CN117987590A - 小麦TaOSBP-4B基因分子标记在鉴定穗长和产量性状中的应用 - Google Patents
小麦TaOSBP-4B基因分子标记在鉴定穗长和产量性状中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了小麦TaOSBP‑4B基因分子标记在鉴定穗长和产量性状中的应用。本发明属于生物技术领域，尤其涉及小麦TaOSBP‑4B基因分子标记在鉴定穗长和产量性状中的应用。本发明的检测小麦基因组中SNP的多态性或基因型的物质或检测单倍型的物质可应用于鉴定或辅助鉴定小麦产量及小麦育种。其中SNP为如下四种：SNP1为序列表中序列1的第726‑734位核苷酸，其核苷酸种类为含有5’‑CACCACCAC‑3’或缺失，SNP2为序列1的第1128位核苷酸，为G或A，SNP3为序列1的第10620位核苷酸，为A或G，SNP4为序列1的第10626位核苷酸，为A或G。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及小麦TaOSBP-4B基因分子标记在鉴定穗长和产量性状中的应用。
背景技术
小麦是世界上重要的粮食作物之一，提高小麦产量已成为小麦育种的关键目标。传统基于表型选择的育种方法，存在育种周期长、效率低等劣势。利用分子标记辅助育种能够极大缩短育种年限，提高育种效率。亩穗数、穗粒数和千粒重是小麦的产量三要素，共同决定了最终产量。小麦穗长是重要的穗部性状，具有较高遗传力，与穗粒数呈显著正相关。因此，挖掘控制穗长性状的基因，开发相应分子标记，可为小麦高产育种提供准确有效的途径。
氧化固醇结合蛋白OSBP广泛存在于酵母、植物和哺乳动物中，在信号转导和脂质代谢等多种细胞活动和响应逆境胁迫调控网络中发挥着重要作用，可显著提高拟南芥、马铃薯、大豆的抗逆性，但有关小麦TaOSBP-4B基因的研究未见报道。因此，开展小麦TaOSBP-4B基因与农艺性状关系的研究及开发实用性分子标记可为小麦遗传改良和分子标记辅助育种提供有效的标记资源。
发明内容
本发明所要解决的主要问题是如何快速高效鉴定小麦穗长和产量性状。
为了解决上述问题，本发明提供了一种检测小麦基因组中SNP的多态性或基因型的物质或检测单倍型的物质的应用。
本发明提供的检测小麦基因组中SNP的多态性或基因型的物质或检测单倍型的物质在如下任一中的应用，
(1)鉴定或辅助鉴定小麦产量；
(2)筛选或选育高产量的小麦单株或株系或品系或品种；
(4)小麦育种；
(5)制备鉴定或辅助鉴定小麦产量的产品；
(6)制备筛选或选育高产量的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(7)制备小麦育种的产品。
以中国春基因组参考序列，小麦TaOSBP-4B基因(基因组核苷酸序列为序列1(SEQIDNo.1))有4处改变氨基酸的SNP，分别位于序列1第726-734位(含有核苷酸序列5’-CACCACCAC-3’/缺失核苷酸序列5’-CACCACCAC-3’)、第1128位(G/A)、第10620位(A/G)和第10626位(A/G)，对应中国春参考基因组序列RefSeq v1.0中的物理位置分别为28950085-28950093、28950487、28959979、28959985。四个SNP位点对应的分子标记分别命名为SNP-726(简称SNP1)、SNP-1128(简称SNP2)、SNP-10620(简称SNP3)、SNP-10626(简称SNP4)。序列1中，r表示a或g。
所述SNP为小麦基因组中的名称分别为SNP1、SNP2、SNP3和SNP4这四个SNP，所述SNP1为序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸，其核苷酸种类为含有5’-CACCACCAC-3’或缺失5’-CACCACCAC-3’，所述SNP2为序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸，其核苷酸种类为G或A，所述SNP3为序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸，其核苷酸种类为A或G，所述SNP4为序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸，其核苷酸种类为A或G；
所述单倍型是小麦一条染色体上所述SNP1和所述SNP2和所述SNP3和所述SNP4这4个SNP的多态性组合。
本发明还提供了鉴定或辅助鉴定小麦产量的方法，所述方法可为方法A或方法B：
所述方法A为鉴定或辅助鉴定小麦产量的方法，包括检测待测小麦中前文所述SNP的基因型，根据所述待测小麦的所述基因型鉴定或辅助鉴定小麦产量：所述基因型为AAAAGGGG的小麦的产量高于或候选高于基因型为AAGGAAAA的小麦和基因型为BBGGAAAA的小麦；
所述AAAAGGGG是所述SNP1的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP3的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP4的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为G的纯合型)的4个SNP组合基因型；
所述AAGGAAAA是所述SNP1的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP3的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP4的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为A的纯合型)的4个SNP组合基因型；
