CN117982658A - Enpp1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂在协同抑制肿瘤中的应用 - Google Patents
Enpp1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂在协同抑制肿瘤中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂在协同治疗肿瘤中的应用。具体地，本发明涉及一种活性成分组合的用途，所述活性成分组合包括ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂，并且所述组合用于制备协同抑制肿瘤的药物组合物。本发明活性成分组合能够有效地协同抑制肿瘤(尤其是结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌)的生长，并且能与辐照治疗联合施用，从而显著提升肿瘤抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，更具体地涉及ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂在协同抑制肿瘤中的应用及其相关药物。
背景技术
肿瘤是一种多因素参与、多步骤发展的全身性、系统性疾病。肿瘤具有高度复杂性、可变性和多样性的生物学特征。癌症相关基因的异常可以引起肿瘤基因组稳定性丧失，进而导致肿瘤细胞出现异常的生物学行为，如逃避凋亡、无限复制的潜能、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等。
目前临床上有很多用于治疗肿瘤的医疗技术手段，可以大体分为以下几个类别：外科手术切除，放疗，化疗等。然而，临床治疗效果不佳以及耐药性的频繁出现，促使人们需要开发更有效的治疗方案。此外，一些抗肿瘤药物的毒副作用很大，导致病人不得不放弃治疗。
近些年来随着肿瘤免疫研究的深入，免疫疗法在肿瘤治疗中也受到越来越多的关注。目前已开发了一些通过促进免疫功能来治疗肿瘤的药物。
然而，仍需要进一步开发能够以低剂量施用的更安全且高效治疗肿瘤的药物。
发明内容
本发明的目的是提供了一种有效治疗肿瘤的治疗方法和药物，具体地，本发明提供了ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂在协同治疗肿瘤的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种活性成分组合的用途，所述活性成分组合包括第一活性成分ENPP1抑制剂和第二活性成分胞外核苷酸酶抑制剂，并且所述化学成分组合用于制备一药物组合物、制剂或药盒；并且所述药物组合物、制剂或药盒用于：
(a)促进cGAMP进入T细胞；
(b)促进T细胞的活化和功能。
在另一优选例中，所述药物组合物、制剂或药盒还用于治疗肿瘤。
在另一优选例中，所述T细胞是肿瘤微环境中的T细胞。
在另一优选例中，所述的ENPP1抑制剂选自下组：STF1623、STF1084、RBS2418、MV626、SR-8314、SR-8541、Enpp-1-IN-11。
在另一优选例中，所述的ENPP1抑制剂为STF1623。
在另一优选例中，所述的胞外核苷酸酶抑制剂选自下组：CD39抑制剂、CD73抑制剂、CD38抑制剂。
在另一优选例中，所述的胞外核苷酸酶抑制剂为抗体；所述抗体靶向选自下组的靶点：CD39、CD73、CD38。
在另一优选例中，所述的胞外核苷酸酶抑制剂是小分子抑制剂。
在另一优选例中，所述的CD39抑制剂为ARL67156。
在另一优选例中，所述药物组合物、制剂或药盒还具有以下中的一种或多种用途：
(1)增加T细胞中PDCA1、CD71和/或IFN-γ的表达量；
(2)增加CD45+细胞、CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞在肿瘤微环境中的数量；
(3)增加IFN-γ+ T细胞、TNF-α+CD4+ T细胞、IFN-γ+CD8+ T细胞、GZMB+CD8+ T细胞、TNF-α+CD8+ T细胞在肿瘤微环境中的百分比及数量；
