：洗涤和初步干燥完成后，将样品转移至冻干机中冻干，得到流动性良好的载药微球冻干粉。
表2
通过上述实验可知，采用早期公开的相反转方法，将药物以粉末颗粒分散在油相中后，相反转的微球制备方法不能很好的将亲水性药物颗粒完全包埋在微球内部，大部分药物粉末在相反转的过程中被外水相所溶解，导致包封率和载药率均较低。
实施例3本发明所述“相反转”法制备醋酸曲普瑞林缓释微球
参照表3，选择不同的界面调节剂组合制备醋酸曲普瑞林缓释微球，具体步骤如下：
(1)溶液配制：
1)配制内水相：称取0.5g醋酸曲普瑞林溶解于去离子水中并调节pH为3.0，待溶解备用。
2)配制油相：称取5g PLGA溶解于有机溶剂乙酸乙酯中，待溶解备用。
3)配制反转相：分别称取一定量的单组份/双组分界面调节剂溶于去离子水中，并通过柠檬酸和氢氧化钠调节pH为7.0，待溶解备用。
4)配制固化相：称取一定质量的表面活性剂泊洛沙姆溶解于去离子水中，泊洛沙姆的质量百分浓度为10％。
(2)乳化：选取不锈钢反应釜，往釜内加入油相和含有药物的内水相。合上釜盖，并按照一定的气体流速通入高纯氮气进行持续吹扫。启动具有力矩检测功能的搅拌桨，以一定的固定的速率对料液进行机械搅拌。当搅拌的力矩达到2.2N.m时完成初乳的制备。
(3)相反转：在保持搅拌速率不变的情况下，停止氮气的吹扫，然后通过蠕动泵按照一定的流速往釜内加入反转相。载药微球迅速形成。
(4)固化：将上一步形成的微球转移至第二反应釜，通过振动分散器对微球进行均匀分散，并加入固化相，促进有机溶剂的置换。半小时后，对反应釜进行加热，并通过隔膜泵进行减压，从而更进一步实现有机溶剂的移除和微球的完全固化。
(5)固液分离：固化完成后，将料液转移至固液分离器，进行搅拌过滤，并加入去离子水进行洗涤，最终在搅拌下进行抽滤直至达到初步干燥。
(6)冻干：洗涤和初步干燥完成后，将样品转移至冻干机中冻干，得到流动性良好的载药微球冻干粉。
各实验组结果如表3所示。
表3
通过上述实验对比分析可知，采用乙酸乙酯为有机溶剂，油相PLGA浓度为15％、药物：PLGA＝1:10的固定条件下，改变界面调节剂的种类，采用双组份的界面调节剂时会明显提高药物的载药率，当采用1％泊洛沙姆、9％甘露醇为界面调节剂A和B时，制备的微球载药率、包封率和产率最高，达到2.8％。
实施例4
在实施例3的基础上，采用双组分界面调节剂：界面调节剂A泊洛沙姆(1％)：界面调节剂B甘露醇(9％)时，考察PLGA的浓度对载药微球的影响。具体步骤如下：
(1)溶液配制：
1)配制内水相：称取一定量的醋酸曲普瑞林溶解于去离子水中并调节pH为3.0，待溶解备用。
2)配制油相：称取一定量的PLGA溶解于有机溶剂乙酸乙酯中，待溶解备用。
3)配制反转相：称取一定质量配比的双组分界面调节剂溶解于去离子水中，并通过柠檬酸和氢氧化钠调节pH为7.0。
4)配制固化相：称取一定量的PVA溶解于去离子水中，PVA的质量百分浓度为1％。
(2)乳化：
将不锈钢反应釜恒温至24度，然后往釜内加入油相和含有药物的内水相。合上釜盖，并按照一定的气体流速通入高纯氮气进行持续吹扫。启动具有力矩检测功能的搅拌桨，以一定的固定的速率对料液进行机械搅拌。当搅拌的力矩达到2.2N.m时完成初乳的制备。
(3)相反转：在保持搅拌速率不变的情况下，停止氮气的吹扫，然后通过蠕动泵按照一定的流速往釜内加入反转相。载药微球迅速形成。
(4)固化：将上一步形成的微球转移至第二反应釜，通过振动分散器对微球进行均匀分散，并加入固化相，促进有机溶剂的置换。半小时后，对反应釜进行加热，并通过隔膜泵进行减压，从而更进一步实现微球的完全固化。
(5)固液分离：固化完成后，将料液转移至固液分离器，进行搅拌过滤，并加入去离子水进行洗涤，最终在搅拌下抽滤至初步干燥完成。