所述BBGGAAAA是所述SNP1的基因型为BB(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP3的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP4的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为A的纯合型)的4个SNP组合基因型。
所述方法B为鉴定或辅助鉴定小麦产量的方法，包括检测待测小麦中前文所述单倍型，根据所述待测小麦的单倍型鉴定或辅助鉴定小麦产量：单倍型Hap1对应的纯合基因型小麦产量高于或候选高于单倍型Hap2对应的纯合基因型小麦和单倍型Hap3对应的纯合基因型小麦；所述单倍型Hap1为所述SNP1为缺失5’-CACCACCAC-3’且所述SNP2的碱基为A且所述SNP3的碱基为G且所述SNP4的碱基为G的单倍型，所述单倍型Hap2为所述SNP1为缺失5’-CACCACCAC-3’且所述SNP2的碱基为G且所述SNP3的碱基为A且所述SNP4的碱基为A的单倍型，所述单倍型Hap3为所述SNP1为含有5’-CACCACCAC-3’且所述SNP2的碱基为G且所述SNP3的碱基为A且所述SNP4的碱基为A的单倍型。
上述应用或方法中，所述小麦为小麦自交系。
本发明还提供了上述鉴定方法在小麦育种中的应用。
本发明还提供了小麦育种的方法，所述方法为M1和M2：
M1、所述方法包括检测小麦基因组中前文所述SNP的基因型，选择所述SNP的基因型为AAAAGGGG小麦作为亲本进行育种，所述AAAAGGGG基因型是所述SNP1为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型，且所述SNP2为A的纯合型，且所述SNP3为G的纯合型，且所述SNP4为G的纯合型，所述方法的育种的目包括选育高产量的小麦；
M2、所述方法包括检测小麦基因组中前文所述的单倍型的类型，选择单倍型Hap1的小麦作为亲本进行育种，所述单倍型Hap1为所述SNP1为缺失5’-CACCACCAC-3’且所述SNP2的碱基为A且所述SNP3的碱基为G且所述SNP4的碱基为G的单倍型。
本发明还提供了用于检测前文所述SNP的多态性或基因型的产品，所述产品含有前文所述物质，所述产品可为任一种：
C1)检测小麦产量相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
C2)鉴定或辅助鉴定小麦产量的产品；
C3)用于小麦育种的产品；
C4)筛选或选育高产量的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
上述应用或产品中，所述物质可为如下D1)、D2)或D3)：
D1)所述物质为扩增包括所述SNP1在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物、扩增包括所述SNP2在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物、扩增所述SNP3在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物和扩增包括所述SNP4在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物；
D2)所述物质为含有D1)所述引物组合物的PCR试剂；
D3)所述物质为含有D1)所述引物组合物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
上述应用或产品中，1)扩增包括所述SNP1在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物由引物F1-A和引物F1-B组成；2)扩增包括所述SNP2在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物由引物F2-A和引物F2-B组成；3)扩增包括所述SNP3和所述SNP4在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物由引物F3-A和引物F3-B组成；
所述引物F1-A为核苷酸序列是序列表中序列22的单链DNA分子；
所述引物F1-B为核苷酸序列是序列表中序列23的单链DNA分子；
所述引物F2-A为核苷酸序列是序列表中序列4的单链DNA分子；
所述引物F2-B为核苷酸序列是序列表中序列5的单链DNA分子；
所述引物F3-A为核苷酸序列是序列表中序列20的单链DNA分子；
所述引物F3-B为核苷酸序列是序列表中序列21的单链DNA分子。
采用分子标记SNP1、SNP2、SNP3和SNP4的引物组进行PCR扩增，依次得到扩增产物A、B、C、D。
所述PCR扩增反应体系为25μL，组分包括：2μLDNA，8μLddHap-2O，上下引物各1μL，13μL 2×Taq Master Mix。
所述PCR扩增反应条件为：95℃5min，95℃30S，61℃30S，72℃15S，36个循环，72℃10min，4℃保存。
所述PCR结果判定如下：
