CN118005798A

CN118005798A - 一种抗维生素k2抗体及其应用

Info

Publication number: CN118005798A
Application number: CN202410411699.4A
Authority: CN
Inventors: 宋纯理; 原婉琼; 郭健夫; 魏丙卓; 马福鑫
Original assignee: Beijing Sisweide Biotechnology Co ltd; Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Current assignee: Beijing Sisweide Biotechnology Co ltd; Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Priority date: 2024-04-08
Filing date: 2024-04-08
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2044-04-08
Also published as: CN118005798B

Abstract

本发明涉及生物医药领域，提供了一种抗维生素K₂抗体及其应用。本发明所提供的抗体G026选自下列至少之一：（1）具有SEQ ID NO:3、4和5所示的轻链CDR序列，以及具有SEQ ID NO:6、7和8所示的重链CDR序列；或者与（1）相比，具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。此外，本发明还公开了利用此抗体制备的酶免试剂盒，具有较高的灵敏度和特异性。

Description

一种抗维生素K2抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种抗维生素K₂抗体及其应用。

背景技术

维生素K₂是具有2-甲基-1,4-萘醌化学结构的一种化合物，属于脂溶性维生素，化学式为C₄₆H₆₄O₂，分子量为649。维生素K₂主要由人体肠道菌群合成，也存在于动物产品和发酵食品中，健康成人每日需补充的维生素K₂量约为50-120 μg。维生素K₂除基本的凝血功能外，参与体内骨、钙质的代谢与调节，在促进及维持人体骨健康方面不可或缺的基础作用，国内外多项临床研究表明维生素K₂可增加骨密度，降低骨折发生的机率，对骨质疏松症有良好的预防与治疗效果。

在钙代谢中，维生素K₂能够激活骨钙素抓取血液中的游离钙离子使其沉积于骨骼，促进骨形成。参与类固醇及异质物受体(SXR)介导的转录调节，增加骨胶原的聚集。还能抑制破骨细胞活性，减少骨吸收。同时，维生素K₂可以激活MGP蛋白，使其抑制并逆转非正常组织钙化。因此维生素K₂能够智能调节钙离子沉积，改善骨组织代谢的失衡状态，并将错位沉积的钙离子移除，抑制钙离子沉积到血管、软骨(关节及椎间盘)、肾脏、肝脏、皮肤甚至眼底中，防止软组织和血管钙化。

此外，维生素K₂是体内十几种蛋白质羧化酶的辅酶，具有提高细胞内线粒体功能、减少炎性因子过度释放、调节免疫、强抗氧化等作用，从而在防治心脑血管疾病及糖尿病、肝病、肾病、癌症、高血压、帕金森病、阿尔茨海默病等方面发挥重要作用，是骨骼和血管健康的缔造者。

维生素K₂缺乏容易导致钙的吸收障碍，就会引起骨质疏松、手脚抽搐等低钙表现，也会对凝血功能造成影响，引发出血症。体内维生素K₂过高会引起消化系统的不适，如消化不良、恶心、腹泻等不良反应，还会因此皮肤的异常改变，例如皮肤瘙痒、红肿、出疹子等；由于维生素K₂具有血液稀释作用，过量的维生素K₂会导致血液中铁成分下降。此外，维生素K₂是在肝脏代谢后，才能发挥活性，体内过高的维生素K₂会加大肝脏的负担，容易导致肝脏损伤。

基于抗原和抗体之间的特异性反应，免疫测定已成为测定维生素的一种有潜力的替代方法，与仪器方法相比，免疫分析方法成本低、速度快、准确度高、灵敏度高，其核心是特异性抗体。然而一方面维生素K₂无免疫原性，不足以作为免疫原制备抗体；另一方面维生素K₂分子量很小，很难筛选到特异性好的抗体，进而导致临床维生素K₂的阳性血清很难被确定。

目前，亟需开发一种特异性强、灵敏度高的抗维生素K₂抗体。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

本发明一方面提供一种抗维生素K₂抗体或抗原结合片段，包括：

选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列：

轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；

重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

本发明提供了一种抗维生素K₂的抗体或抗原结合片段，利用所述抗体或抗原结合片段制备的酶免试剂盒，具有较高的灵敏度和特异性。

根据本发明的一些实施方案，所述抗体或抗原结合片段包括：SEQ ID NO:3所示的轻链可变区CDR1序列，SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR2序列， SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR3序列，SEQ ID NO:6所示的重链可变区CDR1序列，SEQ ID NO:7所示的重链可变区CDR2序列，SEQ ID NO:8所示的重链可变区CDR3序列。

