CN117990671A - 一种Eu3+络合物在荧光检测羟基吲哚乙酸的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Eu3+络合物在荧光检测羟基吲哚乙酸中的应用，所述Eu3+络合物为Eu3+‑DPA复合探针，其中DPA为吡啶二羧酸。本发明提供了Eu3+络合物在荧光检测羟基吲哚乙酸中的应用，利用荧光探针Eu3+‑DPA与HIAA之间的内滤效应(IFE)，HIAA在遇到DPA和Eu3+的络合物时能够淬灭Eu3+的特征荧光。本发明以具有红色荧光、良好水溶性、分散性和特异性的Eu3+‑DPA复合探针为检测平台，其中DPA作为配体与Eu3+发生配位反应使Eu3+产生强烈的红色荧光，成功通过“天线效应”有效敏化Eu3+，实现对HIAA的特异性荧光淬灭检测，并且对HIAA的检出限低至0.28nM。
Description
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，具体涉及一种Eu3+络合物在荧光检测羟基吲哚乙酸的应用。
背景技术
人体中的神经递质及其代谢物参与许多生物和生理过程，通常与多种疾病有关，如类癌肿瘤、阿尔茨海默症、帕金森氏症和精神分裂症。类癌肿瘤是一种罕见的、生长缓慢的神经内分泌肿瘤，起源于肠嗜铬细胞，可参与任何器官。在过去的几十年里，类癌肿瘤的发病率有所增加，大约10-50％的类癌肿瘤患者可发展为类癌综合症，并伴有潮红和腹泻的特征。手术是一种治疗方法，但复发是常见的。因此开发一种类癌肿瘤的早期诊断是非常重要的。
血清素(5-HT)是一种中枢神经系统的神经递质，在多种生物学功能中起着关键作用，是检测类癌肿瘤的最具鉴别性的生物标志物。其代谢产物为羟基吲哚乙酸(HIAA)，随尿液排出。因此，可以通过检测尿液中HIAA的含量，早期诊断和监测类癌综合症患者。在过去的几年中，已经发现了检测HIAA的分析技术，如液相色谱质谱、液相色谱发光光谱和电化学分析。然而，这些方法通常需要昂贵的仪器和复杂的预处理过程、有毒的试剂和较长的分析时间。选择荧光检测法能够提高检测速度、简化仪器。
由于镧系离子具有独特的光谱性质如荧光寿命长、大斯托克斯位移和来源于f-f禁带跃迁的尖发射带，基于镧系离子的检测平台已经被广泛应用于生物检测。目前有研究表明通过“天线效应”即作为天线分子的发色团与镧系金属离子配位时，发色团能够将吸收的能量转移到镧系金属离子上，使镧系金属离子的特征荧光发生敏化，一旦破坏发色团的“天线效应”，镧系金属离子被敏化的荧光将发生猝灭，这有利于为荧光检测提供精准有效检测。但目前尚无关于敏化镧系离子应用于检测HIAA。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种Eu3+络合物在荧光检测羟基吲哚乙酸的应用。本发明的目的之二在于提供一种羟基吲哚乙酸的荧光检测方法。该方法是利用被DPA敏化的Eu3+对羟基吲哚乙酸进行荧光强度检测，具有检测速度快、特异性好、成本低的特点，为血清素代谢物HIAA的精准有效检测提供新的思路。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一方面提供了一种Eu3+络合物在荧光检测羟基吲哚乙酸的应用，所述Eu3 +络合物为Eu3+-DPA复合探针，其中DPA为吡啶二羧酸。
优选地，所述Eu3+-DPA复合探针是由如下步骤的制备方法制得：将Eu3+溶液与DPA溶液混合，制得复合探针。
本发明第二方面提供了一种羟基吲哚乙酸的荧光检测方法，包括如下步骤：
S1、将Eu3+溶液与DPA溶液混合，制得含有复合探针的反应溶液；
S2、将含羟基吲哚乙酸的待测样品加入到反应溶液中并混合均匀；
S3、在荧光激发下测试Eu3+的荧光强度，根据测得的荧光强度和对应的工作曲线，得到待测样品中羟基吲哚乙酸的浓度。
优选地，步骤S1中，所述Eu3+溶液的浓度为1-5mmol/L。
优选地，步骤S1中，所述Eu3+溶液由可溶性铕盐及其水合物配制得。
更优选地，步骤S1中，所述Eu3+溶液由Eu(NO3)3·6H2O配制得。
优选地，步骤S1中，所述DPA溶液的浓度为50-500μmol/L。
