CN117987445A - 一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达方法及其应用 - Google Patents
一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达和纯化方法。本发明通过构建不同的表达质粒，通过筛选分析，结果显示含中低拷贝BBR 1复制子的表达质粒及高丝氨酸内酯受体编码基因自身启动子驱动的表达质粒能获得更高活性的高丝氨酸内酯受体，且无需诱导剂诱导；随后通过离子交换层析和分子排阻层析，获得了纯度高的蛋白，凝胶阻滞实验表明通过该方法纯化的高丝氨酸内酯受体能很好的与其靶探针结合。本发明提供的这种方法可以解决高丝氨酸内酯受体在大肠杆菌中包涵体表达的问题，为细菌群体感应抑制剂筛选、开展高丝氨酸内酯受体结构研究提供物质基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
高丝氨酸内酯是一类小的中性脂质分子，变形菌门中的细菌能用它们来感知细胞密度并发出细胞密度信号，而这种信号传递的过程又被称为群体感应。细菌能通过群体感应系统激活多样化导向群体生活方式的分化，包括毒力因子分泌、抗生素合成、生物膜形成等。高丝氨酸内酯由高丝氨酸内酯合成酶催化合成，一旦开始合成，高丝氨酸内酯能通过被动扩散和主动运输机制进出细胞。在给定的细胞阈值数下，高丝氨酸内酯的最终浓度达到足够高的水平，进而被高丝氨酸内酯受体识别，后者是群体感应系统的另一组分。高丝氨酸内酯受体包括许多转录调控因子，如LuxR和LasR，它们能直接与DNA结合并调控基因的转录；另一类高丝氨酸内酯受体是与LuxN相关的感应激酶小家族，它们是一类定位于细胞膜上的感应激酶，结合高丝氨酸内酯后能通过磷酸化激活响应的感应调控元件，进而调控不同基因的表达。由于高丝氨酸内酯受体在细菌的细胞通讯及生理代谢中发挥着重要作用，对其结构和功能的具有十分重要的意义，然而LuxR类型高丝氨酸内酯受体的的生物化学和结构研究受到了蛋白质溶解性的阻碍，因而建议一套高效的高丝氨酸内酯受体表达和纯化方法尤为重要。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是一类生物安全1级生物，基于荧光假单胞菌的研究提供了一套灵活的分子遗传学工具，使得荧光假单胞菌能被广泛应用于生物防治和治疗性蛋白质生产。目前已有多种荧光假单胞菌蛋白诱导表达系统被开发应用，而组成型蛋白表达系统也能合理且有效地发挥目的蛋白的功能。荧光假单胞菌2P24能合成多种促进植物生长和健康的次生代谢产物，其中莫匹罗星已被用于临床医学。位于莫匹罗星合成基因簇内的pc oI基因编码一种高丝氨酸内酯合成酶，其能合成C8和C10等中长链的高丝氨酸内酯；而上游的pcoR基因编码的LuxR类型的高丝氨酸内酯受体PcoR能响应PcoI合成的高丝氨酸内酯，发挥多种生物学功能并直接激活莫匹罗星的合成。
发明内容
鉴于荧光假单胞菌2P24能产生多种类型的高丝氨酸内酯，这为高丝氨酸内酯受体发挥生理活性提供了一种天然的表达环境。本发明基于此，利用荧光假单胞菌2P24作为表达宿主开发了高丝氨酸内酯受体的表达纯化方法，获得有功能、高纯度和高质量的PcoR蛋白。
本发明是通过以下技术方案实现的
本发明提供了一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达方法，构建含有荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体编码基因pcoR的表达质粒，并转化到荧光假单胞菌表达系统中进行表达，所述表达质粒中含有BBR1复制子，所述BBR1复制子受乳糖操纵子控制。
作为本发明的进一步优化方案，所述BBR1复制子的拷贝数为30copy。
作为本发明的进一步优化方案，所述表达质粒为大肠杆菌表达质粒pBBR1MCS2或pSE VA234-NHis质粒。
作为本发明的进一步优化方案，所述高丝氨酸内酯受体编码基因pcoR以PpcoR启动子驱动表达，所述PpcoR启动子序列如SEQ ID No.16所示。
作为本发明的进一步优化方案，所述pcoR基因序列如SEQ ID No.14所示，氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
作为本发明的进一步优化方案，所述荧光假单胞菌为高丝氨酸内酯受体编码基因pcoR缺失的2P24菌株。
本发明还提供了一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的纯化方法，利用上述表达方法表达后，用阴离子交换层析和/或分子排阻层析进行纯化荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体。