根据本发明的一些实施方案，所述抗体或抗原结合片段包括下列至少之一：

（a）具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区和SEQ ID NO:2所示的重链可变区；

与（a）相比，序列同一性至少在80%的氨基酸序列。

（b）具有SEQ ID NO:1所示轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及具有SEQ IDNO:2所示重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列；

或者与（b）相比，具有一个以上保守氨基酸取代的氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方案，所述抗体或抗原结合片段进一步包括重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于哺乳动物源抗体。

根据本发明的一些实施方案，所述重链恒定区和轻链恒定区源自鼠源抗体、兔源抗体、灵长目源抗体或其突变体至少之一。

根据本发明的一些实施方案，所述重链恒定区和轻链恒定区源自鼠源抗体或其突变体。

根据本发明的一些实施方案，所述抗体或抗原结合片段包括单抗或多抗；

根据本发明的一些实施方案，所述单抗包括全长抗体、Fv、单链抗体、Fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一。

本发明又一方面提供一种抗体类似物，所述抗体类似物包含上述的抗体或抗原结合片段的可变区或可变区中的CDR区。

本发明再一方面提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码上述抗体或抗原结合片段。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸包含：

（c）具有SEQ ID NO:9所示编码轻链可变区的核酸序列，

与（c）相比，序列同一性至少80%的核酸序列；或者

（d）具有SEQ ID NO:10所示编码重链可变区的核酸序列，

与（d）相比，序列同一性至少80%的核酸序列；或者

（e）具有SEQ ID NO:11所示核酸序列，

与（e）相比，序列同一性至少80%的核酸序列；或者

（f）具有SEQ ID NO:12所示核酸序列，

与（f）相比，序列同一性至少80%的核酸序列。

本发明再一方面提供一种表达载体，包含上述多核苷酸。

本发明再一方面提供一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞可以产生上述抗维生素K₂抗体或抗原结合片段。

本发明又再一方面提供一种制备抗维生素K₂抗体或抗原片段的方法，包括培养上述的重组细胞或上述杂交瘤细胞。

本发明又再一方面提供上述抗体或抗原结合片段和上述抗体类似物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测维生素K₂。

本发明另一方面提供一种试剂盒，包括上述的抗体或抗原结合片段、抗体类似物、载体、重组细胞、杂交瘤细胞至少之一。

本发明另一方面提供一种组合物，包括上述的抗体或抗原结合片段、抗体类似物、多核苷酸、载体、重组细胞、杂交瘤细胞。

本发明另一方面提供一种制备上述的抗体或抗原结合片段的方法，包括培养上述重组细胞、杂交瘤细胞。

本发明另一方面提供一种药物，包括上述的抗体或抗原结合片段、抗体类似物、多核苷酸、载体、重组细胞、杂交瘤细胞、组合物。

本发明另一方面提供一种上述抗体或抗原结合片段、抗体类似物、多核苷酸、载体、重组细胞、杂交瘤细胞、组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防维生素K₂介导的相关疾病；

根据本发明的一些实施方案，所述维生素K₂介导的相关疾病包括骨质疏松、血管钙化、手脚抽搐、凝血功能障碍、出血症、消化不良、恶心、腹泻、皮肤瘙痒、红肿、肝脏损伤。

本发明提供了抗维生素K₂的单克隆抗体，此抗体具有高亲和力和特异性的特点，同时也提供了基于上述抗体的体外诊断检测试剂盒。本发明解决了目前市场上维生素K₂检测项目抗体原料和试剂盒的相对短缺的问题。

本公开的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本公开的实践了解到。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的杂交瘤细胞株G026表达的抗体的亚型鉴定及抗体可变区的克隆胶图，泳道顺序如表5所示。

图2是本发明的试剂盒对人血清中维生素K₂进行定量检测的OD₄₅₀标准曲线。

具体实施方式

下面详细描述本公开的实施方案。下面描述的实施方案是示例性的，仅用于解释本公开，而不能理解为对本公开的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

本发明中，术语“抗体”是指由动物的抗体基因编码并生物合成的的蛋白质。

本发明中，术语“抗体类似物”是指通过生物或化学方法产生的，在抗体结构的基础上，通过化学基团（如氨基酸）删减，添加，或修饰而得到的衍生物。这些衍生物仍然含有类似于抗体可变区（或抗体可变区中的CDR区）的结构，并能通过这些结构发生类似于抗原-抗体结合的反应。

