CN118019845A - tRNA、氨酰基tRNA、多肽合成用试剂、非天然氨基酸的导入方法、多肽的制作方法、核酸展示文库的制作方法、核酸-多肽连接体及筛选方法 - Google Patents

tRNA、氨酰基tRNA、多肽合成用试剂、非天然氨基酸的导入方法、多肽的制作方法、核酸展示文库的制作方法、核酸-多肽连接体及筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA及其应用。

Description

tRNA、氨酰基tRNA、多肽合成用试剂、非天然氨基酸的导入方 法、多肽的制作方法、核酸展示文库的制作方法、核酸-多肽连 接体及筛选方法
技术领域
本发明涉及一种tRNA、氨酰基tRNA、多肽合成用试剂、非天然氨基酸的导入方法、多肽的制作方法、核酸展示文库的制作方法、核酸-多肽连接体及筛选方法。
背景技术
导入非天然氨基酸(也称为特殊氨基酸。)的多肽作为医药品的候选而受到关注。
在专利文献1中公开了使用人工氨酰化催化剂并用特殊氨基酸将tRNA进行酰化，通过包含用特殊氨基酸酰化的tRNA的无细胞翻译系统制作特殊多肽的文库，而筛选与目标蛋白质结合的特殊多肽的方法。
在专利文献2中公开了细胞膜透过性优异的环状肽化合物的制造方法及筛选方法。
在专利文献3中公开了山羊支原体(Mycoplasma capricolum)的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA以及使用该tRNA来将非天然氨基酸导入到多肽中的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012-058092号公报
专利文献2：国际公开第2018/174078号
专利文献3：国际公开第2007/055429号
发明内容
发明要解决的技术课题
本发明的课题在于提供将UAA密码子翻译成氨基酸的tRNA及氨酰基tRNA、在多肽中导入至少两种非天然氨基酸的多肽合成用试剂、非天然氨基酸的导入方法、多肽的制作方法及核酸展示文库的制作方法、在多肽中导入有至少两种非天然氨基酸的核酸-多肽连接体、从导入有至少两种非天然氨基酸的多肽中选出具有目标活性的多肽的筛选方法。
用于解决技术课题的手段
用于解决课题的具体方案包括以下方式。
＜1＞一种tRNA，其中，
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的色氨酸用tRNA被改变，并且所述tRNA作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对。
＜2＞根据＜1＞所述的tRNA，其中，
与CCA末端的5’侧相邻的碱基为A或G。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的tRNA，其中，
从5’末端起第3个碱基和与该碱基配对的碱基的组合为UA、GU或UG。
＜4＞根据＜1＞或＜2＞所述的tRNA，其中，
从5’末端起第4个碱基和与该碱基配对的碱基的组合为GU。
＜5＞一种tRNA，其具有选自包括序列号7、序列号8、序列号9、序列号13、序列号15及序列号17的组中的1种碱基序列。
＜6＞一种氨酰基tRNA，其在＜1＞至＜5＞中任一项所述的tRNA上结合有氨基酸。
＜7＞根据＜6＞所述的氨酰基tRNA，其中，
所述氨基酸为选自包括非天然氨基酸、修饰化氨基酸及这些的衍生物的组中的1种。
＜8＞根据＜6＞所述的氨酰基tRNA，其中，
所述氨基酸为选自包括氯乙酰化赖氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基苯丙氨酸及荧光标记氨基酸的组中的1种。
＜9＞一种多肽合成用试剂，其包含：
山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA；及
肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA。
＜10＞一种多肽合成用试剂，其包含：
在山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA上结合有第一非天然氨基酸的氨酰基tRNA；及
在肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA上结合有第二非天然氨基酸的氨酰基tRNA。
＜11＞一种非天然氨基酸的导入方法，其是将至少两种非天然氨基酸导入到多肽中的方法，其包括通过无细胞肽合成系统从核酸表达多肽的步骤，所述无细胞肽合成系统含有：
具有包含UAG密码子及UAA密码子的碱基序列的核酸；
在山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA上结合有第一非天然氨基酸的氨酰基tRNA；及
在肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA上结合有第二非天然氨基酸的氨酰基tRNA。
＜12＞根据＜11＞所述的非天然氨基酸的导入方法，其中，
所述碱基序列进一步包含终止密码子即UGA密码子。
＜13＞一种多肽的制作方法，其是制作在氨基酸序列中包含至少两种非天然氨基酸的多肽的方法，其包括通过无细胞肽合成系统从核酸表达多肽的步骤，所述无细胞肽合成系统含有：
具有包含UAG密码子及UAA密码子的碱基序列的核酸；
在山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA上结合有第一非天然氨基酸的氨酰基tRNA；及
在肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA上结合有第二非天然氨基酸的氨酰基tRNA。
＜14＞根据＜13＞所述的多肽的制作方法，其中，
所述碱基序列进一步包含终止密码子即UGA密码子。
＜15＞一种核酸展示文库的制作方法，其包括通过无细胞肽合成系统从核酸表达多肽并制作核酸-多肽连接体的步骤，所述无细胞肽合成系统含有：
具有包含UAG密码子及UAA密码子的碱基序列的核酸；
在山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA上结合有第一非天然氨基酸的氨酰基tRNA；及
在肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA上结合有第二非天然氨基酸的氨酰基tRNA。
＜16＞根据＜15＞所述的核酸展示文库的制作方法，其中，
制作核酸-多肽连接体的步骤包括：
制作mRNA-多肽连接体的步骤；及
反向转录mRNA-多肽连接体的mRNA并制作cDNA-多肽连接体的步骤。