1)若所述PCR产物A为310bp，酶切产物E为663bp和134bp，酶切产物F为406bp和437bp，酶切产物G为412bp、285bp、146bp，则待检样品的基因型为Hap-1，Hap-1的基因型具体为AAAAGGGG，其中所述SNP1的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP3的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP4的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为G的纯合型)的4个SNP组合基因型。
2)若所述PCR产物A为310bp，酶切产物E为797bp，酶切产物F为843bp，酶切产物G为558bp、285bp，则待检样品的基因型为Hap-2，Hap-2的基因型具体为AAGGAAAA，其中所述SNP1的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP3的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP4的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为A的纯合型)的4个SNP组合基因型。
3)若所述PCR产物A为319bp，酶切产物E为797bp，酶切产物F为843bp，酶切产物G为558bp、285bp，则待检样品的基因型为Hap-3，Hap-3的基因型具体为5’-CACCACCAC-3’、G、A、A，其中所述SNP1的基因型为BB(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为含有5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为G(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP3的基因型为A(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP4的基因型为A(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为A的纯合型)的4个SNP组合基因型。
本发明还提供了一种DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列是序列表中的序列1。
本发明还提供了所述的DNA分子在如下任一中的应用，
(1)鉴定或辅助鉴定小麦产量；
(2)筛选或选育高产量的小麦单株或株系或品系或品种；
(3)小麦育种；
(4)制备鉴定或辅助鉴定小麦产量的产品；
(5)制备筛选或选育高产量的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(6)制备小麦育种的产品。
本发明中，所述产量性状具体可为穗长、小穗数、穗粒数、千粒重。
本发明通过克隆小麦TaOSBP-4B基因，发现有4处氨基酸改变的SNP，分别位于序列1的第726-734位、第1128位、第10620位和第10626位，这4个SNP存在3种单倍型：单倍型Hap-1(缺失5’-CACCACCAC-3’、A、G、G)、单倍型Hap-2(缺失5’-CACCACCAC-3’、G、A、A)和单倍型Hap-3(5’-CACCACCAC-3’、G、A、A)。通过关联分析证明及自然群体验证，这3种单倍型的纯合类型中，Hap-1的穗长、小穗数、穗粒数、千粒重均显著高于Hap-3，Hap-1的穗长显著高于Hap-2，Hap-1和Hap-2的小穗数、穗粒数、千粒重之间没有显著差异，Hap-2和Hap-3的穗长、小穗数、穗粒数、千粒重之间没有显著差异。通过实验证明：本发明提供的小麦TaOSBP-4B基因分子标记SNP-726(简称SNP1)、SNP-1128(简称SNP2)、SNP-10620(简称SNP3)、SNP-10626(简称SNP4)，可以快速筛选出小麦穗长和产量相关性状，在分子标记辅助育种过程种具有重要的应用价值，对小麦品种的遗传改良有重要意义。
附图说明
图1为TaOSBP-4B基因组序列中SNP位点示意图。其中(a)为TaOSBP-4B基因结构示意图；(b)为TaOSBP-4B基因引起氨基酸改变的SNP及其位点示意图。
图2为实施例1的分子标记电泳图。其中(a)为分子标记SNP1的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；(b)为分子标记SNP2的琼脂糖凝胶电泳图；(c)为分子标记SNP3的琼脂糖凝胶电泳图；(d)为分子标记SNP4的琼脂糖凝胶电泳图；其中1-6号泳道样品分别为徐麦24、扬麦158、冀麦19、冀麦23、冀麦31、冀麦32。
图3为自然群体中TaOSBP-4B基因三种单倍型穗长和产量性状统计结果；其中(a)为TaOSBP-4B基因三种单倍型穗长的统计结果；(b)为TaOSBP-4B基因三种单倍型千粒重的统计结果；(c)为TaOSBP-4B基因三种单倍型每穗小穗数的统计结果；(d)为TaOSBP-4B基因三种单倍型每穗穗粒数的统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例1中的小麦品种武农988为审定品种，于2021年通过国家农作物品种审定委员会审定，品种审定编号为国审麦20210153。
下述实施例2中的小麦自然群体中小麦品种来自于国家种质资源库，公众可从国家种质资源库获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例采用SPSS26统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异，P＞0.05(ns)表示不具有显著性差异。