(6)冻干：洗涤和初步干燥完成后，将样品转移至冻干机中冻干，得到载药微球冻干粉。各实验组参数如表4所示。
表4
微球体外溶出实验：
试剂：PBS缓冲溶液。
方法：恒温水浴振荡器。
条件：37.5℃±0.5。
方法：取三只50ml离心管，分别称取一定量的载药微球，定容到7.5gPBS缓冲液中，分别置于37℃水浴摇床中。
取样：于一定时间点取上清液7.5g，并补加相同克重的空白PBS缓冲液，上清液用HPLC测定药物浓度，计算微球的累计溶出率。
测试：对取出得上清液在HPLC下进行药物含量的测定。
HPLC方法：色谱柱为C18(150×3.0mm，2μm)，流动相为0.1％三氟乙酸的水溶液(A)+0.1％三氟乙酸的乙腈溶液(B)，浓度梯度如下表所示，流速为0.4mL/min，柱温为30℃，进样量为8μL。
时间(min) ％B
0 26
30 27
45 35
50 60
51 26
分别采用HPLC测得上述样品的载药率、包封率，采用水浴摇床法在37℃浸提液中测得上述样品的累计溶出率，并用激光粒度仪测得上述样品的粒径和粒度分布，具体结果如下：
表5
通过上述实施例中实验15-19对比分析可知，采用乙酸乙酯为有机溶剂，醋酸曲普瑞林：PLGA质量比＝1:10、醋酸曲普瑞林浓度为25％的固定条件下，改变PLGA的浓度，通过测试结果发现，当PLGA的浓度为40％时，制备的微球载药率和包封率最高，载药率达到5.0％，平均粒径为60μm。
本实施例中实验17微球的光镜图如图2所示。
不同曲普瑞林微球实验的累计溶出曲线对比图见图3。由上述累计溶出率数据分析可知，采用浓度为40％ PLGA制备的微球在37℃水溶摇床中，药物保持持续的释放。当PLGA的浓度升高到50％或以上时，微球前两周没有药物释放，可以实现两周的延迟释放。
实施例5
在上述实施例的基础上，以泊洛沙姆：甘露醇以质量比1:9为界面调节剂，PLGA浓度为40％，考察曲普瑞林药物浓度对微球载药率和包封率的影响。具体步骤如下：
(1)溶液配制：
1)配制内水相：称取一定量的醋酸曲普瑞林溶解于去离子水中并调节PH为5.0，待溶解备用。
2)配制油相：称取5.0g PLGA溶解于10ml乙酸乙酯中，待溶解备用。
3)配制反转相：将一定质量配比的双组分溶解于去离子水中，并通过柠檬酸和氢氧化钠调节pH为7.0。
4)配制固化相：称取一定量的泊洛沙姆溶解于去离子水中，泊洛沙姆的质量分数为15％，待溶解备用。
(2)乳化：将不锈钢反应釜恒温至24度，然后往釜内加入油相和含有药物的内水相。合上釜盖，并按照一定的气体流速通入高纯氮气进行持续吹扫。启动具有力矩检测功能的搅拌桨，以一定的固定的速率对料液进行机械搅拌。当搅拌的力矩达到2.2N.m时完成初乳的制备。
(3)相反转：在保持搅拌速率不变的情况下，停止氮气的吹扫，然后通过蠕动泵按照一定的流速往釜内加入反转相。载药微球迅速形成。
(4)固化：将上一步形成的微球转移至第二反应釜，通过振动分散器对微球进行均匀分散，并加入固化相，促进有机溶剂的置换。半小时后，对反应釜进行加热，并通过隔膜泵进行减压，从而更进一步实现微球的完全固化。
(5)固液分离：固化完成后，将料液转移至固液分离器，进行搅拌过滤，并加入去离子水进行洗涤，最终在搅拌下抽滤至初步干燥完成。
(6)冻干：洗涤和初步干燥完成后，将样品转移至冻干机中冻干，得到载药微球冻干粉。各实验组参数如表6所示。
表6
分别采用HPLC测得上述样品的载药率、包封率、采用水浴摇床法在37℃浸提液中测得上述样品的累计溶出率，并用激光粒度仪测得上述样品的粒径和粒度分布，具体结果如下：
表7
通过上述实施例中实验20-24对比分析，总结结论如下：
采用乙酸乙酯为有机溶剂、药物：PLGA＝1:10、PLGA浓度为40％的固定条件下，改变醋酸曲普瑞林的浓度，通过测试结果发现，当醋酸曲普瑞林的浓度为17％时，制备的微球载药率和包封率最高，载药率达到7.3％，平均粒径为49μm。