＜17＞根据＜15＞或＜16＞所述的核酸展示文库的制作方法，其中，
在核酸-多肽连接体中的核酸及多肽通过嘌呤霉素连接体连接。
＜18＞一种核酸-多肽连接体，其是连接了在氨基酸序列中包含至少两种非天然氨基酸的多肽以及具有编码多肽的碱基序列的核酸的核酸-多肽连接体，其中，
碱基序列包含UAG密码子及UAA密码子，
在碱基序列中UAG密码子编码多肽中的第一非天然氨基酸，
在碱基序列中UAA密码子编码多肽中的第二非天然氨基酸。
＜19＞根据＜18＞所述的核酸-多肽连接体，其中，
其是mRNA-多肽连接体或cDNA-多肽连接体。
＜20＞一种筛选方法，其包括：
通过＜15＞至＜17＞中任一项所述的核酸展示文库的制作方法制作核酸展示文库的步骤；及
从核酸展示文库选择具有目标活性的核酸-多肽连接体并鉴定所选择的核酸-多肽连接体的核酸的碱基序列的步骤。
发明效果
根据本发明，可提供将UAA密码子翻译成氨基酸的tRNA及氨酰基tRNA、在多肽中导入至少两种非天然氨基酸的多肽合成用试剂、非天然氨基酸的导入方法、多肽的制作方法及核酸展示文库的制作方法、在多肽中导入有至少两种非天然氨基酸的核酸-多肽连接体、从导入有至少两种非天然氨基酸的多肽中选出具有目标活性的多肽的筛选方法。
附图说明
图1是表示本发明的tRNA的实施方式例的图，并且是三叶草结构的示意图。
图2是用甲酰胺固定的tRNA的电泳凝胶。
图3是多次导入荧光标记氨基酸及N-甲基苯丙氨酸的多肽的电泳凝胶。
图4是多次导入荧光标记氨基酸及N-甲基苯丙氨酸的mRNA展示的电泳凝胶。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。这些说明及实施例是实施方式的示例，并不限制实施方式的范围。本发明中描述的作用机制包括推测，其正确与否并不限定实施方式的范围。
在本发明中，使用“～”表示的数值范围表示将记载于“～”前后的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。
在本发明中分阶段记载的数值范围中，以一个数值范围记载的上限值或下限值可置换为其他阶段性记载的数值范围的上限值或下限值。并且，在本发明中所记载的数值范围中，该数值范围的上限值或下限值也可以置换为实施例所示的值。
在本发明中，各成分也可以包含多种相应的物质。在本发明中，在提及组合物中的各成分的量时，在组合物中存在多种相当于各成分的物质的情况下，只要无特别说明，则是指在组合物中存在的多种物质的总量。
在本发明中，多肽是指通过肽键连接了氨基酸的分子。多肽的氨基酸残基数没有限制，多肽是包括蛋白质的用语。本发明中的多肽优选氨基酸残基数为6个以上。多肽包含氨基酸被翻译后修饰的多肽。作为氨基酸的翻译后修饰，可举出磷酸化、甲基化、乙酰化等。
在本发明中，核酸是指携带合成多肽的信息的分子。核酸是包含所有核酸(例如，DNA、RNA、这些的类似物、天然物、人工产物)、以及所有核酸中连接有除低分子化合物、基团、核酸以外的分子、结构物等的核酸的用语。TOOD核酸可以为单链核酸，也可以为双链核酸。
在本发明中，以序列号确定的tRNA的碱基序列如表1所示。
序列号2及序列号5～17是肺炎支原体的色氨酸用tRNA的变体。
序列号18是肺炎支原体的野生型色氨酸用tRNA。
序列号1及序列号19是山羊支原体的色氨酸用tRNA的变体。
序列号3是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的色氨酸用tRNA的变体。
序列号4是希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)的色氨酸用tRNA的变体。
在表1中，反密码子带有下划线，每种微生物的与野生型色氨酸用tRNA不同的碱基以斜体显示。
[表1]
自然界中发现的tRNA的碱基数的范围是从70个到90个。典型的tRNA的碱基数为76个。在表1的备注栏中记载的碱基位置是与碱基数为76个典型的tRNA进行对比而确定的位置。以序列号2为例，则碱基数为74，但将3’末端的位置确定为碱基号76，并将与CCA末端的5’侧相邻的位置确定为碱基号73。
＜tRNA＞
本发明的tRNA是肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变的tRNA，并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对。本发明的tRNA将UAA密码子翻译成氨基酸。
肺炎支原体具有两种野生型色氨酸用tRNA(Nucleic Acids Res(核酸研究).1993Oct 25；21(21):4967-4974)。本发明的tRNA包含两种野生型色氨酸用tRNA中的任一个变体。本发明的tRNA优选为对序列号18所示的野生型色氨酸用tRNA进行改变的tRNA。
本发明的tRNA是将肺炎支原体的野生型色氨酸用tRNA的反密码子从CCA改变为UUA的tRNA。通过该改变，本发明的tRNA具有将UAA密码子翻译成氨基酸的功能。
本发明的发明人在对各种微生物的野生型色氨酸用tRNA进行改变而研究的结果发现，肺炎支原体的色氨酸用tRNA的变体有效地将UAA密码子翻译成氨基酸。
本发明的tRNA优选为在肺炎支原体的野生型色氨酸用tRNA中除了反密码子以外还对受体茎进行改变的变体。推测受体茎的改变影响tRNA的超分子结构并提高核糖体中的肽基转移反应的效率。作为受体茎的改变例，可举出与CCA末端的5’侧相邻的碱基的改变；从5’末端起第3个碱基和与该碱基配对的碱基的组合的改变；从5’末端起第4个碱基和与该碱基配对的碱基的组合的改变。
tRNA的CCA末端是指在tRNA的3’末端上普遍存在的3个碱基。
tRNA内部中的配对是指在tRNA的三叶草结构中碱基对彼此相对。
图1是表示本发明的tRNA的实施方式例的图，并且是三叶草结构的示意图。在图1中例示了与CCA末端的5’侧相邻的碱基(碱基号73)的改变例、从5’末端起第3个碱基和与该碱基配对的碱基(碱基号70)的组合的改变例、及从5’末端起第4个碱基和与该碱基配对的碱基(碱基号69)的组合的改变例。
从有效地将UAA密码子翻译成氨基酸的观点考虑，本发明的tRNA优选包含选自包括下述形态(1)、形态(2)及形态(3)的组中的至少一种形态。
形态(1)：与CCA末端的5’侧相邻的碱基为A或G。
形态(2)：从5’末端起第3个碱基及与该碱基配对的碱基的组合为UA、GU或UG。在此，关于2个碱基的记载，先记载从5’末端起第3个碱基。例如，“UA”中，从5’末端起第3个碱基为U，在三叶草结构中与第3个碱基配对的碱基为A。
形态(3)：从5’末端起第4个碱基和与该碱基配对的碱基的组合为GU。在此，关于2个碱基的记载，先记载从5’末端起第4个碱基。从5’末端起第4个碱基为G，在三叶草结构中与第4个碱基配对的碱基为U。