优选地，步骤S1中，所述反应溶液的组分还包括EDTA和PBS缓冲溶液。
更优选地，步骤S1中，将EDTA溶液、Eu3+溶液、PBS缓冲溶液和DPA溶液混合为反应体系溶液。进一步优选地，所述EDTA溶液的浓度为1-5mmol/L。
优选地，步骤S1中，所述Eu3+与DPA的用量摩尔比为100:(5-30)。
更优选地，所述Eu3+与DPA的摩尔比为100:(5-20)。
优选地，步骤S1中，所述Eu3+溶液的溶剂为水。
优选地，步骤S1中，所述DPA溶液的溶剂为水。
优选地，步骤S2中，所述含羟基吲哚乙酸的待测样品中羟基吲哚乙酸的浓度为0.001-200μmol/L。
优选地，步骤S2中，将含羟基吲哚乙酸的待测样品加入到反应溶液中，混合溶液稀释至0.5-5mL，随后混合均匀。
优选地，步骤S3中，以265nm为激发波长，获得扫描范围为550～650nm的荧光发射光谱。更优选地，在265m的紫外光激发下，产生位于593nm和616nm的发射峰。
优选地，步骤S3中，所述工作曲线是荧光强度比值与羟基吲哚乙酸浓度的标准曲线。
优选地，步骤S3中，所述Eu3+-DPA复合探针在检测羟基吲哚乙酸时，Eu3+的红色荧光逐渐减弱。
优选地，步骤S3中，所述测试在溶液pH为7-8的条件下进行反应。
本发明的有益效果是：
本发明提供了Eu3+络合物在荧光检测羟基吲哚乙酸的应用，利用荧光探针Eu3+-DPA与HIAA之间的内滤效应(IFE)，HIAA在遇到DPA和Eu3+的络合物时能够淬灭Eu3+的特征荧光。本发明以具有红色荧光、良好水溶性、分散性和特异性的Eu3+-DPA复合探针为检测平台，其中DPA作为配体与Eu3+发生配位反应使Eu3+产生强烈的红色荧光，成功通过“天线效应”有效敏化Eu3+，实现对HIAA的特异性荧光淬灭检测，并且对HIAA的检出限低至0.28nM。
附图说明
图1为HIAA样品加入Eu3+-DPA荧光探针反应前(左管)后(右管)紫外光照下照片；
图2为荧光工作曲线建立结果，其中，(a)为Eu3+-DPA对不同浓度HIAA响应的荧光发射光谱；(b)为不含HIAA荧光强度与含HIAA荧光强度的比值和HIAA浓度的线性关系图；
图3为检测体系中Eu3+-DPA对HIAA的选择性检测结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到或通过简单合成制备分离；所采用的工艺，如无特殊说明，均采用本领域的常规工艺。
实施例1
本发明的技术方案是基于DPA作为配体与Eu3+发生配位反应使Eu3+产生强烈的红色荧光，发射波长为593nm和616nm。将Eu3+-DPA探针与不同浓度的HIAA放置在pH为7.4的条件下进行反应，HIAA与探针反应时，Eu3+的红色荧光随着HIAA浓度的升高而降低，探针加入HIAA前与加入HIAA反应后的紫外光照下照片见图1，HIAA在遇到DPA和Eu3+的络合物时能够淬灭Eu3+的特征荧光。收集发射光谱616nm处的荧光强度，做出616nm处无HIAA的荧光强度和含HIAA的荧光强度的比值数据，通过该比值数据与HIAA的浓度呈现的线性关系，建立检测样品中HIAA的荧光分析法。
具体步骤如下：
1.试剂的配制
(1)2mmol/L Eu3+溶液的配制:用分析天平称取0.0446g Eu(NO3)3·6H2O固体加入到少量超纯水中稀释，转移进10mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度线，得到10mmol/L Eu3+溶液；取2mL的10mmol/L Eu3+溶液加入到少量超纯水中稀释，转移到10mL容量瓶中，加水定容至刻度线，得到2mmol/L Eu3+溶液。
(2)2mmol/L EDTA溶液的配制:用分析天平称取0.0372g二水乙二胺四乙酸二钠固体加入到少量超纯水中稀释，转移进10mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度线，得到10mmol/LEDTA溶液；取2mL 10mmol/L EDTA溶液加入到少量超纯水中稀释，转移到10mL容量瓶中，加水定容至刻度线，得到2mmol/L EDTA溶液。