本发明中，术语“抗体可变区”是指抗体重链和轻链中的一个结构域。在自然界中，抗体可变区由免疫球蛋白（重链和轻链）基因中的V，D（仅重链适用），和J片段通过基因重组拼接编码。不同的抗体之间可变区的氨基酸序列具有高度的差异性（抗体的其他区域的氨基酸序列相对高度相同），并负责与特异的抗原决定簇识别和结合。在抗体可变区中，又可以细分出骨架区和CDR区（comlementarity determining region）。一个典型的抗体可变区具有3个骨架区和3个CDR区（它们互相间插排列）。骨架区主要起到蛋白质结构域框架形成的作用，而CDR区主要起到抗原-抗体特异性识别结合的作用。

本发明中，术语“抗维生素K₂抗体（或抗体类似物）”是以单一的（或单克隆的）形式存在的，单一的抗体（或抗体类似物）含有单一的结构（如单一的氨基酸序列）。

在本发明中，在本文中，术语“同一性”用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols in MolecularBiology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和 ALIGN程序 (Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(NationalBiomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman 算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和 BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者 WU-BLAST-2(Altschul 等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者 GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。

在本发明中，术语“抗原结合片段”也即“抗体片段”，抗体片段通常是指抗原结合性抗体片段，可以包括完整抗体的一部分，一般是抗原结合区或可变区，抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv，双抗体，线性抗体，单链抗体分子等。

在不实质性影响抗体活性（保留至少95%的活性）的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10 个或更多个）氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体序列可以与参比序列具有至少80%一致性（或同源性）。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。

抗维生素K₂抗体或抗原结合片段

本发明提供了一种抗维生素K₂抗体或抗原结合片段，选自（1）具有SEQ ID NO:1所示轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及具有SEQ ID NO:2所示轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列；或者与（1）相比，具有至少一个保守氨基酸取代的序列。所提到的保守氨基酸取代可以为一个、两个或者三个氨基酸取代。

本发明还提供了一种抗维生素K₂抗体或抗原结合片段，选自（1）具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的轻链CDR序列，以及具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的重链CDR序列；或者与（1）相比，具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的轻链CDR序列，以及SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的轻链CDR序列。

在另一些实施方案中，本发明所提供的抗体或抗原结合片段与上述序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代。“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原能力的抗体片段。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是该取代不破坏维生素K₂抗体或者与维生素K₂抗原的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者用极性氨基酸例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。

本发明所述的抗体也可以根据本发明提供的抗体可变区氨基酸序列直接合成出来，并且可以通过进一步化学修饰衍生成不同的抗体类似物。

在一些具体实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，包括下列至少之一：（a）具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区和SEQ ID NO:2所示的重链可变区；与（a）相比，同一性至少在80%的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区序列和SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代。当然，这些保守氨基酸取代不会对抗体或抗原结合片段的生物学功能带来改变。在一些具体方式中，这些保守氨基酸取代可以发生在重链可变区和轻链可变区中除了CDR区之外的氨基酸上。

根据本发明的具体实施方式，所述抗体或抗原结合片段为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体或小分子抗体。例如，所述抗体为单链抗体。例如，所提到的小分子抗体包括Fab抗体、Fv抗体、单链抗体以及最小识别单位的至少之一。

根据本发明的具体实施方式，所提供的轻链可变区序列如下所示：

DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEEAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIK

（SEQ ID NO:1）

根据本发明的具体实施方式，所提供的重链可变区序列如下所示：

QVQLKQSGPELVKPGASVKMSCKASGYIFTDYVIIWVKQRTGQGLEWIGEIYPGSGGTYYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGGLGNFDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO:2）

多核苷酸、表达载体、重组细胞、杂交瘤细胞

在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的多核苷酸，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体。

为此，本发明还提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码上述所述的抗体或抗原结合片段。所提供的核苷酸序列可以通过本领域人员的公知技术获得。而且还可以经过种属优化，更易在哺乳动物细胞中表达。

根据本发明所提供的抗体重链和轻链的可变区（或CDR区）序列，或者本发明提供的分离的多核苷酸序列，行内人士可以通过化学合成和/或抗体基因在异源细胞中的表达（即重组蛋白表达）的方法制备与本发明一样的或类似的抗体（或抗体类似物）。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的多核苷酸。在将上述分离的多核苷酸连接到载体上时，可以将多核苷酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如pcDNA质粒。

本发明还提供了一种重组细胞，该重组细胞中包含有该表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的抗体或抗原结合片段。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。这些可用的哺乳动物细胞例如可以为293F细胞，CHO细胞等。

本发明还提供了一种杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞可以通过经典制备单克隆抗体的方法产生。

在经典的单克隆抗体制备方法里，首先需要具备合适的抗原，并用其免疫动物。为了制备抗维生素K₂的抗体（或抗体类似物），合适的抗原必须含有维生素K₂。这个抗原可以通过天然人组织或血液中分离纯化，化学合成，或这些方法的互相组合而获得。之后需要将维生素K₂偶联到KLH（钥孔血蓝蛋白）和BSA（牛血清白蛋白）载体蛋白上，以制备全抗原用于动物免疫和抗体筛选检测使用。