作为本发明的tRNA的实施方式例，可举出包括形态(1)及形态(2)的tRNA及包括形态(1)及形态(3)的tRNA。
作为本发明的tRNA的实施方式例，可举出具有序列号2、序列号5、序列号6、序列号7、序列号8、序列号9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号15、序列号16或序列号17的碱基序列的tRNA。这些中，从有效地将UAA密码子翻译成氨基酸的观点考虑，优选为具有序列号7、序列号8、序列号9、序列号13、序列号15或序列号17的碱基序列的tRNA。
能够基于肺炎支原体的野生型色氨酸用tRNA的碱基序列并使用公知的基因工程技术来制作本发明的tRNA。例如，设计tRNA基因，通过使用适当的引物的PCR(PolymeraseChain Reaction，聚合酶链式反应)制作tRNA基因，并从tRNA基因转录tRNA。
＜氨酰基tRNA＞
本发明的氨酰基tRNA是本发明的tRNA上结合有氨基酸的tRNA。在氨酰基tRNA中，氨基酸共价结合在tRNA的3’末端上。
本发明的tRNA可以被所有氨基酸酰化。因此，本发明的氨酰基tRNA所具有的氨基酸的种类不受限制。在此，氨基酸包含天然氨基酸、非天然氨基酸、修饰化氨基酸及这些的衍生物。
在本发明中，天然氨基酸是指一般的构成蛋白质的氨基酸，可举出丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸及缬氨酸。天然氨基酸可以为天然物，也可以为人工产物。
在本发明中，非天然氨基酸是指除上述20种氨基酸以外的氨基酸，也包含天然物及人工产物。
作为非天然氨基酸的一例，可举出具有氯乙酰基的氨基酸(例如，氯乙酰化赖氨酸(chloroacethyl lysine)等氯乙酰化氨基酸、氯乙酰基二氨基丁酸)。
作为非天然氨基酸的一例，可举出N-甲基氨基酸(例如，N-甲基丙氨酸、N-甲基苯丙氨酸)。
作为修饰化氨基酸的一例，可举出与标记化合物结合的氨基酸即标记氨基酸。标记化合物为能够通过生化、化学、免疫化学或电磁检测方法检测的物质。作为标记化合物，可举出色素化合物、荧光物质、化学发光物质、生物发光物质、酶底物、辅酶、抗原性物质、与特定的蛋白质结合的物质、磁性物质等。若按功能分类标记氨基酸，则例如有荧光标记氨基酸、光响应性氨基酸、光转换氨基酸、荧光探针氨基酸等。
标记氨基酸可以是氨基酸与标记化合物直接结合，也可以是氨基酸与标记化合物经由间隔区结合。作为间隔区，可举出聚乙烯、聚丙烯等聚烯烃；聚氧乙烯、聚乙二醇、聚乙烯醇等聚醚；聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚氨酯、聚碳酸酯等。
作为天然氨基酸、非天然氨基酸或修饰化氨基酸的衍生物，例如可举出羟酸、巯基酸及羧酸。
作为本发明的氨酰基tRNA的实施方式例，可举出在tRNA上结合有选自包括氯乙酰化赖氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基苯丙氨酸及荧光标记氨基酸的组中的1种的氨酰基tRNA。
作为用氨基酸酰化本发明的tRNA的方法，可举出下述方法。
预先使tRNA的3’末端的CA二核苷酸脱落。另一方面，预先将CA二核苷酸结合在氨基酸的羧基。将两者使用RNA连接酶连接。本方法已经是公知的方法，其详细内容例如公开于国际公开2004/009709号及国际公开2007/055429号中。在本发明的氨酰基tRNA的制作中能够采用这些文献中公开的方法。
＜多肽合成用试剂＞
作为多肽合成用试剂，本发明提供两种方式的多肽合成用试剂(即，第一多肽合成用试剂及第二多肽合成用试剂)。
第一多肽合成用试剂包含：
山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA；及
肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA。
在第一多肽合成用试剂中，上述两种tRNA可以是混合状态，也可以是非混合状态。第一多肽合成用试剂可以进一步包含除上述两种tRNA以外的tRNA。
第二多肽合成用试剂包含：
在山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA上结合有第一非天然氨基酸的氨酰基tRNA；及
在肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA上结合有第二非天然氨基酸的氨酰基tRNA。
在第二多肽合成用试剂中，上述两种氨酰基tRNA可以是混合状态，也可以是非混合状态。第二多肽合成用试剂可以进一步包含除上述两种氨酰基tRNA以外的氨酰基tRNA。
在第二多肽合成用试剂中，第一非天然氨基酸及第二非天然氨基酸为不同种类的氨基酸。第一非天然氨基酸及第二非天然氨基酸分别包含非天然氨基酸；天然氨基酸或非天然氨基酸的修饰化氨基酸；或者天然氨基酸、非天然氨基酸或修饰化氨基酸的衍生物。这些氨基酸的详细内容如上所述。
以下，将山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA称为“UAG密码子翻译tRNA”。
以下，将肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA称为“UAA密码子翻译tRNA”。
本发明的多肽合成用试剂是组合使用UAG密码子翻译tRNA及UAA密码子翻译tRNA的试剂。通过将两种tRNA用不同非天然氨基酸进行酰化并组合使用，能够在多肽中导入至少两种非天然氨基酸。
第一多肽合成用试剂例如通过用非天然氨基酸进行酰化后添加到无细胞肽合成系统中来使用。第二多肽合成用试剂例如通过添加到无细胞肽合成系统中来使用。根据这些使用方式，能够在通过无细胞肽合成系统合成的多肽上导入至少两种非天然氨基酸。无细胞肽合成系统的详细内容如下所述。
第一多肽合成用试剂只要至少包含合成多肽时所需的要素中的UAG密码子翻译tRNA及UAA密码子翻译tRNA即可。
第二多肽合成用试剂只要至少包含合成多肽时所需的要素中结合有第一非天然氨基酸的UAG密码子翻译tRNA及结合有第二非天然氨基酸的UAA密码子翻译tRNA即可。
本发明的多肽合成用试剂可以包含合成多肽时所需的所有要素。本发明的多肽合成用试剂可以包含用于多肽合成的器具。
山羊支原体的色氨酸用tRNA的变体即UAG密码子翻译tRNA被公开于国际公开2007/055429号中。能够将在国际公开2007/055429号中公开的tRNA变体采用于本发明的多肽合成用试剂以及、后面叙述的非天然氨基酸的导入方法、多肽的制作方法及核酸展示文库的制作方法中。
