CN117999339A - 用于细胞的连续转染的规模化系统和方法 - Google Patents

用于细胞的连续转染的规模化系统和方法 Download PDF

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Abstract

用于改善连续转染过程(诸如连续瞬时转染过程)的规模化性和相关联的功效的方法和系统。该连续转染系统包括：至少第一输入管线和第二输入管线，其中该第一输入管线和该第二输入管线被构造用于分别无菌流体地连接到第一试剂壳体和第二试剂壳体；混合室，该混合室流体地连接到该至少第一输入管线和第二输入管线；递送管线，该递送管线流体地连接到该混合室，其中该递送管线被构造用于无菌流体连接到细胞培养容器；以及流速控制部件(诸如泵)，该流速控制部件可操作以控制液体进入该至少第一输入管线和第二输入管线、贯穿该混合室并且进入该细胞培养容器的流速。

Description

用于细胞的连续转染的规模化系统和方法
相关申请的交叉引用
本专利申请是2022年10月7日提交的国际申请号PCT/US2022/046107的国家阶段条目，其要求2021年10月13日提交的美国临时申请号63/255,357的优先权的权益，其公开内容被认为是本专利申请的一部分，并且通过引用并入本专利申请的公开内容中。
背景技术
技术领域
本发明整体涉及分子生物学，并且更具体地涉及用于转染细胞的规模化系统和方法。
背景信息
已知并用于将生物分子(例如，核酸、蛋白质、核蛋白等)引入细胞中的各种方法，包括电穿孔、显微注射、脂质介导的转染、聚合物介导的转染(例如，聚乙烯亚胺/PEI介导的转染)、病毒介导的转染等。
非机械转染方法通常涉及将有效载荷与转染试剂(例如，阳离子/可离子化脂质转染试剂、聚合转染试剂等)络合一定持续时间以产生转染复合物。靶细胞随后与转染复合物接触，该转染复合物与细胞膜相互作用(例如，经由内吞、融合等)。这最终导致内化并将有效载荷递送至细胞内部。影响转染效率的已知参数包括例如转染络合体积、络合时间、转染复合物暴露于细胞的程度以及细胞健康状况、细胞密度等。
非常需要使得能够一致、连续地形成转染复合物(例如，以预定比率)并且使得能够一致且连续地将细胞暴露于转染复合物(例如，在转染复合物形成后以预定时间、流速、温度和试剂混合物)的系统。自动化系统以规模化方式提供连续转染且用户干预最少，从而解决了尚未满足的需求。
发明内容
在各个方面，本公开整体涉及用于细胞的连续转染的系统和方法，该系统和方法实现了在产生转染的细胞中的规模化性，例如在产生经基因修饰的细胞的细胞工作流中。
在一个方面，本文提供了一种连续转染系统，该连续转染系统包括与递送管线无菌流体连接的培养容器，以及任选地被构造成与该系统一起使用的耗材组件。在一些实施方案中，本公开的连续转染系统包括一个或多个传感器，诸如光学传感器、压力传感器、超声波传感器、热传感器或它们的任何组合。在一些实施方案中，处理器电子地耦合到系统并且可操作为部分地或完全地自动控制系统。例如，处理器包括自动控制系统的一个或多个部件以监测或改变转染的一个或多个条件和/或过程的功能，包括进入和/或通过系统的液体的流速。在实施方案中，处理器包括控制通过第一输入管线和/或第二输入管线的流量、包含在系统内的任何内容物(诸如第一试剂壳体和/或第二试剂壳体)的温度、培养容器中的内容物的操纵、系统中的传感器的控制或它们的任何组合的功能。
在各种实施方案中，本公开的连续转染系统的细胞培养容器是生物反应器，该生物反应器任选地包括被配置为控制流体中颗粒的混合和/或搅拌速率的部件，诸如叶轮或搅拌器、摇瓶、生物反应器和/或能够培养细胞的任何其他容器。应当理解，细胞培养容器的容量通常是变化的。在一些实施方案中，细胞培养容器具有大于约0.5升(L)的最大培养体积，包括约1L、约3L、约5L、约7L、约10L、约15L、约20L、约25L、约50L、约75L、约100L、约200L、约500L、约1,000L或约2,000L。
另一方面，本公开提供了用于本公开的连续转染系统中的耗材。在一些实施方案中，耗材包括：第一输入管线和第二输入管线，该第一输入管线和该第二输入管线被构造用于分别无菌流体连接到第一试剂壳体和第二试剂壳体；混合室，该混合室流体地连接到该至少第一输入管线和第二输入管线；递送管线，该递送管线流体地连接到该混合室，可操作用于无菌流体连接到细胞培养容器；以及部件，该部件被配置为控制液体进入该第一输入管线和/或该第二输入管线、贯穿该混合室并且进入该细胞培养容器的流速。在一些实施方案中，第一试剂壳体和第二试剂壳体与第一输入管线和第二输入管线无菌流体连接。
另一方面，本公开提供了用于连续转染系统中的耗材。在一些实施方案中，耗材包括：至少第一输入管线和第二输入管线，该第一输入管线和该第二输入管线被构造用于分别无菌流体连接到第一试剂壳体和第二试剂壳体；混合室，该混合室流体地连接到该至少第一输入管线和第二输入管线；递送管线，该递送管线流体地连接到该混合室，被构造用于无菌流体连接到细胞培养容器；以及部件，该部件被配置为控制液体进入该至少两条输入管线、贯穿该混合室并且进入该细胞培养容器的流速。在一些实施方案中，第一试剂壳体和第二试剂壳体可以与第一输入管线和第二输入管线无菌流体连接。
应当理解，在各种实施方案中，连续转染系统可以以多种几何排列构造，使得本公开的连续转染系统是以规模化方式实现细胞的连续转染的封闭无菌系统。在一些实施方案中，连续转染系统包括至少或大于约2条输入管线，例如2条至10条输入管线，诸如2条至4条输入管线、2条至5条输入管线、2条至6条输入管线、2条至7条输入管线、2条至8条输入管线、或2条至9条输入管线。另外，在一些实施方案中，递送管线可用于将流体(包括转染复合物)连续引入如本文所述的细胞培养容器的系统中。在各种实施方案中，递送管线为能够促进流体连续转移到系统中和/或系统内的任何标准或专用管材尺寸。在一些实施方案中，递送管具有范围从约1毫米(约0.04英寸)至约20毫米(约0.79英寸)的内径。
在另一方面，本文提供了使用本文所述的连续转染系统用有效载荷转染细胞群的方法。该方法包括提供连续转染系统，该连续转染系统具有其中带有有效载荷的第一试剂壳体、其中带有转染试剂的第二试剂壳体和流体地连接的无菌培养容器，其中第一试剂壳体与第一输入管线流体连接，第二试剂与第二输入管线呈流体构型，该无菌培养容器含有用于用有效载荷转染的细胞培养物。
在各种实施方案中，有效载荷和转染试剂分别连续地流入第一输入管线和第二输入管线，然后以受控速率流入混合室以产生转染复合物。在一些实施方案中，混合后，将所得的转染复合物以受控速率和/或固定时间量(包括约1分钟至约24小时、约2分钟至约1小时、约5分钟至约30分钟和约7分钟至约20分钟)转移通过递送管线并进入细胞培养容器中。在一些实施方案中，调节和/或定制从形成转染复合物到将转染复合物递送到细胞培养容器中的时间量以最佳地适应感兴趣的转染方法和/或系统。