不同曲普瑞林微球实验的累计溶出曲线对比图见图4。由上述累计溶出率数据分析得出，醋酸曲普瑞林的浓度对微球的溶出率影响较大，采用浓度为17％醋酸曲普瑞林制备的微球在37℃水溶摇床中，药物可以持续释放，而高浓度的曲普瑞林内水相会导致前期释放缓慢，甚至可以实现2周以上的药物的延迟释放。
实施例6
在上述实施例的基础上，考察内水相pH值对载药微球载药率和包封率的影响。具体步骤如下：
(1)溶液配制：
1)配制内水相：称取一定量的醋酸曲普瑞林溶解于去离子水中并调节pH，待溶解备用。
2)配制油相：称取一定量的PLGA溶于乙酸乙酯中，待溶解备用。
3)配制反转相：将一定质量配比的双组分溶解于去离子水中，并通过柠檬酸和氢氧化钠调节pH为7.0。
4)配制固化相：称取一定量的PVA溶解于去离子水中，PVA的质量百分浓度为1％。
(2)乳化：
1)初乳制备：将不锈钢反应釜恒温至24度，然后往釜内加入油相和含有药物的内水相。合上釜盖，并按照一定的气体流速通入高纯氮气进行持续吹扫。启动具有力矩检测功能的搅拌桨，以一定的固定的速率对料液进行机械搅拌。当搅拌的力矩达到2.2N.m时完成初乳的制备。(3)相反转：在保持搅拌速率不变的情况下，停止氮气的吹扫，然后通过蠕动泵按照一定的流速往釜内加入反转相。载药微球迅速形成。
(4)固化：将上一步形成的微球转移至第二反应釜，通过振动分散器对微球进行均匀分散，并加入固化相，促进有机溶剂的置换。半小时后，对反应釜进行加热，并通过隔膜泵进行减压，从而更进一步实现微球的完全固化。
(5)固液分离：固化完成后，将料液转移至固液分离器，进行搅拌过滤，并加入去离子水进行洗涤，最终在搅拌下抽滤至初步干燥完成。
(6)冻干：洗涤和初步干燥完成后，将样品转移至冻干机中冻干，得到载药微球冻干粉。各实验组参数如表8所示。
表8
分别采用HPLC测得上述样品的载药率、包封率、采用水浴摇床法在37℃浸提液中测得上述样品的累计溶出率，并用激光粒度仪测得上述样品的粒径和粒度分布，具体结果如下：
表9
通过上述实施例中实验25-28对比分析可知，当其他条件不变的情况下，内水相的pH对微球的载药率和溶出情况有影响，当内水相的pH为5.0时，制备的微球载药率和包封率最高，载药率达到7.8％，平均粒径为39μm。
不同曲普瑞林微球实验的累计溶出曲线对比图见图5。由上述累计溶出率数据分析得出，当内水相的pH为5.0时制备的微球在37℃水溶摇床中，药物可以持续释放，15d的累计溶出率为55％。
实施例7
在上述实施例的基础上，以泊洛沙姆：甘露醇以质量比1:9为界面调节剂，PLGA浓度为40％，曲普瑞林药物浓度为17％，考察乳化时间对微球载药率和包封率的影响。具体步骤如下：
(1)溶液配制：
1)配制内水相：称取一定量的醋酸曲普瑞林溶解于去离子水中并调节PH为5.0，待溶解备用。
2)配制油相：称取4.0g PLGA溶解于10ml乙酸乙酯中，待溶解备用。
3)配制反转相：将一定质量配比的双组分溶解于去离子水中，并通过柠檬酸和氢氧化钠调节pH为7.0。
4)配制固化相：称取一定量的泊洛沙姆溶解于去离子水中，泊洛沙姆的质量百分浓度为20％。(2)乳化：将不锈钢反应釜恒温至24度，然后往釜内加入油相和含有药物的内水相。合上釜盖，并按照一定的气体流速通入高纯氮气进行持续吹扫。启动具有力矩检测功能的搅拌桨，以一定的固定的速率对料液进行机械搅拌。搅拌时间参照表10。
(3)相反转：在保持搅拌速率不变的情况下，停止氮气的吹扫，然后通过蠕动泵按照一定的流速往釜内加入反转相。载药微球迅速形成。