从有效地将UAG密码子翻译成氨基酸的观点考虑，山羊支原体的色氨酸用tRNA的变体即UAG密码子翻译tRNA优选包含选自包括下述形态(A)、形态(B)及形态(C)的组中的至少一种形态。
形态(A)：5’末端和与该碱基配对的碱基的组合为GC。在此，关于2个碱基的记载，先记载5’末端的碱基。5’末端的碱基为G，在三叶草结构中与5’末端的碱基配对的碱基为C。
形态(B)：从3’末端起第4个碱基为A。
形态(C)：A、C、G或U插入到与CCA末端的5’侧相邻的位置。
能够基于山羊支原体的野生型色氨酸用tRNA的碱基序列并使用公知的基因工程技术来制作山羊支原体的色氨酸用tRNA的变体。例如，设计tRNA基因，通过使用适当的引物的PCR制作tRNA基因，并从tRNA基因转录tRNA。
＜非天然氨基酸的导入方法、多肽的制作方法＞
本发明的非天然氨基酸的导入方法是将至少两种非天然氨基酸导入到多肽中的方法，其包括通过无细胞肽合成系统从核酸表达多肽的步骤。
本发明的多肽的制作方法是制作在氨基酸序列中包含至少两种非天然氨基酸的多肽的方法，其包括通过无细胞肽合成系统从核酸表达多肽的步骤。
本发明的非天然氨基酸的导入方法及多肽的制作方法中的无细胞肽合成系统含有：
具有包含UAG密码子及UAA密码子的碱基序列的核酸；
在山羊支原体的色氨酸用tRNA的变体即UAG密码子翻译tRNA上结合有第一非天然氨基酸的氨酰基tRNA；及
在肺炎支原体的色氨酸用tRNA的变体即UAA密码子翻译tRNA上结合有第二非天然氨基酸的氨酰基tRNA。
第一非天然氨基酸及第二非天然氨基酸为不同种类的氨基酸。第一非天然氨基酸及第二非天然氨基酸分别包含非天然氨基酸；天然氨基酸或非天然氨基酸的修饰化氨基酸；或者天然氨基酸、非天然氨基酸或修饰化氨基酸的衍生物。这些氨基酸的详细内容如上所述。
无细胞肽合成系统是用于合成多肽的反应系统，并且是不使用细胞其本身而进行(1)核酸的翻译的系统、或进行(2)核酸的转录及翻译的系统。无细胞肽合成系统由模板核酸、核糖体、用于转录和/或翻译的因子及酶、除这些以外系统的构成所需的酶类、各种底物、能源、缓冲液及盐类构成。作为用于转录和/或翻译的因子及酶，可举出来源于肠菌大等原核细胞的物质；来源于小麦芽、动物细胞、昆虫细胞等真核细胞的物质等。
在无细胞肽合成系统中，模板核酸可以为DNA，也可以为RNA。在DNA中，将UAG密码子读作TAG，并将UAA密码子读作TAA。
模板核酸可以为单链核酸，也可以为双链核酸。模板核酸可以为线状核酸，也可以为环状核酸。模板核酸可以为将合成多肽时所需的碱基序列编入到载体(质粒载体、粘粒载体等)中的核酸。
模板核酸具有通过无细胞肽合成系统合成多肽时所需的碱基序列。合成多肽时所需的碱基序列不仅是排列有与多肽的氨基酸序列对应的密码子的碱基序列(即编码区域)，除此以外例如还是启动子序列、核糖体结合序列。
模板核酸的碱基序列可以包含终止密码子，也可以不包含终止密码子。在此，终止密码子是指不具有配对的tRNA的密码子。终止密码子的一例为UGA密码子。在模板核酸的碱基序列不包含终止密码子的情况下，可以形成mRNA-核糖体-多肽连接体。
进行(1)核酸(例如RNA)的翻译的无细胞肽合成系统包含核糖体、翻译起始因子、翻译延伸因子、翻译终止因子、氨酰基tRNA合成酶、通过氨酰基tRNA合成酶酰化的tRNA及与氨基酸结合的本发明的tRNA，在来源于大肠菌的系统的情况下，进一步包含甲硫氨酰tRNA转化酶。
进行(2)核酸(例如DNA)的转录及翻译的无细胞肽合成系统除(1)的构成物质以外还包含RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)及RNA聚合酶的底物即三磷酸核苷。
在(1)及(2)中的任一个中，都能够通过从构成物质去除翻译终止因子来形成mRNA-核糖体-多肽连接体。
作为除用于转录和/或翻译的因子及酶以外的酶类，例如可举出肌酸激酶、肌激酶、核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase；NDPK)等用于再生能量的酶；无机焦磷酸酶等用于分解转录和/或翻译中产生的无机焦磷酸的酶等。
作为各种底物，可举出天然氨基酸和/或非天然氨基酸、作为能源的核苷酸三磷酸、磷酸肌酸、甲酰叶酸等。作为核苷酸三磷酸，可举出ATP、GTP、CTP、UTP，在(1)中使用ATP及GTP，在(2)中使用ATP、GTP、CTP及UTP。
作为缓冲液，通常使用磷酸钾缓冲液(pH7.3)。作为盐类，通常使用谷氨酸钾、氯化铵、乙酸镁、氯化钙、腐胺(putrescine)、精胺(spermidine)、二硫苏糖醇(dithiothreitol；DTT)等。
本发明的非天然氨基酸的导入方法及多肽的制作方法能够采用公知的所有无细胞肽合成系统。作为无细胞肽合成系统的市售品的例，可举出PUREfrex(Genefrontier、“PUREfrex”是注册商标)、Human Cell-Free Protein Expression System(人无细胞蛋白质表达系统)(BIO INC.)、Rapid Translation System(快速翻译系统)(Roche)、Expressway Cell-Free Expression System(Expressway无细胞表达系统)(Invitrogen)等。
本发明的非天然氨基酸的导入方法及多肽的制作方法中，编码多肽的碱基序列的UAG密码子及UAA密码子分别被结合有第一非天然氨基酸的UAG密码子翻译tRNA及结合有第二非天然氨基酸的UAA密码子翻译tRNA翻译，并且至少两种非天然氨基酸被导入到多肽中。
作为多肽的实施方式例，可举出在一个分子中包含N-甲基氨基酸(例如N-甲基丙氨酸或N-甲基苯丙氨酸)、具有氯乙酰基的氨基酸(例如氯乙酰基二氨基丁酸或氯乙酰化赖氨酸)及具有硫醇基的氨基酸(例如半胱氨酸)的多肽。在合成该多肽时使用结合有N-甲基氨基酸的UAG密码子翻译tRNA及结合有具有氯乙酰基的氨基酸的UAA密码子翻译tRNA(或结合有具有氯乙酰基的氨基酸的UAG密码子翻译tRNA及结合有N-甲基氨基酸的UAA密码子翻译tRNA)即可。该多肽通过氯乙酰基及硫醇基反应并环化而成为环状N-甲基多肽。环状N-甲基多肽的氨基酸残基数例如为3个～20个。
＜核酸展示文库的制作方法、核酸-多肽连接体＞
核酸展示文库将核酸-多肽连接体作为构成单位，是指多个核酸-多肽连接体的集合。构成核酸展示文库的核酸-多肽连接体的克隆数及复制数不受限制。
本发明的核酸-多肽连接体是连接了在氨基酸序列中包含至少两种非天然氨基酸的多肽以及具有编码该多肽的碱基序列的核酸的核酸-多肽连接体，其中，
碱基序列包含UAG密码子及UAA密码子，
在碱基序列中UAG密码子编码多肽中的第一非天然氨基酸，
在碱基序列中UAA密码子编码多肽中的第二非天然氨基酸。