(4)增加巨噬细胞中IFN-β相关基因的表达量。
在另一优选例中，所述的IFN-β相关基因包括：Ifnb、Ccl5、Cxcl10、Mx2。
在另一优选例中，所述药物组合物、制剂或药盒被施用于受试者。
在另一优选例中，所述受试者患有肿瘤或其相关疾病。
在另一优选例中，所述受试者是哺乳动物，更佳地所述哺乳动物为啮齿类动物(如小鼠、大鼠)或人。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：结肠腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、或其组合。
在另一优选例中，所述受试者具有选自下组的一个或多个分型特征：
(i)所述受试者体内肿瘤微环境中的免疫细胞数量偏低；
(ii)所述受试者体内肿瘤微环境中的活化的免疫细胞的百分比偏低；
(iii)所述受试者的巨噬细胞中IFNβ相关基因的表达量偏低；
(iv)所述受试者的T细胞中IFNγ相关基因的表达量偏低。
在另一优选例中，所述的偏低指表达量显著低于基准值，或免疫细胞数量或百分比显著低于基准值。
在另一优选例中，所述的基准值为正常受试者中相应基因的表达量或免疫细胞数量或百分比，或非肿瘤微环境中相应基因的表达量或活化的免疫细胞的数量或百分比。
在另一优选例中，所述的显著低于指表达量≤2/3基准值，较佳地≤1/2基准值，≤1/3基准值。
在另一优选例中，所述的显著低于指免疫细胞数量或百分比≤2/3基准值，较佳地≤1/2基准值，≤1/3基准值。
在另一优选例中，所述免疫细胞选自下组：CD45+细胞、CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞。
在另一优选例中，所述活化的免疫细胞选自下组：IFN-γ+CD4+ T细胞、TNF-α+CD4+T细胞、IFN-γ+CD8+ T细胞、GZMB+CD8+ T细胞、TNF-α+CD8+ T细胞。
在另一优选例中，所述药物组合物、制剂或药盒的施用方式选自下组：瘤内、口服、静脉内、肌内、肠胃外、透皮、腹腔内、或其组合。
在另一优选例中，所述药物组合物、制剂或药盒的施用方式选自下组：瘤内、口服、静脉内、腹腔内。
在另一优选例中，所述药物组合物、制剂或药盒的剂型选自下组：口服制剂、注射剂、贴剂、透皮剂。
在另一优选例中，所述药物组合物、制剂或药盒的剂型选自下组：口服制剂、注射剂。
在另一优选例中，所述口服制剂选自下组：胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酊剂。
在另一优选例中，所述的ENPP1抑制剂与胞外核苷酸酶抑制剂的浓度比为1000:1至1:1000；优选地，100:1至1:100；更优选地，10:1至1:10。
在另一优选例中，所述的ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂的质量比为1:500至500:1；优选地，100:1至1:100；更优选地，1:50至50:1。
在另一优选例中，所述药物组合物、制剂或药盒作为单独的制剂联合其他有效的肿瘤治疗方法在肿瘤的综合治疗中的用途。
在另一优选例中，所述有效的肿瘤治疗方法包括辐照治疗、手术治疗。
本发明的第二方面，提供了一种活性成分组合，所述组合由ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂构成。
本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括本发明的第二方面的活性成分组合和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物中，所述活性成分的含量为0.01-99wt％，较佳地0.1-90wt％，按药物组合物的总重量计。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包括额外的治疗药物(如抗肿瘤剂)。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包括化疗剂、检测点抑制剂、CAR-T细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的化疗剂包括顺铂、紫杉醇，替尼泊苷(teniposide)。