在实施方案中，用于在本公开的系统内转染细胞群的有效载荷是普通技术人员已知的任何合适的有效载荷，并且可以根据细胞的类型、测定或方案等来定制。在一些实施方案中，有效载荷是核酸(即，核苷酸、核苷、寡核苷酸、多核苷酸)、蛋白质、肽、多肽或其他生物分子或它们的组合。例如，有效载荷可包括核酸，诸如DNA、RNA或它们的组分(例如，核苷酸、核碱基、核苷、核糖核苷酸、核糖核碱基、核糖核苷等)，以及它们的组合。
在各种实施方案中，核蛋白复合物包含在待与细胞接触的有效载荷中。在一些实施方案中，在将转染复合物递送至细胞培养物期间有利地搅拌或搅动细胞培养物，以便确保有效载荷与细胞培养物的连续且均匀的接触。
在各种实施方案中，细胞培养密度根据例如细胞类型、方案和/或感兴趣的测定而变化。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞以约0.1×106个细胞/ml至约1.0×105个细胞/ml之间的密度存在，包括约0.1×106个细胞/ml至约2.0×106个细胞/ml、约0.5×106个细胞/ml至约0.8×105个细胞/ml、约1.0×106个细胞/ml至约0.5×105个细胞/ml、和约2.0×106个细胞/ml至约4.0×106个细胞/ml、和约2.5×106个细胞/ml至约3.5×106个细胞/ml。在各种实施方案中，细胞能够经历转染，诸如哺乳动物细胞或其组分，例如线粒体。可用于本公开的系统和方法的细胞的实施方案包括哺乳动物细胞，诸如以举例的方式中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、外周血单核细胞(PBMC)、T细胞、大颗粒淋巴细胞(LGL)或天然杀伤(NK)细胞、B细胞以及它们的组合。
附图说明
为了更全面地理解本发明的性质和优点，应参考结合附图进行的以下详细描述。应当理解的是，这些附图仅描绘了本发明的典型实施方案，并且因此不应视为对其范围的限制。将通过使用附图，借助另外的特征和细节来描述与阐明本公开，在这些附图中：
图1是描绘用于细胞的分批转染的本公开的系统的一个实施方案的示意图；
图2是描绘用于根据本公开的连续转染系统的耗材套件的示意图；
图3是描绘与本公开的实施方案中的连续转染系统相关的图2的耗材套件的示意图；
图4是描绘与本公开的实施方案中的连续转染系统相关的图2的耗材套件的示意图；
图5是描绘与本公开的实施方案中的连续转染系统相关的图2的耗材套件的示意图；
图6是描绘与本公开的实施方案中的连续转染系统相关的图2的耗材套件的示意图；以及
图7是描绘与本公开的实施方案中的连续转染系统相关的图2的耗材套件的示意图。
具体实施方式
在详细描述本公开的各种实施方案之前，应当理解，本公开不限于特别示例的系统、方法、设备、产品、工艺、耗材和/或套件的参数，这些参数理所当然地可以变化。因此，虽然将参考特定配置、参数、组件、元件等来详细描述本公开的某些实施方案，但是这些描述为示例性的，并且不应被理解为限制所要求保护的发明的范围。另外，本文中所使用的术语是出于描述实施方案的目的，并且不必用于限制所要求保护的发明的范围。
此外，应理解，对于本文所述的任何给定部件或实施方案，除非隐含地或明确地另有理解或说明，否则针对该部件所列出的任何可能候选方案或替代方案一般可单独使用或彼此结合使用。另外，应当理解，除非隐含地或明确地另有理解或说明，否则此类候选方案或替代方案的任何列表仅是示例性的，而非限制性的。
另外，除非另有指示，否则在说明书和权利要求书中所使用的表达数量、成分、距离或其他测量值的数字应被理解为由术语“约”修饰，正如术语在本文中定义。如本文所用，术语“约”和“近似”当指代可测量的值，诸如量、剂量、时间、温度、活性、水平、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量、位置、长度等时，意在涵盖指定量、剂量、时间、温度、活性、水平、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量、位置、长度等的±15％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。在术语“约”和“近似”与参考多核苷酸或多肽内的区域的定位或位置结合使用的情况下，这些术语涵盖±至多20个碱基对或氨基酸残基、±至多15个碱基对或氨基酸残基、±至多10个碱基对或氨基酸残基、±至多5个碱基对或氨基酸残基、±至多4个碱基对或氨基酸残基、±至多3个碱基对或氨基酸残基、±至多2个碱基对或氨基酸残基、或甚至±1个碱基对或氨基酸残基的变化。
与“包含(including)”、“含有(containing)”、“具有(having)”或“特性在于(characterized by)”同义的术语“包括(comprising)”为包含性的或开放式的，且不排除额外未列出的元件或方法步骤。
需要注意的是，在本说明书和所附权利要求书中，除非内容有明确规定，否则单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，对“入口”的提及包括一个、两个或更多个入口。
如在说明书和所附权利要求书中所使用的，本文的方向性术语，如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上部”、“下部”、“内”、“外”、“内侧”、“外侧”、“内部”、“外部”“近侧”、“远侧”等仅用于指示相对的方向，而不旨在以其他方式限制本公开或权利要求书的范围。如在说明书和所附权利要求书中所使用的，本文的方向性术语，如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上部”、“下部”、“内”、“外”、“内侧”、“外侧”、“内部”、“外部”“近侧”、“远侧”等仅用于指示相对的方向，而不旨在以其他方式限制本公开或权利要求书的范围。
在可能的情况下，在各附图中都使用了类似的附图标记。此外，具体元件的替代配置可以各自包含附加到元件编号的单独字母。相应地，附加字母可以用于指定不含附加字母的元件或特征的替代设计、结构、功能、具体实施和/或实施方案。例如，元件“80”可以体现在替代构型中并且被指定为“80a”。类似地，元件和或亲代元件的子元件的多个实例可以各自包含附加到元件编号的单独字母。在每种情况下，可以使用元件标记而无需大体上指代元件的所有实例或替代元件中的任一者的附加字母。包含附加字母的元件标记可用于指代元件的具体实例，或区分元件的多种使用，或吸引对元件的多种使用的注意。