实施例1、穗长和产量相关基因TaOSBP-4B基因多态性位点(SNP)及单倍型的获得
一、TaOSBP-4B基因多态性位点的获得
(1)提取小麦品种武农988(国审麦20210153)的基因组DNA；
(2)根据中国春基因组参考序列设计克隆TaOSBP-4B(基因组核苷酸序列为序列1)的特异性引物，引物序列如下：
SeqOSBP-4B-1F:5’-ACCCAGCCAGCAGTTCATTA-3’(序列2)
SeqOSBP-4B-1R:5’-GCCAACCACCGATTTCGTTT-3’(序列3)
SeqOSBP-4B-2F:5’-GCATCTCGGGGGTCCTCTA-3’(序列4)
SeqOSBP-4B-2R:5’-GCAAGGTCGGATAAATGTGA-3’(序列5)
SeqOSBP-4B-3F:5’-CCTTGACACTCTTCCAACGC-3’(序列6)
SeqOSBP-4B-3R:5’-ACCTATCCACTCCTCGTCCC-3’(序列7)
SeqOSBP-4B-4F:5’-GGAGTCCTTGGTGTTCCTTCC-3’(序列8)
SeqOSBP-4B-4R:5’-GGAGTAGATGACACAGCGCA-3’(序列9)
SeqOSBP-4B-5F:5’-GGTTATCGTTATCTCCTGCGT-3’(序列10)
SeqOSBP-4B-5R:5’-CTTACTTTGTGCTAAGGCTAG-3’(序列11)
SeqOSBP-4B-6F:5’-CCACTGTTCATTCTCGCAAC-3’(序列12)
SeqOSBP-4B-6R:5’-TATACCTGATGAGGATTGCG-3’(序列13)
SeqOSBP-4B-7F:5’-AGTGAGTTTGTGTACCGTAA-3’(序列14)
SeqOSBP-4B-7R:5’-ACATCACATTGAACACCCAC-3’(序列15)
SeqOSBP-4B-8F:5’-AGCCAAATGTAGGACACTGC-3’(序列16)
SeqOSBP-4B-8R:5’-CATTTACCAAAGAGCGTAGC-3(序列17)
SeqOSBP-4B-9F:5’-TCGAACTGTTGCTACGCTCT-3’(序列18)
SeqOSBP-4B-9R:5’-TGCACAACAAGGCGTAGGTT-3’(序列19)
SeqOSBP-4B-10F:5’-TGAGCATCACATTGGTGAAG-3’(序列20)
SeqOSBP-4B-10R:5’-GAATAGACTTCAGGGGCAAA-3’(序列21)
(3)利用小麦品种武农988的基因组DNA为模版，采用引物SeqOSBP-4B-1F/R、SeqOSBP-4B-2F/R、SeqOSBP-4B-3F/R、SeqOSBP-4B-4F/R、SeqOSBP-4B-5F/R、SeqOSBP-4B-6F/R、SeqOSBP-4B-7F/R、SeqOSBP-4B-8F/R、SeqOSBP-4B-9F/R、SeqOSBP-4B-10F/R进行PCR扩增，得到PCR产物，进行测序比对。
(4)反应体系为25μL，组分包括：2μLDNA，8μLddHap-2O，上下引物各1μL，13μL 2×Taq Master Mix。
(5)反应条件为：95℃5min，95℃30S，61℃30S，72℃15S，36个循环，72℃10min，4℃保存。
序列比对发现：小麦TaOSBP-4B基因(基因组核苷酸序列为序列1)有4处改变氨基酸的SNP，分别位于序列1第726-734(含有核苷酸序列5’-CACCACCAC-3’/缺失核苷酸序列5’-CACCACCAC-3’)、1128(G/A)、10620(A/G)和10626(A/G)位，对应中国春参考基因组序列RefSeq v1.0中的物理位置分别为28950085-28950093、28950487、28959979、28959985。四个SNP位点对应的分子标记分别命名为SNP-726(简称SNP1)、SNP-1128(简称SNP2)、SNP-10620(简称SNP3)、SNP-10626(简称SNP4)。序列1中，r表示a或g。
二、TaOSBP-4B基因分子标记的获得及其在鉴定单倍型中的应用
1、TaOSBP-4B基因分子标记的获得
(1)根据序列比对的结果所述的TaOSBP-4B基因的第726-734、1128、10620和10626位SNP位点，分别设计了分子标记SNP1、SNP2、SNP3和SNP4，标记引物序列如下：
SNP1-F(简称F1-A)：5’-GGCGTGCTCTCCTACTACAA-3’(序列22)
SNP1-R(简称F1-B)：5’-AAGGTCATCGGCGAGGACTC-3’(序列23)
SeqOSBP-4B-2F(简称F2-A):5’-GCATCTCGGGGGTCCTCTA-3’(序列4)
SeqOSBP-4B-2R(简称F2-B):5’-GCAAGGTCGGATAAATGTGA-3’(序列5)
SeqOSBP-4B-10F(简称F3-A):5’-TGAGCATCACATTGGTGAAG-3’(序列20)
SeqOSBP-4B-10R(简称F3-B):5’-GAATAGACTTCAGGGGCAAA-3’(序列21)
其中扩增包括SNP1在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物由引物F1-A和引物F1-B组成；2)扩增包括SNP2在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物由引物F2-A和引物F2-B组成；3)扩增包括SNP3和SNP4在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物由引物F3-A、引物F3-B组成。