本发明的第四方面，提供了一种药盒，所述药盒包括：
(a)第一制剂，所述第一制剂含有ENPP1抑制剂以及药学上可接受的载体；
(b)第二制剂，所述第二制剂含有胞外核苷酸酶抑制剂以及药学上可接受的载体；
(c)说明书，所述说明书描述了将ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂进行联用的方法。
本发明的第五方面，提供了一种体外促进细胞外cGAMP进入T细胞的方法，包括步骤：在T细胞培养体系中，在第一活性成分ENPP1抑制剂和第二活性成分胞外核苷酸酶抑制剂存在下培养T细胞，从而促进cGAMP进入T细胞。
在另一优选例中，所述培养体系还存在cGAMP和ATP。
在另一优选例中，所述方法还包括在所述培养体系直接加入ATP。
本发明的第六方面，提供了一种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：向肿瘤细胞培养体系中加入用本发明的第五方面所述方法培养的T细胞，从而抑制肿瘤细胞生长。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示在存在或不存在1μΜ STF1623、10μΜ ARL67156、1mM ATP、3μΜ cGAMP的情况下，BMDM细胞(bone marrow-derived macrophage，骨髓来源巨噬细胞)的IFNb及相关基因的表达情况；(-)表示不存在，(+)表示存在。
图2A显示在胞外加入或不加入1mM ATP的情况下，cGAMP进入T细胞的量。
图2B显示在胞外加入1μΜ STF1623，分别用空白、100μΜ ATP、1μg/ml cGAMP、100μΜ ATP+1μg/ml cGAMP处理后，T细胞的激活与功能的变化。
图3A显示小鼠接种肿瘤后的给药方案。
图3B显示小鼠接种肿瘤后和给药(分别为对照组、ARL671565、STF1623、ARL671565+STF1623)后，小鼠的肿瘤体积变化。
图3C显示小鼠接种肿瘤后以及给药(分别为对照组、ARL671565、STF1623、ARL671565+STF1623)后，在第28天小鼠的肿瘤重量。
图4A显示小鼠接种肿瘤后以及给药(分别为对照组、ARL671565、STF1623、ARL671565+STF1623)后，适应性免疫细胞的肿瘤浸润情况。
图4B显示小鼠接种肿瘤后以及给药(分别为对照组、ARL671565、STF1623、ARL671565+STF1623)后，天然免疫细胞的肿瘤浸润情况。
图4C显示小鼠接种肿瘤后以及给药(分别为对照组、ARL671565、STF1623、ARL671565+STF1623)后，IFN-γ+和TNF-α+CD4+ T细胞的表达情况。
图4D显示小鼠接种肿瘤后以及给药(分别为对照组、ARL671565、STF1623、ARL671565+STF1623)后，IFN-γ+、GZMB+和TNF-α+CD8+ T细胞的表达情况。
图5A显示小鼠接种肿瘤后，单独的辐照治疗IR、辐照治疗IR与ARL67156+STF1623给药的联合治疗后，小鼠的肿瘤体积变化。
图5B显示小鼠接种肿瘤后，单独的辐照治疗IR、辐照治疗IR与ARL67156+STF1623给药的联合治疗后，IFN-γ+CD8+ T细胞、TNF-α+CD8+ T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞和TNF-α+CD4+T细胞的比例。
具体实施方式
经过广泛而深入的研究，本发明人意外地发现，ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂具有优异的协同激活免疫功能并治疗肿瘤的协同作用。其效果远优于二者的加合作用，并且能与辐照治疗联合施用，从而显著提升肿瘤抑制效果。在此基础上，完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“第一活性成分”指ENPP1抑制剂。