作为本发明的进一步优化方案，所述纯化方法包括以下步骤：
(1)将含高丝氨酸内酯受体基因表达质粒的重组菌株在培养基中表达；
(2)离心收集菌体，利用缓冲液A重悬菌体，冰上超声破碎，离心收集上清；其中，所述缓冲液A为20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH 8.0；
(3)先用缓冲液A平衡HiTrap Q FF离子交换柱，将步骤(1)获得样品上样，再以缓冲液A和缓冲液B梯度洗脱；其中，所述缓冲液B为20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH 8.0；
(4)先用缓冲液C平衡Superdex s200层析柱，再将步骤(3)获得的蛋白洗脱液上样，然后用缓冲液C洗脱蛋白，其中，所述缓冲液C为20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明选用荧光假单胞菌2P24作为蛋白表达宿主和高丝氨酸内酯供体，选用含BBR1复制子和PpcoR启动子组合的中低拷贝质粒pBBR2-PpcoR作为荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达质粒，显著且稳定的发挥了PcoR的功能，且无需IPTG或阿拉伯糖诱导；经离子交换层析和分子排阻层析纯化，不仅减少了蛋白的损失，还可高效的获得纯度高且活性好的蛋白，为荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的结构和功能研究提供物质基础。
附图说明
图1为诱导型PcoR表达质粒改造示意图；
图2为组成型PcoR表达质粒改造示意图；
图3为诱导型PcoR重组表达菌株莫匹罗星产量图；
图4为组成型PcoR重组表达菌株莫匹罗星产量图；
图5为阴离子交换层析及SDS-PAGE蛋白电泳图；
图6为凝胶过滤层析及SDS-PAGE蛋白电泳图；
图7为PcoR蛋白免疫印迹实验验证结果；
图8为PcoR蛋白凝胶阻滞实验验证结果。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体PcoR诱导型表达质粒及重组表达菌株构建
2.1.1诱导型表达质粒pSEVA234-NHis-pcoR的构建
以荧光假单胞菌2P24基因组DNA为模板，加入上游引物PcoR-F1:5’-ACCTGTACTTCCAATCCAATATGCTGGAAGAAATTCTGAT-3’(SEQ ID No.1)和下游引物PcoR-R1:5’-GATCCTTATCCACTTCCAATTCAGGGCGTGACCAGGCCTG-3’(SEQ ID No.2)进行PCR，获得pcoR基因片段，pcoR基因序列如SEQ ID No.14所示，其蛋白序列如SEQ ID No.15所示。
以pSEVA234质粒为骨架，通过Gibson重组在其多克隆位点引入His6-tag编码序列及rr nB T1和T7Te双终止子，获得质粒pSEVA234-NHis。将PCR获得的pcoR基因片段和SspI单酶切线性化后的pSEVA234-NHis(含有BBR1复制子及受乳糖操纵子控制，BBR1复制子拷贝数约为30copy)质粒，按1：1的摩尔比混匀，加入无缝克隆预混液，50℃孵育20min后转化DH5α感受态，涂抗性平板并通过菌液PCR筛选获得阳性克隆，即获得诱导型表达质粒pSEVA234-NHis-pcoR。
2.1.2诱导型表达质粒pBb(RSF1010)-pcoR和pBb(B5)8k-pcoR的构建
构建过程参见图1，使用NdeI/BamHI双酶切处理pSEVA234-NHis-pcoR，1％琼脂糖电泳后回收含pcoR基因片段，并分别与NdeI/BamHI酶切处理后的革兰氏阴性菌广宿主荧光质粒pBb(RSF1010)1k-GFPuv(含有RSF1010复制子及受乳糖操纵子控制，RSF1010复制子拷贝数约为130copy)和细菌广宿主载体pBb(B5)8k-sfGFP(含有BBR1复制子及受阿拉伯糖操纵子控制，BBR1复制子拷贝数约为70copy)连接，转化DH5α感受态，涂抗性平板并通过菌液PCR筛选获得阳性克隆，即获得诱导型表达质粒pBb(RSF1010)-pcoR和pBb(B5)8k-pcoR。
2.1.3诱导型重组表达菌株的构建
通过三亲本接合转移，将上述3种诱导型表达质粒分别导入荧光假单胞菌2P24ΔpcoR中，获得诱导型重组表达菌株2P24ΔpcoR::pSEVA234-NHis-pcoR，2P24ΔpcoR::pBb(RSF1010)-pc oR和2P24ΔpcoR::pBb(B5)8k-pcoR。