可参考一个或多个示例性实施方案来展示本发明的装置、系统和方法的各个方面。如本文中使用的，术语“实施方案”意指“充当实例(example或instance)或展示”并且不一定应被解释为与本文所公开的其他实施方案相比是优选的或有利的。
可以通过描述联接、附接和/或结合在一起的多个部件来展示本发明的装置和系统的多个不同方面。如本文中所使用，术语“联接”、“附接”、“连接”和/或“接合”用以指示两个组件之间的直接连接，或在适当时通过介入或中间组件到彼此的间接连接。相反，当组件被称作“直接联接”、“直接附接”、“直接连接”和/或“直接连结”到另一个组件时，不存在中间元件。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在本公开的实践中可以使用与本文所描述的类似或等效的多种方法和材料，但是本文中描述了优选的材料和方法。
在各个方面，本文提供了用于细胞培养物的连续转染的系统、方法和耗材。特别地，本文提供的系统、方法和耗材有利地允许连续组合或混合转染试剂(例如，基于脂质的转染试剂和/或基于聚合物的转染试剂等)与有效载荷，例如以形成转染复合物。本文所述的系统有利地使有效载荷和转染试剂能够在递送至待用有效载荷转染的细胞培养物(靶细胞群或靶细胞培养物)之前络合固定的持续时间。使用本文提供的系统和方法，可连续产生转染复合物并使其络合固定时间段(即，最佳时间)(下文称为“络合时间”)，并连续递送至靶细胞培养物。优选地，当向其中连续添加转染复合物时，连续搅拌或搅动靶细胞培养物，从而确保转染复合物分散在整个靶细胞培养物中，并使转染复合物仅与靶细胞培养物内的靶细胞亚群(例如，靠近递送管线的细胞)接触的可能性最小化。
术语“连续转染”在本文中用于指代将有效载荷和转染试剂连续混合并且在混合后连续递送至细胞群的过程。优选地，混合有效载荷和转染试剂直至混合物被递送至细胞群之间的时间量(络合时间)是可调节的。例如，对于用期望的有效载荷转染靶细胞群的整个过程，络合时间可以是固定的。另选地，可以在整个转染过程中调节络合时间。
术语“有效载荷”是指待递送到细胞中(例如，递送到细胞的细胞质或核中)的生物分子。在各种实施方案中，有效载荷包括核酸(例如，DNA、RNA以及它们的组合)、蛋白质、肽以及它们的组合(例如，核蛋白等)。
术语“转染试剂”在本领域中是已知的，并且是指能够与核酸和/或细胞膜相互作用和/或粘结以促进细胞摄取有效载荷的任何化学试剂或修饰剂。普通技术人员将容易理解，各种类型的转染试剂可用于本文提供的实施方案中，包括许多可商购获得的转染试剂。以举例的方式，在一些实施方案中，转染试剂是包含阳离子或可离子化脂质、阴离子聚合物等的组合物。在一些实施方案中，转染试剂是阳离子-脂质转染试剂，例如MessengerMAXTM、/>2000、/>3000，其用于通过脂质转染提高RNA(包括mRNA和siRNA)或质粒DNA向细胞培养物的转染效率。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”互换使用，以指代氨基酸残基的聚合物。该术语适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物。
如本文所用，肽可指编码完整蛋白或其部分的完整氨基酸序列。“蛋白质编码序列”或“编码”特定多肽或肽的序列是当置于适当调控序列的控制下时在体外或体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸序列。编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列、甚至合成的DNA序列。转录终止序列将通常位于编码序列的3'处。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由基因密码编码的氨基酸以及之后被修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经过修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经过修饰的肽主链，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的通式化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(the IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号提及。
本文广泛使用术语“多核苷酸”或“寡核苷酸”或“核苷酸序列”或“核酸分子”或“核酸”以意指通过磷酸二酯键连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。因此，该术语包括RNA和DNA，其可以是基因或其部分、cDNA、合成的多脱氧核糖核酸序列等，并且可以是单链或双链的，以及DNA/RNA杂交体。
核酸包括但不限于基因组DNA、cDNA、mRNA、iRNA、miRNA、tRNA、ncRNA、rRNA和重组产生的和化学合成的分子，诸如核酸配体、质粒、反义DNA链、shRNA、核糖酶、缀合的核酸和寡核苷酸。根据本发明，核酸可以作为单链或双链以及线性或共价环状闭合分子存在。核酸可用于引入到细胞(例如，细胞的转染)中，例如以RNA的形式，RNA可通过体外转录从DNA模板制备。此外，RNA可以在应用前通过稳定序列、封盖和聚腺苷酸化进行修饰。通常，核酸可通过多种技术提取、分离、扩增或分析，诸如Green和Sambrook，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第四版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Woodbury，NY 2,028页(2012年)中描述的那些技术。
还应理解，核酸包括可从细胞分离的天然存在的核酸分子，以及可例如通过化学合成方法或通过酶促方法(诸如通过聚合酶链反应(PCR))制备的合成多核苷酸。应当认识到，不同的术语仅用于方便讨论，以便区分例如组合物的不同组分。
一般来讲，多核苷酸中所含的核苷酸是天然存在的脱氧核糖核苷酸，诸如与2'-脱氧核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或者是核糖核苷酸，诸如与核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。然而，根据用途，多核苷酸还可以含有核苷酸类似物，包括非天然存在的合成核苷酸或修饰的天然存在的核苷酸。核苷酸类似物是本领域熟知的并且可商购获得，含有此类核苷酸类似物的多核苷酸也是如此。连接多核苷酸的核苷酸的共价键通常是磷酸二酯键。然而，根据使用多核苷酸的目的，共价键也可以是众多其他键中的任一种，包括硫代二酯键、硫代磷酸酯键、肽样键或本领域技术人员已知的可用于连接核苷酸以产生合成多核苷酸的任何其他键。