如本文所用，术语“第二活性成分”指胞外核苷酸酶抑制剂，尤其是小分子的靶向抑制剂和抗体类靶向抑制剂。优选地，所述的原癌基因产物为蛋白，例如EGFR蛋白、Her2蛋白等。
如本文所用，术语“本发明的活性成分组合”、“本发明的组合”、“本发明的药物成分组合”可互换使用，指上述第一活性成分和第二活性成分的组合。
如本文所用，术语“本发明的药物组合物”指包括或含有第一活性成分(或含所述第一活性成分的第一制剂)和第二活性成分(或含所述第二活性成分的第二制剂)的组合物，其中，所述的第一制剂和第二制剂可以是相同或不同的制剂。此外，第一制剂和第二制剂可以是同一制剂，或各自独立的制剂。
ENPP1抑制剂
ENPP1，即核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1，通过分解核苷酸三磷酸，产生核苷酸单磷酸和焦磷酸，从而影响细胞内外的各种生理过程。ENPP1抑制剂通过阻断ENPP1的活性，激活邻近的免疫细胞，同时减少免疫抑制性的腺苷分子，从而促进抗肿瘤免疫反应。ENPP1抑制剂的非限制性实例包括(但并不限于)：STF1623、STF1084、RBS2418、MV626、SR-8314、SR-8541、Enpp-1-IN-11。
STF1623是一种ENPP1小分子抑制剂，其具有如下所示的结构：
胞外核苷酸酶抑制剂
胞外核苷酸酶指在胞外水解核苷酸的糖和磷酸间的键而生成无机磷酸和核苷的特异的磷酸酯酶。CD39是胞外核苷酸三磷酸二磷酸水解酶。CD73，即胞外-5'-核苷酸酶(Ecto-5'-Nucleotidase)，是催化AMP形成胞外腺苷的主要酶。肿瘤细胞通过CD39、CD73等蛋白向肿瘤微环境中输送大量腺苷来实现免疫逃逸。胞外核苷酸酶抑制剂的非限制性实例包括(但并不限于)：抗CD39抗体、抗CD73抗体、ARL67156、ABSK051。
CD39小分子抑制剂ARL67156的结构式如下所示：
药物组合物以及给药方式
本发明还提供一种可用于协同治疗肿瘤的组合物，它可用于激活免疫功能以抑制肿瘤生长和/或转移。
本发明药物组合物包括：有效量的ENPP1抑制剂，和有效量的胞外核苷酸酶抑制剂，以及药学上可接受的载体。
此外，本发明药物组合物还可以包括任选的实体肿瘤化疗剂。所述的化疗剂包括(但不限于)顺铂、紫杉醇、阿霉素、teniposide等。
通常，可将本发明的ENPP1抑制剂，或胞外核苷酸酶抑制剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
如本文所用，“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物和/或细胞产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、聚山梨酯、乙醇及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
此外，本发明的活性成分组合还可与其他治疗剂(如抗肿瘤剂或免疫调节剂)一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的活性成分组合(包括第一活性成分(或其制剂)和/或第二活性成分(或其制剂))施用于哺乳动物。
应理解，本发明所述活性成分组合中第一活性成分(或其制剂)和/或第二活性成分(或其制剂)的有效量，可随给药的模式和肿瘤的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；肿瘤的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
典型地，对于第一活性成分，其安全有效量通常至少约10纳克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约50纳克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
对于第二活性成分，其安全有效量通常至少约10纳克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约50纳克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明所述的药物组合物的给药方式没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：静脉注射、皮下注射、肌肉注射等。