作为本发明的核酸-多肽连接体的实施方式例，可举出mRNA-多肽连接体或cDNA-多肽连接体。cDNA-多肽连接体是mRNA-多肽连接体的反向转录产物。在cDNA-多肽连接体中，将UAG密码子读作TAG，并将UAA密码子读作TAA。
在本发明的核酸-多肽连接体中，核酸及多肽例如经由嘌呤霉素连接体或核糖体连接。
本发明的核酸展示文库的制作方法包括通过无细胞肽合成系统从核酸表达多肽并制作核酸-多肽连接体的步骤。
本发明的核酸展示文库的制作方法中的无细胞肽合成系统以在多肽中导入至少两种非天然氨基酸为目的而含有：
具有包含UAG密码子及UAA密码子的碱基序列的核酸；
在山羊支原体的色氨酸用tRNA的变体即UAG密码子翻译tRNA上结合有第一非天然氨基酸的氨酰基tRNA；及
在肺炎支原体的色氨酸用tRNA的变体即UAA密码子翻译tRNA上结合有第二非天然氨基酸的氨酰基tRNA。
无细胞肽合成系统可以是进行(1)核酸的翻译的系统或进行(2)核酸的转录及翻译的系统中的任一个。无细胞肽合成系统的详细内容如上所述。在本发明的核酸展示文库的制作方法中能够采用公知的所有无细胞肽合成系统以及公知的所有核酸展示文库的制作技术。
在无细胞肽合成系统中，模板核酸可以为DNA，也可以为RNA。模板核酸是例如通过使用包含随机序列的随机引物组来进行重叠延伸PCR制作的双链DNA片段的群体。随机序列例如是三联体的重复序列[NNK]m(在此，m为正整数、N分别独立地为A、T、G或C，K分别独立地为T或G)。能够通过将三联体[NNK]的重复次数设定为任意数来制作任意长度的肽。从抑制终止密码子的出现的观点考虑，随机序列优选为对1种氨基酸分配1种密码子的三聚体寡核苷酸。
从提高多肽的柔软性的观点考虑，优选在模板核酸的3’末端侧存在编码间隔区的碱基序列。间隔区例如是选自甘氨酸及丝氨酸中的至少1个氨基酸。
本发明的核酸展示文库的制作方法的实施方式的一例包括：制作mRNA-多肽连接体的步骤；及反向转录mRNA-多肽连接体的mRNA并制作cDNA-多肽连接体的步骤。根据本实施方式例，由于核酸-多肽连接体的核酸为DNA，因此可得到化学上更稳定的核酸展示文库。
在本发明的核酸展示文库的制作方法中，被翻译的核酸(通常为mRNA)与翻译产物的连接可以为经由嘌呤霉素连接体的连接及经由核糖体的连接等中的任一个。从翻译产物容易形成适当的超分子结构的观点及容易评价翻译产物的功能的观点考虑，被翻译的核酸与翻译产物的连接优选为经由嘌呤霉素连接体的连接。
因此，无细胞肽合成系统中被翻译的核酸优选为在3’末端附加有嘌呤霉素连接体的核酸。作为用于将嘌呤霉素附加到核酸的连接体，从抑制核酸与嘌呤霉素的解离的观点考虑，优选为2’-邻-甲基化的核酸连接体或在5’末端具有紫外线交联性化合物的核酸连接体。
在本发明的核酸展示文库的制作方法中，由于在保持20种天然氨基酸的密码子的状态下进一步将UAG密码子及UAA密码子使用于氨基酸的翻译中，因此能够多样化构成核酸展示文库的多肽的氨基酸序列。
＜筛选方法＞
本发明的筛选方法包括：通过本发明的核酸展示文库的制作方法制作核酸展示文库的步骤；及从核酸展示文库选择具有目标活性的核酸-多肽连接体并鉴定所选择的核酸-多肽连接体的核酸的碱基序列的步骤。
“目标活性”例如是指与目标物质的结合。目标物质是包含表现出生理活性的所有化学物质的用语，并且是包含化合物、基团、分子、蛋白质、核酸、脂质、糖质、这些的复合体等的用语。目标物质例如是受体、转录因子、酶、辅酶、调节因子、抗体、抗原、DNA、RNA、这些的片段、这些的复合体、这些的修饰基团。
本发明的筛选方法的实施方式的一例包括使核酸展示文库与目标物质(例如，目标蛋白质)接触而恒温培养的步骤。例如，使核酸展示文库与目标物质在缓冲液中接触，并调节缓冲液的pH及温度以及接触时间来进行恒温培养。此时，可以预先将目标物质固定在固相载体上，并使核酸展示文库与被固定的目标物质接触。固相载体只要是能够固定目标物质的载体，则没有限制，可举出微量滴定板、基板、珠、磁性珠、硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDF膜等。通过公知的技术将目标物质固定在这些固相载体上。
在上述接触之后，提取与目标物质(例如，目标蛋白质)结合的核酸-多肽连接体，并鉴定所提取的核酸-多肽连接体的核酸的碱基序列。碱基序列的鉴定能够使用核酸扩增系统及定序器来实施。
核酸扩增系统是指以核酸为模板来扩增核酸的系统。核酸扩增系统的核酸扩增反应可以为聚合酶链反应(polymerase chain reaction；PCR)、连接酶链反应(ligase chainreaction；LCR)、TMA(transcription mediated amplification，转录介导的扩增)、NASBA(nucleic acid sequence-based amplification，基于核酸序列的扩增)等中的任一个。
在本发明中，“定序器”是将第一代定序器(毛细管定序器)、第二代定序器(下一代定序器)、第三代定序器、第四代定序器及今后开发的定序器包括在内的术语。定序器可以是毛细管定序器，也可以是下一代定序器，也可以是其他定序器。作为定序器，从分析速度，一次可处理的试样数量的多少等观点考虑，优选下一代定序器。下一代定序器(nextgeneration sequencer，NGS)是指与使用桑格法的毛细管定序器(称为第一代定序器。)对比来进行分类的定序器。当前最为普及的下一代定序器是捕捉与DNA聚合酶的互补链合成或DNA连接酶的互补链结合联动的荧光或发光来决定碱基序列的原理的定序器。具体而言，可以举出MiSeq(Illumina,Inc.，MiSeq为注册商标)、HiSeq2000(Illumina,Inc.，HiSeq为注册商标)、Roche454(Roche Diagnostics K.K.)等。
根据本发明的筛选方法，能够从导入有至少两种非天然氨基酸的多肽中选出具有目标活性的多肽、编码该多肽的碱基序列及该多肽的氨基酸序列。
实施例
以下举出具体例并通过本发明的tRNA等具体地进行说明。以下具体例中示出的材料、处理步骤等只要不脱离本发明的宗旨，则能够适当进行变更。本发明的tRNA等范围不应被以下所示的具体例限定地解释。
在以下说明中，若无特别说明，则合成、处理、制造等在室温(25℃±3℃)下进行。物质浓度的百分比为质量基准。物质浓度的“M”表示摩尔浓度，为1M＝1mol/L。
以下说明中，简称具有下述含义。
AcOK：乙酸钾
α-CHCA：α-氰基-4-羟基肉桂酸
BSA：牛血清白蛋白
DMSO：二甲亚砜
dNTP：脱氧核苷三磷酸
D-PBS：Dulbecco's phosphate buffered saline(杜氏磷酸盐缓冲液)
DTT：二硫苏糖醇
GMP：鸟苷一磷酸
NTP：核苷三磷酸