在经典的单克隆抗体制备方法中，首先用KLH偶联的维生素K₂抗原免疫动物，并通过间隔时间采血，验证动物是否对BSA偶联的维生素K₂抗原产生了抗体反应。然后将从有抗体反应的动物的脾脏中分离出来B细胞，在体外与永生的骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞。然后将这些杂交瘤细胞在培养板中极限稀释并重新生长起来（单克隆杂交瘤细胞株），并采取这些杂交瘤细胞株的培养液上清，检测其是否含有针对抗原的特异性抗体。根据抗体产量，质量和细胞株生长特性，可以选出最佳的单克隆抗体生产细胞株，进行后续的单克隆抗体生产。

其他的方法也可以用来获取单克隆抗体。譬如，上述动物的脾脏细胞可以被分离出来，然后用标记的抗原（如荧光素标记维生素K₂）与之孵育。由于产生抗体的B细胞通常会有抗体分子呈现在细胞膜表面，这些细胞会被标记的抗原结合（染色），从而可以被荧光流式细胞分选仪分选出来。这些分选出来的B细胞的mRNA可以被分离出来，通过体外反转录和特异性PCR反应得到抗体的可变区cDNA的文库。这个cDNA 文库可以被插入到表达质粒中（如适合在哺乳动物细胞表达的抗体表达质粒，或适合在细菌细胞表达的噬菌体表达质粒），并在适合这个表达质粒的宿主细胞中进行表达。这些宿主细胞（或噬菌体）可以通过不同的方法（如前面所述的细胞极限稀释培养方法，或噬菌体斑铺板方法）被分离纯化（克隆）出来。这些细胞株或噬菌体克隆可以被用来生产抗体，并对抗体进行分析鉴定。

根据本发明提供的抗体或抗原结合片段，抗体类似物，多核苷酸序列，表达载体，重组细胞，杂交瘤细胞，在维生素K₂缺乏和相关疾病的辅助诊断中的作用，及基于G026抗体制备的酶免试剂盒大大提高了诊断的精准性及便捷性。

根据本发明的一个优先实施方案，本发明中动物免疫采用皮下多次、多点注射。提高了最终动物血清的效价，提升了阳性克隆率。

根据本发明的一个优先实施方案，本发明将HAT筛选试剂从融合当天加入推迟到第2天，使细胞阳性率得到了明显的提升。

根据本发明的一个优先实施方案，本发明选用多种维生素K₂结构类似物（维生素K₁），对抗体特异性检测进行比较。经多轮筛选，得到G026是对维生素K₂特异性较好的抗体。

根据本发明的一个优先实施方案，本发明所用到的维生素K₂阳性样本均是由液相质谱检测过得维生素K₂呈阳性血清的，以确保后期试剂盒检测的真实性。

本发明的抗维生素K₂的抗体可以用于检测人血清或体液中的维生素K₂，或含有维生素K₂的物质，以及能与维生素K₂特异结合的物质（如抗维生素K₂的抗体），检测的原理主要是基于本发明的维生素K₂的抗体与维生素K₂的特异性识别和结合，并利用化学标记技术（如标记抗体，或标记的特异性二抗）或物理检测技术（如光散射技术，等离子体共振技术等）进行检测。

本发明提供了抗维生素K₂的单克隆抗体G026，此抗体具有高亲和力和特异性的特点，同时也提供了基于上述抗体的体外诊断检测试剂盒。本发明解决了目前市场上维生素K₂检测项目抗体原料和试剂盒的相对短缺的问题，可作为维生素K₂综合征和相关神经类疾病的辅助诊断，填补国内相关市场空白。

编码本发明的抗体的重链和/或轻链的核酸在本发明的范围内，根据重链和/或轻链的氨基酸序列，本领域技术人员能够很容易得到相应的核酸序列，如表1所示。需要说明的是，下表1列出的CDR序列是根据IMGT CDR编码规则所定义的。本领域技术人员应知的是，不同数据库分析出来的CDR序列可能不一样，但是这些变化均应包含在本发明的保护范围之内。

表1

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：维生素K₂的偶联

利用二步戊二醛法分别将维生素K₂（Sigma，900074）偶联到KLH和BSA载体蛋白上。首先分别取10 mgKLH或BSA溶于0.2ml戊二醛溶液（10 mM PB，12.5 mM 戊二醛，PH6.8）中，室温反应18小时后用PBS缓冲液（10mM PBS，PH7.2）4℃过夜透析，将2mg 维生素K₂溶于1mL150mM NaCl中，再分别取0.5ml与醛化的KLH或BSA溶液混合。加入0.1mL 1M PH9.6 碳酸盐缓冲溶液（调节PH至9.0-9.6），4℃反应24小时之后，加入0.1mL 0.2M赖氨酸溶液，4℃静置2小时，终止反应。最终以10mM PBS缓冲液（10mM PBS，PH7.2）4℃过夜透析，透析液即为偶联蛋白。