2.2荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体PcoR组成型表达质粒及重组表达菌株构建
构建过程参见图2所示，具体步骤包括：
2.2.1组成形型重组表达质粒pBBR2-PpcoR-pcoR的构建
以荧光假单胞菌2P24基因组DNA为模板，加入上游引物Promoter-pcoR-F:5’-AAAGGT ACCACCATTGATCAGCTCATTTA-3’(SEQ ID No.3)和下游引物Promoter-pcoR-R:5’-TGA TGATGATGATGATGCATTTTAACCTCCTTGTCGTTGT-3’(SEQ ID No.4)进行PCR，获得pcoR基因启动子PpcoR的片段。
以荧光假单胞菌2P24基因组DNA为模板，加入上游引物PcoR-F2:5’-ATGCATCATCATCATCATCATCATCATCTGGAAGAAATTCTGATGTG-3’(SEQ ID No.5)和下游引物PcoR-R1:5’-AAGCTTTCAGGGCGTGACCAGGCCTG-3’(SEQ ID No.6)，获得pcoR基因片段；以上述PpcoR基因片段和pcoR基因片段为模板，加入上游引物Promoter-pcoR-F和下游引物PcoR-F2，通过重叠PCR获得片段PpcoR-pcoR。
使用KpnI/HindIII同时双酶切处理PpcoR-pcoR和大肠杆菌表达质粒pBBR1MCS2，连接后转化DH5α感受态，涂抗性平板并通过菌液PCR筛选获得阳性克隆，即获得组成形型重组表达质粒pBBR2-PpcoR-pcoR。其中重组表达质粒pBBR2-PpcoR-pcoR具有PpcoR启动子，Ppc oR启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
2.2.2组成形型重组表达质粒pBBR2-Prpsh-pcoR的构建
以引物Prpsh-1/Prpsh-2/Prpsh-3互为模板和引物，通过PCR获得通用型核糖体蛋白S8编码基因的Prpsh启动子DNA。再以Prpsh启动子DNA为模板，加入以上游引物Prpsh-4:5’-AAAGGGCCCTCGTCGCAGGCAAGGCGCGG-3’(SEQ ID No.7)和下游引物Prpsh-4:5’-AAAAAGCTTCATATTTCATTACTCCATTA-3’(SEQ ID No.8)，获得Prpsh启动子片段；ApaI/HindIII双酶切同时处理Prpsh启动子片段和pBBR1MCS2，连接后转化DH5α感受态，涂抗性平板并通过菌液PCR筛选获得pBBR2-Prpsh质粒。
引物Prpsh-1:
5’-TCGTCGCAGGCAAGGCGCGGGTGGAAGGGGAGCAATCTTCCGACCGCCGGTGA CCTTGC-3’(SEQ ID No.11)；
引物Prpsh-2:
5’-CCGCCGGTGACCTTGCCAACAAACAAGCCCCTATATGGGGCTTGTTTCGTTTCTGCCTTGTGTCTAGAATGACCG-3’(SEQ ID No.12)；
引物Prpsh-3:
5’-CATATTTCATTACTCCATTATTGTGTATTCTGTTAATTAAGCCGGTCATTCTAGA CAC-3’(SEQID No.13)。
以荧光假单胞菌2P24基因组DNA为模板，加入上游引物PcoR-F3:5’-AAAAAGCTTATGCATCATCATCATCATCA-3’(SEQ ID No.9)和下游引物PcoR-R3:5’-AAAGGATCCTCAGGGCGTGACCAGGCCTG-3’(SEQ ID No.10)，通过PCR获得pcoR基因片段；HindIII/Bam HI双酶切同时处理pBBR2-Prpsh质粒和pcoR基因片段，连接后转化DH5α感受态，涂抗性平板并通过菌液PCR筛选获得pBBR2-Prpsh-pcoR重组表达质粒。其中，重组表达质粒pBBR 2-Prpsh-pcoR具有Prpsh启动子，Prpsh启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
2.2.3诱导型重组表达菌株的构建
通过三亲本接合转移将上述2种组成型表达质粒分别导入荧光假单胞菌pcoR基因缺失体2P24ΔpcoR中，获得组成型重组表达菌株2P24ΔpcoR::pBBR2-PpcoR-pcoR和2P24ΔpcoR::pBBR2-Prpsh-pcoR。
2.3诱导型和组成型PcoR重组表达菌株的发酵培养