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
＜实施例1＞
分别改变山羊支原体、肺炎支原体、金黄色葡萄球菌及希瓦氏菌各自的色氨酸用tRNA，设计了序列号1～4的tRNA作为在反密码子上具有UUA的tRNA。
-tRNA基因的制作-
根据序列号1～4的碱基序列，化学合成了2个寡核苷酸作为引物。正向引物包含T7启动子及tRNA的第1个～第51个碱基序列。反向引物包含tRNA的第36个～第74个(直到CCA末端的第1个C)碱基序列。使用该引物来进行PCR，纯化PCR产物而获得tRNA基因。将该基因称为tRNA-CA基因。PCR反应液包含KOD Dash Buffer、0.2mM dNTP、2.5单位KOD Dash，在100μL中包含0.2nmol的各引物。纯化PCR产物时使用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司)。
-tRNA的制作-
转录tRNA-CA基因并纯化转录产物而获得tRNA。将该tRNA称为tRNA-CA。转录的反应液100μL包含40mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM MgCl2，5mM DTT，4mM NTP，20mM GMP，2mM精胺，10μg/mL BSA，40单位酶抑制剂，0.5单位焦磷酸酶，400单位T7 RNA聚合酶，6μg tRNA-CA基因。使反应液在37℃下反应12小时，并通过RNEasy Minelute Cleanup Kit(QIAGEN公司)纯化了tRNA-CA。
-tRNA的氨酰化-
使BODIPYFL-氨基苯丙氨酸与tRNA结合。将该tRNA称为荧光标记氨基酸-tRNA。将4μL的5×Ligation Buffer(连接缓冲液)(275mM Hepes-Na(pH7.5)、75mM MgCl2、16.5mMDTT、5mM ATP)、2.5μL的200μM tRNA-CA、2μL的BODIPYFL-氨基苯丙氨酸-pdCpA的DMSO溶液、0.4μL的0.1％BSA、0.6μL的T4 RNA Ligase(40单位s/μL)、10.5μL的水进行混合，并在4℃下使这些反应2小时。添加20μL的0.3M AcOK(pH4.5)及120μL的乙醇并轻轻混合，且在-80℃下放置30分钟。在4℃下以15000rpm离心分离30分钟后，去除上清液并向其添加200μL的在-30℃下保存的70％乙醇，并在4℃下以15000rpm离心分离了1分钟。去除上清液，进行了减压干燥。将其溶解在3μL的1mM AcOK(pH4.5)中。
-在多肽中导入荧光标记氨基酸-
准备了具有编码包含20个氨基酸的多肽(序列号20：MCKXKPRSKNMSDYKDDDDK。X为非天然氨基酸)的碱基序列(序列号21：ATGTGCAAATAAAAACCGCGGAGCAAAAACATGAGCGATTATAAAGATGA TGATGATAAG)的DNA。将该多肽及DNA称为多肽(1)及DNA(1)。多肽(1)包含FLAG标签，氨基酸序列的第13个～第20个为FLAG标签。DNA(1)包含基于PUREfrex2.0的多肽(1)的表达中所需的所有碱基序列。
转录DNA(1)，纯化转录产物而获得mRNA。除在反应液中不添加20mM GMP以外，以与从tRNA-CA基因的上述转录相同的方式进行从DNA(1)的转录。
使用荧光标记氨基酸-tRNA及PUREfrex2.0(Genefrontier公司)并从DNA(1)的转录产物且纯化产物即mRNA翻译了多肽(1)。10μL的反应液中包含5μL的PUREfrex2.0的Solution(溶液)I、0.5μL的SolutionII、1μL的SolutionIII、1μL的16μM mRNA、1μL的荧光标记氨基酸-tRNA溶液及1.5μL的水。翻译反应在25℃下进行1小时。
-荧光标记氨基酸的导入效率的评价-
向1μL的翻译反应后的反应液中添加9μL的1×样品缓冲液。将其中的5μL供于15％SDS-PAGE(0.1％SDS)中。用荧光扫描仪(Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.、FMBIO-III)观察了电泳凝胶。通过488nm激发/520nm检测，确认荧光标记氨基酸导入到多肽(1)中，并定量了其导入效率。在表2中示出将序列号1作为基准值1.00的相对值。
另一方面，向9μL的翻译反应后的反应液中添加81μL的D-PBS(-)(nacalaitesque)及20μL的抗FLAGM2磁性珠(Sigma-Aldrich公司)，并在室温下振荡了30分钟。将磁性珠用200μL的D-PBS(-)清洗了5次。向磁性珠添加9μL的2％甲酸水溶液，并在室温下振荡了1小时。收集上清液作为多肽(1)的纯化物。混合0.75μL的纯化溶液及0.75μL的饱和α-CHCA溶液(50％乙腈/0.1％三氟乙酸)，并进行质量分析(Bruker公司ultrafleXtreme、正模式测定)。确认到多肽(1)中导入有荧光标记氨基酸。
[表2]
显现出肺炎支原体的色氨酸用tRNA的变体的优越性。
＜实施例2＞
将肺炎支原体的色氨酸用tRNA进行改变，设计了序列号5～9的tRNA作为在反密码子上具有UUA的tRNA。对序列号5～9的tRNA，以与实施例1相同的方法，进行tRNA基因的制作、tRNA的制作、tRNA的氨酰化、荧光标记氨基酸向多肽的导入及导入效率的评价。在表3中示出将序列号2作为基准值1.00的相对值。
[表3]
序列号2 序列号5 序列号6 序列号7 序列号8 序列号9
荧光标记多肽带/总荧光带 1.00 0.79 O.83 1.04 1.15 1.05
序列号7、序列号8及序列号9的tRNA具有较高的荧光标记氨基酸的导入效率。这表明，在肺炎支原体的色氨酸用tRNA中，显现出从5’末端起第3个碱基和与该碱基配对的碱基的组合为UA、GU或UG的tRNA的优越性。
＜实施例3＞
将肺炎支原体的色氨酸用tRNA进行改变，设计了序列号10～14的tRNA作为在反密码子上具有UUA的tRNA。对序列号10～14的tRNA，以与实施例1相同的方法，进行tRNA基因的制作、tRNA的制作、tRNA的氨酰化、荧光标记氨基酸向多肽的导入及导入效率的评价。在表4中示出将序列号2作为基准值1.00的相对值。
[表4]
序列号2 序列号10 序列号11 序列号12 序列号13 序列号14
荧光标记多肽带/总荧光带 1.00 0.71 0.57 0.86 1.03 0.83
序列号13的tRNA具有较高的荧光标记氨基酸的导入效率。这表明，在肺炎支原体的色氨酸用tRNA中，显现出从5’末端起第4个碱基和与该碱基配对的碱基的组合为GU的tRNA的优越性。
<实施例4>