(2)以徐麦24、扬麦158、冀麦19、冀麦23、冀麦31、冀麦32(来自于国家种质资源库)基因组DNA为模板，采用分子标记SNP1、SNP2、SNP3和SNP4的引物组进行PCR扩增，依次得到扩增产物A、B、C、D。
(3)反应体系为25μL，组分包括：2μLDNA，8μLddHap-2O，上下引物各1μL，13μL2×Taq Master Mix。
(4)反应条件为：95℃5min，95℃30S，61℃30S，72℃15S，36个循环，72℃10min，4℃保存。
(5)经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物A，结果如图2中(a)所示；经限制性内切酶BSrDI酶切扩增产物B得到酶切产物E，结果如图2中(b)所示；经限制性内切酶AluI酶切扩增产物C得到酶切产物F，结果如图2中(c)所示；经限制性内切酶MWOI酶切扩增产物D，得到酶切产物G，结果如图2中(d)所示。
PCR结果判定如下：
1)若PCR产物A为310bp，酶切产物E为663bp和134bp，酶切产物F为406bp和437bp，酶切产物G为412bp、285bp、146bp，则待检样品的基因型为Hap-1，Hap-1的基因型具体为AAAAGGGG，其中所述SNP1的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP3的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP4的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为G的纯合型)的4个SNP组合基因型。
2)若PCR产物A为310bp，酶切产物E为797bp，酶切产物F为843bp，酶切产物G为558bp、285bp，则待检样品的基因型为Hap-2，Hap-2的基因型具体为AAGGAAAA，其中所述SNP1的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP3的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP4的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为A的纯合型)的4个SNP组合基因型。
3)若PCR产物A为319bp，酶切产物E为797bp，酶切产物F为843bp，酶切产物G为558bp、285bp，则待检样品的基因型为Hap-3，Hap-3的基因型具体为5’-CACCACCAC-3’、G、A、A，其中所述SNP1的基因型为BB(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为含有5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为G(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP3的基因型为A(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP4的基因型为A(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为A的纯合型)的4个SNP组合基因型。
2、TaOSBP-4B基因分子标记在鉴定单倍型中的应用
根据步骤1中的PCR产物/酶切产物判断待检样品的基因型为Hap-1、Hap-2或Hap-3，具体步骤如下：
(1)提取待检小麦样品籽粒基因组DNA；
(2)以待检小麦样品籽粒基因组DNA为模板，采用分子标记SNP1、SNP2、SNP3和SNP4的引物对进行PCR扩增，依次得到扩增产物A、B、C、D。
(3)经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物A；限制性内切酶BSrDI酶切扩增产物B，得到酶切产物E；经限制性内切酶AluI酶切扩增产物C，得到酶切产物F；经限制性内切酶MWOI酶切扩增产物D，得到酶切产物G。
待检样品的基因型结果判定如下：
1)若PCR产物A为310bp，酶切产物E为663bp和134bp,酶切产物F为406bp和437bp，酶切产物G为412bp、285bp、146bp，则待检样品的基因型为Hap-1，Hap-1的基因型具体为AAAAGGGG，其中所述SNP1的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP3的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP4的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为G的纯合型)的4个SNP组合基因型。
2)若PCR产物A为310bp，酶切产物E为797bp，酶切产物F为843bp，酶切产物G为558bp、285bp，则待检样品的基因型为Hap-2，Hap-2的基因型具体为AAGGAAAA。其中所述SNP1的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP3的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP4的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为A的纯合型)的4个SNP组合基因型