药盒
本发明提供一种药盒，所述药盒包括：
组分(1)：含有ENPP1抑制剂的制剂；
组分(2)：含有胞外核苷酸酶抑制剂的制剂；
组分(3)：说明书。
所述的含有ENPP1抑制剂的制剂包括(但并不限于)：冻干剂、液体制剂、片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。
所述的含有胞外核苷酸酶抑制剂的制剂包括(但并不限于)：冻干剂、液体制剂、片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。
典型地，药盒中装有一个或多个(如至少两个)含有ENPP1抑制剂的单元剂型和一个或多个(如至少两个)含有胞外核苷酸酶抑制剂的单元剂型；较佳地各为4-10个。
如本文所用，术语“单元剂型”是指为了服用方便，将组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。
本发明提供的说明书中可以有如下描述：所述药盒的使用方法是同时使用含有ENPP1抑制剂的单元剂型和含有胞外核苷酸酶抑制剂的单元剂型。
本发明提供的药盒通过下述步骤制备得到：将含有ENPP1抑制剂的制剂和含有胞外核苷酸酶抑制剂的制剂，以及说明书一起放置，形成药盒。
所述的含有ENPP1抑制剂的制剂优选含有ENPP1抑制剂的单元剂型，所述含有胞外核苷酸酶抑制剂的制剂优选含有胞外核苷酸酶抑制剂的单元剂型。
所述步骤优选将至少一个含有ENPP1抑制剂的单元剂型和至少一个含有胞外核苷酸酶抑制剂的单元剂型，以及说明书一起放置，形成药盒。
辐照治疗
辐照治疗，即放射治疗，常用的为电离辐射(IR)，是用放射线的电离辐射作用杀灭肿瘤的方法。其在一定程度上能短期抑制肿瘤，但费用高昂，且副作用大，肿瘤疾病难以被根治，容易复发。
本发明首次将具有协同作用的免疫活性组合成分与辐照治疗联合治疗肿瘤，可显著改善单独辐照治疗存在的问题，实现更优的疗效。
本发明的主要优点包括：
(1)联用ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂能够协同促进胞外cGAMP进入T细胞。
(2)联用ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂能够协同促进T细胞的活化和免疫功能。
(3)联用ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂能够协同抑制肿瘤生长。
(4)联用ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂能够促进辐照(IR)抑制肿瘤的效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
STF1623和ARL67156协同增加ATP刺激后cGAMP促进IFNb表达
将1μΜ STF1623、10μΜ ARL67156提前处理BMDM细胞0.5h，然后将1mM ATP与3μΜcGAMP处理BMDM细胞(bone marrow-derived macrophage，骨髓来源巨噬细胞)1h，通过Real-time PCR检测IFNβ的表达。
如图1和表1所示，STF1623和ARL67156联合处理后，IFNβ及其相关基因的表达水平最高，远优于STF1623或ARL67156单独处理的结果。
表1处理后的BMDM细胞免疫相关基因的表达
实施例2
ATP促进cGAMP进入T细胞并增强T细胞功能
用Stem Cell的EasySepTMMouse CD8+ T Cell Isolation Kit分离CD8+ T细胞，并在5μg/ml anti-CD3及2μg/ml anti-CD28存在时激活过夜，在胞外加入1μΜSTF1623，100μΜATP，5μg/ml cGAMP处理2h，通过液相串联质谱LC-MS/MS检测cGAMP进入T细胞的量。
结果如图2A所示，相比于未加入额外的ATP，当胞外存在较高浓度的ATP时，能显著促进cGAMP进入T细胞的水平。