将肺炎支原体的色氨酸用tRNA进行改变，设计了序列号15～17的tRNA作为在反密码子上具有UUA的tRNA。对序列号15～17的tRNA，以与实施例1相同的方法，进行tRNA基因的制作、tRNA的制作、tRNA的氨酰化、荧光标记氨基酸向多肽的导入及导入效率的评价。在表5中示出将序列号2作为基准值1.00的相对值。
[表5]
序列号2 序列号15 序列号16 序列号17
荧光标记多肽带/总荧光带 1.00 1.04 0.89 1.08
序列号17的tRNA具有较高的荧光标记氨基酸的导入效率。这表明，在肺炎支原体的色氨酸用tRNA中，显现出从5’末端起第4个碱基和与该碱基配对的碱基的组合为GU且与CCA末端的5’侧相邻的碱基为G的tRNA的优越性。
＜实施例5＞
将甲酰胺添加到序列号2及5～17的tRNA中，进行热处理(95℃、3分钟)，并在10×加样缓冲液(TaKaRa，9157)中混合。用含尿素的丙烯酰胺凝胶(SuperSepTM RNA，15％，17孔(Wako，194-15881))进行电泳，并用染色试剂(Gel Red Nucleic Acid Gel Stain(Biotium，41003))染色而进行了检测。在图2中示出染色后的电泳凝胶。在图2中凝胶上的数字是序列号。
在图2的凝胶中，在非天然氨基酸导入效率较高的序列号7～9、13及17中确认了tRNA的超分子结构的变化及尖锐的带强度。
＜实施例6＞
准备了对DNA(1)中编码多肽(1)的碱基序列(序列号21)进行取代的DNA(a)～(d)。DNA(a)～(d)分别具有对序列号21进行下述取代的碱基序列。
DNA(a)：在序列号21中，将第4个密码子取代为TAG，并将第11个密码子取代为TAA的DNA。
DNA(b)：在序列号21中，将第4个密码子及第5个密码子取代为TAG，并将第11个密码子取代为TAA的DNA。
DNA(c)：在序列号21中，将第4个密码子及第6个密码子取代为TAG，并将第11个密码子取代为TAA的DNA。
DNA(d)：在序列号21中，将第4个密码子及第7个密码子取代为TAG，并将第11个密码子取代为TAA的DNA。
准备序列号19的tRNA作为山羊支原体的色氨酸用tRNA的变体即UAG密码子翻译tRNA，并在该tRNA上结合N-甲基苯丙氨酸或BODIPYFL-氨基苯丙氨酸。
准备序列号2的tRNA作为肺炎支原体的色氨酸用tRNA的变体即UAA密码子翻译tRNA，并在该tRNA上结合N-甲基苯丙氨酸或BODIPYFL-氨基苯丙氨酸。
以与实施例1相同的方法，进行tRNA基因的制作、tRNA的制作、tRNA的氨酰化、荧光标记氨基酸向多肽的导入及导入效率的评价。在图3中示出电泳凝胶。图3左侧的凝胶是纯化前的试样的电泳凝胶，图3右侧的凝胶是利用FLAG标签的纯化后的试样的电泳凝胶。
在图3中，凝胶上的数字表示下述多肽。
(1)从DNA(a)翻译且使用结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合N-甲基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(2)从DNA(a)翻译且使用结合N-甲基苯丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(3)从DNA(b)翻译且使用结合N-甲基苯丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(4)从DNA(c)翻译且使用结合N-甲基苯丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(5)从DNA(d)翻译且使用结合N-甲基苯丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
在图3右侧的凝胶中，比较浓的带是多肽。从纯化后的多肽带的检测可以看出，能够通过使用两种tRNA变体来将荧光标记氨基酸及N-甲基苯丙氨酸多次导入到多肽中。
＜实施例7＞
进行与实施例6相同的实验，但是追加进行在被翻译的mRNA的3’末端结合嘌呤霉素的步骤。在UAG密码子翻译tRNA及UAA密码子翻译tRNA中结合N-甲基苯丙氨酸、N-甲基丙氨酸或BODIPYFL-氨基苯丙氨酸。在图4中示出电泳凝胶。
在图4中，凝胶上的数字表示下述多肽。
(6)从DNA(a)翻译且使用结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合N-甲基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(7)从DNA(a)翻译且使用结合N-甲基苯丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(8)从DNA(b)翻译且使用结合N-甲基苯丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(9)从DNA(c)翻译且使用结合N-甲基苯丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(10)从DNA(d)翻译且使用结合N-甲基苯丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(11)从DNA(a)翻译且使用结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合N-甲基丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(12)从DNA(a)翻译且使用结合N-甲基丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(13)从DNA(b)翻译且使用结合N-甲基丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(14)从DNA(c)翻译且使用结合N-甲基丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
(15)从DNA(d)翻译且使用结合N-甲基丙氨酸的UAG密码子翻译tRNA、以及结合BODIPYFL-氨基苯丙氨酸的UAA密码子翻译tRNA翻译的多肽。
在图4的凝胶中，底部的粗带是BODIPYFL-氨基苯丙氨酸，其稍微上方的带是多肽，98kDa附近的细带是mRNA-多肽连接体。
从图4的凝胶可以看出，能够实现多次导入荧光标记氨基酸及N-甲基苯丙氨酸的mRNA展示。
