CN118019540A

CN118019540A - 用于治疗多发性硬化的lou064

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Publication number: CN118019540A
Application number: CN202280059621.XA
Authority: CN
Inventors: S·巴塔查里亚; B·比耶特; B·岑尼; P·恩德; G·格拉哈姆; M·容克; R·S·卡兰; A·D·曼; E·皮若莱; K·拉普; 善金贤; 于慧心; 张鹰
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2022-09-01
Publication date: 2024-05-10

Abstract

本发明涉及用于有效治疗多发性硬化(MS)的LOU064或其药学上可接受的盐。

Description

用于治疗多发性硬化的LOU064

技术领域

背景技术

多发性硬化(MS)是一种免疫介导的慢性中枢神经系统疾病，其特征是炎症、脱髓鞘和轴突/神经元破坏，最终导致严重残疾。尽管无法治愈所述疾病，但是可以使用多种疾病缓解疗法(DMT)，这些疗法通常减缓疾病进展。

尽管大多数针对MS的疾病缓解疗法已被概念化为通过基于T细胞的机制起作用，但越来越多的数据表明这些DMT对B细胞也有明显的影响。常见的主题包括促进初始B细胞而不是记忆细胞或浆母细胞(阿仑单抗)；将B细胞细胞因子转变为抗炎基调状态(β干扰素、醋酸格拉替雷、芬戈莫德)；增加调节性B细胞(β干扰素、醋酸格拉替雷、芬戈莫德和富马酸二甲酯)；减少抗原呈递所需的B细胞上的II类MHC表达和共刺激分子(β干扰素和富马酸二甲酯)；隔离淋巴器官中的B细胞(芬戈莫德)；阻断VLA-4介导的B细胞运输至CNS(那他珠单抗)；或B细胞的直接细胞溶解(阿仑单抗、特立氟胺、米托蒽醌)，参见Greenfield等人,Ann.Neurol.[神经学年报]2018年1月；83(1):13-26。

虽然这些DMT通常会显著降低复发率和MRI疾病活动，从而延迟残疾恶化的时间，但通常(严重)不良事件可能与这些DMT中的每一个有关。例如，那他珠单抗可能导致致命的机会性感染(即进展性多灶性白质脑病或PML)的风险增加，而一些口服DMT可能与S1P相关的安全性风险有关，例如治疗开始后缓慢性心律失常、黄斑水肿、高血压和肝转氨酶升高。

患有MS的患者的另一种治疗选择是通过施用靶向表达CD20的B细胞的单克隆抗体(例如奥法木单抗、奥瑞珠单抗、利妥昔单抗、奥比妥珠单抗和乌妥昔单抗)来非特异性耗减B细胞，参见Torke,S.和Weber,M.S.(2020),Expert Opinion on Investigational Drugs[对研究药物的专家意见],29:10,1143-1150。

然而，长期试验强调随着B细胞耗竭药剂的终生剂量增加，免疫系统的关键功能可能受到损害。

尽管如此，鉴于持久免疫抑制疗法的长期影响，例如体液能力下降，需要可持续和灵活的方法来控制MS驱动的致病性B细胞，特别是让医生在治疗方案中具有灵活性。

最近，已有建议将布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的治疗抑制作为实现这一目标的新颖策略。

BTK是集中参与B细胞受体(BCR)信号传导的酶，并且对正常B细胞成熟至关重要。虽然BTK的主要的作用被描述为介导BCR信号传导，但它已被证明参与其他途径，例如Fc受体(FcR)和toll样受体(TLR)信号传导以及活性氧(ROS)的产生。BTK属于TEC(在肝细胞癌中表达的酪氨酸激酶)激酶家族。TEC激酶家族的成员的表达主要局限于造血系统。

BTK对正常B细胞发育和成熟是必需的。在例如X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)患者中BTK的缺乏揭示几乎完全缺乏外周B细胞和浆细胞，导致循环免疫球蛋白水平非常低。相比之下，在xid小鼠中，外周B细胞成熟有特定的停滞，而在骨髓(BM)中产生的前B细胞数量是正常的。BTK通过控制IL-7驱动的大型循环前B细胞的扩增以及促进它们向小型静息前B细胞的进展，对前B细胞的进展至关重要。随后，BTK控制第一免疫球蛋白链的表达以及B细胞进入滤泡结构。最后，BTK参与BCR介导的B细胞激活及其最终终末分化为记忆细胞或浆细胞。

因此，不希望受任何理论的束缚，阻断参与B细胞成熟的关键酶的BTK抑制剂将抑制疾病(如MS)中的致病性B细胞。

迄今为止，已经开发并测试了几种BTK抑制剂用于治疗多种疾病。因此，依鲁替尼(Imbruvica)已被批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，并且是套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤和慢性移植物抗宿主疾病的二线治疗。阿卡替尼(Calquence)和泽布替尼(Brukinsa)也被批准用于治疗MCL。目前正在测试阿卡替尼和泽布替尼以及新颖的化合物ONO-4059(替卢替尼)、HM71224(珀舍替尼)和ABBV-105(乌帕替尼)对B细胞恶性肿瘤和/或自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎(RA)、干燥综合征(SjS)和系统性红斑狼疮(SLE)的功效。

迄今为止，BTK抑制剂依伏替尼(evobrutinib)、托来布替尼(tolebrutinib)和非奈替尼在MS患者中已经进入III期研究，奥布替尼在II期研究中测试并且BIIB091在I期研究中测试用于治疗MS的功效。

依伏替尼和托来布替尼被归类为共价的、不可逆的BTK抑制剂，而非奈替尼的BTKi结合机制被描述为非共价的、可逆的。

在其中期试验中，托来布替尼使得MS病变进展减少，最频繁的不良事件为头疼和感冒样症状(Dolgin,E.BTK blockers make headway in multiple sclerosis[BTK阻断剂在多发性硬化中取得进展].Nat.Biotechnol.[自然生物技术]39,3-5(2021))。

已经在动物模型以及RA、SLE的临床试验和RRMS的II期安全性和功效研究中对依伏替尼进行了测试。

在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(MS的动物模型)中，剂量为3mg/kg的依伏替尼是有效的，而10mg/kg的剂量不能进一步改善影响，从而支持了在3mg/kg下完全BTK抑制的观点(Torke,S.等人,Inhibition of Bruton’s tyrosine kinase interferes withpathogenic B-cell development in inflammatory CNS demyelinating disease[抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶干扰炎性CNS脱髓鞘疾病中的致病性B细胞发育],Acta Neuropathol.[神经病理学学报]140,535-548(2020))。

在依伏替尼作为RRMS(复发缓解型多发性硬化)和活跃性继发进展型MS的单一疗法的II期试验中，针对安慰剂或富马酸二甲酯(DMF)测试了3种剂量的依伏替尼(25mg每日一次、75mg每日一次或75mg每日两次)。与给予安慰剂或富马酸二甲酯的复发MS患者相比，接受每天一次或两次75mg较高剂量的依伏替尼的那些患者表现出发生较少脑病变和经历较少复发的趋势。然而，除了鼻咽炎之外，每日一次和每日两次75mg较高剂量的依伏替尼与更高频率的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和脂肪酶升高有关，因此引发安全性问题(Montalban X.等人,2019,N Engl J Med[新英格兰医学杂志]；380(25):2406-17)。

目前，在患有复发型多发性硬化(RMS)的参与者中正在进行评估每日两次口服施用依伏替尼对比每日一次口服施用特立氟胺的功效和安全性的III期试验。

考虑到这些BTK抑制剂的潜在不良事件以及尚未完全确定的有效性，需要改善BTK抑制剂，使其特别是在MS的长期治疗中有效和安全。

附图说明

图1

在人MOG EAE期间，预防性LOU064(3mg/kg p.o.b.i.d.和30mg/kg p.o.b.i.d.)对每日神经缺损的影响。随着LOU064 30mg/kg p.o.b.i.d.治疗显著改善每日体重变化(A)，表明炎症诱导的恶病质减少。与体重数据一致的是随着LOU064 30mg/kg p.o.b.i.d改善的EAE得分(B)。组大小n＝8-10/治疗组。使用克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)与邓恩(Dunn)检验(非参数ANOVA)确定的统计学显著性。

图2

在人MOG EAE期间，预防性LOU064 30mg/kg(b.i.d.)显著降低疾病发病率。LOU064b.i.d.治疗降低EAE发作的频率和速度。组大小n＝10/治疗组。使用卡普兰-迈耶非参数检验确定的统计学显著性。

图3

在人MOG EAE期间，预防性LOU064剂量依赖地降低疾病负担。LOU064 30mg/kgb.i.d.治疗显著降低峰值EAE得分(A)和累积疾病负担(B)。组大小n＝10/治疗组。使用克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)与邓恩(Dunn)检验(非参数ANOVA)确定的统计学显著性。

图4

在最后剂量的LOU064的经口b.i.d.给药后1、5和8小时，在脾脏中的BTK占有率。显示的是个体动物的占有率水平。组平均值显示为中间短线，并且标准偏差显示为误差须线。针对p<0.0001的统计学显著性(ANOVA，随后邓恩检验)显示为****。在格鲁布斯(Grubb)检验后去除在媒介物组中的一个异常值(具有-112％BTK占有率)。

图5

在最后剂量的LOU064的经口b.i.d.给药后1、5和8小时，在淋巴结中的BTK占有率。显示的是个体动物的占有率水平。组平均值显示为中间短线，并且标准偏差显示为误差须线。针对p<0.0001的统计学显著性(ANOVA，随后邓恩检验)显示为****。

图6

在最后剂量的LOU064的经口b.i.d.给药后1、5和8小时，在脑匀浆中的BTK占有率。显示的是个体动物的占有率水平。组平均值显示为中间短线，并且标准偏差显示为误差须线。针对p<0.01的统计学显著性(ANOVA，随后邓恩检验)显示为**。

图7

在人MOG EAE期间，预防性LOU064(b.i.d.)治疗仅微弱调节MOG特异性免疫球蛋白应答。经口LOU064 b.i.d.治疗显著减少血清中MOG特异性IgM和IgG应答；然而，影响非常微弱(A、B)。减少IgG1(C)、IgG2a(D)和IgG2b(E)揭示的亚类分析。在IgG2c(F)上没有检测到变化。组大小n＝8-10/治疗组。统计学显著性(ANOVA与邓恩检验)显示为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。

图8

在人MOG EAE期间，预防性LOU064(b.i.d.)治疗改善炎症诱导的恶病质。在模型的EAE前期没有观察到神经学症状(A)。经口LOU064b.i.d.治疗(30mg/kg每日两次)改善免疫小鼠的体重增加，表明炎症诱导的恶病质减少(B)。组大小n＝5/治疗组。

图9

在人MOG EAE期间，预防性LOU064(b.i.d.)治疗抑制(自身)抗原回忆增殖。用人MOG体外孵育分离的脾细胞和引流淋巴结细胞48小时。通过[³H]-胸苷掺入确定抗原特异性增殖。用LOU064体内给药的动物证明了在MOG特异性增殖中剂量依赖性降低(A、B)，用抗CD3/CD28的多克隆刺激没有变化(C)。组大小n＝5/治疗组。

图10

在人MOG EAE期间，预防性LOU064(b.i.d.)治疗减少Th17细胞。用人MOG免疫的并且用LOU064体内b.i.d.给药的小鼠证明了B细胞群的频率没有显著的变化(A、B)。总CD4⁺T细胞群体没有变化(C)；然而，细胞内细胞因子染色揭示了Th17(IL-17⁺)细胞显著减少(D)。在Th1或Treg中没有观察到变化(E、F)。组大小n＝5/治疗组。统计学显著性(ANOVA与邓恩检验)显示为*p<0.05。

图11

在大鼠MOG EAE期间，b.i.d.施用预防性BTK抑制剂证明没有不良应答。每日b.i.d.给药BTK抑制剂(LOU064、依鲁替尼)没有诱导的神经学症状(A)或恶化的体重变化(B)。环孢菌素A(CsA)与明显的重量损失有关。组大小n＝4-5/治疗组。

图12

在大鼠MOG EAE期间，b.i.d.施用预防性BTK抑制剂未能抑制(自身)抗原回忆增殖。用大鼠MOG体外孵育分离的引流淋巴结细胞48小时。通过[³H]-胸苷掺入确定抗原特异性增殖。动物用BTK抑制剂(LOU064、依鲁替尼或环孢菌素A(CsA))体内给药持续8天。组大小n＝4-5/治疗组。

图13

LOU064减少大鼠MOG EAE病理性。通过LOU064 30mg/kg p.o.b.i.d.治疗每日体重变化(A)显著减少，表明炎症诱导的恶病质减少。与体重数据一致的是EAE得分的改善(B)。组大小n＝10/治疗组。使用克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)与邓恩(Dunn)检验(非参数ANOVA)确定的统计学显著性。

图14

在大鼠MOG EAE期间，LOU064显著降低疾病发病率。LOU064 30mg/kg b.i.d.治疗降低EAE发作的频率和时间(临床得分≥1)。组大小n＝10/治疗组。使用卡普兰-迈耶非参数检验确定的统计学显著性。

图15

在大鼠MOG EAE期间，LOU064减少疾病负担。LOU064 30mg/kg b.i.d.治疗显著降低峰值EAE得分(A)和累积疾病负担(B)。组大小n＝10/治疗组。使用克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)与邓恩(Dunn)检验(非参数ANOVA)确定的统计学显著性。

图16

在脾脏、血液和脑中的BTK谷占有率。在脾脏和血液中的BTK谷占有率表明峰值的最高目标占有率。在脑匀浆中评估的BTK占有率显示在脾脏(A)、血液(B)和脑(C)中的中间水平，表明显著的但是次最高的脑BTK占有率达到峰值。通过双侧未配对t检验与Welch校正确定的统计学显著性。