3)若PCR产物A为319bp，酶切产物E为797bp，酶切产物F为843bp，酶切产物G为558bp、285bp，则待检样品的基因型为Hap-3，Hap-3的基因型具体为BBGGAAAA，其中所述SNP1的基因型为BB(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为含有5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP3的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP4的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为A的纯合型)的4个SNP组合基因型。
实施例2、单倍型与小麦穗长和产量性状的U检验
利用实施例1中的4个分子标记SNP-726(简称SNP1)、SNP-1128(简称SNP2)、SNP-10620(简称SNP3)、SNP-10626(简称SNP4)对自然群体(表1)进行基因分型，并对基因型和穗长、小穗数、穗粒数、千粒重性状做U检验。具体步骤如下：
1、基因分型
以333份地方和育成小麦品种构成的自然群体(来自于国家种质资源库)为待检样品，根据实施例1中建立的方法进行基因分型，判断每个待检样品的基因型为Hap-1、Hap-2还是Hap-3。检测结果如表1所示。
表1、自然群体单倍型及小麦性状统计结果
二、单倍型与小麦穗长和产量性状的U检验
在2022-2023年，自然群体种植于在安徽农业大学教学实验基地(淮北濉溪县五铺农场)。期间调查各小麦品种的穗长、小穗数、穗粒数和千粒重。利用U检验对实施例1所述三种单倍型Hap-1、Hap-2和Hap-3与穗长和产量性状进行关联分析。自然群体中三种单倍型与穗长和产量性状统计结果如表1和图3所示。
Hap-1的穗长、小穗数、穗粒数、千粒重显著高于Hap-3，Hap-1的穗长显著高于Hap-2，Hap-1和Hap-2的小穗数、穗粒数、千粒重之间没有显著差异，Hap-2和Hap-3的穗长、小穗数、穗粒数、千粒重之间没有显著差异。表明本发明中的小麦TaOSBP-4B基因分子标记SNP-726(简称SNP1)、SNP-1128(简称SNP2)、SNP-10620(简称SNP3)、SNP-10626(简称SNP4)能够很好区分优异单倍型Hap-1，能够在选育大穗高产小麦品种中起到作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.检测小麦基因组中SNP的多态性或基因型的物质或检测单倍型的物质在如下任一中的应用，
(1)鉴定或辅助鉴定小麦产量；
(2)筛选或选育高产量的小麦单株或株系或品系或品种；
(4)小麦育种；
(5)制备鉴定或辅助鉴定小麦产量的产品；
(6)制备筛选或选育高产量的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(7)制备小麦育种的产品；
所述SNP为小麦基因组中的名称分别为SNP1、SNP2、SNP3和SNP4这四个SNP，所述SNP1为序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸，其核苷酸种类为含有5’-CACCACCAC-3’或缺失5’-CACCACCAC-3’，所述SNP2为序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸，其核苷酸种类为G或A，所述SNP3为序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸，其核苷酸种类为A或G，所述SNP4为序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸，其核苷酸种类为A或G；
所述单倍型是小麦一条染色体上所述SNP1和所述SNP2和所述SNP3和所述SNP4这4个SNP的多态性组合。
2.鉴定或辅助鉴定小麦产量的方法，所述方法为方法A或方法B，
所述方法A为鉴定或辅助鉴定小麦产量的方法，包括检测待测小麦中权利要求1中所述SNP的基因型，根据所述待测小麦的所述基因型鉴定或辅助鉴定小麦产量：所述基因型为AAAAGGGG的小麦的产量高于或候选高于基因型为AAGGAAAA的小麦和基因型为BBGGAAAA的小麦；
所述AAAAGGGG是所述SNP1的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP3的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP4的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为G的纯合型)的4个SNP组合基因型；
所述AAGGAAAA是所述SNP1的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP3的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP4的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为A的纯合型)的4个SNP组合基因型；