实施例2：维生素K₂的偶联蛋白的鉴定

首先，分别将KLH、BSA以及维生素K₂（KLH-VK2）和BSA（BSA-VK2）偶联蛋白以1µg/ml包被于酶标板中，利用纯化的抗维生素K₂的多克隆抗体被用作间接ELISA方法的一抗，并利用HRP标记的山羊抗大鼠抗体作为二抗，以TMB作为显色液，之后1M H₂SO₄终止反应，酶标仪OD₄₅₀读值，通过数据比较维生素K₂偶联载体蛋白后的抗原活性，可见维生素K₂与KLH偶联后的抗原活性检出最高。

实施例3：用维生素K₂KLH偶联蛋白（KLH-VK2）免疫BALB/c小鼠

选取6~8周龄的BALB/c小鼠进行如下免疫程序：初次免疫时，用25 µg KLH-VK2偶联蛋白与等量弗式完全佐剂混合，经乳化后皮下多点注射；首次免疫后14天，用12.5 µgKLH-VK2偶联蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合，乳化后加强免疫。二次免疫后14天，用12.5µg KLH-VK2偶联蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合，乳化后加强免疫。三次免疫后14天采血并分离血清，用1µg /mL BSA-VK2偶联蛋白包被ELISA板，进行间接ELISA试验，测定血清效价。结果显示制备的鼠抗血清效价为1：72900，典型的免疫小鼠血清检测结果参见表2。

表2

实施例4：细胞融合

在实施例3中加强免疫小鼠3天后进行细胞融合。摘出小鼠眼球取血后，脱臼处死小鼠，放入70 %酒精瓶中放置2分钟后，于生物安全柜内将小鼠固定于泡沫板上，解开腹部皮肤找到脾脏，用镊子取下，放入200目不锈钢滤膜中轻轻研碎，用DMEM培养基（Thermo，11965092）轻轻冲洗下细胞，之后室温下的离心机中200 g离心10分钟，弃上清后备用；制备饲养细胞时，脱臼处死小鼠，放入70 %酒精瓶中放置2分钟后，于生物安全柜内将小鼠固定于泡沫板上，解开腹部皮肤，用注射器吸取PBS轻轻注入腹膜下，从另一边再将含有饲养细胞的液体洗出，之后室温下的离心机中200 g离心10分钟，弃上清后备用。将2.0×10⁷个FO骨髓瘤细胞与2.0×10⁸个脾细胞混匀，离心机中200 g离心10分钟，弃上清，轻微振荡混匀，于37℃水浴中，在90秒内滴加1ml体积浓度为50%的PEG-1450（Merk，P1458）水溶液，然后滴加20 mL DMEM培养基，离心机中200 g离心10分钟，弃上清，重复洗一次，离心机中200 g离心10分钟，弃上清，得到杂交瘤细胞，将细胞铺到10块96孔培养板中，每孔150 μL。将饲养层细胞10000个细胞/孔加入上述10块96孔细胞培养板中，每孔100 μL，将培养板标记好后，放入37℃的含5% CO₂的细胞培养箱中培养，第二日加入HAT筛选培养基（ Merk，H0262），再用HAT选择培养1~2天内，将有大量瘤细胞死亡，3~4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT筛选培养液维持7~10天后应换用HT培养液（ Merk，H0137），再维持2周，改用20% FBS（ExCell, FSP500）的DMEM培养基继续培养。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2~3天换一半培养液。

实施例5：阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆培养

首先，通过方正实验确定BSA-VK2作为抗原最佳包被量。将0.5、1.0、2.0、4.0 µg的BSA-VK2偶联蛋白包被96孔板，每个浓度6个孔分别设置为3个阳性3个阴性。用不同稀释倍数的BSA-VK2偶联蛋白免疫鼠阳性血清进行方正滴定，同时以未免疫鼠阴性血清作为阴性对照。用每孔0.5 μg纯化的BSA-VK2偶联蛋白包被96孔ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤2次；每孔加入200 µL的1 % BSA的PBS，室温封闭2小时后置于三折纸上拍干；加样：加待检样品0.1mL于反应孔中，置37 ℃温育1小时，然后洗涤，同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔及阳性对照孔。各反应孔中加入新稀释的抗体0.1 mL，置37 ℃温育1小时，然后洗涤3次。加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1 mL。37 ℃温育1小时，洗涤3次。加底物液显色：各反应孔中加入TMB底物溶液0.1 mL，室温静置10分钟。各反应孔中加入1M H₂SO₄ 0.1mL。测OD值判断结果，使用酶标仪在450 nm测定吸光值（A450）。以阴性对照OD值的2 .1倍以上为阳性(以空白对照孔调零后计算)。挑选出抗维生素K₂的杂交瘤细胞单克隆。