在各种实施方案中，核酸是包括含有修饰的寡核苷酸的RNA分子。多种修饰在本领域中是已知的并且预期用于本发明。例如，设想了包含修饰的主链或非天然核苷间键的寡核苷酸。如本文所用，具有修饰的主链的寡核苷酸包括在主链中保留磷原子的那些和在主链中不具有磷原子的那些。为了本说明书的目的，并且如本领域中有时提及的，在它们的核苷间主链中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可以被认为是寡核苷。
在各种实施方案中，修饰的寡核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、具有正常3'-5'键的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯、这些的2'-5'连接的类似物以及具有反极性的那些，其中一个或多个核苷酸间键是3'-3'键、5'-5'键或2'-2'键。某些具有反向极性的寡核苷酸在最3'-核苷酸间键处包含单个3'-3'键，即单个反向核苷残基，其可以是无碱基的(核碱基缺失或在其位置具有羟基)。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
在一些实施方案中，其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包括具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；核糖乙酰基主链；含有主链的烯烃；氨基磺酸盐主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他化合物。
在实施方案中，使用其中核苷酸单元被新基团取代的寡核苷酸模拟物。一种此类低聚化合物，即已经显示具有优异杂交特性的寡核苷酸模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含有酰胺的主链，特别是氨基乙基甘氨酸主链取代。核碱基被保留并直接或间接结合到主链的酰胺部分的氮杂氮原子。在各种实施方案中，寡核苷酸可以包括硫代磷酸酯主链和具有杂原子主链的寡核苷。修饰的寡核苷酸还可以含有一个或多个取代的糖部分。
在一些实施方案中，核酸包括锁定核酸(LNA)以产生对靶多核苷酸具有增强的亲和力和特异性的反义核酸。LNA是其中2'-羟基与糖环的3'碳原子或4'碳原子连接从而形成双环糖部分的核酸。该键优选地是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基基团(-CH2-)n，其中n是1或2。
根据所公开的技术，包括“细胞培养物”或“细胞的培养物”的多个细胞经受转染过程，例如瞬态转染过程。可构成细胞培养物的细胞的示例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、外周血单核细胞(PBMC)、T细胞、大颗粒淋巴细胞(LGL)或天然杀伤(NK)细胞、B细胞以及它们的组合。用于转染的细胞的其他非限制性示例包括但不限于细菌细胞、真核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一些实施方案中，用于转染的细胞是人胚肾293(HEK293)、大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌属、巴斯德毕赤酵母、鼠伤寒沙门氏菌、果蝇属S2、灰翅夜蛾属SJ9、COS(例如，COS-7)、3T3-F442A、HeLa、HUVEC、HUAEC、NIH 3T3、Jurkat、293、293H或293F。
转到图1，示出了转染靶细胞培养物的“分批”方法，即不存在如本文所述的连续转染系统。如图1所示，手动混合有效载荷和转染试剂以分批形成转染复合物。然后将分批产生的转染复合物递送至靶细胞培养物。从图1可以清楚地看出，分批转染不允许(1)精确控制络合时间(例如，在转染复合物随时间通过递送管线递送的情况下)和(2)使局部浓度效应最小化的递送条件，例如将转染复合物递送至细胞培养物。
转到图2，示出了在本文所述的连续转染系统中使用的耗材100的实施方案。在一些实施方案中，图2所示的耗材包括一次性部件和可重复使用的部件两者，并且被构造用于无菌连接到培养容器，以提供封闭的无菌连续转染系统。
在各种实施方案中，耗材100包括至少第一输入管线110和第二输入管线130。第一输入管线和第二输入管线被适配为分别连接到第一试剂壳体200和第二试剂壳体120。例如，第一输入管线和第二输入管线被适配为便于与第一试剂壳体和第二试剂壳体的无菌连接。在实施方案中，第一试剂壳体和第二试剂壳体包括任何形式，例如瓶、管、生物处理容器(例如，袋)等。
第一输入管线和第二输入管线馈送到混合室140中。如图1所示，第一输入管线和第二输入管线的内容物在结合部处相交，并流入混合室。图1至图7中所示的接合部是T形接合部，然而，应当理解，接合部可以采用其他构型，例如Y形接合部等。
通常，输入管线与混合室无菌流体连接。理想地，混合室140是静态或静止混合器，即，其不具有运动部件，并且被构造成实现溶液的最大混合，从而导致混合室的内容物从顶部行进到底部。例如，在一些实施方案中，混合室是静态混合室，其具有防止涡流效应并导致混合室的内容物从顶部移动到底部的导流板或其他内部特征部的布置。普通技术人员将容易理解，许多类型的混合室可用于本文所述的系统中并且是本领域技术人员公知的，包括但不限于美国专利号3,286,922中所述的那些，该专利全文以引用方式并入本文。静态搅拌器允许连续流动，因此来自第一试剂壳体和第二试剂壳体的内容物接触并且可以被小心地监测和控制。可通过改变溶液通过混合器的线速度或流速、所用混合器的类型、混合器的直径和混合器中特征部的数量来控制混合程度。
可调节/调整以下参数以确保所需比率的第一试剂(例如，有效载荷)和第二试剂(例如，转染试剂)在结合部处混合在一起，并且进一步确保转染复合物在转移到细胞培养容器中之前流动通过系统达所需时间量：
a)构成连续转染系统的流体路径的各种组分的体积(例如，输入管线、混合室、孵育室(如果存在)的横截面的高度和面积)；第一试剂(例如，有效载荷)和第二试剂(例如，转染试剂)流入接合部的流速；以及