图17

在大鼠MOG EAE期间，LOU064不调节MOG特异性免疫球蛋白应答。与媒介物相比，经口LOU064 b.i.d.治疗不影响血清中MOG特异性IgM(A)和IgG(B)应答。不调节IgG1(C)、IgG2a(D)和IgG2b(E)、IgG2c(F)和IgG3(G)揭示的亚类分析。组大小n＝4-5/治疗组；在未试验过的小鼠和媒介物治疗的小鼠之间确定的p值。用ANOVA(随后邓恩检验)分析的统计学显著性。

图18

通过LOU064治疗血清中NF-L浓度轻微降低(图18A)并且与EAE临床得分相关(图18B)。与媒介物治疗的组相比，经口LOU064 b.i.d.治疗轻微降低平均血清NF-L水平。在终止时观察到的血清中NF-L水平与临床得分相关。UDL＝检测上限；LDL＝检测下限。用简单的线性回归检验确定的统计学差异。

图19

BTK在未试验过的小鼠的淋巴结中表达而不在脑中表达。未试验过的小鼠的淋巴结和脑的组织学检查证明BTK在淋巴结(A)中表达，在副皮质区并且特别地在B细胞滤泡扩散(B)。在脑(C)中和在胼胝体(D)中没有检测到BTK表达。用苏木精和蓝化复染BTK IHC染色。

图20

纳米LOU064的优选的粒度分布。

图21

(A)在稳态24小时内的BTK谷占有率。图以点显示中值预测并且垂直线显示95％预测区间。(B)在稳态24小时内的平均BTK占有率。图以点显示中值预测并且垂直线显示95％预测区间。

图22

在稳态脾脏BTK占有率的模拟。

图23

用LOU064治疗的大鼠MOG EAE小鼠的scRNA序列分析：来自用LOU06治疗的EAE小鼠的脑和脊髓的小胶质细胞中的神经炎症特征显著下调。

发明内容

本发明潜在的问题是提供对MS患者尤其针对长期治疗的改善的治疗策略。特别地，本发明的目的是提供有利的MS疗法，优选地高效的MS疗法。

另一目的是提供与B细胞耗竭疗法、特别地与CD19耗竭疗法和/或CD20耗竭疗法同样有效的MS疗法。

另一目的是提供与没有不希望影响免疫球蛋白的血清水平的B细胞耗竭疗法同样有效的MS疗法。

另外的目的是提供有效降低年复发率、特别地与B细胞耗竭疗法同样有效降低年复发率的MS疗法。

仍另外的目的是提供可以延迟残疾恶化的MS疗法。

另一目的是提供改善的MS疗法，与其他批准的口服疾病缓解疗法和B细胞耗竭疗法相比、特别地与CD19耗竭疗法/CD20耗竭疗法相比，特别表现出改善的安全性和耐受性特征。

通过施用LOU064或其药学上可接受的盐意外地解决了问题。

LOU064(＝N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺，INN：雷米布鲁替尼)作为候选药物披露于WO 2015/079417 A1用于布鲁顿氏酪氨酸激酶的选择性抑制。该化合物是强效、高选择性、不可逆的共价BTK抑制剂。由于与BTK的无活性构象结合，LOU064表现出精确的激酶选择性并且因此减少激酶脱靶结合，并且由于共价抑制，化合物在没有对延长且高全身性化合物暴露的需求下表现出强效且持续的药效学影响(Angst,D.等人,Discovery of LOU064(Remibrutinib),a Potent and Highly Selective Covalent Inhibitor of Bruton'sTyrosine Kinase[LOU064(雷米布鲁替尼)的发现，强效且高选择性的共价布鲁顿氏酪氨酸激酶抑制剂],J Med Chem.2020年5月28日；63(10):5102-5118)。

先前已经建议用于治疗慢性自发性荨麻疹(CSU)(WO 2020/234782A1)和干燥综合征(SjS)(WO 2020/234781 A1)的LOU064目前正在CSU和SjS的II期临床研究中测试。

在WO 2020/234782 A1中，通常建议b.i.d.施用10mg、25mg和100mg的剂量以达到在CSU中的最大功效。

在一项2b期、随机、双盲、安慰剂对照试验中，评估LOU064在12周内对H₁抗组胺药控制不充分且患有至少中度活跃性CSU的患者的功效和安全性，患者接受LOU064 10mgq.d.(每日一次)、35mg q.d.、100mg q.d.、10mg b.i.d.(每日两次)、25mg b.i.d.、100mgb.i.d.或安慰剂(1:1:1:1:1:1:1比率)。与其他剂量相比，发现25mg b.i.d.方案特别有效。

因此，选择25mg b.i.d.的剂量用于CSU的随后的III期临床研究。

已报道血液和/或组织中的BTK占有率是临床研究(例如CSU和SjS研究)所选剂量的合适的生物标志物。(WO 2020/234782和WO 2020/234781)

此外，已报道在雌性大鼠的血液和各种组织中BTK占有率和BTK占有的持续时间是不同的。(WO 2020/234781)

在评估LOU064的BTK占有率的临床前研究中，单次经口剂量的3mg/kg LOU064已经导致在雌性大鼠的血液和脾脏中BTK完全占有率。在LOU064的单次经口剂量后确定大鼠BTK占有的持续时间时，BTK占有半衰期在血液中约87小时但在脾脏中只有约5小时。不希望受任何理论的束缚，与脾脏、淋巴结和肺等组织相比，推测血液中更长的BTK占有可以反映外周血中表达BTK的细胞是静息的且在代谢上相对无活性。

在不同组织的BTK占有率与功效和不同适应症中最佳剂量选择相关。然而，目前还没有与多发性硬化适应症相关的所有组织的一致的全貌，并且因此需要渗透一个或多个组织用于治疗MS。如在大鼠中报道的，血液和各种组织中BTK占有率和BTK占有半衰期是不同的。

BTK占有半衰期取决于转换率(BTK细胞再生的能力)。此类转换率在每个组织中是不同的，并且是物种特异性的。BTK占有率进一步取决于化合物的PK/PD特性，这些特性也取决于物种。

发现血液中BTK占有率可以与MS适应症不完全相关。

在其他组织例如脾脏、淋巴结和肺中BTK占有率可以比在血液中BTK占有率与MS适应症中的功效更相关。另外，脑中BTK占有率可以是治疗MS中的功效的另一相关因素。

脑中BTK占有率取决于若干因素。某些因素是化合物特异性的。例如，一个因素是化合物的血脑屏障渗透性，它对P糖蛋白转运蛋白的亲和力控制从脑外排泵出的程度。

另一因素是关于脑中BTK的表达的不确定性，这是由于在未试验过的小鼠脑、特别地在胼胝体中不能检测到BTK(图19)。

因此，为了确定BTK抑制剂治疗MS的有效剂量，存在高水平的不可预测性。

为了评估LOU064的体内功效，在小鼠实验性自身免疫性脑炎(EAE)模型中测试化合物。以3mg/kg b.i.d.的剂量的LOU064在给药后1h在脾脏和淋巴结中观察到完全BTK占有率(图4和5)。然而，该3mg/kg b.i.d.的剂量的LOU064仅导致神经学症状以及EAE诱导的重量损失相当微弱的减少(图1)，即使在该剂量下脾脏和淋巴结中已经达到完全BTK占有率。

因此，也在已经制备用于化合物暴露分析的脑匀浆中评估BTK占有率(图6)。与在脾脏和淋巴结中观察到的相比，3mg/kg剂量令人惊讶地导致在1小时时间点脑匀浆中仅最小BTK占有率。然而，甚至更令人惊讶地，接受30mg/kg b.i.d.LOU064的剂量组显示出最高BTK占有率。

考虑到脑中BTK完全占有率需要更高剂量(30mg/kg b.i.d.)，根据本发明发现以30mg/kg b.i.d.的剂量的LOU064强烈减少在小鼠中的神经学症状，以及EAE诱导的重量损失。

另外，在LOU064 b.i.d.口服给药后1、5和8小时确定的脾脏中BTK占有率(图4)也证明在30mg/kg剂量后更持续的占有率。

不受理论的束缚，得出的结论是，脑中BTK占有率可以与MS的治疗更相关。这是完全意想不到的，由于在未试验过的小鼠脑中，特别地在胼胝体中不能检测到BTK(图19)。

根据动物和人之间的转换模型(Journal of basic and clinical pharmacy[基础和临床药学杂志],7(2),27-31)，对于30mg/kg b.i.d.计算的人等效剂量(HED)相当于对于70kg人的约170mg(Nair,A.B.,和Jacob,S.(2016))。

最后，根据人中BTK占有率的预测模型，b.i.d.给药证明比以相同剂量的QD给药更有效，以实现更高的BTK占有率(图21)。因此，选择100mg b.i.d.的剂量的LOU064用于临床研究。

特别令人惊讶地是，当以100mg每日两次的剂量口服施用LOU064来治疗多发性硬化时，表现出极好的功效和安全性。

因此，本发明的主题涉及用于治疗多发性硬化的LOU064或其药学上可接受的盐。

通常，本发明涉及多发性硬化的治疗。在本发明的优选的实施例中，施用LOU064用于治疗复发形式的多发性硬化(RMS)，其包括复发缓解型多发性硬化(RRMS)、继发进展型多发性硬化(SPMS)、特别地活跃性SPMS、和临床孤立综合征(CIS)，优选地在成人中。

特别地，本发明涉及治疗复发缓解型多发性硬化(RRMS)。可替代地，本发明涉及治疗继发进展型MS(SPMS)，特别地活跃性SPMS。另外可替代地，本发明涉及治疗临床孤立综合征(CIS)。

在一个实施例中，将LOU064以如下剂量口服施用：约10mg至约500mg每日两次或约25mg至约400mg每日两次或约50mg至约300mg每日两次、或约50mg至约250mg每日两次、或约50mg至约150mg每日两次。

优选地，将LOU064以约50mg至约150mg的剂量每日两次，更优选地以约100mg的剂量每日两次口服施用。

在另一实施例中，将LOU064以约100mg至约300mg的剂量每日两次，更优选地以约250mg的剂量每日两次口服施用。

在合适的药物制剂中，LOU064可以任何药学上可接受的形式存在。可以优选的是包括在药物制剂中的LOU064是纳米或微米颗粒。

如果LOU064在药物制剂中以纳米颗粒的形式存在，则平均粒度可以小于1000nm。优选地，LOU064的平均粒度可以小于500nm，更优选地小于250nm。

在优选的实施例中，LOU064的平均粒度可以在约50nm和约1000nm之间、或在约50nm和约750nm之间、或在约60nm和约500nm之间、或在约70nm和约350nm之间、或在约100nm和约170nm之间，更优选地，LOU064的平均粒度可以在约100nm和约350nm之间、或在约110nm和约200nm之间、或在约120nm和约180nm之间或在约120nm和约160nm之间，优选地LOU064的平均粒度可以是约150nm至约200nm。

如果LOU064在药物制剂中以纳米颗粒的形式存在，则口服施用优选地以约50mg至约150mg的剂量每日两次，更优选地以约100mg的剂量每日两次。

如果LOU064在药物制剂中以微米颗粒的形式存在，则平均粒度可以是1-5μm或者优选地1.0-1.5μm。优选地，LOU064的平均粒度可以是1.1至1.3μm。

如果LOU064在药物制剂中以微米颗粒的形式存在，则口服施用优选地以约100mg至约300mg的剂量每日两次，例如以约100mg的剂量每日两次。

在优选的实施例中，多分散指数(PI)在0.01和0.5之间，更优选地在0.1和0.2之间，特别地0.12-0.14。优选的粒度分布示于图20。

上述平均粒度是强度加权的。平均粒度可以通过动态光散射确定。优选地，平均粒度是通过光子相关光谱法(PCS)确定的。特别地，可以使用来自英国马尔文帕纳科有限责任公司(Malvern Panalytical Ltd.)的设备“Zetasizer Nano ZS”7.13版用于确定平均粒度。

优选地，在纯化水(1:10)中使用0.1mM NaCl溶液作为湿分散方法进行测量，其中衰减指数是2-9，特别地5。优选地在25℃进行测量。测量系统的另外优选的设置如下：

比色皿：一次性定量比色杯

计数速率(kcPs)：315

持续时间：60sec

测量位置(mm)：4.65。

在本发明的一个实施例中，LOU064组合物按照常规程序配制成适用于人类口服施用的药物组合物。通常，用于口服施用的组合物是胶囊剂或片剂。

在一个实施例中，LOU064的制剂可以根据在美国申请号63/141558或其家族成员中披露的制剂进行配制，所述申请通过引用并入本文。

根据本发明，口服施用的合适的药物组合物包含LOU064和粘合剂。

合适的粘合剂包括聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇、虫胶、聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物、聚乙二醇-丙二醇共聚物或其混合物。优选地，粘合剂是聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物。

LOU064和粘合剂的重量比可以是约3:1至约1:3；例如约3:1，约2:1，约1:1，优选地LOU064和粘合剂的重量比是约2:1或约1:1。

优选地，口服施用的合适的药物组合物包含LOU064、粘合剂和表面活性剂。

合适的表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钾、十二烷基硫酸铵、十二烷基醚硫酸钠、聚山梨醇酯、全氟丁烷磺酸盐、磺基琥珀酸二辛酯或其混合物。优选地，表面活性剂是十二烷基硫酸钠。

LOU064、粘合剂和表面活性剂的重量比是约2:1:0.5，或约2:1:0.1，或约2:1:0.08，或约2:1:0.05，或约2:1:0.04，或约2:1:0.03，或约2:1:0.02。优选地，LOU064、粘合剂和表面活性剂的重量比是约2:1:0.08或约1:1:0.05。

在特别优选的实施例中，口服施用的合适的药物组合物包含LOU064、粘合剂和表面活性剂，其中粘合剂是聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物(共聚维酮)，并且表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SLS)，并且其中LOU064、共聚维酮和SLS的重量比是约2:1:0.08。另外特别优选的是LOU064在该药物组合物中以纳米颗粒的形式存在，优选地具有通过PCS测量的在约100nm和约200nm之间的平均粒度。