按照上述方法，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，通过有限稀释法将原有的孔用HAT选择培养基稀释后重新分到96孔培养板中，之后观察细胞的形态和数量。调整细胞为3~10个细胞/mL。取前一日准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100µL。于37 ℃、5 % CO₂培养箱中静置培养。在第7天换液，以后每2～3天换液1次。8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。每个克隆应尽快冻存，最终选定克隆号G026的杂交瘤细胞株用于抗体生产。

实施例6：单克隆抗体的大量制备及抗体效价测定

（1）单克隆抗体的大量制备

通过腹腔注射0.5 mL弗氏不完全佐剂于8周龄BALB/C鼠，2周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7~10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一只小鼠可获5~10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。将获得的腹水于3000 g离心10分钟，弃去上层油脂和底部沉淀，收集上清分装于-20℃，腹水上清解冻并平衡至室温后，加入1/10体积的1 M Tris–HCl PH8.0，使样品PH值至8.0。用20个柱体积100 mM PH8.0的Tris–HCl平衡protein G亲和柱中，将调节PH至8.0后的腹水上清上柱，之后用20个柱体积100 mM PH8.0的Tris–HCl洗涤，最后用100 mM Glycine–HCL PH 2.5洗脱抗体。将抗体洗脱液加入到浓缩管（Millipore，UFC801008，10K）中离心机（湘仪，L550）室温3000×g离心20 分钟。分批离心至溶液体积至1 ml/浓缩管（2管），加入10 mM PBS PH 7.4缓冲液4 mL,继续室温3000×g离心20 分钟。重复离心3次，使抗体的缓冲液为10 mM PBS PH 7.4，加入10 mM PBS PH7.4至总体积10 mL。最后将浓缩后的抗体溶液2 mL/管分装于离心管中，-80℃中保存。利用BCA试剂盒（索莱宝，PC0020）测定抗体浓度，测定纯化后的单克隆抗体浓度为3.2mg/mL。

（2）抗体效价测定

利用ELISA间接法检测抗维生素K₂抗体G026的效价。将BSA-VK2偶联蛋白用PBS稀释，以0.2 µg/mL、100 µL/孔包被于96孔酶标板中，4℃过夜后，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300 µL/孔，清洗后拍干。用1 %BSA的PBS溶液，200 µL/孔封闭酶标板，室温2小时，封闭后拍干；加入PTB稀释至20 ng/mL的抗维生素K₂抗体G026，37℃恒温箱中反应1小时，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300 µL/孔。清洗后拍干。加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠抗体，37℃恒温箱中反应1小时，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300 µL/孔。清洗后拍干。加入TMB底物溶液，100 µL/孔室温反应10分钟，加入100 µL/孔的1M H₂SO₄终止反应。使用酶标仪在450 nm测定吸光值（A450）。结果参见表3，可见纯化后的抗体效价为1:729000。

表3

实施例7：单克隆抗体的序列分析

（1）单克隆抗体亚型鉴定

将杂交瘤细胞株G026用加有10% 血清的DMEM培养基（GIBCO，#C11995500BT）培养在10 cm直径的细胞培养皿中（37℃、5% CO₂）。培养7天后将细胞转移至15 ml离心管中，血球计数板计数后取出4 × 10⁶个细胞，以200 g离心5分钟后，弃上清，并将离心管倒置，将管内液体控干。管内细胞利用QIAGEN公司的反转录试剂盒(Qiagen,74134)合成cDNA。

抗体亚型是通过用抗体亚型特异的引物做PCR确定的。上述合成的cDNA被用来作为PCR反应模板。PCR反应溶液体系：TAKARA Ex Taq（5 U/µL，TAKARA，RR001B），0.25 μL；10×Ex Taq Buffer，5µL；dNTP 混合物（各2.5 mM），4µL；模板cDNA，1µL；上游引物（100 µM），1µL；下游引物（100 µM），1µL；加入双蒸水至总体积50 µL。PCR反应温度程序：94℃ 5分钟预变性，温度循环30次（94 ℃ 1分钟，57℃ 1分钟，72℃ 1分钟），72℃ 10分钟延伸。反应结束后，PCR产物各取10 µL上样于1% 琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳图如图1所示，各泳道所加样品顺序如表5所示。根据PCR产物结果可以推断出抗体的亚型（表4）。本发明获得的单克隆抗体G026为重链为IgG1，轻链为kappa。