b)流体流动通过系统的速率(例如，经由一个或多个泵)。
例如，在一些实施方案中，第一试剂(例如，有效载荷)与第二试剂(转染试剂)的比率通过调节第一泵和第二泵(例如，如图2和图4所描绘的)使第一试剂和第二试剂分别流入系统中的速率来调节。另选地，在一些实施方案中，通过调节第一输入管线和第二输入管线的尺寸来调节第一试剂(例如，有效载荷)与第二试剂(例如，转染试剂)的比率，其中第一试剂和第二试剂通过第一输入管线和第二输入管线的流量由单个泵控制(即，以相同的速率)，例如，如图3和图7所描绘的。
在一些实施方案中，第一试剂与第二试剂的比率为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:15、约1:20、约1:30、约1:40、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90、约1:100、约1:500、约1:1000、约1:5000、约1:10000、约1:50000、约1:100000或约1:1000000。在一些实施方案中，第二试剂与第一试剂的比率为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:15、约1:20、约1:30、约1:40、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90、约1:100、约1:500、约1:1000、约1:5000、约1:10000、约1:50000、约1:100000或约1:1000000。
应当理解，尽管图2至图7描绘了两条输入管线，但在一些实施方案中，该系统包括一条或多条附加的输入管线，例如1条、2条、3条、4条、5条、6条、7条、8条、9条、10条或更多条位于混合室140上游或下游的输入管线。在实施方案中，附加的输入管线被构造用于无菌流体连接到附加的试剂壳体、废物容器等。例如，图6所示的连续转染系统包括输入管线210和位于混合室下游并与递送管线160流体连接的相关联的试剂壳体220。在一些实施方案中，附加的输入管线用于在递送至靶细胞培养物之前将缓冲液、培养基或其他期望的组分添加至转染复合物。
混合室140流体地连接到递送管线160。图2描绘了包括位于混合室140下游和递送管线160上游的孵育管线150的耗材。然而，普通技术人员将容易理解，孵育管线是任选的，并且一些耗材可具有其中混合室140直接位于递送管线160上游的构型。当存在时，孵育管线150可以以多种方式构造。例如，图2至图7中描绘的孵育管线150具有盘绕形状，但孵育管线可以是交织的，或处于任何其他构型。
图2以及图4至图7所示的连续转染系统和耗材包括分别沿着输入管线110和输入管线130定位的泵180和泵190，而图3和图5所示的连续转染系统和耗材描绘了沿着递送管线定位在混合室(和任选的孵育管线)下游的泵250。可用于本文所述的连续转染系统的各种类型的泵包括但不限于蠕动泵、注射器泵、隔膜泵、真空泵、超高真空泵、毛细管泵、提升泵、凸轮泵等。
如图2所示，连续转染系统任选地包括孵育管线，该孵育管线将混合室140流体地连接到递送管线160。尽管图2至图7中描绘的孵育管线以盘绕形式表示，但普通技术人员将容易理解，孵育(以及输入和递送)管线的许多构型/形状适用于本文提供的系统。在一些实施方案中，孵育管线具有交织构造或盘绕构造(例如，如图2至图7所描绘地)。
孵育管线可以具有从大约1米(大约3.28英尺)到大约15米(大约49.2英尺)的长度，包括从大约5米(大约16.4英尺)到大约10米(大约38.2英尺)的长度。孵育管线和递送管线可具有范围从约1毫米(约0.04英寸)至约20毫米(约0.79英寸)的内径。
在实施方案中，流体路径，例如包括输入管线、混合室、孵育管线(如果存在的话)、递送管线等，由确保流体均匀地流动通过路径并表现出最小流体阻力的材料(例如，管材)组成，从而使得能够精确控制络合时间。示例性材料包括聚合物，诸如聚丙烯、聚碳酸酯、橡胶、硅酮、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、尼龙、丙烯酸、高密度聚乙烯(HDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)、聚烯烃以及它们的组合。非聚合物材料(诸如合金、金属、无机玻璃或陶瓷)也可用于本文提供的系统中。
本文提供的耗材和连续转染系统100的部件优选地由与生物材料不反应的材料(例如，细胞培养试剂、转染试剂、有效载荷等)制成。此外，制造各种部件的材料能够耐受灭菌，诸如通过高压灭菌、辐射、液体化学灭菌(LCS)、等离子体气体灭菌、汽化过氧化氢(VHP)灭菌等。有利地，流体路径由满足用于制备细胞治疗剂的装置的规则要求的材料制成。
优选地，耗材包括一个或多个传感器，诸如传感器230、260、270和/或280，如图5所描绘的。例如，本文提供的耗材和系统可包括用于监测和/或进一步控制通过系统的流体流量的一个或多个传感器。传感器可包括液体传感器、分析物传感器、pH传感器、密度传感器、压力传感器、气泡检测器、热传感器等。普通技术人员理解，一个或多个传感器可以定位在系统和相关联的耗材内，例如沿着传送管线、试剂壳体、培养容器、孵育管线等定位或者定位在传送管线、试剂壳体、培养容器、孵育管线等内。
可通过与系统的至少一个部件可操作地连接的一个或多个泵(例如，一个、两个、三个、四个或更多个泵)来控制和操纵本公开的系统内的流体内容物(诸如液体介质、转染试剂、有效载荷溶液和/或转染复合物)的流速。例如，连续转染系统的一个或多个泵可以是注射器泵、蠕动泵、隔膜泵、真空泵、超高真空泵、抽吸泵、毛细管泵、提升泵和凸轮泵中的一者或多者或它们的任何组合，例如蠕动泵和注射器泵。泵可以同时操作，例如，以确保1)用于形成转染复合物的DNA/络合缓冲液和转染试剂的最佳络合；以及2)将转染复合物连续且有效地引入细胞培养物中。例如，第一泵可被构造成控制一种或多种流体通过第一输入管线的流量，而第二泵可被构造成控制流体通过第二输入管线的流量。另选地，单个泵被构造成控制一种或多种流体通过第一输入管线和第二输入管线的流量，其中第一输入管线和第二输入管线在尺寸上被不同地设定尺寸以控制通过管线的流体流量，因此控制来自第一输入管线的流体量，来自第一输入管线的流体以线性或指数方式接触第二输入管线的流体。
在实施方案中，本文提供的耗材和系统包括处理器，诸如图5至图6所示的处理器240。处理器可以包括控制泵和试剂壳体的内容物的流速的硬件和软件，并且可以1)通过例如电缆、电线等直接连接到耗材的一个或多个部件；2)例如经由基于蜂窝的配对无线地连接到一个或多个部件；或者3)既直接地又无线地连接。例如，处理器可提供用于根据预先制定地参数使过程自动化的机制，并且可包括软件组件，该软件组件可包括“运行数据”的自动化收集，该“运行数据”包括(例如)一次性部件的批号、温度和体积测量结果、细胞数量参数、所施用的剂量有效载荷、络合时间、操作者标识、日期和时间、靶细胞标识等。