如果错过一剂的LOU064，优选地应尽快施用不要等到下一次计划的剂量。随后的剂量应在推荐的区间施用。

在I期临床研究中已经证明以高达600mg的单次剂量并且进一步以100mg b.i.d.持续长达18天的LOU064的短期安全性。然而，没有关于长期安全性的可用的数据。

考虑到用共价不可逆的BTK抑制剂依伏替尼和托来布替尼观察到的剂量限制的副作用，在II期临床研究中以75mg b.i.d.的剂量的依伏替尼已经显示剂量限制的肝酶升高，并且托来布替尼显示剂量限制的腹泻(Becker A.等人,2019,Clin Transl Sci[转化科学]；13,325-336；Montalban X.等人,2019,N Engl J Med[新英格兰医学杂志]；380(25):2406-17,Smith P.F.等人,2019,ACTRIMS论坛,2019年2月28日,P072)，非常令人惊讶的是在延长的时间段以100mg b.i.d.的甚至更高剂量的LOU064不会诱导任何此类不良影响，使LOU064特别适于长期治疗。特别地，在延长的时间段，以100mg b.i.d.的剂量的LOU064不会诱导任何剂量限制的肝酶升高以及其他脱靶影响。

特别地，令人惊讶地发现LOU064不仅比其他DMT、特别地比其他BTK抑制剂更久地预防不希望的副作用，而且还比其他DMT、特别地比其他BTK抑制剂更久地保持活性，即维持功效。

另外令人惊讶地发现LOU064比其他DMT、特别地比其他BTK抑制剂更久地延迟症状的恶化。

因此，在本发明的优选的实施例中，治疗MS的LOU064或其药学上可接受的盐用于长期治疗。术语长期治疗表明LOU064或其药学上可接受的盐在延长的时间段使用。例如，LOU064或其药学上可接受的盐可以使用超过2年、3年、4年、5年、10年。LOU064或其药学上可接受的盐可能使用长达5年、10年、15年、20年或终生。

由于多发性硬化的治疗可能跨越数十年，因此经常需要改变治疗计划以适应不断变化的情况(例如不良影响、治疗失败、突破性疾病、疾病进展、合并症、生命周期事件(如妊娠和哺乳期))和/或不断变化的患者偏好。

更换药物或完全中止免疫调节剂可能使患者容易复发或疾病进展。在一些情况下，在治疗停止后在临床和MRI上注意到严重的MS疾病活动。当这种疾病活动与治疗开始前观察到的模式不成比例时，据说患者经历了反弹。

根据本发明，LOU064提供强大且有效的治疗策略以预防复发。对于用其他DMT的突破性疾病，LOU064进一步提供强大且有效的治疗策略。此外，对于另一种DMT停止后反弹的预防，LOU064提供强大且有效的治疗策略。

因此，在一个实施例中，LOU064用于已经用疾病缓解疗法而不是LOU064治疗的患者。换言之，已经用早期疾病缓解疗法而不是LOU064治疗的患者从早期疾病缓解治疗转换为LOU064。

在一个实施例中，早期疾病缓解疗法而不是LOU064的药物选自B细胞和/或T细胞抑制剂、特立氟胺、米托蒽醌、富马酸二甲酯、克拉屈滨、芬戈莫德、西尼莫德、波内西莫德、醋酸格拉替雷和β干扰素。

在优选的实施例中，将LOU064施用于由于副作用例如严重的输注相关的反应或反复感染而中止早期DMT(例如抗CD20疗法)的患者。

在优选的实施例中，在早期疾病缓解疗法缺乏功效的情况下，患者从早期疾病缓解疗法转换为LOU064。存在功效的缺乏，例如，如果正在接受疾病缓解疗法(DMT)的患者显示疾病活动的体征，例如复发或病变。功效的缺乏可以定义为未停止或未适当减缓疾病进展。换言之，本发明针对LOU064治疗对早期DMT无应答者的用途。

在另一优选的实施例中，在患者对早期疾病缓解疗法缺乏耐受性的情况下，患者从早期疾病缓解疗法转换为LOU064。优选地，缺乏耐受性涉及存在如下不良事件：头疼、头晕、恶心、感染(如带状疱疹)、黄斑水肿、输注相关的反应或反复感染。在本发明的优选的实施例中，在开始LOU064施用前，中止早期疾病缓解疗法而不是LOU064。

尽管通常LOU064和另一种疾病缓解疗法可以在同一时间获得，优选地LOU064治疗是单一疗法，即LOU064优选地是施用的唯一疾病缓解药物。

因此，在一个实施例中，LOU064用于治疗多发性硬化，其中所述治疗是单一疗法。

据预期LOU064是敏感的CYP3A底物，并且不能排除当与强CYP3A4抑制剂施用时，LOU064的口服药物暴露可以增加几倍。同样，CYP3A4的强诱导剂可以显著减少暴露并且导致功效降低。LOU064的这些特性不仅与MS相关，而且与任何BTK诱导的病症相关。

与强CYP3A4抑制剂和/或诱导剂伴随施用可能引起LOU064药物暴露的实质性变化，并且应避免。CYP3A4抑制剂包括强CYP3A4抑制剂例如波普瑞韦、克拉霉素、可比司他、考尼伐坦、丹诺普韦/利托那韦、地瑞纳韦/利托那韦、埃替拉韦/利托那韦、葡萄柚汁、艾代拉里斯、茚地那韦、茚地那韦/利托那韦、伊曲康唑、酮康唑、LCL161、洛匹那韦/利托那韦、米贝拉地尔、奈法唑酮、奈非那韦、泊沙康唑、利托那韦、沙奎那韦、沙奎那韦/利托那韦、特拉匹韦、泰利霉素、替拉那韦/利托那韦、醋竹桃霉素、达塞布韦钠(Viekira pack)或/和伏立康唑。

因此，在另一优选的实施例中，LOU064不与CYP3A4的强抑制剂和/或诱导剂伴随施用。

进一步发现LOU064可以与口服避孕药(例如炔雌醇或左炔诺孕酮)共同施用且对口服避孕药的暴露和功效没有重大影响。因此，在优选的实施例中，LOU064与口服避孕药共同施用。

在优选的实施例中，在第一剂量的LOU064前未施用术前用药。

作为共价不可逆的BTK抑制剂，LOU064通过BTK的不可逆的抑制起作用，这被从头蛋白质合成所抵消。因此，不希望受任何理论的束缚，据信，虽然在B细胞耗减后B细胞池的重构可能需要几个月的时间，但BTK抑制后B细胞功能的恢复可以在中止后不久实现，特别地在数天内实现。因此，如果需要的话，可以迅速停止该疗法，从而在出现无法预见的情况时，为临床医生和患者提供更容易和更快的反应能力。

因此，在一个实施例中，如果患者计划在接下来的12个月内怀孕，则有利地选择LOU064。

在另一实施例中，如果患者将在接下来的12个月内进行化疗，则有利地选择LOU064。

尤其根据2020COVID-19大流行，B细胞耗减的患者具有更高的感染风险。此外，缺乏完全功能的适应性免疫应答可能导致更严重的病程。

然而，由于LOU064不会导致B细胞池的耗减，因此停止疗法导致完全B细胞功能的快速恢复。这使患者和治疗医生有可能对传染性疾病或疫苗接种需求，特别是用活疫苗和减毒疫苗的疫苗接种作出快速反应。

根据本发明，LOU064可以在感染期间(例如在COVID-19感染期间)施用。因此，LOU064施用可以在感染期间(例如在COVID-19感染期间)继续进行。

可替代地，LOU064在患有活跃性感染(例如COVID-19)的患者中延迟施用，直到感染消退。

因此，本发明的一个实施例涉及用于治疗多发性硬化的LOU064，其中对急性感染或先前感染COVID-19的患者进行治疗。

在优选的实施例中，LOU064治疗在COVID-19感染期间继续进行。

在另外的实施例中，LOU064治疗在COVID-19感染期间中断并且在克服感染后继续进行。

本发明的仍另外的实施例涉及用于治疗BTK介导的病症、特别地多发性硬化的LOU064，其中患者在LOU064疗法期间接种疫苗。可替代地，患者可以在LOU064疗法期间接种非活疫苗。

在一个实施例中，患者在LOU064疗法期间(例如在LOU064疗法开始后15天)接种四价流感疫苗、PPV-23疫苗或KLH新抗原疫苗。在该实施例的一个方面，接受四价流感疫苗的患者，在疫苗接种后28天时，与基线相比，达到了定义为抗血凝素抗体滴度增加>4倍的应答。在该实施例的另一方面，接受PPV-23疫苗的患者，在疫苗接种后28天时，与基线相比，达到IgG滴度增加>2倍。在又另一实施例中，接受KLH新抗原疫苗的患者，在疫苗接种后28天时，达到T细胞依赖的抗体应答，如通过抗KLH IgG和IgM滴度测量的。

本发明的另一实施例涉及用于治疗BTK介导的病症、特别地多发性硬化的LOU064，其中LOU064治疗由于疫苗接种被中止，特别地其中LOU064治疗被中止5-10天(例如7或8天)，优选地在疫苗接种前6周中止并且在疫苗接种后继续进行，例如在疫苗接种后5-20天、优选地5-10天或更优选地10-15天。在该实施例的特定方面，在LOU064治疗中止后(例如LOU064治疗中止后5-10天或7或8天)，患者接种四价流感疫苗、PPV-23疫苗或KLH新抗原疫苗。在该实施例的一个方面，接受四价流感疫苗的患者，在疫苗接种后28天时，与基线相比，达到了定义为抗血凝素抗体滴度增加>4倍的应答。在该实施例的另一方面，接受PPV-23疫苗的患者，在疫苗接种后28天时，与基线相比，达到IgG滴度增加>2倍。在又另一实施例中，接受KLH新抗原疫苗的患者，在疫苗接种后28天时，达到T细胞依赖的抗体应答，如通过抗KLH IgG和IgM滴度测量的。然后，LOU064治疗在疫苗接种后第29天继续开始。

在可替代的实施例中，疫苗接种是用活疫苗和/或减毒疫苗的疫苗接种。在优选的实施例中，不考虑体重、性别、年龄、种族或基线B细胞计数，都可以施用LOU064。例如，优选的是体重为60kg的35岁女性接受与体重为90kg的50岁男性相同的剂量。特别地，体重、性别、年龄、种族或基线B细胞计数对LOU064的药代动力学没有临床意义的影响。

根据本发明LOU064治疗在任何种族或民族组中同样有效。

因此，本发明进一步涉及用于治疗多发性硬化的LOU064，其中所述治疗是无族群差异的治疗。

在本发明的一个实施例中，根据以下标准选择接受LOU064或其药学上可接受的盐治疗MS的患者：

-患者在第一次施用LOU064前EDSS得分0至5.5分，

-患者在第一次施用LOU064前的前一年期间经历过至少一次复发或在前两年期间经历过两次复发，并且

-在第一次施用LOU064前的前一年/6个月期间，患者的Gd增强MRI扫描呈阳性，

在本发明的优选的实施例中，在复发后施用LOU064。

在本发明的另一优选的实施例中，在第一次施用LOU064前的前12个月内检测到至少一个Gd+病变后施用LOU064。

在本发明的仍另一优选的实施例中，在检测到新的或扩大的T2病变后施用LOU064。

在本发明的另一实施例中，选择LOU064用于治疗由于不太有利的风险/利益比而不能选择S1P调节剂治疗的患者的多发性硬化。此类患者是例如易患或患有一种或多种影响心脏或心率、呼吸功能、眼睛、肝功能的疾病或障碍的患者。特别地，此类患者包括可能更易受不良事件(例如心率和心脏传导的短暂降低)影响的患者。

在本发明中，意外地发现施用LOU064有利地导致以下中的至少一种：

-与未治疗的患者相比和/或与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷和富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，钆增强病变的平均总数降低。

-与未治疗的患者相比和/或与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷和富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，年复发率降低，

-与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷和富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，达到3个月确诊的残疾进展的时间更长。

在这方面，本发明的另外的主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与未治疗的患者相比和/或与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷、富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，LOU064降低钆增强病变的平均总数。

本发明的仍另外的主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与未治疗的患者相比和/或与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷和富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，LOU064导致年复发率降低。

本发明的仍另外的主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷和富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，LOU064导致达到3个月确诊的残疾进展的时间更长。

本发明的另一主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与未治疗的患者相比和/或与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷和富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，LOU064导致MS症状的改善，如通过一个或多个患者报告的结果(PRO)(即MSIS-29、PHQ-9、GAD-7、FSIQ-RMS和BPI-SF)的得分的降低测量的。

本发明的另一主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与基线相比，LOU064导致MS症状的改善，如通过一个或多个患者报告的结果(PRO)(即MSIS-29、PHQ-9、GAD-7、FSIQ-RMS和BPI-SF)的得分的降低测量的。在该实施例的一个方面，MS症状的改善是通过在长达60个月内、或在长达30个月内、或在长达24个月内、优选地在12-24个月内，与基线相比，在用LOU064(100mg bid)治疗后的MSIS-29得分降低至少6分(优选地至少8分)来实现的。在该实施例的另一方面，MS症状的改善是通过在长达60个月内、或在长达30个月内、或在长达24个月内、优选地在12-24个月内，与基线相比，在用LOU064(100mg bid)治疗后的PHQ9得分降低至少2分(优选地至少3分、更优选地至少5分)来实现的。在该实施例的又另一方面，MS症状的改善是通过在长达60个月内、或在长达30个月内、或在长达24个月内、优选地在12-24个月内，与基线相比，在用LOU064(100mg bid)治疗后的GAD-7得分降低至少2分(优选地至少3分)来实现的。在该实施例的又另一方面，MS症状的改善是通过在长达60个月内、或在长达30个月内、或在长达24个月内、优选地在12-24个月内，与基线相比，在用LOU064(100mgbid)治疗后的BPI-SF得分降低至少1分(优选地至少2分)来实现的。