表4

表5

（2）杂交瘤细胞株G026抗体可变区（V区）测序

细胞株G026的抗体的V区在PCR扩增后得到的片段（见上条）被从琼脂糖凝胶上切割下来，并用DNA抽提试剂盒（Qiagen，74134）提取出来。提取得到的DNA片段被与pEASY-T1克隆载体链接，并被转化到Trans1-T1感受态细胞中（Transgen,CT101-1）。转化的细菌菌落被挑取到LB培养基中，经过过夜培养后进行DNA测序。本发明提供的抗维生素K₂抗体（G026）的轻链V区核酸序列如SEQID NO.8所示，重链V区的核酸序列如SEQID NO.9所示。

实施例8：利用抗体G026制备的酶免试剂盒在检测人血清中维生素K₂的应用

（1）抗体G026的辣根过氧化物酶（HRP）标记及标记产物的鉴定

取0.5 mL抗体G026（20 nmol，3 mg）加入到透析袋（10 KDa，宽度1 cm）中，在2L 10mM PBS溶液（PH 7.4）中4 ℃过夜透析。次日将含有抗体溶液的透析袋放入1 L 10 mM碳酸盐缓冲液（PH 9.5）中室温搅拌透析2小时，准备与活化好的HRP进行偶联。

与此同时，使用分析天平精确称取1 mg HRP，加入0.2 mL超纯水溶解，使HRP浓度为5 mg/mL。向上述HRP溶液中加入40 µl 0.1 M NaIO₄，放置在水平摇床上，室温避光反应（活化）20分钟。将活化后的HRP溶液加入到透析袋（10 KDa，宽度1cm）中，在2L 1 mM醋酸钠缓冲液（PH4.4）中4 ℃过夜透析。将透析后的HRP溶液小心吸出并转入新的1.5 mL离心管中，加入1/10体积的0.2 M碳酸盐缓冲液，使活化后的HRP溶液PH升高至9.0-9.5。

将以上抗体和HRP混合（进行偶联反应），放置在水平摇床上，室温避光反应4小时。偶联反应结束后，加入10ul（用预冷的超纯水）新鲜配制的NaBH4，4℃避光过夜终止反应。将偶联反应终止后的抗体溶液移至透析袋（10 KDa，宽度1cm）中，室温搅拌透析2小时。最后将溶液转移至棕色的离心管中，4℃保存。

（2）利用抗体G026制备的酶免试剂盒标准曲线的测定

在本实验中，维生素K₂-BSA偶联蛋白(BSA-VK2)作为抗原用PBS稀释，并被包被于96孔酶标板中，包被浓度1 µg/mL，体积100 µL/孔。在4C过夜包被后，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300 µL/孔。清洗后拍干，酶标板用含1%BSA的PBS溶液封闭，200 µL/孔，室温2小时。拍干，抗体G026(用PTB稀释至10 ng/mL)溶液稀释的不同浓度的维生素K₂，室温摇床反应30分钟，之后加入到上述封闭后酶标板中，100 µL/孔，并在37℃恒温箱中反应1小时。拍干PBST洗板3次，每次300 µL/孔。拍干，标板内加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠抗体37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，300 µL/孔。拍干，酶标板内加入TMB底物溶液，100 µL/孔，室温10分钟，然后加入100 µL/孔的1M H₂SO₄终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。样本浓度与吸光值线性结果如图2所示，结果表明，曲线R²=0.9962，本方法标准曲线范围为0-10 ng/ml。

（3）利用抗体G026制备的酶免试剂盒在检测人血清中维生素K₂

在本实验中，BSA-VK2用PBS稀释到1 µg/mL，然后100 µL/孔包被于96孔酶标板中（4 ℃过夜）。用300 µL/孔PBST洗板2次。拍干，用含1 % BSA的PBS溶液封闭酶标板，200 µL/孔，室温2小时。拍干，酶标板加入1000倍稀释的HRP标记抗体G026（用PTB稀释）溶液25ul/孔，再分别加入不同浓度的维生素K₂和人血清样品（选用临床服用维生素K₂的临床血清作为待测样本，以正常人血清作为阴性样本），75 µL/孔，并在37 ℃恒温箱中反应45分钟。 PBST洗板3次，每次300 µL/孔。拍干，加入TMB底物溶液，100 µL/孔，室温反应10分钟。然后加入100 µL/孔的1M H₂SO₄终止反应，使用酶标仪在450 nm测定吸光值（A450）。结果如表6所示，显示利用本发明的抗体G026制备的酶免试剂盒可以高效的检测人血清中维生素K₂。本发明的酶免试剂盒可以通过OD₄₅₀数值代入标准曲线（图2）对人血清中维生素K₂进行定量检测，通过比较表6的结果，显示本试剂盒可以初步对阴阳性血清进行判定。