(3)100μmol/L DPA溶液的配制：用分析天平称取0.0167g DPA固体加入到少量超纯水中稀释，转移进10mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度线，得到10mmol/L DPA溶液；取1mL10mmol/L DPA溶液加入到少量超纯水中稀释，转移到10mL容量瓶中，加水定容至刻度线，得到1mmol/L DPA溶液；取1mL 1mmol/L DPA溶液加入到少量超纯水中稀释，转移到10mL容量瓶中，加水定容至刻度线，得到100μmol/L DPA溶液。
(4)0.1-200μmol/L不同浓度的HIAA溶液的配制：用分析天平称取0.0191g HIAA固体加入到少量超纯水中稀释，转移进10mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度线，得到5mmol/LHIAA溶液；取2mL 5mmol/L HIAA溶液加入到少量超纯水中稀释，转移到10mL容量瓶中，加水定容至刻度线，得到1mmol/L HIAA溶液；取1mL 1mmol/L HIAA溶液加入到少量超纯水中稀释，转移到10mL容量瓶中，加水定容至刻度线，得到100μmol/L HIAA溶液；取1mL 100μmol/L HIAA溶液加入到少量超纯水中稀释，转移到10mL容量瓶中，加水定容至刻度线，得到10μmol/L HIAA溶液；取1mL 10μM HIAA溶液加入到少量超纯水中稀释，转移到10mL容量瓶中，加水定容至刻度线，得到1μmol/L HIAA溶液。采用上述方法可制得0.1-200μmol/L不同浓度的HIAA溶液。
2、将50μL 2mmol/L的EDTA溶液、50μL 2mmol/L的Eu3+溶液、100μL 10mmol/L的PBS缓冲溶液和110μL 100μmol/L的DPA溶液混合均匀制成反应溶液，将0.1-200μmol/L不同浓度的HIAA溶液加入到反应溶液中，加超纯水稀释至溶液总量为1mL，混合均匀后立即进行荧光测试，利用荧光分光光度计分别测量不同浓度HIAA体系中Eu3+的荧光强度；以265nm为激发波长，测定体系在616nm峰值处的荧光强度。另外空白组中不添加HIAA溶液，测量不含HIAA体系中Eu3+的荧光强度。
3、实验结果验证与分析：
(1)图2为荧光工作曲线建立结果，其中(a)为Eu3+-DPA对不同浓度HIAA响应的荧光发射光谱，随着HIAA浓度提升，Eu3+在616nm处的荧光强度逐渐下降；；(b)为关于(a)的线性关系图，线性工作曲线为y＝0.00874x+0.999，其中y为不含HIAA荧光强度与含HIAA荧光强度的比值，x为HIAA浓度相关系数，R2为0.999，R2值越接近1说明拟合程度越好，表明616nm处不含HIAA荧光强度与含HIAA荧光强度的比值与HIAA浓度呈现的良好的线性关系，线性范围为0.1～200μM，检出限为0.28nM，适用于可用常量、微量、痕量的物质分析。
(2)HIAA检测的选择性测试
实验分析Eu3+-DPA复合探针选择性检测5-HIAA的潜力，通常存在于尿液中的其它成分包括肌酸、肌酐、组氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、酪氨酸、尿素、葡萄糖、氯化铵、氯化钠、氢氧化镁和硫酸钠。
将2mmol/L的EDTA溶液、2mmol/L的Eu3+溶液、10mmol/L的PBS缓冲溶液和100μmol/L的DPA溶液混合均匀制成反应溶液，分别将HIAA(200μmol/L)溶液和其它尿液成分(200μmol/L)的溶液加入到反应溶液中，加超纯水稀释至溶液总量为1mL，混合均匀后进行荧光测试，利用荧光分光光度计分别测量HIAA和其它成分对Eu3+荧光强度的影响。结果如图3所示，只有HIAA引起616nm处不含HIAA荧光强度与含HIAA荧光强度的比值明显增加，表明Eu3+-DPA复合探针对HIAA表现出高响应性和选择性。
(3)Eu3+-DPA复合探针在尿液样本中的实际应用