本发明的另一主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与未治疗的患者相比和/或与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷和富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，LOU064导致MS症状的改善，如通过HUI-III患者报告的结果(PRO)的得分的增加测量的。

本发明的另一主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与基线相比，LOU064导致MS症状的改善，如通过HUI-III患者报告的结果(PRO)的得分的增加测量的。在该实施例的一个方面，MS症状的改善是通过在长达60个月内、或在长达30个月内、或在长达24个月内、优选地在12-24个月内，在用LOU064(100mg bid)治疗后的HUI得分增加至少0.02分(优选地至少0.03分)来实现的。

本发明的另一主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与未治疗的患者相比和/或与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷和富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，LOU064导致MS症状的改善，如通过SDMT得分的降低测量的。

本发明的另一主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与基线相比，LOU064导致MS症状的改善，如通过SDMT的降低测量的。在该实施例的一个方面，MS症状的改善是通过在长达60个月内、或在长达30个月内、或在长达24个月内、优选地在12-24个月内，在用LOU064(100mg bid)治疗后的SDMT得分降低至少3分(优选地至少5分)来实现的。

本发明的另一主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与未治疗的患者相比和/或与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷和富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，LOU064导致步行速度的提高，如通过T25FW测量的。

本发明的另一主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与基线相比，LOU064导致步行速度的提高，如通过T25FW测量的。基线T25FW结果被定义为在LOU064的第一剂量前的最后一次评估。

本发明的另一主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与未治疗的患者相比和/或与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷和富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，LOU064导致患者进行9HPT测试的速度的提高。

本发明的另一主题是用于治疗复发型多发性硬化的LOU064，其中在长达60个月内、或在长达30个月内或在长达24个月内、优选地12-24个月，与基线相比，LOU064导致患者进行9HPT测试的速度的提高。基线9HPT结果被定义为在LOU064的第一剂量前的最后一次评估。

在本发明中，另外意外地发现在治疗的第12周或第24周施用LOU064后，与疗法开始时的基线水平相比，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和脂肪酶的水平变化有利地不超过10％。

根据本发明，意外地发现施用LOU064有利地导致以下中的至少一种：

-与特立氟胺相比，年复发率相对降低45％-50％，优选地55％-60％，

-与特立氟胺相比，钆增强病变(Gd+T1)的平均总数相对降低60％-75％，优选地90％-95％，

-与特立氟胺相比，新的/扩大的T2病变相对降低65％-70％，优选地80％-85％，

-与特立氟胺相比，达到3个月确诊的残疾进展(3mCDP)的时间相对降低约30％，优选地30％-35％，

-与特立氟胺相比，达到6个月确诊的残疾进展(6mCDP)的时间相对降低约30％-35％，优选地35％-40％，

-在12至60个月，或在12至30个月或在12-24个月(NEDA-3)时，多达6-7/10名患者，优选地多达8-9/10名患者没有疾病能力证据，

-与特立氟胺相比，血清Nfl浓度相对降低至少20％。

另外意外地发现LOU064治疗在降低年复发率方面与CD20耗竭疗法一样有效，特别地与CD20耗竭疗法相比在降低年复发率方面占优势。

本发明进一步涉及生产用于治疗多发性硬化的药物的LOU064，其中优选地所述药物以约50mg至约150mg的剂量每日两次口服施用。

本发明的另外的主题是一种治疗多发性硬化的方法，所述治疗包含向需要这种治疗的患者口服施用LOU064，优选地以约50mg至约150mg的剂量每日两次。

本发明的另外的主题是一种制造用于上述治疗的药物的方法。

具体实施方式

定义

如本文所用，“BTK抑制剂”是能够抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)(是细胞质酪氨酸激酶和TEC激酶家族的成员)的任何物质。BTK在适应性和先天免疫系统的细胞(包括B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞)中且在血小板中选择性表达。BTK抑制剂的实例包括非共价、可逆的BTK抑制剂例如非奈替尼以及共价、不可逆的BTK抑制剂例如依伏替尼、托来布替尼、利扎鲁替尼、替卢替尼、布瑞替尼(branebrutinib)、奥布替尼和雷米布鲁替尼(LOU064)。

如本文所用，具有INN雷米布鲁替尼的“LOU064”是指化合物N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰基酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺，所述化合物具有以下结构式：

或其药学上可接受的盐、或其游离形式。在一个实施例中，LOU064是指LOU064的结晶形式，如在WO 2020/234779的实例1中披露的，其通过引用并入本文。

LOU064是选择性的强效的不可逆共价BTK抑制剂并且是新一代设计的共价酶抑制剂之一(Angst等人2020)。所述化合物首次披露于2014年11月28日提交的WO 2015/079417的实例6中。

术语“治疗”(“treatment”或“treat”)可以定义为向患者应用或施用例如LOU064，其目的是消除、减少或减轻多发性硬化(MS)等疾病的症状。特别地，术语“治疗”包含实现对患者有临床意义的影响，例如在治疗RMS时实现有临床意义的年复发率的降低。所述术语可以进一步包括延迟进展为进展型MS。

如本文所用，术语“患者”可以是哺乳动物，例如灵长类动物，优选高等灵长类动物，尤其优选的是人(例如具有患有本文所述的障碍的风险的或处于患有本文所述的障碍的风险的患者)。优选地，所述患者是成年人。理论上，也包括老年患者，然而，优选的是在18岁至60岁之间的患者。

如本文所用，如果这种患者会在医学上或生活质量方面从这种治疗中获益，那么所述患者是对治疗“有需要的”。

如本文所用，术语“施用”(“administering”或“administration”)LOU064可意指向需要治疗的患者提供LOU064。与一种或多种其他治疗剂“组合”施用包括以任何顺序和任何施用途径同时(并行)施用和连续施用。

如本文所用，“治疗上有效量/剂量”可以是指LOU064的有效量/剂量，即实现有临床意义的影响。

术语“不良事件”(AE)可以涉及在患者或临床调查中的任何不良医学事件，其中向受试者施用不一定与该治疗有因果关系的药物产品。因此，不良事件(AE)可以是任何不良和非预期的迹象(包括异常实验室发现)、症状或与药物(研究)产品的使用时间上相关的疾病(无论是否与药物(研究)产品相关)。

短语“治疗方案”(“therapeutic regimen”或“treatment regimen”)可意指用于治疗病患或预防疾病病症或疾病发展的方案，例如使用的给药。治疗方案可以包括诱导方案、负荷方案和维持方案(例如负荷剂量作为药物的初始剂量，优选地初始较高剂量，可以在维持剂量取得成功前在疗程(例如DMT)开始时给予，优选地降低至较低的维持剂量)。

如本文所用，“多发性硬化”是指包括原发进展型多发性硬化(PPMS)和复发型多发性硬化(RMS)的任何形式的疾病，所述复发型多发性硬化涵盖复发缓解型多发性硬化(RRMS)、继发进展型多发性硬化(SPMS)，特别地活跃性SPMS(有偶尔的复发和/或新的MRI活动的证据)、和临床孤立综合征(CIS)。

原发进展型MS(PPMS)的特征是从症状发作时神经功能(残疾累积)恶化，没有早期复发或缓解。PPMS可以在不同的时间点进一步表征为活跃性(有偶尔的复发和/或新的MRI活动的证据)或非活跃性，以及进展(在客观测量随时间变化的情况下疾病恶化的证据，有或没有复发或新的MRI活动)或无进展。参考Lublin 2014。

每个人对PPMS的体验都是独特的。PPMS可有短暂的疾病稳定期，有或没有复发或新的MRI活动，以及在有或没有新的复发或MRI病变的情况下发生残疾增加的时期。

术语RMS(复发型多发性硬化)涵盖RRMS、SPMS，特别地活跃性SPMS和CIS。

复发缓解型多发性硬化(RRMS)的特征是复发，例如定义为持续超过24h的新的神经缺陷或神经恶化发作，常常不存在发热或感染。

在缓解期间，疾病没有明显的进展。在不同的时间点，RRMS可以进一步表征为活跃性(有复发和/或新的MRI活动的证据)或非活跃性，以及恶化(复发后在特定的时间段确诊的残疾增加)或非恶化。参考Lublin 2014,Neurology[神经病学]:2014年7月15日；83(3):278-286。

继发进展型多发性硬化(SPMS)在初始复发缓解型病程后发生。大多数被诊断患有RRMS的人将最终转换为继发进展型病程，其中随时间神经功能会进展型恶化(残疾累积)。SPMS可以在不同的时间点进一步表征为活跃性(有复发和/或新的MRI活动的证据)或非活跃性，以及进展(在客观测量随时间变化的情况下疾病恶化的证据，有或没有复发)或无进展。参考Lublin 2014,Neurology[神经病学]:2014年7月15日；83(3):278-286。

每个人对SPMS的体验都是独特的。SPMS在复发缓解型MS后发生。残疾随时间逐渐增加，有或没有疾病活动的证据(复发或在MRI上的变化)。在SPMS中，可能出现偶尔的复发，以及稳定期。根据本发明，术语SPMS特别是指活跃性SPMS，即有疾病活动的证据的SPMS，如通过存在复发和/或在MRI上的变化确定的。

临床孤立综合征(CIS)可能是指提示多发性硬化(MS)的中枢神经系统(CNS)炎性脱髓鞘症状的单一临床发作。CIS表现可以是单焦点的或多焦点的，并且通常可能涉及视神经、脑干、小脑、脊髓或大脑半球。参考Miller等人,Clinically isolated syndromes[临床孤立综合征],Lancet Neurol.[柳叶刀神经病学]2012；11:157-169。

复发可定义为新的神经缺陷或神经恶化的发作，优选地持续超过24h。换言之，复发可认为是神经功能障碍的离散的发作(在本领域也称为“发作”、“突然复发”或“急性加重”)优选地持续至少24h。通常，复发之后是完全或部分恢复以及没有症状进展或残疾累积(缓解)的时期。

推测复发是由在中枢神经系统(CNS)内炎性事件部位的新的或扩大的脱髓鞘斑块引起的。

修订的McDonald标准(Thompson等人2018)

根据修订的McDonald标准，如果髓鞘损伤在空间中扩散(DIS)，则可能诊断为MS，如在MRI中所示：

-在至少两个或四个CNS位置中至少一个T2亮病变：脑的近皮质、脑室旁和幕下区域，以及脊髓(T2是最常见的MRI扫描，用于诊断MS和检测大脑和脊髓中新旧髓鞘损伤区域)。

-这些病变不需要钆增强(对比剂)。

关于髓鞘损伤在时间中扩散(DIT)，MRI证据是：

-与基线扫描(不考虑自基线以后的时间)相比，在随访MRI中的新的T2和/或钆增强损伤。2005修订版要求在初次发作和首次发作之间至少间隔30天。

-在任何时间同时存在无症状的钆增强和非增强损伤。

进展型原发MS(PPMS)有特定的诊断需求。特别地，修订的McDonald标准要求至少一个年的证明进展(前瞻性或回顾性完成)，加上以下三个发现中的两个：

-在脑中的DIS证据，在三个关键的脑区域(脑室旁、近皮质或幕下)中的至少一个T2病变可见。

-在脊髓中的DIS证据，基于至少两个T2病变DIS(≥2个T2损伤)。

-在寡克隆带和/或高IgG指数存在下可见阳性CSF受累。

Gd+病变

钆(“对比剂”)是在MRI扫描期间注射至人的静脉的化学化合物。由于血脑屏障，钆通常不会从血流进入脑或脊髓。但是在脑或脊髓内的活跃性炎症期间，如在MS复发期间，血脑屏障被破坏，从而允许钆通过。然后，钆可以进入脑或脊髓并且渗入MS病变，点亮它并且在MRI上形成一个突出的点。这种MS病变称为钆增强病变或Gd+病变。

T1和T2病变

T1和T2涉及用于产生磁共振图像的不同的MRI方法。特别地，T1和T2是指在磁脉冲和图像记录之间所用的时间。这些不同的方法用于检测中枢神经系统中的不同的结构或化学物质。T1和T2病变是指是否使用T1或T2方法检测到的病变。T1 MRI图像通过活跃性炎症的突出区域提供关于当前疾病活动的信息。T2MRI图像提供关于疾病负担或病变负荷(新旧两种病变区域的总量)的信息。

EDSS

扩展残疾状态量表(EDSS)是一种量化多发性硬化中的残疾并且监测残疾水平随时间变化的方法。

EDSS量表范围从0到10，以0.5个单位为增量，代表更高的残疾水平。得分基于神经科医生的检查。

EDSS步骤1.0至4.5是指能够在没有任何帮助的情况下步行的患有MS的人，并且基于八个功能系统(FS)的病变测量：

·锥体-肌无力或四肢移动困难

·小脑-共济失调、失去平衡、协调或震颤

·脑干-言语、吞咽和眼球震颤问题

·感觉-麻木或感觉丧失

·肠和膀胱功能

·视觉功能-视力问题

·脑功能-思维和记忆问题

·其他。

功能系统(FS)代表脑中负责特定任务的神经元网络。每个FS的得分范围为0分(无残疾)至5或6分(更严重的残疾)。参考Kurtzke JF.Rating Neurologic Impairment inMultiple Sclerosis:An Expanded Disability Status Scale(EDSS)[评定多发性硬化的神经损害：扩展残疾状况量表(EDSS)].Neurology[神经病学]:1983年11月；33(11):1444-52。

多发性硬化影响量表(MSIS-29)

