CN118006679A - 一种柽柳的遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种柽柳的遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域。该方法包括如下步骤：步骤一、取柽柳叶片的顶端分生组织，诱导其形成丛生芽，以丛生芽作为转化受体；步骤二、用农杆菌对步骤一获得的转化受体进行侵染，共培养；步骤三、对步骤二共培养后的转化受体进行分化筛选培养，获得阳性芽。本申请设计并成功构建了柽柳的遗传转化方法，在本申请提供的方法中，采用柽柳叶片顶端分生组织诱导形成的丛生芽作为转化受体，并对叶片尤其是顶端分生组织诱导形成丛生芽的诱导培养条件进行了优化，柽柳叶片在优化的诱导培养条件下形成的丛生芽具有很强的分裂分化能力，克服了使用叶片等材料作为受体材料转化基因不能稳定表达的缺点。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种柽柳的遗传转化方法。
背景技术
柽柳(Tamarix chinensis Lour.)为柽柳科、柽柳属多年生灌木或小乔木植物，具有耐盐碱、耐高温寒冷的优良特性，能适应干旱沙漠和在滨海盐土生存，是防风固沙、改造盐碱地、绿化环境的优良树种之一，也是优良抗逆植物资源。
对植物的抗逆基因功能以及机制的研究需要建立高效、稳定的遗传转化体系，现有技术中也提供了一些柽柳的遗传转化方法，例如，专利CN115094083A提供了一种农杆菌介导的刚毛柽柳遗传转化体系的构建方法，该方法以柽柳组培苗的茎段基部组织为外植体进行侵染转化。然而，发明人在实验中发现，目前建立的遗传转化方法在转化后基因的表达稳定性随时间延长而减弱，基因整合的成功率较低。
因此，目前针对柽柳急需构建一种提高基因整合成功率以及表达稳定性的遗传转化体系和方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在提供一种柽柳的遗传转化方法，包括如下步骤：
步骤一、取柽柳叶片的顶端分生组织，诱导其形成丛生芽，以所述丛生芽作为转化受体；
步骤二、用农杆菌对步骤一获得的转化受体进行侵染，共培养；
步骤三、对步骤二共培养后的转化受体进行分化筛选培养和生根培养。
在一种实施方式中，步骤一中所述诱导的步骤在诱导培养基中进行，所述诱导培养基包括：WPM培养基，0.5mg/L 6-BA，1mg/L KT，30g/L蔗糖，3.8g/Lphyto。
在一种实施方式中，所述诱导的条件为：25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
在一种实施方式中，所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌，优选为根癌农杆菌
在一种实施方式中，所述农杆菌中含有表达目的基因的重组载体。
可选的，所述目的基因为筛选标记基因，例如荧光标记基因。
在一种实施方式中，步骤二中所述侵染的方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.05～2MPa条件下抽真空5～20min，20kHz～30kHz条件下超声振荡3～10min，再于0.05～2MPa条件下抽真空5～20min。
优选的，步骤二中所述侵染的方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.1MPa条件下抽真空10min，20kHz下超声振荡5min，再于0.1MPa条件下抽真空10min。
在一种实施方式中，所述农杆菌侵染液的OD600值为0.2～0.5。
在一种实施方式中，步骤二中所述共培养的方法包括：取出转化受体置于共培养培养基中，于22℃～26℃，黑暗条件下培养3～4天，转为光培；
在一种实施方式中，所述共培养培养基包括：WPM培养基，0.5mg/L 6-BA，1mg/LKT，30g/L蔗糖，3.8g/L phyto，200uM/L As。
在一种实施方式中，步骤三中所述分化筛选培养的步骤在分化培养基中进行，所述分化培养基包括：WPM培养基，0.5mg/L 6-BA，1mg/L KT，30g/L蔗糖，3.8g/L phyto。
在一种实施方式中，所述分化培养的条件包括：22℃～26℃、4000lux光照条件下，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
在一种实施方式中，本申请采用的培养基pH均为5.90～6.00，优选为5.95。
在一种实施方式中，所述方法还包括获得阳性芽后继续扩繁的步骤，所述扩繁包括生根培养。
可选的，所述生根培养可采用现有的柽柳生根培养基以及培养条件。
另一方面，本申请还提供了所述的方法在提高柽柳遗传转化中目的基因表达稳定性中的应用。