将2mmol/L的EDTA溶液、2mmol/L的Eu3+溶液、10mmol/L的PBS缓冲溶液和100μmol/L的DPA溶液混合均匀制成反应溶液，分别将含HIAA的尿液样本加入到反应溶液中，加超纯水稀释至溶液总量为1mL，混合均匀后进行荧光测试，利用荧光分光光度计测量HIAA对Eu3+荧光强度的影响。
加标后的尿液样本用ICP-MS检测HIAA浓度与上述方法用Eu3+-DPA复合探针检测HIAA浓度做比较，根据检测结果利用3(1)所得线性方程式计算得出实际检出浓度，据此计算加标回收率.，具体结果如表1所示：
表1实际样品中HIAA的含量、回收率(n＝3)
本实施例用Eu3+-DPA复合探针检测到尿液样品中HIAA的量的回收率为95.92％至105.72％，表明了Eu3+-DPA复合探针可用于定量检测尿液中的HIAA。
综上所述，本发明提供了Eu3+络合物在荧光检测羟基吲哚乙酸中的应用，利用荧光探针Eu3+-DPA与HIAA之间的内滤效应(IFE)，HIAA在遇到DPA和Eu3+的络合物时能够淬灭Eu3+的特征荧光。本发明以具有红色荧光、良好水溶性、分散性和特异性的Eu3+-DPA复合探针为检测平台，其中DPA作为配体与Eu3+发生配位反应使Eu3+产生强烈的红色荧光，成功通过“天线效应”有效敏化Eu3+，实现对HIAA的特异性荧光淬灭检测，并且对HIAA的检出限低至0.28nM，在选择性测试中对HIAA表现出高响应性和选择性，可结合ICP-MS检测实现对HIAA的高效准确检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种Eu3+络合物在荧光检测羟基吲哚乙酸的应用，其特征在于，所述Eu3+络合物为Eu3 +-DPA复合探针，其中DPA为吡啶二羧酸。
2.根据权利要求1所述的Eu3+络合物在荧光检测羟基吲哚乙酸的应用，其特征在于，所述Eu3+-DPA复合探针是由如下步骤的制备方法制得：将Eu3+溶液与DPA溶液混合，制得复合探针。
3.一种羟基吲哚乙酸的荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将Eu3+溶液与DPA溶液混合，制得含有Eu3+-DPA复合探针的反应溶液；
S2、将含羟基吲哚乙酸的待测样品加入到反应溶液中并混合均匀；
S3、在荧光激发下测试Eu3+的荧光强度，根据测得的荧光强度和对应工作曲线，得到待测样品中羟基吲哚乙酸的浓度。
4.根据权利要求3所述的羟基吲哚乙酸的荧光检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述反应溶液的组分还包括EDTA和PBS缓冲溶液。
5.根据权利要求3所述的羟基吲哚乙酸的荧光检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述Eu3+与DPA的用量摩尔比为100:(5-30)。
6.根据权利要求3所述的羟基吲哚乙酸的荧光检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述Eu3+溶液的溶剂为水；
和/或，所述DPA溶液的溶剂为水。
7.根据权利要求3所述的羟基吲哚乙酸的荧光检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述Eu3+溶液由可溶性铕盐及其水合物配制得。
8.根据权利要求3所述的羟基吲哚乙酸的荧光检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述含羟基吲哚乙酸的待测样品中羟基吲哚乙酸的浓度为0.001-200μmol/L。
9.根据权利要求3所述的羟基吲哚乙酸的荧光检测方法，其特征在于，步骤S3中，以265nm为激发波长，获得扫描范围为550～650nm的荧光发射光谱。
10.根据权利要求3所述的羟基吲哚乙酸的荧光检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述工作曲线是荧光强度比值与羟基吲哚乙酸浓度的标准曲线。
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