MSIS-29第2版是29项自我管理的问卷，包括2个领域：身体和心理。回答采用4分顺序量表，范围从1分(一点也不)至4分(非常)，其中得分越高反映对日常生活的影响越大。MSIS-29大约需要5分钟才能完成，并且问题旨在确定患者对过去2周内MS对其日常生活影响的看法。参考Hobart J和Cano S(2009),“Improving the evaluation of therapeuticinterventions in multiple sclerosis:the role of new psychometric methods[提高对多发性硬化治疗干预的评估：新心理测量方法的作用]”,Health Technol Assess[卫生技术评估]；13(12):iii,ix-x,1-177.NS RO，Hobart J,Lamping D,Fitzpatrick R等人(2001),“The Multiple Sclerosis Impact Scale(MSIS-29):a new patient-basedoutcome measure[多发性硬化影响量表(MSIS-29)：新的基于患者的结果测量]”,Brain[脑]；124(Pt5):962-73。

SDMT或符号数字模态是敏感且特定的测试以评估处理速度，这通常影响认知受损的MS参与者(Benedict等人2017,Mult Scler[多发性硬化]；23(5):721-733)。测试得分是根据90秒内正确答案的数量计算的(最高为110分，最低为0分)。较高得分表明改善并且较低得分表明恶化。

T25FW或定时的25英尺步行是在定时的25英尺步行测试中6个月确诊的恶化至少20％的时间。T25FW是神经功能的客观定量测试(Fischer等人1999,Mult Scler[多发性硬化]；5:244-50)，并且广泛用于临床MS试验以评估行走。它是评估步行速度的行走测量：步行25英尺(7.62米)的时间(以秒为单位)。时间越长说明上肢功能越差。20％的改善被定义为以秒为单位缩短20％的时间。

9HPT或九孔插柱测试(9HPT)是神经功能的客观定量测试(Fischer等人1999,MultScler[多发性硬化]；5:244-50)，并且广泛用于临床MS试验以评估敏捷度。测量以评估左右臂得分，度量标准是插入和移除9个钉子所需的时间(以秒为单位)。

Nfl或神经丝轻链NfL是神经元细胞骨架的组成部分，并且在神经轴突损伤后释放到脑脊液中并且随后释放到血液中。它已被确定为疾病活动(Kuhle等人2019,Ann ClinTransl Neurol[临床和转化神经病学年鉴]；6(9):1757-1770)、疾病监测(Akgün等人2019,Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm[神经病学-神经免疫学和神经炎症]；6(3):e555)、治疗应答(Hauser等人2020,N Engl J Med[新英格兰医学杂志]；546-557)的生物标志物，并且来预测患有MS的参与者的疾病活动和残疾恶化(Barro等人2018,Brain[脑]141:2382-2391,Kuhle等人2019,Kapoor等人2020Neurology[神经病学]；95(10):436-444,Jakimovski等人2019Ann Clin Transl Neurol[临床和转化神经病学年鉴]；6(9):1757-1770)。

GAD-7或广泛性焦虑障碍-7是7项自评量表(由Spitzer等人2006开发的,ArchIntern Med[内科医学档案]；166:1092-7)，它被用作GAD的筛选工具和严重性指标。量表的回答选择由以下4分Likert量表组成：0：一点也不；1：几天；2：超过半天；3：几乎每天。总分范围从0分至21分。得分越高意指焦虑症状的严重性越高。

PHQ-9或患者健康问卷-9是来自完整PHQ的9项可靠和有效的抑郁模块。这一自我管理的工具用于筛选、诊断、监测和测量抑郁的严重性。另外，它用于对抑郁症进行基于标准的诊断(Kroenke等人2001,J Gen Intern Med[普通内科学杂志]；16:606-13)。

PHQ-9得分的范围可以从0到27，因为9个项目中的每一个都可以从0(一点也不)到3(几乎每天)进行得分。5、10、15和20分的PHQ-9得分分别代表轻度、中度、中度严重和严重抑郁。

BPI-SF或简明疼痛清单-简明形式是15项简明疼痛清单的更简明版本(Cleeland和Ryan 1994,Ann Acad Med[医学年鉴]；23(2):129-59)。它用于评估疼痛的严重性以及疼痛对日常功能的影响。除了疼痛的严重性、疼痛的位置、止痛药和过去24小时内的疼痛缓解量外，BPI-SF还包括七项干扰量表，来评估疼痛对一般活动、情绪、步行、工作、与其他人的关系、睡眠和享受生活的干扰程度。它有10分回答选项，范围从0分(不干扰)至10分(完全干扰)。总分范围从0分至10分，其中得分越低代表疼痛越轻。

FSIQ-RMS^TM或疲劳综合征和影响问卷-复发型多发性硬化测量RMS的疲劳症状和影响。这个可靠且有效的工具包含20个项目，分为两个症状领域(能量、肌无力)和七个影响领域(日常活动、认知、情绪、身体影响、自我护理、睡眠和社会影响)。回忆期为24小时以记录症状并且7天以记录影响。FSIQ-RMS按照领域和子领域得分。总分范围从0分至100分，其中得分越高代表越疲劳(Hudgens等人2019,Value Health[健康价值]；22:453-466)。

HUI-III^TM或)是一系列通用健康特征和基于偏好的系统，用于测量健康状态、报告与健康相关的生活质量、以及产生效用得分(Feeny等人2002,Med Care[医疗]；40(2):113-28)。HUI-III测量八个HRQoL领域包括视觉、听觉、言语、行走/移动性、疼痛、敏捷度、情感和认知。该研究将实施自我报告版本，并且参与者将根据回忆期回答他们的“通常健康状况”。对HUI问卷的答案能够将回答映射至特定水平。HUI-III具有以下领域(每个领域的水平)：

·视觉(6个水平)

·听觉(6个水平)

·言语(5个水平)

·行走(6个水平)

·敏捷度(6个水平)

·情感(5个水平)

·认知(6个水平)

·疼痛(5个水平)

HUI得分的降低意指病症已经恶化。

疾病缓解疗法(DMT)

使用术语“疾病缓解疗法”是因为仍然没有针对多发性硬化(MS)的治愈性治疗，但是一些疾病缓解药物(DMD)已经被批准用于MS。通常，用于RMS的DMT降低频率和/或复发的严重性。因此，虽然DMT不能治愈RMS患者，但它们可以减少患者的复发次数和严重程度。DMT包括但不限于用如下DMD进行治疗：干扰素β、醋酸格拉替雷、特立氟胺、米托蒽醌、富马酸二甲酯、克拉屈滨、芬戈莫德、西尼莫德、波内西莫德、阿仑单抗、达利珠单抗、那他珠单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗和利妥昔单抗。

根据本发明，如果DMT未停止或未适当减缓疾病进展，则它具有“功效的缺乏”。就是这种情况，例如，如果正在接受疾病缓解疗法(DMT)的患者显示疾病活动的体征，例如复发或病变。

根据本发明，DMT缺乏耐受性涉及存在如下不良事件：头疼、头晕、恶心、感染(如带状疱疹)、黄斑水肿、输注相关的反应或反复感染。

B细胞耗竭疗法

如本文所用，术语“B细胞耗竭疗法”是指导致B细胞耗竭的任何疗法，其包括CD19-/CD20-耗竭疗法例如基于抗CD20 mAb的B细胞耗竭疗法。特别地，在基于抗CD20 mAb的B细胞耗竭疗法中，B细胞的耗竭通过施用如下靶向表达CD20的B细胞的单克隆抗体来实现：阿仑单抗、达利珠单抗、那他珠单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗和利妥昔单抗。

负荷剂量

负荷剂量是药物的初始剂量，优选地初始较高剂量，可以在维持剂量取得成功前在疗程(例如DMT)开始时给予，优选地降低至较低的维持剂量。

神经稳定

临床状态的特征在于缺乏精神状态或意识水平的变化。这种状态可以包含控制癫痫；不存在新的神经缺陷，例如失语、共济失调、构音障碍、轻瘫、瘫痪、视野缺损或失明，并且定义为神经稳定性。

反弹

DMT停止后超过患者DMT前基线的严重疾病重新激活被认为是反弹事件。参考Barry等人，Fingolimod Rebound:A Review of the Clinical Experience andManagement Considerations[芬戈莫德反弹：临床经验和管理考虑的回顾].Neurol Ther[神经病学和治疗](2019)8:241-250。

突破性疾病

出于本发明的目的，突破性疾病被定义为：

·在前一年期间有至少一次记录的复发或在前两年期间有两次复发，

·在过去12个月内MRI扫描上存在至少一次Gd+病变，和/或

·在过去12个月内，在DMT下存在新的或扩大的T2病变。

如本文所用，“B细胞抑制剂”通常可以涉及消除、降低或衰减生物B细胞功能的任何物质。B细胞抑制剂可以中断生物B细胞功能(例如细胞因子分泌或对顺式和/或反式刺激的应答)所必需的信号转导途径。B细胞抑制剂还可以干扰干细胞/祖细胞产生B细胞或对其成熟产生负面影响。此外，B细胞抑制剂可以通过抑制与其他细胞群例如T细胞的串扰起作用。可替代地，B细胞抑制剂可以通过封存(例如进入淋巴组织例如脾脏)或通过裂解(例如经过CDC、ADCC、吞噬作用或其他方法)耗减B细胞。几个B细胞亚群可以表达CD20。

如本文所用，B细胞可以涉及一类淋巴细胞亚型的白细胞。B细胞功能通过分泌抗体例如免疫球蛋白(例如IgG)在适应性免疫系统的体液免疫组分中起作用。另外，B细胞可以呈递抗原并且分泌细胞因子。与T细胞和天然杀伤细胞不同，B细胞在其细胞膜上表达B细胞受体(BCR)。BCR允许B细胞与特异性抗原结合，从而开始抗体应答。

如本文所用，T细胞抑制剂可以涉及消除、降低和/或衰减生物T细胞功能的任何物质。T细胞抑制剂可以中断生物T细胞功能(例如细胞因子分泌或对顺式和/或反式刺激的应答)所必需的信号转导途径。T细胞抑制剂还可以干扰干细胞/祖细胞产生T细胞或对其成熟产生负面影响。此外，T抑制剂可以通过抑制与其他细胞群例如T细胞的串扰起作用。可替代地，T细胞抑制剂可以通过封存(例如进入淋巴组织例如脾脏)或通过裂解(例如经过CDC、ADCC、吞噬作用或其他方法)耗减T细胞。

如本文所用，T细胞可以涉及一类在胸腺中产生的淋巴细胞。T细胞可以通过细胞表面上T细胞受体的存在与其他淋巴细胞区分开。

实例

实例1

在人MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎中的布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂LOU064

在啮齿动物或非人灵长类动物中没有已知的天然存在的MS样疾病。用在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的CNS特异性髓鞘蛋白对易感啮齿动物菌株进行免疫后，开发了诱导的疾病模型。实验性自身免疫性脑炎(EAE)模仿了MS的许多病理表型，伴有CNS白质的局灶性脱髓鞘病变。在C57BL/6小鼠中，有两种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导的EAE变体，这取决于使用的是人(人MOG)还是大鼠(大鼠MOG)重组蛋白序列(Lyons J.A.等人(1999)European Journal of Immunology[欧洲免疫学杂志]29:3432-3439；Oliver A.R.等人(2003)J Immunology[免疫学研究杂志]171:462-468)。微小的氨基酸残基差异导致人MOG诱导的EAE作为APC完全依赖于B细胞，而大鼠MOG诱导的EAE不依赖于B细胞并且需要树突细胞作为主要的APC群体(Lyons等人1999；Molnarfi N.等人(2013)Journal ofExperimental Medicine[实验医学杂志]210(13):2921-2937)。

在人MOG诱导的EAE中，BTK抑制剂LOU064在12hr间隔以3mg/kg或30mg/kg每日两次(b.i.d.)给药。LOU064的预防性给药在MOG/CFA免疫前6小时开始并且持续到研究结束。

使用在表1中概述的得分系统评估EAE。在整个实验期间每日评估临床得分和体重。在治疗开始前，将动物随机分配，以使所有组的临床特征和体重具有可比性。

表1EAE得分标准

根据动物法规，EAE小鼠的人道终点为3分(>7天)、3.5分(>3天)或达到4分时立即。

LOU064(30mg/kg p.o.b.i.d.)抑制炎症诱导的恶病质并且显著减少EAE的临床症状(图1)。所述化合物在所有动物中均具有良好的耐受性。

额外的分析揭示LOU064功效与EAE发作频率的降低有关，且许多动物完全免受疾病侵害(图2)。

在整个实验期间，BTK抑制还降低组EAE得分(神经瘫痪峰值)和总疾病负担(图3)。

在化合物b.i.d.给药后1、5和8小时，LOU064存在于血液的浓度示于表2。血液中的暴露在1小时时间点显示出预期水平，在5小时和8小时时间点快速下降，并且从3到30mg/kgb.i.d给药剂量成比例地增加。总脑匀浆中的化合物水平非常低，并且主要在早期时间点可检测到。类似地，脑脊液(CSF)的水平低。

表2小鼠组织中LOU064的水平

在3和30mg/kg b.i.d.的口服给药后LOU064的血液、脑和CSF水平LLOQ在血液中是0.2nM，在脑匀浆中是0.5pmol/g以及在CSF中是0.5nM。显示的是1h时间点的4只动物以及5和8h时间点的3只动物的平均值±SD。其中用^a指示的高于LLOQ的值来自三只动物中的一只。

在脾脏中的BTK占有率在LOU064 b.i.d.口服给药后1、5和8小时进行确定(图4)。两种剂量在脾脏中的BTK占有率均最高，并且在3mg/kg剂量后显示衰减，且在30mg/kg剂量后更持续的占有率。这些BTK占有率水平与在小鼠中进行的其他研究相当。

在腹股沟淋巴结中的BTK占有率示于图5。两种剂量的BTK占有率均最高，并且在3mg/kg剂量后显示衰减，且在30mg/kg剂量后更持续的占有率。这些BTK占有率水平与在小鼠中用LOU064的进行的其他研究相当。