此外，在胞外加入1μΜ STF1623，分别用对照组(PBS)、100μΜ ATP、1μg/mlcGAMP、100μΜ ATP+1μg/ml cGAMP处理3天，通过流式细胞术检测T细胞的激活与功能。
结果如图2B所示，同时加入ATP与cGAMP显著增强了T细胞功能(图2B)。尤其是，从IFN-γ的表达量来看(图2B和表2)，同时含有ATP和cGAMP时，相对于对照组增加的IFN-γ的△MFI值(2476.92)显著高于单独加入ATP或cGAMP时相对于对照组增加的IFN-γ的△MFI值(分别为44.61和1295.58)，并具有意外地协同提升效果(2476.92>44.61+1295.58)。
表2不同处理条件下的T细胞的IFN-γ平均荧光强度(MFI)
| Vehicle(PBS) | ATP | cGAMP | ATP+cGAMP | |
| MFI | 1131.53 | 1176.15 | 2427.12 | 3608.46 |
| ΔMFI | - | 44.61 | 1295.58 | 2476.92 |
实施例3
ARL67156和STF1623协同抑制肿瘤生长
3.1小鼠肿瘤模型构建
实验选取8-12周C57/B6鼠，肿瘤体积<2000mm3，所有操作均符合动物伦理。提前至少一周将小鼠从繁育区转移至实验区，每个实验组小鼠≥5只。腹腔注射1.25％阿佛丁麻醉小鼠，待小鼠进入麻醉状态后，将小鼠后背剃毛，使用1ml胰岛素注射器皮下进针大约3mm左右，接种1×106MC38肿瘤细胞，待接种5-7天进行肿瘤体积测量，每周测量2-3次。肿瘤体积V＝(L×W2)/2(L：肿瘤的长度，W：肿瘤的宽度)。
3.2小鼠肿瘤ARL67156和STF1623的化学治疗
ARL67156和STF1623的化学治疗方案如图3A所示。在小鼠接种肿瘤后的第5至第9天和第18至第22天，每天腹腔注射5mg/kg CD39抑制剂ARL671565(溶于磷酸盐缓冲液PBS)和10mg/kg ENPP1抑制剂STF1623(溶于磷酸盐缓冲液PBS)，对照组腹腔注射100μL的PBS(vehicle)。药物治疗后每隔2-3天检测肿瘤大小变化。在第28天，取出皮下接种的肿瘤，进行称重统计。
结果如图3B和3C所示，ARL67156和STF1623单独治疗肿瘤时有不同程度的抑制作用，只有ARL67156和STF1623联用治疗肿瘤时，对肿瘤大小和重量的抑制作用相较于单独用药的抑制效果更加显著。
实施例4
ARL67156和STF1623通过增加免疫细胞浸润及功能来抑制肿瘤生长
4.1小鼠肿瘤微环境的免疫细胞提取
在小鼠接种肿瘤后的第28天，取出皮下接种的肿瘤，肿瘤消化液配制：在完全培养基1640(1％P/S+5％FBS)中加入1mg/ml胶原酶IV型，200μg/ml DNA酶I。处死小鼠，置于75％酒精中浸泡消毒2min，将小鼠腹部朝上四肢固定，取出引流淋巴结，将肿瘤剥离下来，置于FACS溶液中于冰上。将肿瘤组织大致剪碎，加入5-10ml肿瘤消化液，转移到全自动组织处理器配套的消化管中，37℃，60min，置于自动组织处理器上消化。肿瘤消化结束后，得到单细胞悬液，转移至70m滤网中，边研磨边过滤，使一些未完全消化的组织块散开。4℃，1800rpm，6min离心弃掉上清，加入10ml完全培养基1640，洗去残余消化液。离心收集肿瘤单细胞，加入4ml 40％的percoll分离液将细胞重悬，使用巴氏吸管吸取2.5ml 80％的percoll分离液缓慢加到40％的percoll分离液下面，使40％与80％形成2个液面层，室温25℃，2500rpm，升速9，降速0，离心20min。密度梯度离心结束后，分层之间为免疫细胞富集区域，将上层液体以逆时针方向打圈吸走弃掉，以打圈形式吸取免疫细胞层，加入5倍体积完全培养基1640清洗，离心后得到免疫细胞。
4.2小鼠肿瘤免疫细胞流式染色方法
为了进行表面标记染色，将上述制备的免疫细胞与抗小鼠CD16/32一起在4℃下孵育15分钟，阻断Fc受体。用FACS缓冲液(2％ FBS in PBS)洗涤后，在4℃下与以下抗体孵育30分钟。
表3细胞分群标志物