在一些实施方案中，本公开的系统包括条形码读取系统，以允许将变量(例如，一次性套装批号和有效期、试剂的批号和有效期、样品标识符等)的数据输入到装置控制器中作为处理的文档记录的一部分。这种能力减少了数据输入错误的机会；以及通知系统批号内的任何潜在变化，这些变化可以限定管直径的结构变化。
在一些实施方案中，本文提供的耗材和系统包括处理器和相关联的软件，该软件提供提示用户完成将管材和其他元件适当插入到系统中所必需的步骤的功能。在一些实施方案中，软件还具有发起自动化测试以确认管材、试剂壳体、细胞培养容器等正确插入以及不存在堵塞等的功能。
如图3至图7所示，递送管线160被构造成流体地连接到培养容器170。递送管线160具有近侧端部和远侧端部，该近侧端部和该远侧端部在任一侧具有开口。当存在时，近侧端部处的开口提供了到混合管线或者另选地到孵育管线的附接点。远侧端部处的开口是转染复合物离开连续转染系统的耗材部分并进入培养容器的地方。递送管线可定位成使得远侧端部处的开口位于细胞培养容器内的细胞培养物的表面处或上方。另选地，递送管线可定位成使得远侧端部处的开口位于细胞培养容器中的细胞培养物内，例如，在培养物的中间、在细胞培养物/细胞培养容器的底部等。
应当理解，多种培养容器可用于本文所述的连续转染系统中。例如，培养容器可以是管、烧瓶、板(用于贴壁培养物)、生物反应器(例如，搅拌槽生物反应器)等。可用于本文提供的系统中的各种生物反应器包括但不限于整合的一次性使用生物反应器、开放式架构的一次性使用生物反应器、摇臂式生物反应器等。以举例的方式，本文提供的系统的培养容器包括例如在美国专利号8,960,486；9,943,814；10,150,090；以及10640741；以及美国专利申请公开号2019/0083947中描述的那些，这些专利中的每一者全文以引用方式并入本文。
参考图5的系统，为了允许改变路径长度和孵育时间，除了系统100具有孵育管线150的限定流体路径之外，多个系统(图1至图7)的多个部件彼此串联连接，例如多个第一和第二试剂壳体，该多个第一和第二试剂壳体通过混合室联接并且通向孵育管线150。在一些实施方案中，由混合室联接的至少2组、3组、4组、5组、6组、7组、8组、9组、10组或更多组第一试剂壳体和第二试剂壳体流体地连接在孵育管线150的上游。
如本文所讨论的，应当理解，孵育管线150可以以多种几何图案形成，诸如，以举例的方式，同心盘绕的圆、卵形、椭圆形等。在一些实施方案中，孵育管线150包括具有如国际PCT申请公开号WO 2020/076683中所示的任何种类的转弯、弧、曲线和层的管几何形状，该申请全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，孵育管线150被成形为避免流动路径内的汇聚和/或漩涡，使得流动路径内的试剂实现均匀的颗粒流动，以确保颗粒混合的恒定速率以及到培养容器170的流速。在一些实施方案中，孵育管线150包括位于孵育管线管腔内的沟槽、表面纹理和/或其他表面改性特征以促进均匀的颗粒流动。在一些实施方案中，孵育管线150包括位于孵育管线管腔内的沟槽、表面纹理和/或其他表面改性特征以抑制均匀的颗粒流动。
有利地，可调节/调整本文所述的连续转染系统以确保最大数量的细胞暴露于转染复合物。就这一点而言，优选地，培养容器包括搅拌元件，诸如叶轮、搅拌器或类似装置。例如，在其中培养容器是搅拌槽生物反应器的实施方案中，可调节/调整细胞培养容器中的细胞混合的速度(并且通过延伸，在整个过程中培养物内的单个细胞相对于递送管线的输出的位置)以便使培养物中的所有细胞均匀地暴露于转染复合物的可能性最大化。
用于搅拌培养容器的内容物的各种实施方案可有效地用于本文公开的连续转染系统中。搅拌实施方案的非限制性示例包括但不限于在欧洲专利号245654、美国专利号7,628,528和10,092,787中描述的那些，这些专利中的每一者全文以引用方式并入本文。
在附加的方面，细胞培养容器包含大于约0.5升(L)的最大培养体积，包括但不限于选自约1L、约3L、约5L、约7L、约10L、约15L、约20L、约25L、约50L、约75L、约100L、约200L、约500L、约1,000L或约2,000L的最大培养体积。
该系统还可包括用于各种部件的各种支承件、壳体等，这些部件可与本系统联接以执行本文所述的方法和过程。例如，该系统可以包括一个或多个支撑结构，这些支撑结构被构造成保持和/或支撑多种试剂、样品、过滤器、流体等。支撑结构可以包括各种钩状物、吊架和/或保持器，以及普通技术人员已知的相关工具。在一些实施方案中，该系统包括温度控制单元，用于调节或以其他方式控制系统中流体的温度，例如，在培养容器或孵育管线中。
本文提供的连续转染系统还可包括覆盖整个系统的壳体或盖，或其任何部件或部件的组合。
递送管线、管和/或管材可包括范围从约1毫米(约0.04英寸)至约20毫米(约0.79英寸)的内径。递送管线、管和/或管材可包括范围从约1毫米(约0.04英寸)至约20毫米(约0.79英寸)的内径。
如前所述，目前在分子和细胞生物学中的主要限制涉及缺乏可靠的规模化系统，该系统能够在递送至待用有效载荷转染的细胞培养物之前适应有效载荷和转染试剂的络合达固定时间段。因此，本文公开的系统有利地适应此类络合以及在例如瞬时转染过程中向细胞培养物的连续递送。所公开的系统和方法有利地减少了与孵育时间可变性和将络合的(有效载荷/转染试剂)溶液不连续引入到包含培养物的容器中相关的培养问题。另外，本文所述的系统有利地减少或消除了与细胞培养容器的混合可变性，从而确保对络合溶液的最大且一致的细胞暴露。该系统还实现了大规模过程期间的最小操作员交互和监督，从而减少偶然污染的可能性和/或瞬时转染经常遇到的加工困难。
尽管已经参考本发明的某些优选的实施方案相当详细地描述了本发明，但是其他版本也是可能的。因此，所附权利要求的实质和范围不应限于本说明书中所包含的描述和优选版本。将通过参考以下非限制性实施例来说明本发明的各个方面。
实施例
以下实施例描述了细胞转染方法和所得细胞的产生相对于相关领域中先前公开的那些的改进。提供以下实施例以证明所公开的技术的某些非限制性方面。
实施例1
基于生物反应器的连续转染
以下实施例证明了使用搅拌釜生物反应器形式在如本文提供的连续转染系统内转染细胞。