所述BBGGAAAA是所述SNP1的基因型为BB(序列表中SEQ ID No.1的第726-734位核苷酸为5’-CACCACCAC-3’的纯合型)且所述SNP2的基因型为GG(序列表中SEQ ID No.1的第1128位核苷酸为G的纯合型)且所述SNP3的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10620位核苷酸为A的纯合型)且所述SNP4的基因型为AA(序列表中SEQ ID No.1的第10626位核苷酸为A的纯合型)的4个SNP组合基因型；
所述方法B为鉴定或辅助鉴定小麦产量的方法，包括检测待测小麦中权利要求1中所述单倍型，根据所述待测小麦的单倍型鉴定或辅助鉴定小麦产量：单倍型Hap1对应的纯合基因型小麦产量高于或候选高于单倍型Hap2对应的纯合基因型小麦和单倍型Hap3对应的纯合基因型小麦；所述单倍型Hap1为所述SNP1为缺失5’-CACCACCAC-3’且所述SNP2的碱基为A且所述SNP3的碱基为G且所述SNP4的碱基为G的单倍型，所述单倍型Hap2为所述SNP1为缺失5’-CACCACCAC-3’且所述SNP2的碱基为G且所述SNP3的碱基为A且所述SNP4的碱基为A的单倍型，所述单倍型Hap3为所述SNP1为含有5’-CACCACCAC-3’且所述SNP2的碱基为G且所述SNP3的碱基为A且所述SNP4的碱基为A的单倍型。
3.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的方法，其特征在于：所述小麦为小麦自交系。
4.权利要求2或3所述的方法在小麦育种中的应用。
5.小麦育种的方法，其特征在于：所述方法为M1和M2：
M1、所述方法包括检测小麦基因组中权利要求1中所述SNP的基因型，选择所述SNP的基因型为AAAAGGGG小麦作为亲本进行育种，所述AAAAGGGG基因型是所述SNP1为缺失5’-CACCACCAC-3’的纯合型，且所述SNP2为A的纯合型，且所述SNP3为G的纯合型，且所述SNP4为G的纯合型，所述方法的育种的目包括选育高产量的小麦；
M2、所述方法包括检测小麦基因组中权利要求1中所述的单倍型的类型，选择单倍型Hap1的小麦作为亲本进行育种，所述单倍型Hap1为所述SNP1为缺失5’-CACCACCAC-3’且所述SNP2的碱基为A且所述SNP3的碱基为G且所述SNP4的碱基为G的单倍型。
6.用于检测权利要求1中所述SNP的多态性或基因型的产品，所述产品含有权利要求1中所述物质，所述产品为任一种：
C1)检测小麦产量相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
C2)鉴定或辅助鉴定小麦产量的产品；
C3)用于小麦育种的产品；
C4)筛选或选育高产量的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
7.根据权利要求1所述的应用或权利要求6所述的产品，其特征在于：所述物质为如下D1)、D2)或D3)：
D1)所述物质为扩增包括所述SNP1在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物、扩增包括所述SNP2在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物、扩增所述SNP3在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物和扩增包括所述SNP4在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物；
D2)所述物质为含有D1)所述引物组合物的PCR试剂；
D3)所述物质为含有D1)所述引物组合物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的应用或产品，其特征在于：1)扩增包括所述SNP1在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物由引物F1-A和引物F1-B组成；2)扩增包括所述SNP2在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物由引物F2-A和引物F2-B组成；3)扩增包括所述SNP3和所述SNP4在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物由引物F3-A和引物F3-B组成；
所述引物F1-A为核苷酸序列是序列表中序列22的单链DNA分子；
所述引物F1-B为核苷酸序列是序列表中序列23的单链DNA分子；
所述引物F2-A为核苷酸序列是序列表中序列4的单链DNA分子；
所述引物F2-B为核苷酸序列是序列表中序列5的单链DNA分子；
所述引物F3-A为核苷酸序列是序列表中序列20的单链DNA分子；
所述引物F3-B为核苷酸序列是序列表中序列21的单链DNA分子。
9.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的核苷酸序列是序列表中的序列1。
10.权利要求9所述的DNA分子在如下任一中的应用，
(1)鉴定或辅助鉴定小麦产量；
(2)筛选或选育高产量的小麦单株或株系或品系或品种；
(3)小麦育种；
(4)制备鉴定或辅助鉴定小麦产量的产品；
(5)制备筛选或选育高产量的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(6)制备小麦育种的产品。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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