肿瘤细胞内IFN-γ，Granzyme B，TNF-α的胞内因子检测。取出部分肿瘤浸润的免疫细胞于1640完全培养基中，加入50ng/ml PMA，5μg/ml BFA，1μg/ml Ionomycin，置于细胞培养箱中，处理4h。免疫细胞悬液用固定缓冲液在4℃下固定40分钟，用其洗涤两次，并与抗体在4℃的孵育40分钟。数据通过多色流式细胞仪(Aurora,Cytek)获取，并使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。
表4免疫细胞胞内染色分群策略
免疫细胞分析表明，如图4A和4B所示，ARL67156对免疫细胞的浸润比例没有显著影响，证明ARL67156对肿瘤生长的影响可以忽略不计。而STF-1623增加了CD45+免疫细胞肿瘤浸润总数、CD8+ T细胞和巨噬细胞的浸润百分比和数量增加。而ARL67156与STF-1623对肿瘤治疗有协同作用，不仅促进适应性免疫细胞如CD4+和CD8+ T细胞的浸润，还促进天然免疫细胞如树突状细胞(Dendritic cell，DC)、巨噬细胞(Macrophages，Mφ)、NK细胞(Natural killer cell，自然杀伤细胞)的浸润。此外，STF1623和ARL67156也显著提高了IFN-γ+和TNF-α+CD4+ T细胞以及IFN-γ+、GZMB+和TNF-α+CD8+ T细胞的百分比和数量(图4C和图4D)。
如表5和表6所示，ARL67156与STF-1623联合给药后，各免疫细胞的数量的增长程度显著高于单独给药ARL67156或STF-1623的增长量，并且出乎意料地，在多种免疫细胞的数量增长中表现出协同作用，例如CD45+细胞(43.13＞11.65+28.62)、CD3+ T细胞(5.35＞0.49+2.44)、CD4+ T细胞(0.96＞0.30+0.42)、CD8+ T细胞(2.41＞0.48+1.27)、巨噬细胞(22.57＞5.69+15.55)、NK细胞(2.54＞0.65+1.33)。
表5细胞密度
*细胞密度差值Δ是相对于对照组的细胞密度差值Δ。
表6细胞密度
*细胞密度差值Δ是相对于对照组的细胞密度差值Δ。
如表7所示，ARL67156与STF-1623联合给药后，免疫细胞的增长百分比也显著高于单独给药ARL67156或STF-1623时的增长百分比。并且出乎意料地，在多种免疫细胞的增长百分比中表现出协同作用，例如IFN-γ+和TNF-α+CD4+T细胞(分别11.2＞1.7+3.6、15.4＞1.9+3.7)以及IFN-γ+、GZMB+和TNF-α+CD8+T细胞(分别15.4＞2.0+7.3、8.0＞0.8+3.0、13.5＞4.5+6.2)。
表7细胞百分比
*百分比差值Δ是相对于对照组的百分比差值Δ。
实施例5
ARL67156和STF1623促进辐照(IR)抑制肿瘤的效果
在小鼠接种肿瘤后的第12天，对肿瘤进行局部辐照治疗，同时在第12、13、15、17天腹腔注射5mg/kg ATP水解酶CD39抑制剂ARL671565(溶于磷酸盐缓冲液PBS)和10mg/kgENPP1抑制剂STF1623(溶于磷酸盐缓冲液PBS)，对照组腹腔注射100μL的PBS。药物治疗后每隔2-3天检测肿瘤大小变化。在第30天，取出皮下接种的肿瘤，进行称重统计。
结果如图5A所示，在第12天对肿瘤进行单一的局部辐照后，肿瘤生长速度仅在短时间内略有放缓，并在30天内继续快速生长。而使用辐照与ARL67156+STF1623联合施用后，肿瘤生长受到迅速抑制，并且停止施用后肿瘤体积在持续减小。并且如图5B所示，相比仅对肿瘤进行辐照，辐照与ARL67156+STF1623联合施用著提高了T细胞的杀伤功能。
以上结果表明，辐照与ARL67156+STF1623联合施用对肿瘤疾病具有显著抑制效果。
讨论
目前肿瘤的治疗治愈是全人类面临的重大挑战。因此本发明人的此项工作集中在肿瘤的治疗与治愈上。据报道由于肿瘤基因组不稳定会产生cGAMP并释放到肿瘤微环境中，同时肿瘤微环境中死亡或濒死的细胞会释放ATP到肿瘤微环境中。本发明通过体外实验证实了ATP可以促进cGAMP进入免疫细胞的量，并增强免疫细胞的激活与功能。而肿瘤细胞及免疫细胞表面都存在大量ATP水解酶CD39及cGAMP水解酶ENPP1的表达，为了增强肿瘤治疗，本发明在治疗的同时给予ATP水解酶CD39抑制剂ARL.67156及cGAMP水解酶ENPP1抑制剂STF1623，发现这两种药物同时使用显著抑制了肿瘤生长，同时对于肿瘤放疗有极强的促进作用。本发明的这项发现极有可能可以联合免疫治疗anti-PD1/PDL1进一步促进肿瘤治疗及治愈，为肿瘤的治疗治愈提供了新的思路。