将用于如本文所述的连续转染系统的耗材连接到2L生物反应器(Sartorius，型号：Biostat B 2L Single，序列号：Project 4200047)以提供封闭的无菌流体路径。(基于HEK-293的)病毒产生细胞在病毒产生培养基中生长至约0.55×106个细胞/ml的活细胞密度(VCD)，并引入生物反应器中。在整个实验中，细胞在37℃培养，以200rpm连续混合。
将(基于pCDNA 3.1的)GFP表达载体在络合缓冲液中稀释至1.5μg/mL(“有效载荷”)的浓度，在第一试剂壳体中持续约10分钟。在第二试剂壳体中提供转染试剂。同时，经由标准注射器泵将有效载荷泵入直列排静态搅拌器中。使用直列排静态搅拌器将DNA/络合缓冲液和转染试剂混合以形成转染复合物，随后以12.97mL/min的速率流动通过孵育管线和递送管线。在经过9分钟后，转染复合物通过递送管线的出口进入生物反应器。将有效载荷和转染试剂泵送通过连续转染系统共7.7分钟，使得100mL转染复合物最终递送至生物反应器。
在递送转染复合物后，将细胞培养另外48小时并随后收获。然后测量GFP水平。转染效率计算为约83％，GFP的平均荧光强度(MFI)计算为约260250个相对荧光单位。
前述内容证明了使用本文提供的系统和方法实现连续转染的能力。
实施例2
非连续转染系统在AAV病毒颗粒产生中的用途
以下实施例证明了使用本文提供的系统产生AAV颗粒的能力。
(基于HEK-293的)病毒产生细胞在2L病毒产生培养基中生长至约0.55×106的活细胞密度(VCD)，并引入5L摇瓶中。在整个实验中，细胞在约37℃培养，以约100rpm连续混合。
将基于AAV的GFP表达载体在络合缓冲液(“有效载荷”)中稀释至约1.5μg/mL的浓度，并在如图2所示的耗材的第一试剂壳体中孵育约10分钟。转染试剂在第二试剂壳体中孵育约10分钟。有效载荷和转染试剂分别经由蠕动泵和标准注射器泵流入直列排静态搅拌器中，以形成转染复合物。转染复合物以约12.97mL/min的速率流动通过孵育管线和递送管线。将递送管线插入一系列四个50ml锥形管中以收集转染复合物。将有效载荷和转染试剂泵送通过转染系统共约15.4分钟，使得将约200mL转染复合物泵送到锥形管中(将约50mL有效载荷和转染试剂转移到四个50mL锥形管中的每个锥形管中)。在填充第四锥形管后，将四个管的内容物同时递送至摇瓶中的细胞培养物。
随后将细胞于37℃在摇瓶中培养约20小时，并收获。一部分细胞培养物用于计算转染效率，一部分细胞用于计算AAV滴度。转染效率计算为约63％(与阳性对照相比)，而GFP强度计算为约14500个相对荧光单位。AAV2滴度浓度计算为约5.4×1010个病毒基因组单位/mL(vg/mL)。
前述内容另外证明了使用本文提供的系统和方法实现AAV产生的能力。
实施例3
基于摇瓶的连续转染/LV颗粒产生
以下实施例证明了细胞的转染和慢病毒(LV)颗粒在如本文提供的用于连续转染的摇瓶形式内的产生。
将用于如本文所述的连续转染系统的耗材连接到5L摇瓶。(基于HEK-293的)病毒产生细胞在LV-MAXTM产生培养基(购自Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)中生长至约1.0×106的活细胞密度(VCD)，并引入摇瓶中。在整个实验中，细胞在约37℃培养，以约100rpm连续混合。
将LV-MAXTM病毒包装混合物(Thermo Fisher Scientific，目录号A43237)在络合缓冲液中稀释至约2.5μg/mL的浓度，并在如图2所示的耗材的第一试剂壳体中孵育约10分钟。使用标准蠕动泵将DNA/络合缓冲液(有效载荷)溶液泵入直列排静态搅拌器中。同时，经由标准注射器泵将转染试剂泵入直列排静态搅拌器中。使用直列排静态搅拌器将DNA/络合缓冲液和转染试剂混合以形成转染复合物，随后在5mL摇瓶中的细胞培养物顶部以约12.97mL/min的速率流动通过孵育管线和递送管线。将有效载荷和转染试剂泵送通过连续转染系统共约15.4分钟，使得约200mL转染复合物直接递送至摇瓶内的细胞培养物。
将细胞培养另外20小时，此时取出第一部分细胞培养物并用于计算转染效率，并将第二部分细胞用于计算LV滴度。将剩余的细胞培养约28小时(即转染后48小时)。此时，收获一部分细胞培养物并用于计算活细胞计数(以活细胞/mL为单位测量)。转染后72小时收获另一部分细胞培养物并用于计算感染滴度。
转染效率(作为与阳性对照相比的％GFP表达的函数)计算为约26％，并且活细胞计数浓度确定为约35500个活细胞/mL。此外，感染滴度浓度计算为约2.76×106个转导单位/mL(TU/mL)。
前述内容进一步证明了使用本文提供的系统和方法实现连续转染的能力。
应当理解，根据本公开的某些实施方案的系统、过程和/或产品可以包括、结合或以其他方式包括在本文所公开和/或描述的其他实施方案中描述的特点特征(例如，部件、构件、元件、零件和/或部分)。因此，某些实施方案的各种特征可以与本公开的其他实施方案相兼容、组合，纳入和/或并入本公开的其他实施方案中。因此，参照本公开的具体实施方案而公开了某些特征，这不应视为限制了将所述特征应用于或纳入该具体实施方案中。相反，应当理解的是，其他实施方案也可以包括所述特征而不一定偏离本公开内容的范围。
此外，除非一项特征被描述为需要与另一特征相组合，否则本文中的任何特征可以与本文所公开的相同或不同实施方案的任何其他特征相组合。此外，例示性系统、过程、产品等的各种众所周知的方面在本文没有特别详细地描述，以避免掩盖示例性实施方案的各个方面。然而，此类方面在本文也是可以考虑的。
虽然本公开提供了某些例示性方面并且描述了所描述的技术的一般原理，但是相关领域的普通技术人员将理解，可以在不脱离这些方面和原理的情况下引入对本公开的布置和细节的修改。因此，申请人要求保护在所附权利要求的实质和范围内的所有修改。

Claims (34)

1.一种连续转染系统，所述连续转染系统包括：
a)至少第一输入管线和第二输入管线，其中所述第一输入管线和所述第二输入管线被构造用于分别无菌流体连接到第一试剂壳体和第二试剂壳体；
b)混合室，所述混合室流体地连接到所述至少第一输入管线和第二输入管线；
c)流体地连接到所述混合室的递送管线，其中所述递送管线被构造用于无菌流体连接到细胞培养容器；和
d)部件，所述部件被配置为控制液体进入所述至少第一输入管线和第二输入管线、贯穿所述混合室并且进入所述细胞培养容器的流速。
2.根据权利要求1所述的连续转染系统，还包括与所述第一输入管线和所述第二输入管线无菌流体连接的所述第一试剂壳体和所述第二试剂壳体。
3.根据权利要求1所述的连续转染系统，还包括所述培养容器，其中所述培养容器与所述递送管线无菌流体连接。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的连续转染系统，还包括传感器。