挑取重组表达菌株单克隆于含氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LB，28℃过夜培养至OD600约1.0。按5％接种量转接至50mL新鲜的含氨苄青霉素和卡那霉素抗性的KB培养基(Trypt one 20g/L，Glycerol 10mL/L，K2HPO4.3H2O 1.97g/L，MgSO4 0.73g/L)，28℃、200rpm振荡培养。对于含诱导型表达质粒的重组菌，当OD600约0.6-0.8时，加入100mM阿拉伯糖或0.8mM IPTG进行诱导，含组成型表达质粒的重组菌则不做处理。
2.4高效液相色谱法检测莫匹罗星
取重组表达菌株在KB培养基中培养60h的发酵液1mL，12000rpm离心10min。上清液用0.22μm水系滤头过滤后转移至HPLC进样瓶中。配制500mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L的莫匹罗星标准品。配制流动相A：5g/L NH4H2PO4；流动相B：乙腈。以40％ A：60％ B平衡色谱柱WondaSil C18-WR column(5μm，4.6x150mm)。检测条件如下：流动相40％ A：60％ B；流速：1mL/min；检测波长230nm；进样量10μL；柱温：35℃；检测时间：10min/样。检测分析各种重组菌的莫匹罗星表达情况。
由图3-图4可以看出，以组成型表达的ΔpcoR::pBBR2-PpcoR-pcoR的表达量最高，其次为诱导型的ΔpcoR::pSEVA234-NHis-pcoR，ΔpcoR::pBb(RSF1010)-pcoR，而ΔpcoR::pBb(B5)8k-pcoR基本不表达。
2.5荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达和纯化
2.5.1取冻存的荧光假单胞菌2P24ΔpcoR::pBBR2-PpcoR-pcoR于含氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LB平板上划线，28℃培养2天。挑取单克隆于含相应抗生素的5mL LB液体培养基中，28℃、220rpm振荡培养15h。以5％接种量转接至含响应抗生素200mL LB液体培养基中，28℃、200rpm继续培养至36h，离心收集菌体。
2.5.2用40mL缓冲液A(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，利用超声破碎细胞仪对菌体进行破碎，程序设置：功率30％，超声时间30min，超声2.0s，停止3.0s。待菌体呈现透明清澈后，进行低温高速离心：4℃，12000rpm，1h。
2.5.3HiTrap Q FF阴离子交换柱层析
把A泵放在抽滤过后的ddH2O中，B泵放在缓冲液B(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.0)中，。在load模式下先用缓冲液A平衡柱子5个柱体积，电导值达到85～90ms/cm，再用ddH2O冲柱子至电导下降为0ms/cm，而后把A泵放入缓冲液A中，平衡柱子，电导值达到7.5～8ms/cm。将破碎后的菌离心后取上清进行以1mL/min的流速上样，上样之后进行离子交换层析。程序结束后，分别取上清、沉淀、流穿和280nm主峰的样品进行SDS-PAGE收集主要的目的蛋白样品(参见图5)，将其用10KDa的浓缩管进行浓缩，以用作后续处理。
2.5.4Superdex s200凝胶过滤层析
凝胶过滤层析采用洗脱缓冲液为缓冲液C(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH
8.0)。在load模式下，以1.0mL/min的流速平衡层析柱，待电导值达到34-38ms/cm平衡稳定后将浓缩后的蛋白进行上样，30min后设置收样，最后在280nm最高峰处获得目的蛋白，分别取上样前的样品和峰尖处的蛋白样品进行SDS-PAGE(参见图6)，获得纯度高的目的蛋白进行浓缩保存，以供后续测试。
2.6荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体PcoR的鉴定及活性验证
为了验证纯化获得的目的蛋白PcoR是否可用，进行蛋白质免疫印迹实验和凝胶阻滞实验。
2.6.1蛋白质免疫印记实验(Western Blot)
纯化后的目的蛋白PcoR为实验组1，与目的蛋白大小相似蛋白GST为对照组2，采用15％的SDS-PAGE电泳胶进行电泳180V，45min，后拨胶进行电转100V，100min将蛋白转移到纤维膜上，而后进行脱脂牛奶封闭、洗脱、孵育抗体、洗脱和显色。
参见图7，本发明表达的PcoR能够被相应的抗体识别而产生印迹斑点；而GST无法被抗体识别产生印迹斑点；