(4)固化：将上一步形成的微球转移至第二反应釜，通过振动分散器对微球进行均匀分散，并加入固化相，促进有机溶剂的置换。半小时后，对反应釜进行加热，并通过隔膜泵进行减压，从而更进一步实现微球的完全固化。
(5)固液分离：固化完成后，将料液转移至固液分离器，进行搅拌过滤，并加入去离子水进行洗涤，最终在搅拌下抽滤至初步干燥完成。
(6)冻干：洗涤和初步干燥完成后，将样品转移至冻干机中冻干，得到载药微球冻干粉。各实验组参数如表10所示。
表10
分别采用HPLC测得上述样品的载药率、包封率、采用水浴摇床法在37℃浸提液中测得上述样品的累计溶出率，并用激光粒度仪测得上述样品的粒径和粒度分布，具体结果如下：
表11
通过上述实施例中实验29-32对比分析可知，在实验配方一定的条件下，改变工艺参数中的乳化时间，当乳化时间为5min时(转动力矩达到2.2N.m左右)，制备的微球载药率和包封率最高，载药率达到7.6％，平均粒径为27μm。
不同曲普瑞林微球实验的累计溶出曲线对比图见图6。由上述累计溶出率数据分析得出，乳化时间对微球的粒度分布和溶出率影响都较大，乳化时间为5min时的微球在37℃水溶摇床中，药物持续释放。乳化时间较短(实验29)或者较长(实验31，32)会导致制备的微球前期具有非常低的药物释放量，甚至可以实现一周的药物延迟释放。
实施例8
在上述实施例的基础上，考察搅拌速度对载药微球粒径的影响。具体步骤如下：
(1)溶液配制：
1)配制内水相：称取一定量的醋酸曲普瑞林溶解于去离子水中调节PH为5.0，待溶解备用。
2)配制油相：称取一定量的PLGA溶于乙酸乙酯中，待溶解备用。
3)配制反转相：将一定质量配比的双组分溶解于去离子水中，并通过柠檬酸和氢氧化钠调节pH为7.0。
4)配制固化相：称取一定量的泊洛沙姆溶解于去离子水中，泊洛沙姆的质量百分浓度为15％。(2)乳化：将不锈钢反应釜恒温至24度，然后往釜内加入油相和含有药物的内水相。合上釜盖，并按照一定的气体流速通入高纯氮气进行持续吹扫。启动具有力矩检测功能的搅拌桨，以一定的固定的速率对料液进行机械搅拌。搅拌时间参照表12。
(3)相反转：在保持搅拌速率不变的情况下，停止氮气的吹扫，然后通过蠕动泵按照一定的流速往釜内加入反转相。载药微球迅速形成。
(4)固化：将上一步形成的微球转移至第二反应釜，通过振动分散器对微球进行均匀分散，并加入固化相，促进有机溶剂的置换。半小时后，对反应釜进行加热，并通过隔膜泵进行减压，从而更进一步实现微球的完全固化。
(5)固液分离：固化完成后，将料液转移至固液分离器，进行搅拌过滤，并加入去离子水进行洗涤，最终在搅拌下抽滤至初步干燥完成。
(6)冻干：洗涤和初步干燥完成后，将样品转移至冻干机中冻干，得到载药微球冻干粉。各实验组结果如表12所示。
表12
通过上述实施例中实验33-37对比分析可知，在其他实验条件一定的情况下，搅拌速度不同的状态下，制备的微球载药率和包封率明显不同。通过测试结果发现，当搅拌速度设置为2500rpm时，制备的微球载药率和包封率最高，载药率可达7.9％，包封率为87％。
实施例9
在上述实施例的基础上，考察辐照对载药微球药物稳定性的影响。对实施例8中实验35样品进行辐照灭菌，对比辐照前后样品的载药率和累计溶出率，并分析辐照对样品稳定性的影响。
分别采用HPLC测得辐照前后样品的载药率、采用水浴摇床法在37℃浸提液中测得上述样品的累计溶出率，并用激光粒度仪测得上述样品的粒径和粒度分布，具体结果如表13所示。
表13
通过上述实验38和实验39对比分析可知，通过辐照灭菌后，样品的载药率和粒径分布未发生变化，而且通过HPLC测试载药率发现，未发现其他杂质峰。
不同曲普瑞林微球实验的累计溶出曲线对比图见图7。
对辐照前后样品进行体外溶出测定，通过测试结果发现，样品经辐照后，会明显提高微球的累计溶出率，7d的累计溶出率为55.4％。