5.根据权利要求4所述的连续转染系统，其中所述传感器选自由以下项组成的组：光学传感器、压力传感器、超声波传感器、热传感器以及它们的任何组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的连续转染系统，还包括处理器，其中所述处理器控制选自由以下项组成的组的一个或多个条件：液体进入所述第一输入管线和/或所述第二输入管线的流速、所述第一试剂壳体和/或所述第二试剂壳体中的任何内容物的温度、所述培养容器中的任何内容物、一个或多个传感器以及它们的任何组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的连续转染系统，其中所述系统是部分或完全自动化的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的连续转染系统，其中所述细胞培养容器是生物反应器。
9.根据权利要求8所述的连续转染系统，其中所述生物反应器包括搅拌元件。
10.根据权利要求9所述的连续转染系统，其中所述搅拌元件包括叶轮或搅拌器。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的连续转染系统，其中所述细胞培养容器包含大于约0.5升(L)的最大培养体积。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的连续转染系统，其中所述细胞培养容器包含选自由以下项组成的组的最大培养体积：约1L、约3L、约5L、约7L、约10L、约15L、约20L、约25L、约50L、约75L、约100L、约200L、约500L、约1,000L和约2,000L的最大培养体积。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的连续转染系统，其中被配置为控制所述流速的所述部件包括泵。
14.根据权利要求13所述的连续转染系统，其中所述系统包括至少两个泵。
15.根据权利要求13所述的连续转染系统，其中所述泵选自由以下项组成的组：注射器泵、蠕动泵、隔膜泵、真空泵、超高真空泵、抽吸泵、毛细管泵、提升泵和凸轮泵。
16.根据权利要求14所述的连续转染系统，其中所述至少两个泵包括控制流体通过所述第一输入管线的流量的第一泵和控制流体通过所述第二输入管线的流量的第二泵。
17.根据权利要求13所述的连续转染系统，其中所述泵包括控制流体通过所述第一输入管线、所述第二输入管线或所述第一输入管线和所述第二输入管线的所述流量的泵。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的连续转染系统，其中所述系统是封闭的无菌系统。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的连续转染系统，其中所述系统包括2条至10条输入管线。
20.根据权利要求1所述的连续转染系统，其中所述递送管线的内径范围为约1毫米(约0.04英寸)至约20毫米(约0.79英寸)。
21.一种用于用有效载荷转染细胞群的方法，所述方法包括：
a)提供根据权利要求1至20中任一项所述的连续转染系统；
b)提供包含有效载荷的第一试剂壳体，其中所述第一试剂壳体和所述第一输入管线流体地连接；
c)提供包含转染试剂的第二试剂壳体，其中所述第二试剂壳体和所述第二输入管线流体地连接；
d)提供所述培养容器，其中所述培养容器和所述递送管线流体地连接，并且其中所述培养容器包含细胞培养物，所述细胞培养物包含待用所述有效载荷转染的细胞群；
e)使所述有效载荷和所述转染试剂连续流入所述第一输入管线和所述第二输入管线，并以受控速率流入所述混合室，从而产生转染复合物；以及
f)使所述转染复合物以受控速率连续流动通过所述递送管线并进入所述细胞培养容器；
其中从形成所述转染复合物到将所述转染复合物递送至所述细胞培养容器中的时间量是能够调节的。
22.根据权利要求21所述的方法，其中从形成所述转染复合物到将所述转染复合物递送至所述细胞培养容器中的所述时间量是固定的。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述有效载荷选自由以下项组成的组：核酸、蛋白质、肽以及它们的任何组合。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述核酸选自由以下项组成的组：DNA、RNA或它们的组合。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述有效载荷包含核蛋白复合物。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述固定时间量在约1分钟至约24小时的范围内。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述固定时间量在约2分钟至约1小时的范围内。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中在将所述转染复合物递送至所述细胞培养物的过程中，搅拌或搅动所述细胞培养容器中的所述细胞培养物。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中所述培养容器包含细胞培养物，并且其中所述细胞培养物的细胞以约0.1×106个细胞/ml至约2.0×106个细胞/ml之间的密度存在。
30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述细胞培养容器包含选自由以下项组成的组的细胞培养物：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、外周血单核细胞(PBMC)、T细胞、大颗粒淋巴细胞(LGL)或天然杀伤(NK)细胞、B细胞以及它们的任何组合。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞培养物包含T细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述T细胞在与所述混合物接触之前被活化。
33.根据权利要求21所述的方法，其中所述连续转染系统包括至少两个泵。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述至少两个泵同时或串联操作。
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