在已经制备用于化合物暴露分析的脑匀浆中评估BTK占有率(图6)。接受30mg/kgb.i.d.LOU064的剂量组显示最高的BTK占有率且在给药间隔期间下降。3mg/kg剂量仅在1小时时间点导致最小的BTK占有率。脑BTK占有率的变异性可能是由于分析是在为化合物水平评估制备的匀浆的剩余部分上进行的。

血清中MOG特异性抗体应答的离体分析揭示IgM和IgG水平仅小幅但具有统计学显著的降低(图7)。在人MOG诱导的EAE模型中，(自身)抗体应答是微致病性的。在EAE得分功效和抗体仅有轻微调节之间的差异表明B细胞抗原呈递是神经炎症过程的关键驱动因素。

使用短暂的八天(疾病发作前)EAE方案，研究了人MOG模型期间的免疫引发机制。用LOU064的预防性治疗与改善的体重增加有关，表明在模型中炎症诱导的恶病质被调节(图8)。如先前所述，任一剂量组均没有观察到不良事件。

使用在免疫后第8天收集的分离的脾细胞和引流淋巴结细胞研究离体MOG诱导的回忆增殖应答。体内治疗导致两个免疫细胞区室中增殖的剂量依赖性减少(图9)。相比之下，淋巴结细胞的板结合的抗CD3/CD28多克隆刺激不受体内治疗的影响。该数据表明特异性抑制B细胞抗原呈递功能而不是广泛的免疫抑制。

分离的脾细胞、淋巴结细胞和血液的离体分析揭示总B细胞群没有显著的变化(图10)。CD4+T细胞的分析揭示只有Th17群体在LOU064治疗后减少，而Th1和调节性T细胞没有变化。

为了进一步阐明BTK抑制剂功效是否与B细胞抗原呈递功能的降低直接相关，在重组大鼠MOG诱导的EAE模型中测试了化合物。该EAE模型与重组人MOG诱导的EAE具有许多特征，其中MOG特异性T细胞浸润CNS并且导致神经瘫痪。然而，大鼠MOG诱导的EAE不依赖于B细胞，并且树突细胞是主要的抗原呈递细胞类型。因此，预测BTK抑制剂在大鼠MOG诱导的EAE中没有显著的功效，除非药物治疗与更广泛的、非特异性的免疫抑制有关。除了以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg使用的LOU064之外，还测试了参考化合物依鲁替尼。环孢菌素A(CsA)作为直接T细胞免疫抑制的阳性对照。使用短暂的八天(疾病前)EAE方案研究了在大鼠MOG模型期间的免疫引发机制，没有观察到任一BTK抑制剂的不良事件。使用在免疫后第8天收集的分离的脾细胞研究离体MOG诱导的回忆增殖应答。体内BTK抑制剂治疗对回忆应答没有影响(图12)。相比之下，CsA显著抑制T细胞回忆增殖。该数据表明BTK抑制介导的免疫调节具有高选择性，并且与在(自身)免疫引发期作为抗原呈递细胞的B细胞直接相关。

结论与讨论

这些研究在C57BL/6小鼠中利用两种不同的EAE模型。重组人MOG诱导的EAE模型依赖于B细胞并且对抗CD20 B细胞耗减敏感，而大鼠MOG诱导的EAE模型不依赖于B细胞且树突细胞作为关键的抗原呈递细胞。

证明低分子量BTK不可逆的(共价)抑制剂LOU064意外地高效抑制人MOG诱导的EAE诱导。对临床得分和炎症诱导的恶病质的功效与组织中持续高水平的BTK占有率密切相关。从机制上讲，实验发现与在免疫引发期间抑制B细胞依赖性(自身)抗原呈递导致致病性Th17细胞频率降低是一致的。显著的临床得分功效和(自身)抗体的轻微减少之间的连接断开表明这不是关键的致病机制。

来自大鼠MOG诱导的EAE模型的证据显示BTK抑制在免疫引发期不影响(自身)免疫T细胞应答。因此可以得出结论，BTK抑制剂(LOU064)的功效不是广泛(非选择性)免疫抑制的结果。

总之，令人惊讶地是，共价BTK抑制剂LOU064证明了高选择性作用机制，意外地在已知与治疗人的多发性硬化高度相关的致病过程中产生了出色和更好的功效。

实例2

在大鼠MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎中的布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂LOU064

已报道药理学BTK抑制或遗传BTK缺乏改善临床前小鼠EAE，表明BTK抑制剂可由于其对B细胞以及骨髓细胞的影响而获得功效(Torke S.和Weber M.S.(2020)ExpertOpinion on Investigational Drugs[对研究药物的专家意见]29:1143-1150；Mangla A.等人(2004)Blood[血液]104(4):1191-7和实例1)。虽然先前对LOU064的研究侧重于B细胞驱动的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型(实例1)，但本研究通过显示LOU064在B细胞非依赖性大鼠MOG-EAE中显示功效(可能通过它对骨髓细胞的作用)进一步扩展了这一证据。

LOU064治疗减少EAE发展

在大鼠MOG诱导的EAE中，BTK抑制剂LOU064在8/16hr间隔以30mg/kg每日两次(b.i.d.)给药。LOU064的给药在MOG/CFA免疫前4小时开始并且持续每日两次到研究结束。LOU064抑制炎症诱导的EAE和恶病质的临床症状(图13)。所述化合物在所有小鼠中均具有良好的耐受性。

额外的分析揭示LOU064功效与EAE发病率的降低和延迟的发作有关，且许多小鼠完全免受疾病侵害(图14)直至研究终止(p值＝0.018)。

在整个实验期间，BTK抑制还显著降低组EAE得分(神经瘫痪峰值p值＝0.069)和总疾病负担(p值＝0.013)(图15)。

LOU064治疗实现其药理学靶标

图16显示了在终止当天，最后一次给药后16小时从小鼠取样的脾脏、血液和脑中的终端BTK占有率。在LOU064暴露峰值时，脾脏和血液中的BTK谷占有率水平在指示的最高BTK占有率的范围内。一旦LOU064的全身暴露减弱，显示它就会受到游离BTK重新合成的影响(Angst等人，2020)。这些BTK占有率水平与在小鼠中进行的先前研究相当。

在脑匀浆中评估的BTK占有率显示中间水平，表明在血液暴露峰值时达到显著(对于脾脏、血液和脑，p值<0.001)但可能次最高的脑BTK占有率。

LOU064治疗对自身抗体水平没有影响

图17显示在终止当天最后一次给药后16小时血清中MOG特异性自身抗体的水平(第21天)。与未试验过的小鼠相比，在用媒介物或LOU064治疗的免疫小鼠中，MOG特异性自身抗体水平、总IgM和IgG亚类显著更高。与媒介物治疗的小鼠相比，LOU064治疗对血清中MOG特异性IgM和IgG应答没有影响。这些结果与在人MOG EAE模型观察到的结果一致，如在以上实例1中描述的。

LOU064治疗倾向于降低血清NF-L水平

图18显示血清中NF-L的水平。与未试验过的小鼠相比，在用媒介物或LOU064治疗的免疫小鼠中，NF-L平均水平显著更高。此外，媒介物治疗组显示在临床得分增加和血清NF-L水平之间的显著的相关性(p值＝0.0006)。与媒介物治疗组相比，这在LOU064治疗组中观察到NF-L平均水平降低的趋势不显著。

通过IHC在组织中BTK表达的证据

图19显示BTK在淋巴结(阳性对照；A和B)和未试验过的小鼠(C和D)脑中表达的IHC染色的代表性实例。在这些小鼠中，BTK在淋巴结中的B细胞滤泡中表达(A)的，特别是在整个淋巴结副皮质区的一些扩散细胞中(B)。在未试验过的小鼠脑中，特别地在胼胝体中不能检测到BTK(C和D)。

结论与讨论

本研究的主要目的是评估有效和选择性BTK共价抑制剂(LOU064)在B细胞非依赖性EAE模型中的功效。在本研究中，以30mg/kg b.i.d.的剂量给予LOU064证明在血液和脾脏中BTK完全占有率但在脑中BTK仅部分占有率。

获得的结果显示LOU064在降低大鼠MOG诱导的EAE的严重性方面确实有效，且不会影响平行的IgM和IgG应答。

总之，这些结果显示LOU064的治疗功效，与其抑制B细胞中BTK的能力无关。由于骨髓细胞(例如巨噬细胞、中性粒细胞或肥大细胞)也已知表达BTK(Torke等人,2020)，因此可以怀疑这些细胞在所用模型中的关键致病作用。这与最近的临床前和临床观察一致，清楚地表明靶向外周骨髓细胞以控制CNS炎症的有益影响(Ifergan I.和Miller S.D.(2020)Front Immunology[免疫学前沿]11:571897)。

虽然本研究中使用RatMOG EAE模型的LOU064功效的驱动因素可能是抑制外周BTK表达的骨髓型免疫细胞，如巨噬细胞，但意外地显示在脑中检测到的BTK占有率水平也可能有助于整体治疗效果。由于组织学分析未揭示健康小鼠的脑中的BTK表达，因此可以得出结论，在EAE小鼠的脑中测量的BTK占有率水平反映了EAE诱导的BTK表达细胞对CNS的浸润。

本研究显示LOU064对EAE诱导的IgM/IgG应答没有影响的事实与先前对抗MOG抗体应答水平的观察一致(实例1)。总之，共价BTK抑制剂LOU064意外地在已知与治疗人的多发性硬化高度相关的致病过程中显示了出色的功效。使用30mg/kg b.i.d的EAE剂量转换为100mg b.i.d的人体剂量令人惊讶地获得了尤其有利的结果。

实例3：LOU064脑渗透性

使用犬P-gp敲除MDCK细胞单层(MDCK-LE V2)进行被动渗透性测量

基于细胞的测定用于评估候选药物在胃肠道吸收的上下文中的被动渗透性。已敲除编码P-gp的内源性犬Mdr1(cMdr1)基因的MDCK细胞系在96孔Transwell板上生长以形成单层。将化合物以每盒10μM的浓度装入三个盒的顶区室中，并且在孵育两小时后，通过串联质谱法定量出现在基底室中的化合物的量。

特别地，通过敲除内源性犬Mdr1(cMdr1)基因产生MDCK细胞系。该细胞系的亚克隆用于使用一组37种已知吸收部分的商业化合物将被动渗透性与人体肠道吸收的部分联系起来。所述测定能够根据测定中测量的Papp估计人体吸收的部分。

方法

样品经受RapidFire/MS/MS分析和LC/MS/MS分析。RapidFire和LC/MS/MS条件在以下指出。

质谱仪：Sciex QTRAP5500

自动进样器：Shimadzu SIL-30ACmp

HPLC泵：Shimadzu LC-30AD

柱：Phenomenex Kinetex极性C18 2.1x 30mm，2.6μm

柱箱温度：50℃

进样体积：2μL注射剂

流动相A：含有0.1％(v/v)甲酸的水

流动相B：含有0.1％(v/v)甲酸和4％(v/v)水的乙腈

检测器：SCIEX API5500 QTrap参数：

来源：ESI

离子喷射电压：4500V(在负离子模式下-4500V)

离子源Gas1：60psi

离子源Gas2：40psi

温度：450℃

气帘气体：30psi

碰撞气体：9psi

使用自动调整应用DiscoveryQuant-Optimize获取所有MS参数，例如亲本质量、产品质量、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等。扫描时间是0.025s。

经典的HPLC前端仪器的更快替代品是配备C4(RFCP4A)管状柱的RapidFire 360系统(安捷伦技术公司(Agilent Technologies))。所述设备以类似于HPLC的方式连接到串联质谱仪。Rapid Fire用最小的色谱进行固相萃取。所述方法比传统LC快得多，但是LLOQ会增加，并且某些化合物在管状柱上的保留很差，因此可能需要使用经典的LC方法对某些化合物进行再处理。

RapidFire参数：

RapidFire：Agilent RF360参数：

RapidFire循环持续时间：

抽吸：500ms(约20μL)

加载/清洗：4000ms，流速为1.5mL/min，使用0.1％(v/v)甲酸水溶液

洗脱：3000ms，流速为1.0mL/min，使用0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液

重新平衡：500ms，流速为1.25mL/min，使用0.1％(v/v)甲酸水溶液

RapidFire管状柱类型：C4(RFCP4A)

结果

对于LOU064，发现Papp＝37.3的高渗透性在MDCK跨孔测定中具有高回收率。

实例4

LOU064的安全性

LOU064的安全性已经在I期和II期药代动力学和临床药理学健康受试者研究以及II期/III期临床研究中进行了测试，这些研究在患有MS以外适应症(特别是慢性自发性荨麻疹(CSU)和干燥综合征(SjS))的患者中进行。

在I期临床研究中LOU064的短期安全性

LOU064作为单次剂量或长达18天的多次剂量，长达18天涵盖的剂量范围从0.5mg至600mg，并且进一步以长达12天的100和200mg b.i.d.的短期安全性在I期临床研究中显示(Kaul,M.等人(2021).Remibrutinib(LOU064):A selective potent oral BTKinhibitor with promising clinical safety and pharmacodynamics in a randomizedphase I trial[雷米布鲁替尼(LOU064)：在随机I期试验中有希望的临床安全性和药效学的选择性强效的口服BTK抑制剂].Clinical and Translational Science[临床和转化科学].10.1111/cts.13005)。

在CSU受试者中的2b期研究的安全性和耐受性的总结(中期结果)