表6

（4）抗体G026在检测维生素K₂的特异性的鉴定

抗体G026检测游离维生素K₂的特异性的能力用竞争法ELISA进行了评估。在这个实验里，维生素K₂ BSA偶联蛋白（BSA-VK2）作为抗原用PBS稀释，并被包被于96孔酶标板中，包被浓度1 µg/mL，体积100 µL/孔。在4℃过夜包被后，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300 µL/孔。清洗后拍干，酶标板用含1 % BSA的PBS溶液封闭，200 µL/孔，室温2小时。拍干，抗体G026（用PTB稀释至10 ng/mL）溶液分别为稀释的不同浓度维生素K₁和维生素K₂，室温摇床反应30分钟，之后加入到上述封闭后酶标板中，100 µL/孔，并在37 ℃恒温箱中反应1小时。拍干，PBST洗板3次，每次300 µL/孔。拍干，酶标板内加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠抗体，37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，300 µL/孔。拍干，酶标板内加入TMB底物溶液，100 µL/孔，室温10分钟，然后加入100 µL/孔的1M H₂SO₄，终止反应。使用酶标仪在450 nm测定吸光值（A450）。实验结果如表7所示，表明抗体G026检测维生素K₂特异性较好。

表7

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种抗维生素K₂抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括：

轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；

重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括：

SEQ ID NO:3所示的轻链可变区CDR1序列，SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR2序列，SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR3序列，SEQ ID NO:6所示的重链可变区CDR1序列，SEQID NO:7所示的重链可变区CDR2序列，SEQ ID NO:8所示的重链可变区CDR3序列。

3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括下列至少之一：

或者与（a）相比，序列同一性至少在80%的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括下列至少之一：

（b）具有SEQ ID NO:1所示轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及具有SEQ ID NO:2所示重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列；

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，进一步包括重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于哺乳动物源抗体。

6.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括单抗或多抗。

7.一种抗体类似物，其特征在于，所述抗体类似物包含权利要求1~6中任一项所述的抗体或抗原结合片段的可变区或可变区中的CDR区。

8.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1~6中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含：

（c）具有SEQ ID NO:9所示编码轻链可变区的核酸序列，

或者与（c）相比，序列同一性至少80%的核酸序列；或者

（d）具有SEQ ID NO:10所示编码重链可变区的核酸序列，

或者与（d）相比，序列同一性至少80%的核酸序列；或者

（e）具有SEQ ID NO:11所示核酸序列，

或者与（e）相比，序列同一性至少80%的核酸序列；或者

（f）具有SEQ ID NO:12所示核酸序列，

或者与（f）相比，序列同一性至少80%的核酸序列。

10.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求8或9所述的多核苷酸。

11.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求10所述的表达载体。

12.一种杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞可以产生权利要求1~6任意一项所述的抗维生素K₂抗体或抗原结合片段。

13.一种制备抗维生素K₂抗体或抗原片段的方法，其特征在于，包括培养权利要求11所述的重组细胞或权利要求12所述的杂交瘤细胞。

14.权利要求1~6中任一项所述的抗体或抗原结合片段和权利要求7所述的抗体类似物在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒用于检测维生素K₂。

15.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要1~6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求7所述的抗体类似物、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的重组细胞、权利要求12所述的杂交瘤细胞至少之一。

16.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1~6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求7所述的抗体类似物、权利要求8或9所述的多核苷酸、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的重组细胞、权利要求12所述的杂交瘤细胞。

17.一种制备权利要求1~6中任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，其特征在于，包括培养权利要求11所述的重组细胞、权利要求12所述的杂交瘤细胞。

18.一种药物，其特征在于，包括权利要求1~6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求7所述的抗体类似物、权利要求8或9所述的多核苷酸、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的重组细胞、权利要求12所述的杂交瘤细胞、权利要求16所述的组合物。

19.权利要求1~6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求7所述抗体类似物、权利要求8或9所述的多核苷酸、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的重组细胞、权利要求12所述的杂交瘤细胞、权利要求16所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防维生素K₂介导的相关疾病；

任选地，所述维生素K₂介导的相关疾病包括骨质疏松、血管钙化、手脚抽搐、凝血功能障碍、出血症、消化不良、恶心、腹泻、皮肤瘙痒、红肿、肝脏损伤。