日本专利申请第2021-156183号的发明整体通过参考并入到本说明书中。本说明书中记载的所有文献、专利申请及技术标准可与具体且分别记载通过参考援用每一个文献、专利申请及技术标准的情况相同程度地援用于本说明书中，并且并入到本说明书中。

Claims (20)

1.一种tRNA，其是肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变的tRNA，其中，
作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对。
2.根据权利要求1所述的tRNA，其中，
与CCA末端的5’侧相邻的碱基为A或G。
3.根据权利要求1或2所述的tRNA，其中，
从5’末端起第3个碱基和与该碱基配对的碱基的组合为UA、GU或UG。
4.根据权利要求1或2所述的tRNA，其中，
从5’末端起第4个碱基和与该碱基配对的碱基的组合为GU。
5.一种tRNA，其具有选自序列号7、序列号8、序列号9、序列号13、序列号15及序列号17中的1种碱基序列，
序列号7：GGUGGUGUAG UUUAGUGGCA GAACAACAGU CUUUAAAACU GUCUGUGUGG GUUCGAUUCCUUCCACCACC ACCA
序列号8：GGGGGUGUAG UUUAGUGGCA GAACAACAGU CUUUAAAACU GUCUGUGUGG GUUCGAUUCCUUCCACCUCC ACCA
序列号9：GGUGGUGUAG UUUAGUGGCA GAACAACAGU CUUUAAAACU GUCUGUGUGG GUUCGAUUCCUUCCACCGCC ACCA
序列号13：GGGGGUGUAG UUUAGUGGCA GAACAACAGU CUUUAAAACU GUCUGUGUGGGUUCGAUUCC UUCCACUCCC ACCA
序列号15：GGGGGUGUAG UUUAGUGGCA GAACAACAGU CUUUAAAACU GUCUGUGUGGGUUCGAUUCC UUCCACCCCC GCCA
序列号17：GGGGGUGUAG UUUAGUGGCA GAACAACAGU CUUUAAAACU GUCUGUGUGGGUUCGAUUCC UUCCACUCCC GCCA。
6.一种氨酰基tRNA，其在权利要求1至5中任一项所述的tRNA上结合有氨基酸。
7.根据权利要求6所述的氨酰基tRNA，其中，
所述氨基酸为选自非天然氨基酸、修饰化氨基酸及这些的衍生物中的1种。
8.根据权利要求6所述的氨酰基tRNA，其中，
所述氨基酸为选自氯乙酰化赖氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基苯丙氨酸及荧光标记氨基酸中的1种。
9.一种多肽合成用试剂，其包含：
山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA；及
肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA。
10.一种多肽合成用试剂，其包含：
在山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA上结合有第一非天然氨基酸的氨酰基tRNA；及
在肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA上结合有第二非天然氨基酸的氨酰基tRNA。
11.一种非天然氨基酸的导入方法，其是将至少两种非天然氨基酸导入到多肽中的方法，其包括通过无细胞肽合成系统从具有包含UAG密码子及UAA密码子的碱基序列的核酸表达多肽的步骤，所述无细胞肽合成系统含有：
所述核酸；
在山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA上结合有第一非天然氨基酸的氨酰基tRNA；及
在肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA上结合有第二非天然氨基酸的氨酰基tRNA。
12.根据权利要求11所述的非天然氨基酸的导入方法，其中，
所述碱基序列进一步包含终止密码子即UGA密码子。
13.一种多肽的制作方法，其是制作在氨基酸序列中包含至少两种非天然氨基酸的多肽的方法，其包括通过无细胞肽合成系统从具有包含UAG密码子及UAA密码子的碱基序列的核酸表达多肽的步骤，所述无细胞肽合成系统含有：
所述核酸；
在山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA上结合有第一非天然氨基酸的氨酰基tRNA；及
在肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA上结合有第二非天然氨基酸的氨酰基tRNA。
14.根据权利要求13所述的多肽的制作方法，其中，
所述碱基序列进一步包含终止密码子即UGA密码子。
15.一种核酸展示文库的制作方法，其包括通过无细胞肽合成系统从具有包含UAG密码子及UAA密码子的碱基序列的核酸表达多肽并制作核酸-多肽连接体的步骤，所述无细胞肽合成系统含有：
所述核酸；
在山羊支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有CUA并与UAG密码子配对的tRNA上结合有第一非天然氨基酸的氨酰基tRNA；及
在肺炎支原体的色氨酸用tRNA被改变并且作为反密码子具有UUA并与UAA密码子配对的tRNA上结合有第二非天然氨基酸的氨酰基tRNA。
16.根据权利要求15所述的核酸展示文库的制作方法，其中，
制作所述核酸-多肽连接体的步骤包括：
制作mRNA-多肽连接体的步骤；及
反向转录所述mRNA-多肽连接体的mRNA并制作cDNA-多肽连接体的步骤。
17.根据权利要求15或16所述的核酸展示文库的制作方法，其中，
在所述核酸-多肽连接体中的核酸及多肽通过嘌呤霉素连接体连接。
18.一种核酸-多肽连接体，其是连接了在氨基酸序列中包含至少两种非天然氨基酸的多肽以及具有编码所述多肽的碱基序列的核酸的核酸-多肽连接体，其中，
所述碱基序列包含UAG密码子及UAA密码子，
在所述碱基序列中所述UAG密码子编码所述多肽中的第一非天然氨基酸，
在所述碱基序列中所述UAA密码子编码所述多肽中的第二非天然氨基酸。
19.根据权利要求18所述的核酸-多肽连接体，其是mRNA-多肽连接体或cDNA-多肽连接体。
20.一种筛选方法，其包括：
通过权利要求15至17中任一项所述的核酸展示文库的制作方法制作核酸展示文库的步骤；及
从所述核酸展示文库选择具有目标活性的核酸-多肽连接体，并鉴定所选择的核酸-多肽连接体的核酸的碱基序列的步骤。
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