在CSU受试者中进行的剂量范围发现研究中，正在测试以下剂量：在12周内10、35和100mg q.d.以及10、25和100mg b.i.d.和安慰剂。

LOU064在整个剂量范围内均具有良好的耐受性，大多数AE的严重程度较轻并且没有明显的剂量依赖性模式。严重AE和最频繁的AE按优选的术语和主要系统器官类别列于表3。总体而言，58.1％服用任何剂量的LOU064的患者有至少一个AE：38.6％服用LOU064的患者有轻度AE，16.9％的患者有中度AE，并且2.6％的患者有严重AE。在安慰剂组，42.9％的患者报告至少一个AE：33.3％服用安慰剂的患者有轻度AE，9.5％的患者有中度AE，并且0.0％的患者有严重AE。研究期间没有死亡。接受任何剂量LOU064的五名患者(1.9％)报告了严重AE，而接受安慰剂的患者则没有(0.0％)：一名患者报告肾脓肿，这导致治疗的中止(在第29天，25mg b.i.d.)；一名患者报告淋巴结病的恶化(在研究开始前出现但在第12天恶化，10mg q.d.)；一名患者在无治疗随访期间报告输尿管结石(在第87天，10mg b.i.d.)；并且两名患者经历其CSU发作/恶化(一名患者在第30天导致中止，10mg b.i.d.并且一名患者在第5天，25mg b.i.d.)。

感染和侵染是主要系统器官类别中最常见的AE，其中24.0％接受任何剂量LOU064的患者对比21.4％接受安慰剂的患者。头痛(在任何剂量LOU064中为9.7％对比14.3％安慰剂)和鼻咽炎(8.6％对比7.1％)是最频繁报告的AE(在任何治疗组中≥10％的患者出现)。

总体而言，2.6％任何剂量LOU064的患者(n＝7)有导致研究药物中止的AE，而安慰剂为0.0％(n＝0)。没有显著的实验室发现，包括在研究期间任何试验组的血细胞计数。

对实验室数据的分析没有揭示显著的发现。总的来说，AE 3级事件有三个通用术语标准(没有一个更高)，均无症状且无需医疗干预即可消退。一名患者在开始生酮饮食(10mg q.d.)后第8周出现肌酐升高；在停止饮食后值正常化。一名有淋巴细胞减少病史的患者(35mg q.d.)在第12周时出现一个中性粒细胞计数减少；值在无治疗随访期间改善。第8周有一次丙氨酸转氨酶升高(100mg q.d.)；值在治疗时恢复正常。

表3：治疗时出现的不良事件、严重不良事件和暴露的安全性总结

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AE，不良事件；b.i.d.，一天两次；N，患者数量；PT，优选的术语；q.d.，一天一次；SAE，严重不良事件；SOC，系统器官类别

MedDRA 24.0版用于报告。

在CSU受试者中的2b期研究(扩展期)的安全性的总结(中期结果)

在52周开放标签扩展研究中，评估LOU064在参加2b期研究的患有CSU的有资格受试者中的长期安全性和耐受性，使用的剂量是100mg b.i.d。

基于对100名接受至少1剂量的LOU064且具有17.86周的中位暴露(范围：2.9周至44.7)的受试者的中期分析，没有观察到安全性信号。在截止时，93名受试者(93％)正在进行研究，并且7名受试者已经从研究中止；没有因为不良事件而中止。表4呈现了至中期分析截止日期的2b期研究中观察到的安全性总结数据。

表4开放标签扩展研究的中期分析：死亡、其他严重或临床显著的不良事件或相关的中止(安全性集)

中期分析截止2020年8月31日

五十八名受试者(58％)经历至少一个治疗时出现的AE。大多数AE不严重，不会导致治疗中止，并且严重性较轻。受影响最频繁的SOC是感染和侵染(14％)，其次是皮肤和皮下组织障碍(13％)，且没有关于特定不良事件的趋势。最常见的不良事件优选的术语(≥2％)是头疼(6％)、腹泻(4％)、头晕(3％)和胃肠炎(3％)；未报告出血事件(定义为出血SMQ广泛下的事件，PT包括血小板聚集异常、血小板聚集减少、血小板聚集抑制、血小板功能障碍、血小板功能测试异常和血小板毒性)或SOC血液和淋巴系统障碍下的事件。报告三个SAE：卵巢囊肿、胸痛和阑尾炎；认为没有一个与研究药物有关。

2b期研究和相应的开放标签扩展研究的结论

综上所述，在2b期研究中，所有评估的剂量都没有新的或意外的安全性发现。此外，在相应的CSU扩展研究中，使用LOU064 100mg b.i.d.开放标签，截至2020年8月31日，在招募的100名受试者中未观察到安全性信号。认为拟议的100mg LOU064 b.i.d.的剂量具有良好的耐受性并且具有良好的安全性特征。

在CSU受试者中的2b期研究(扩展期)的安全性的总结(中期结果/具有35.14周的中位暴露的患者)总结

在以上52周开放标签扩展研究中，评估LOU064在患有CSU的有资格受试者中的长期安全性和耐受性，这些受试者以100mg b.i.d.的剂量参加2b期研究，对患者(N＝183)进行了新的中期分析且中位暴露为35.14周，并且将结果与随机双盲、安慰剂对照的Ph2b核心研究中的安全性结果进行比较，在患有CSU的成年患者中接受长达12周(wk)的(1:1:1:1:1:1:1)雷米布鲁替尼10mg qd(每日一次)、35mg qd、100mg qd、10mg bid(每日两次)、25mgbid或100mg bid或安慰剂(NCT03926611)。(表5)

在ES的长期暴露(中位35.14wks，N＝183)中，雷米布鲁替尼治疗中出现至少一个不良影响(AE)的患者比例(57.4％[n＝105])与CS相似(通过任何剂量雷米布鲁替尼呈现)(58.1％[n＝155]；中位12.14wk，N＝267)。在ES中，有4例严重不良影响(SAE)，6例导致治疗中止的AE，并且没有死亡。在ES和CS中按照主要器官类别(SOC)报告的AE的发病率相似：感染和侵染(23.0％和24.0％)，其次是皮肤/皮下组织障碍(17.5％和16.9％)(表5)。在ES和CS中按照优选的术语报告的AE的发病率具有可比性，其中头痛(6.6％和9.7％)最为常见。在ES中AESI例如感染(23％)、出血(4.4％)和血细胞减少(0.5％)的发病率与CS一致。在ES(分离的ALT>3xULN，4周内正常化，1名患者因个人原因提前中止)和CS(1名患者的ALT>5xULN，治疗正常化)两者中新出现的显著转氨酶升高都是单一的。实验室参数的分析没有揭示显著的安全性问题，并且没有观察到生命体征有临床意义的变化。在任何患者中没有注意到显著的ECG发现或>500ms的QT。

结论

雷米布鲁替尼在整个剂量范围内均显示良好的安全性特征，且在患有CSU的患者中更长期暴露于100mg bid剂量长达52周，没有观察到新的安全性信号。

表5.雷米布鲁替尼(LOU064)在2b期核心和扩展研究(安全性集)中的安全性特征

/>

实例5

以下说明了优选的药物组合物(薄膜包衣片)。

^1.2在处理过程中去除

实例6

以下说明了另一优选的药物组合物(硬明胶胶囊)。

¹针对胶囊帽和胶囊体

²委员会法规(EU)制定了食品添加剂规范

E＝欧盟用于着色剂的官方编号

硬明胶胶囊显示良好地稳定性，并且当前有效期是36个月。

实例7

使用LOU064的平移PK/PD模型预测BTK占有率

由于LOU064药理学特性(不可逆结合)，血液中的BTK占有率不是用于剂量选择的信息生物标志物。在通过其他生物标志物(CD63、CD203c、皮肤点刺试验)显示药理活性之前，即使在低剂量下也能达到完全占有率。组织中的占有率可以更能代表LOU064的功效。

目标

该分析的目的是表征LOU064在健康志愿者中药代动力学(PK)，并且使用先前开发的平移靶向占有率模型来模拟在一系列剂量和给药方案(BID对比QD)中人脾脏/组织中的BTK占有率。

数据

来自Kaul等人(2021)报告的I期临床研究的药代动力学数据用于当前分析，包括102名患者。

方法

使用两步方法开发平移靶向占有率模型来模拟在脾脏/组织中的BTK占有率。

在第一步，建立群体PK模型以描述来自Kaul等人(2021)报告的I期临床研究的LOU064 PK数据。在第二步，来自群体PK模型的参数估计值用于BTK占有率模型，以预测在血液和脾脏/组织中的BTK占有率。最终，BTK占有率模型用于预测不同剂量下不同给药方案(QD、BID)在脾脏/组织中的BTK占有率。

结果

已经开发群体PK模型以描述来自Kaul等人(2021)报告的I期临床研究的中期PK。为了解决重复给药剂量低于50mg后清除率的变化(与第1天相比，第12天稳态清除率较低，且较高剂量无差异)，对于低于50mg的剂量和高于50mg的剂量的恒定清除率，清除率建模为指数时间衰减的函数。总体而言，所得的群体模型相当好地描述了PK数据。

PK参数估计用于平移BTK占有率模型以模拟在稳态的BTK占有率。BTK占有率模拟显示在相同剂量下BID给药比QD给药更有效，以实现更高的BTK占有率(在24小时间隔内的谷值或平均值)。

对于QD和BID方案的所选的剂量数量，10mg、35mg、100mg每日一次和10mg、25mg和100mg每日两次的给药方案在24小时期间在谷值和平均值的稳态BTK占有率分别示于图21A(在稳态24小时期间的BTK占有率的谷值)和图21B(在稳态24小时期间的BTK占有率的平均值)。两个图都显示了可能需要高达200mg(100mg BID)的每日剂量来实现外周靶向组织中的BTK谷占有率≥80％。

进行模拟来比较不同的给药方案。在100mg BID对比100mg QD的稳态模拟随时间的脾脏BTK占有率的比较示于图22。图显示与QD给药相比，BID给药的占有率更高且变化更小。

结论：

BTK占有率模拟显示在相同剂量下BID给药比QD给药更有效，以实现更高的BTK占有率(在24小时间隔内的谷值或平均值)。

实例8

在用RMS治疗的患者中显示LOU064的功效和安全性的III期临床研究

目标

为了证明LOU064(100mg p.o.b.i.d.)在降低确诊的复发频率方面优于特立氟胺(14mg p.o.每日一次)，如通过复发MS多发性硬化患者的年复发率(ARR)评估，患者接受LOU064治疗。

方法

进行了两项相同的双盲、随机、双模拟、主动比较对照、平行组、多中心研究，评估LOU064(100mg b.i.d.)对比特立氟胺(14mg)治疗患有RMS的患者的功效和安全性以及他们的长期开放标签安全性扩展。总的来说，大约1600名受试者(每个研究800名)参加这些III期研究。

随机分配(1:1)患者接受LOU064 100mg p.o.b.i.d.或特立氟胺14mg每日一次口服持续长达30个月，从第1天开始。研究具有灵活的持续时间，且根据预先特定的标准在设盲核心治疗时期终止。包括年龄为18-55岁，根据2017McDonald诊断标准(这将包括复发缓解型病程(RRMS)或伴有疾病活动的继发进展型(SPMS)病程)诊断为复发MS，且在筛选时具有0-5.5的扩展残疾状态量表(EDSS)得分(根据Kurtzke,Neurology[神经病学]:1983年11月；33(11):1444-52)的患者，所述患者在过去一年中经历≥1次复发或在过去2年中≥2次复发或在随机分组前6个月内钆增强(Gd+)MRI扫描呈阳性并且在随机分配前1个月内神经功能稳定。

研究的主要终点是年复发率(ARR)，即每年确诊的复发次数。主要次要终点包括残疾终点(汇总CDP，即根据两项研究的汇总数据在EDSS上通过3个月确认的残疾进展(3mCDP)和6个月确认的进展(6mCDP)衡量的残疾进展时间)、MRI终点(即每次MRI扫描的T1钆(Gd)增强病变数，每年MRI上新的或扩大的T2病变数(T2年病变率))，血清中神经丝轻链(NfL)浓度，基于两项研究的汇总数据没有疾病活动-3(NEDA3)的证据，以及基于对从基线脑容量变化百分比的评估的脑容量损失率(BVL)。

使用NB模型分析ARR和MRI终点；使用Cox回归模型分析CDP终点。

对于每项研究，共大约800名受试者以1:1比率(每个治疗组400名)随机分配研究药物，提供>90％效力证明LOU064在每项研究的主要终点(ARR)方面优于特立氟胺，假设基于在2年内具有0.025显著性水平和20％退出率的单侧检验，雷米布鲁替尼(LOU064)使ARR相对降低40％。从两项研究组合的1600名患者提供了90％效力来证明LOU064在3mCDP中优于特立氟胺，假设基于在2年内具有0.025显著性和20％退出率的单侧检验降低40％的风险。还通过测量次要终点(如SDMT、T25FW和9HPT)以及测量患者报告的结果(如MSIS-29、HUI-III、PHQ-9、GAD-7、FSIQ-RMS和BPI-SF)来评估LOU064(100mg bid)的附加功效以及LOU064治疗与特立氟胺(14mg QD)相比治疗RMS患者的优势。

次要结果测量的总结示于下表：

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运行扩展部分以测量LOU064(100mg bid)的长期安全性和功效。

扩展部分是开放标签、单臂、固定剂量设计，其中有资格的参与者接受LOU064治疗长达5年。核心研究(长达30个月)中LOU064的参与者将继续使用LOU064(100mg bid)，并且核心研究中特立氟胺(14mg QD)的参与者将转换为LOU064(100mg bid)