由上述各实施例对比发现，本发明制备的载药微球的载药率达7.9％，包封率在85％以上，微球的平均粒径在30μm左右，粒径分布均匀、药物稳定性好。除了能够制备出可以辐照灭菌、具有稳定持续药物释放的多肽缓释微球外，还能通过调节内水相药物浓度和油相PLGA浓度，制备出具有不同延迟释放周期(1-2周)的多肽缓释微球，能够实现不同多肽药物和不同适应症的治疗，具有广阔的商业前景。

Claims (10)

1.一种亲水性多肽缓释微球的制备方法，采用乳化溶剂挥发法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)溶液配制：
配制内水相：将亲水性多肽溶解于去离子水中并调节pH3.0-7.0，得内水相溶液配制油相：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂中，形成澄清透明溶液，制得油相，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、甲酸乙酯，甲酸甲酯，乙酸甲酯，丁酮，四氢呋喃，丙酮，乙腈、二甲基亚砜中的一种或多种；
配制反转相：将界面反转调节剂A和B溶于去离子水中并调节pH3.0-7.0，所述界面反转调节剂A和B选自聚乙烯醇和甘露醇组合或者泊洛沙姆和甘露醇组合；
配制固化相：将表面活性剂溶于去离子水中，得到固化相；
(2)乳化：将步骤(1)配制的油相和内水相混合，持续搅拌得到均匀的乳液；
(3)相反转：搅拌步骤(2)制得的乳液并加入反转相，经相反转得到半固化载药微球；
(4)固化：对步骤(3)制得的微球进行均匀分散，经过升温和减压，得到固化的缓释微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的内水相中亲水性多肽的质量百分浓度为10％-30％，油相中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量百分浓度为20％-60％固化相中表面活性剂的质量百分浓度为0.1％-20％。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述反转相溶液中界面调节剂A和界面调节剂B的质量比为1：9。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述反转相溶液中界面调节剂A的质量百分浓度为1％，界面调节剂B的质量百分浓度为9％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，固化相中的表面活性剂选自吐温、PVA、泊洛沙姆中的一种或几种，质量体积百分浓度为0.1％-20％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)乳化时间为5min-15min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)或(3)搅拌速度为1000-4000rpm。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述亲水性多肽为亮丙瑞林、曲普瑞林、戈舍瑞林或其药学上可成的盐。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于所述方法还包括进一步对步骤(4)得到的缓释微球分离、洗涤、浓缩、干燥的步骤。
10.一种亲水性多肽缓释微球，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述的方法制备得到。
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