在一种实施方式中，所述目的基因包括GFP基因和Ruby基因。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本申请设计并成功构建了柽柳的遗传转化方法，在本申请提供的方法中，采用柽柳叶片顶端分生组织诱导形成的丛生芽作为转化受体，并对叶片尤其是顶端分生组织诱导形成丛生芽的诱导培养条件进行了优化，柽柳叶片在优化的诱导培养条件下形成的丛生芽具有很强的分裂分化能力，相较于叶片、组培苗等其他外植体，其在转化后的基因整合成功率明显提高，并且显著改善了转化基因表达的稳定性。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在附图中：
图1为实施例1中示例7生长的丛生芽图片；
图2为柽柳叶片为转化受体时刚转化GFP基因以及转化一个月后的荧光检测图；
图3为柽柳组培苗为转化受体时刚转化GFP基因以及转化一个月后的荧光检测图；
图4为柽柳的叶片丛生芽为转化受体时刚转化GFP基因、转化一个月后以及转化3个月后的荧光检测图；
图5为柽柳叶片为转化受体时刚转化Ruby基因以及转化一个月后的可视结果图；
图6为柽柳的叶片丛生芽为转化受体时刚转化Ruby基因的可视结果图；
图7为柽柳的叶片丛生芽为转化受体时转化Ruby基因一个月后的可视结果图；
图8为柽柳的叶片丛生芽为转化受体时转化Ruby基因三个月后的可视结果图。
具体实施方式
为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本申请发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下述实施例中，柽柳(Tamarix chinensis Lour.)组培苗等外植体购自青岛文盛元农业科技有限公司；所涉及的质粒载体选用购自杭州宝赛生物科技有限公司的空白pANIC6B载体；所涉及的农杆菌选用购自北京全式金生物技术股份有限公司的EHA105。所涉及的将目的基因导入至质粒载体中获得重组质粒，再将重组质粒导入农杆菌中获得重组农杆菌的方法均采用本领域常规或已知的实验方法实现。
实施例1诱导条件的优化
以柽柳叶片为外植体，对其顶端分生组织进行丛生芽诱导生长，具体方法如下：
1、消毒：将带有叶片的茎段用流动水冲洗10-15min，75％酒精消毒30s，10％次氯酸钠消毒20分钟，无菌水冲洗3-5次。
2、分化诱导：将消毒后的柽柳叶片截取2cm左右大小，置于诱导分化培养基上培养3周进行丛生芽分化诱导，培养条件为：25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗，每周继代一次，均采用相同的芽诱导培养基。
选取不同的培养基进行诱导培养，其中各培养基的pH值控制为5.95，统计各培养基的诱导分化效率，所得结果见表1。
表1
由表1中的结果可知，示例7提供的培养基效果最好，即确定诱导培养基组成为：WPM，0.5mg/L 6-BA，1mg/L KT，30g/L蔗糖，3.8g/Lphyto。采用该培养基诱导培养获得的叶片丛生芽如图1所示。其中1-5培养基诱导的丛生芽，基因在其中均可以稳定表达，但是由于前边分化培养基的影响，最后能成功表达的概率大大下降，即，前期丛生芽的诱导条件对其本申请构建的遗传转化方法具有重要影响。
实施例2遗传转化方法的建立
对柽柳转化绿色荧光蛋白GFP基因，具体步骤包括：
(1)农杆菌侵染液的制备：
将含有35S启动子驱动的GFP报告基因的重组质粒导入根癌农杆菌EHA105，获得重组农杆菌；
冻融法转化农杆菌感受态：冰上融化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，然后加入3μL的潮霉素(HYG)质粒DNA，冰上静置30分钟，液氮中冷冻1分钟；然后37℃水浴3min加入950μL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养3小时；离心浓缩菌液，用100μL YEP培养基回溶菌体，将回溶后的菌体涂于加50mg·L-1卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃下培养，长出单克隆后，用PCR鉴定潮霉素B抗性基因，保存阳性根癌农杆菌落；
活化根癌农杆菌：将上述阳性根癌农杆菌在培养基中培养至OD600值等于0.3，作为转化的侵染液。
(2)侵染：
将柽柳叶片、组培苗以及实施例1中优化的诱导培养基上生长状况良好、致密有颗粒感的丛生芽，分别作为根癌农杆菌侵染的转化受体，其中，柽柳叶片和组培苗的消毒方法与实施例1中的消毒方法相同；
将转化受体分别置于上述根癌农杆菌侵染液中，于0.1MPa条件下抽真空10min，20kHz下超声振荡5min，再于0.1MPa条件下抽真空10min；倒去上层菌液，将侵染后的愈伤组织捞出放滤纸上吹干以除去过多的附着根癌农杆菌，期间需不断翻愈伤组织至干燥。
(3)共培养：将侵染后的愈伤组织置于共培养培养基中进行共培养，共培养培养基包括：WPM培养基，0.5mg/L 6-BA，1mg/L KT，30g/L蔗糖，3.8g/L phyto，200uM/L As，培养条件为：于25℃，黑暗条件下培养4天。检测转化效果。