/>

实例9

用LOU064治疗的大鼠MOG EAE小鼠的scRNA-seq分析

方法

scRNA-seq数据的处理和质量控制

使用Cell Ranger处理10X Genomics Chromium原始测序读数[Zheng,G.等人(2017),Nat Commun[自然传播]8,14049]。所有随后的分析在R v4.1和Bioconductorv3.14中进行，大致遵循在“Orchestrating single-cell analysis with Bioconductor[用Bioconductor协调单细胞分析]”[Amezquita,R.A.等人(2020),Nat Methods[自然-方法]17,137-145]中的指南，并且使用由scuttle、scater[Davis J McCarthy等人(2017),Bioinformatics[生物信息学],第33卷,8,1179-1186]和scran[Lun ATL等人(2016),F1000Research[F1000研究],5:2122；https://doi.org/10.12688/f1000research.9501.2]软件包提供的框架。由于每个细胞的UMI数量少并且怀疑被环境RNA污染，一个样品被排除在分析之外。自适应阈值质量控制用于去除文库大小低、检测基因数量少或线粒体读数比例高的低质量细胞。使用scDblFinder确定和去除双峰[Germain PL等人(2021)F1000Research[F1000研究]10:979；https://doi.org/10.12688/f1000research.73600.1]。总的来说，76287个细胞通过质量控制。

标准化、特征选择和降维

为了校正文库大小和组合物偏差，通过合并细胞和解卷积大小因素进行标准化，然后进行log2转换。每个基因的均值-方差关系分别为两个组织建模。在基因变异的生物组分等于零的零假设下，使用5％FDR阈值选择高度可变的基因。然后使用这些基因进行主要组分分析，并且只保留与基因变异的生物组分相关的PC。最后，所选的PC用于获得数据的降维表示(UMAP)。

聚集和细胞类型注释

基于共享最近邻图的聚集方法，具有5个最近邻，Jaccard指数作为加权方案，并且Louvain作为聚集方法用于识别相似细胞的聚集。使用SingleR[Aran D等人(2019),NatImmunol.[自然实免疫学]20,163-172]和两组小鼠细胞类型的批量转录组学参考[Heng TS等人(2008),Nat.Immunol.[自然实免疫学]9,1091-1094；Benayoun B等人(2019),GenoneRes.[基因组研究]29,697-709]将细胞聚集分配给细胞类型。使用U细胞将小胶质细胞进一步注释为稳态小胶质细胞(HM)和疾病相关的小胶质细胞(DAM)[Andreatta M.等人(2021),Comput Struct Biotechnol J.[计算和结构生物技术杂志]19:3796-3798]以及在[Deczkowska A等人(2018),Cell[细胞].17；173(5):1073-1081]中的标记基因。

差异表达和富集分析

对于每种细胞类型，使用edgeR[Robinson Md等人(2010),Bioinformatics[生物信息学],26(1),139-140]进行伪批量差异表达分析，然后使用fgsea[GennadyKorotkevich等人,doi:https://doi.org/10.1101/060012]进行基因集富集分析以及来自MSigDB的多基因集收集[Arthur Liberson等人,Bioinformatics[生物信息学],第27卷,12:1739-1740]。用U细胞[Andreatta M.等人(2021),Comput Struct Biotechnol J.[计算和结构生物技术杂志]19:3796-3798]对来自人表型本体[S.等人(2021)NucleicAcids Res.[核酸研究]49(D1):D1207-D1217.doi:10.1093/nar/gkaa1043]的神经炎症特征进行得分，并且用单尾曼-惠特尼U检验评估其显著性。

结果

用LOU064抑制大鼠MOG EAE小鼠中的Btk抑制小胶质细胞中的神经炎症

通过使用scRNA-seq分析用LOU064或正常食物处理的大鼠MOG EAE小鼠的脑和脊髓，我们确定了13种不同的细胞类型，包括基质细胞(成纤维细胞、内皮细胞)、CNS中募集的所有主要免疫细胞类型(B细胞、T细胞、DC、单核细胞和巨噬细胞)和CNS的驻留细胞：神经元、神经上皮细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞，我们将其进一步分类为HM和DAM。

在鉴定了LOU064处理的动物和对照在13种细胞类型中差异表达的基因后，我们研究了小胶质细胞中LOU064是否影响神经炎症基因特征(源自人表型本体)，并且在大多数情况下观察到显著下调(图23)。

实例10：通过健康受试者伴随和中断施用雷米布鲁替尼对三种不同类型疫苗的免疫应答调节的评估

目标和相关终点

研究设计

整体设计

这一随机、双盲、安慰剂对照的研究具有平行的组设计。考虑到估计的退出率高达20％，将大约90名具有非生育潜力的健康女性和男性参与者随机分配至三个治疗组中的任一个，以实现最少72名可评估的完成者。所述研究将包括28天的筛选期、43天的治疗期，随后在最后一次研究药物施用后两周内的研究完成评估(第57天)。在最后一次研究药物施用后约30天(第73天)进行安全性随访电话。参与者在第-1天至第1天和第14-17天居住。总的来说，每名参与者的最长研究持续时间是约85天。

参考安慰剂评估伴随和中断雷米布鲁替尼治疗情形对流感23和的影响。

研究实施

筛选及基线

筛选时满足合格标准的参与者将允许在第-1天进行基线评估。所有基线安全性评价结果必须在第一次给药前获得。在基线，将参与者随机分配至下述三个治疗组之一。

治疗

所有参与者从第1天至第42天接受研究药物(雷米布鲁替尼100mg或安慰剂b.i.d.)，并且在第43天返回诊所进行治疗结束访视。所有参与者在第15天还接受四价流感疫苗、PPV-23疫苗和KLH新抗原疫苗。疫苗接种应在研究药物施用后3小时进行。

在临床访视期间和在居住期间(第-1天至第1天和第14-17天)，由诊所的研究人员将研究药物施用于参与者。在治疗期间从临床访视出院后，将研究药物与药物日记一起提供给参与者在家中自我管理。

安全性评估将包括身体检查、ECG、生命体征、标准临床实验室评价(血液学、血液化学、尿液分析)不良事件和严重不良事件监测。

将在第8天、第15天和第36天从所有参与者抽取多个血液样品以评估雷米布鲁替尼的药代动力学。

组A(伴随雷米布鲁替尼治疗)：

参与者将从第1-7天接受安慰剂(b.i.d.)，随后在研究第8-15天用雷米布鲁替尼(100mg b.i.d.)治疗以在第15天三种疫苗施用前达到PK/PD稳态。参与者将继续接受雷米布鲁替尼(100mg b.i.d.)直到第42天。

组B(中断雷米布鲁替尼治疗)：

参与者将从第1-7天用雷米布鲁替尼100mg b.i.d治疗以达到PK/PD稳态条件，随后从第8-28天施用安慰剂(b.i.d.)，并且将在第15天施用三种疫苗。用雷米布鲁替尼100mgb.i.d.的治疗将从第29至42天重新开始治疗。

组C(安慰剂)：

在组C的参与者将从第1-42天接受安慰剂(b.i.d)，并且将在第15天在安慰剂条件下接种3种疫苗。

关键纳入标准

·必须在参与研究之前提供签字的知情同意书。

·年龄在18至55岁(含)的健康或轻度肥胖但其他方面健康的男性和非生育潜力女性参与者。

·参与者应身体健康，如通过既往病史、身体检查、生命体征、ECG和在筛查和基线访视时所示的实验室测试确定的。

·在筛选和基线时，将在坐姿以及再(在评估时间表需要时)在站姿中评估生命体征(收缩压和舒张压和脉搏率)。坐姿生命体征(在坐姿3分钟后)必须在以下范围内：

·35.0℃至37.5℃的鼓膜体温。

·90和139mmHg(含)的收缩压(SBP)。

·50和89mmHg(含)的舒张压(DBP)。

·45和90bpm(含)的脉搏率。

·参与者的体重必须至少为50kg才能参与研究，并且参与者的体重指数(BMI)必须在18至34.9kg/m2的范围内。

·参与者必须愿意按照方案的要求留在临床中心，并遵守ICF中概述的要求/说明。

·能够读、说并理解当地语言，以了解并遵守研究要求。

关键排除标准

1.在首次给药前5个半衰期或30天内(以较长者为准)使用其他研究药物。

2.临床上显著的ECG异常的当前证据或既往病史或QT间期延长综合征或其他心脏传导异常的家族病史(祖父母、父母和兄弟姐妹)、尖端扭转型(TdP)的额外的风险因素的病史(例如心力衰竭、低钾血症)和/或已知病史或当前有临床意义的心律失常。异常ECG定义为PR>220msec，QRS波群>120msec，男性和女性QTcF>450msec，或除早期复极、非特异性S-T或T波变化外的任何其他形态学变化。

3.在过去5年内(无论是否存在局部复发或转移的证据)已治疗的或未治疗的任何器官系统的恶性病史或存在(局部皮肤基底细胞癌或原位宫颈癌除外)。

4.任何主要系统器官类别的任何临床显著疾病(包括(但不限于)在初始给药前两周内未解决的心血管、肺、代谢、肝、肾、血液、内分泌、神经或精神疾病)的病史或存在

5.对雷米布鲁替尼或来自相同化合物类别的药物或其赋形剂的超敏反应。

6.使用Pneumovax 23、流感或KLH疫苗的任何禁忌症，包括任何急性感染、发热或超敏反应或已知对本研究中将施用的疫苗的任何相关组分(例如鸡蛋或贝类/KLH)的超敏反应。

7.2022-2023年季节性流感疫苗接种史或已知在招募前2022-2023年流感季节期间流感感染的临床诊断。

8.先前用KLH暴露或免疫的病史。

Claims

1.一种用于在治疗多发性硬化中使用的LOU064或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述使用的LOU064，其中将LOU064以约50mg至约150mg的剂量每日两次口服施用。

3.根据权利要求1或2所述使用的LOU064，其中将LOU064以约100mg的剂量每日两次口服施用。

4.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中所述治疗是长期治疗。

5.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中多发性硬化选自复发型多发性硬化，特别地临床孤立综合征(CIS)、复发缓解型多发性硬化(RRMS)和继发进展型多发性硬化(SPMS)，特别地活跃性SPMS。

6.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中所述患者从早期疾病缓解疗法的药物转换为LOU064。

7.根据权利要求6所述使用的LOU064，其中所述早期疾病缓解疗法的药物选自B细胞和/或T细胞抑制剂、特立氟胺、米托蒽醌、富马酸二甲酯、克拉屈滨、芬戈莫德、西尼莫德、波内西莫德、醋酸格拉替雷和干扰素(例如β干扰素)。

8.根据权利要求6或7所述使用的LOU064，其中所述早期疾病缓解疗法缺乏功效。

9.根据权利要求6至8中任一项所述使用的LOU064，其中所述患者缺乏对所述早期疾病缓解疗法的耐受性。

10.根据权利要求6至9中任一项所述使用的LOU064，其中所述早期疾病缓解疗法在LOU064施用开始前中止。

11.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中如果所述患者计划在接下来的12个月内怀孕，则选择LOU064。

12.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中如果所述患者将在接下来的12个月内进行化疗，则选择LOU064。

13.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中所述治疗是单一疗法。

14.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中LOU064不与CYP3A的强抑制剂伴随施用。

15.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中LOU064不与CYP3A4的强诱导剂伴随施用。

16.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中对急性感染或先前感染COVID-19的患者进行治疗。

17.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中所述治疗在COVID-19感染期间继续进行。

18.根据权利要求1-16中任一项所述使用的LOU064，其中所述治疗在COVID-19感染期间中断并且在克服所述感染后继续进行。

19.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中所述治疗是无族群差异的治疗。

20.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中将LOU064在复发后施用。

21.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中将LOU064在检测到至少一个Gd+病变后施用。

22.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中将LOU064在检测到新的或扩大的T2病变后施用。

23.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中所述患者是成年人。

24.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中在治疗的长达24个月内，优选地12-24个月，所述患者达到以下中的至少一个：

-与未治疗的患者相比和/或与接受选自干扰素、特立氟胺、醋酸格拉替雷和富马酸二甲酯，优选地干扰素、特立氟胺和富马酸二甲酯，更优选地特立氟胺或干扰素的另一种疾病缓解治疗的患者相比，钆增强病变的平均总数降低，

25.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中在治疗的第12周或第24周，与疗法开始时的基线水平相比，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和脂肪酶的水平变化不超过10％。

26.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中所述治疗在降低年复发率方面至少与CD20耗竭疗法一样有效。

27.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中所述患者在LOU064疗法期间接种疫苗，特别地接种非活疫苗。

28.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中将LOU064以合适的口服药物制剂形式施用，所述药物制剂包含LOU064的纳米颗粒。

29.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中将LOU064以合适的口服药物制剂形式施用，所述药物制剂包含具有通过PCS测量的在约50nm至约750nm之间的平均粒度的LOU064的纳米颗粒。

30.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中将LOU064以合适的口服药物制剂形式施用，所述药物制剂包含重量比约为2:1的LOU064和粘合剂。

31.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中将LOU064以合适的口服药物制剂形式施用，所述药物制剂包含重量比约为2:1:0.08的LOU064、粘合剂和表面活性剂。

32.根据权利要求1至29中任一项所述使用的LOU064，其中将LOU064以合适的口服药物制剂形式施用，所述药物制剂包含重量比约为1:1的LOU064和粘合剂。

33.根据权利要求1至29和32中任一项所述使用的LOU064，其中将LOU064以合适的口服药物制剂形式施用，所述药物制剂包含重量比约1:1:0.05的LOU064、粘合剂和表面活性剂。

34.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中将LOU064以合适的口服药物制剂形式施用，所述药物制剂包含LOU064、作为粘合剂的聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物和作为表面活性剂的十二烷基硫酸钠。

35.根据前述权利要求中任一项所述使用的LOU064，其中将LOU064与口服避孕药共同施用。

36.一种生产用于治疗多发性硬化的药物的LOU064，其中优选地将所述药物以约50mg至约150mg的剂量每日两次口服施用。

37.一种治疗或预防多发性硬化的方法，所述方法包括将治疗有效口服剂量的LOU064施用于需要这种治疗的患者。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述治疗有效剂量是约50mg至约150mg每日两次。

39.根据权利要求37或38所述的方法，其中多发性硬化选自复发型多发性硬化，特别地临床孤立综合征(CIS)、复发缓解型多发性硬化(RRMS)和继发进展型多发性硬化(SPMS)，特别地活跃性SPMS。