2.6.2凝胶阻滞实验(EMSA)
已知PcoR蛋白可以调控高丝氨酸内酯合成酶编码基因pcoI的转录与表达，因此选择pco I的启动子和PcoR蛋白进行EMSA实验。
参见图8，本发明表达的PcoR能够跟pcoI的启动子结合产生阻滞，并且随着浓度的增加与DNA的结合有增加的趋势。
总之，本发明的方法表明联合中低拷贝复制子(受乳糖操纵子控制)可以显著提高荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达量，利用PpcoR启动子组成的组成型表达质粒及联合以产高丝氨酸内酯的荧光假单胞菌2P24为表达宿主，可获得活性好的荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体，无需额外添加诱导剂，解决了荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体在大肠杆菌中包涵体表达的问题。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
Claims (9)
1.一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达方法，其特征在于，构建含有荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体编码基因pcoR的表达质粒，并转化到荧光假单胞菌表达系统中进行表达，所述表达质粒中含有BBR1复制子，所述BBR1复制子受乳糖操纵子控制。
2.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达方法，其特征在于，所述BBR1复制子的拷贝数为30copy。
3.根据权利要求2所述的一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达方法，其特征在于，所述表达质粒为大肠杆菌表达质粒pBBR1MCS2或pSEVA234-NHis质粒。
4.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达方法，其特征在于，所述高丝氨酸内酯受体编码基因pcoR以PpcoR启动子驱动表达，所述PpcoR启动子序列如SEQ ID No.16所示。
5.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达方法，其特征在于，所述pcoR基因序列如SEQ ID No.14所示，氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
6.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的表达方法，其特征在于，所述荧光假单胞菌为高丝氨酸内酯受体编码基因pcoR缺失的2P24菌株。
7.一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的纯化方法，其特征在于，利用如权利要求1-6任一所述表达方法表达后，用阴离子交换层析和/或分子排阻层析进行纯化荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体。
8.根据权利要求7所述的一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：
(1)将含高丝氨酸内酯受体基因表达质粒的重组菌株在培养基中表达；
(2)离心收集菌体，利用缓冲液A重悬菌体，冰上超声破碎，离心收集上清；其中，所述缓冲液A为20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH 8.0；
(3)先用缓冲液A平衡HiTrap Q FF离子交换柱，将步骤(1)获得样品上样，再以缓冲液A和缓冲液B梯度洗脱；其中，所述缓冲液B为20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH 8.0；
(4)先用缓冲液C平衡Superdex s200层析柱，再将步骤(3)获得的蛋白洗脱液上样，然后用缓冲液C洗脱蛋白，其中，所述缓冲液C为20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0。
9.根据权利要求8所述的一种荧光假单胞菌高丝氨酸内酯受体的纯化方法，其特征在于，其特征在于，所述步骤(1)的培养条件为28℃培养36h。
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