(4)分化培养：将暗培养筛选后的愈伤组织转移到分化筛选培养基上，分化筛选培养基包括：MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，0.5mg·L-16-BA，2mg·L-1KT，300mg·L-1特美汀，2mg·L-1潮霉素。培养条件为：光照强度2000lx，光周期为8小时光照，16小时黑暗，15-25天继代一次；经过4-6周筛选培养之后，未转化材料死亡，转化材料能够继续生长；1-3个月后，阳性愈伤组织进行分化。检测转化效果。
上述共培养以及分化培养后对基因转化的荧光检测结果如图2-4所示。
由图2中结果可知，当以柽柳叶片为转化受体时，转化后的柽柳叶片在荧光显微镜下观察，叶片上可看到清晰的绿色荧光，表明GFP基因已经转化到柽柳叶片中；而GFP在叶片中转化1个月后再进行荧光检测，结果显示荧光明显减弱，说明基因整合的成功率较低，并且基因能够长期表达的稳定性较差。
由图3中的结果可知，当以组培苗为转化受体时，其转化效果与叶片大致相同，即在转化后能够观察到明显的绿色荧光，但1个月后产生的荧光也会慢慢消失。
由图4中的结果可知，当以实施例1获得的丛生芽为转化受体时，其不仅在转化后可以观察到大量位置的绿色荧光，在转化1个月甚至3个月后绿色荧光仍清晰可见且亮度较高，说明其基因整合的成功率以及表达的稳定性显著由于其他外植体。
实施例3不同目的基因的遗传转化效果
为了更直观的观察柽柳转化的情况，使用RUBY可视化的载体系统进行柽柳遗传转化体系的探索。其中Ruby基因的遗传转化具体方法步骤同实施例2，区别仅在于，侵染采用的重组农杆菌中导入了含有35S启动子驱动的Ruby基因的重组质粒。分别以叶片和实施例1中获得的丛生芽为转化受体，所得结果如图5-8所示。
由图5中结果可知，当以柽柳叶片为转化受体时，共培养4天后，即可看到红色的叶片产生，但是在1个月后红色的叶片也会慢慢褪去颜色，与转GFP基因时存在的问题相同。
由图6-8中的结果可知，在以实施例1获得的叶片丛生芽为转化受体时，分别在转化1个月尤其是3个月后，仍能够表型为红色阳性芽。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (10)
1.一种柽柳的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、取柽柳叶片的顶端分生组织，诱导其形成丛生芽，以所述丛生芽作为转化受体；
步骤二、用农杆菌对步骤一获得的转化受体进行侵染，共培养；
步骤三、对步骤二共培养后的转化受体进行分化筛选培养，获得阳性芽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述诱导的步骤在诱导培养基中进行，所述诱导培养基包括：WPM培养基，0.5mg/L 6-BA，1mg/L KT，30g/L蔗糖，3.8g/Lphyto；
和/或，所述诱导的条件为：25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌；
和/或，所述农杆菌中含有表达目的基因的重组载体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述侵染的方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.05～2MPa条件下抽真空5～20min，20kHz～30kHz条件下超声振荡3～10min，再于0.05～2MPa条件下抽真空5～20min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液的OD600值为0.2～0.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述共培养的方法包括：取出转化受体置于共培养培养基中，于22℃～26℃，黑暗条件下培养3～4天，转为光培；
和/或，所述共培养培养基包括：WPM培养基，0.5mg/L 6-BA，1mg/L KT，30g/L蔗糖，3.8g/L phyto，200uM/L As。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中所述分化筛选培养的步骤在分化培养基中进行，所述分化培养基包括：WPM培养基，0.5mg/L6-BA，1mg/L KT，30g/L蔗糖，3.8g/L phyto；
和/或，所述分化培养的条件包括：22℃～26℃、4000lux光照条件下，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括获得阳性芽后继续扩繁的步骤，所述扩繁包括生根培养。
9.如权利要求1-8任一所述的方法在提高柽柳遗传转化中目的基因表达稳定性中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述目的基因包括GFP基因和Ruby基因。
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