最近的一项研究表明高浓度ATP(1mΜ)可以促进巨噬细胞中P2x7R打开使得肿瘤细胞释放的cGAMP进入。本发明发现低浓度ATP(100μΜ)可以促进cGAMP进入活化的CD8+T细胞中。
越来越多的证据表明，放疗和化疗通常通过cGAS-STING途径来获得理想的治疗效果。然而，将这一有希望的临床前发现转化为临床应用时却遇到了意想不到的障碍。尽管肿瘤内注射STING激动剂会导致肿瘤消退，但静脉注射STING激动剂反而会抑制抗肿瘤NK反应。这种差异可以部分解释为STING信号在不同免疫细胞中有不同的作用。虽然在CD4+ Th1细胞中STING的激活可以增强IFN-γ的表达，但STING信号也可以促进B细胞或Tregs中抑制性细胞因子IL-35或IL-10的诱导，抑制抗肿瘤免疫。因此，在合适的免疫细胞亚群中激活STING对能否改善癌症治疗至关重要。值得注意的是，过量的STING激活、过多的I型干扰素反应也会损害抗肿瘤免疫。因此，最佳的STING信号传导对于实现有效的CD8+ T细胞应答是必要的。考虑肿瘤抗原和细胞外ATP在放疗后都变多，阻断细胞外ATP降解将特异性增强cGAMP进入到CD8+ T淋巴细胞中激活STING。此外，阻断ENPP1可以造成cGAMP累积，但不会太高，因此其主要效应是增强抗肿瘤免疫，避免导致CD8+ T细胞的死亡。
ATP虽然在稳态组织中只存在nM范围内，但在感染组织或细胞广泛死亡相关的肿瘤微环境中，细胞外ATP可以积累到大约500μM。凋亡细胞通过Pannexin-1或破损的细胞膜来释放ATP。癌细胞也向肿瘤微环境释放cGAMP。据推测。放射治疗也能引起细胞外cGAMP的积聚，免疫细胞摄取cGAMP，激活STING，诱导I型干扰素应答可以提升抗肿瘤免疫反应。考虑到胞外核苷酸酶CD39和CD71可以依次将胞外的ATP转化为腺苷，而腺苷可以发挥免疫抑制作用，本发明测试了CD39和ENPP1的化学阻断是否可能是一种可行的提高肿瘤免疫的方法。本发明发现，单独使用ALR67156抑制CD39对肿瘤的生长或免疫细胞浸润没有显著影响。用STF-1623阻断ENPP1对肿瘤生长和免疫细胞动力学有影响。但是，STF-1623单独作用对肿瘤生长只有很小的影响。因此，应考虑将它与其他试剂联合应用于临床。
在这方面，本发明发现ARL67156和STF-1623在肿瘤抑制中具有协同作用，为未来的发展提供了更好的策略。通过对肿瘤微环境中免疫细胞亚群的分析，本发明发现STF1623和ARL67156联用比STF1623显著增加了CD8+ T细胞的数量，导致肿瘤坏死因子-TNFα、干扰素-γ和GZMB阳性CD8+ T细胞在MC38肿瘤中显著增加。两种化合物共同处理后MC38肿瘤微环境中NK细胞和NKT细胞也明显增多。因此，STF1623和ARL67156可能通过促进这些免疫细胞的功能对肿瘤生长进行更好的控制。此外，同时使用STF-1623和ARL67156治疗可丰富巨噬细胞和DC，这可能有助于改善抗原提呈并维持肿瘤微环境中的效应CD4+和CD8+ T细胞。因此，这种联合化疗具有影响先天免疫反应和获得性免疫反应的能力。这种策略还与放射治疗一起工作，极大地增强放疗抗肿瘤免疫的效果。虽然STING激动剂正在考虑用于临床，但系统激活STING可引起广泛的炎症。瘤内注射STING激动剂，尽管避免了系统性炎症反应，但只有几种癌症如皮肤癌和乳腺癌可以采用这种策略。
相比之下，本发明的联合用药方案利用肿瘤微环境中预先存在的细胞外cGAMP和ATP，并通过局部给药ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂来增强抗肿瘤细胞的免疫反应，有可能使大量的癌症患者受益，副作用小，且治疗效果显著，从而有望改进免疫治疗和放射治疗。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种活性成分组合的用途，其特征在于，所述活性成分组合包括第一活性成分ENPP1抑制剂和第二活性成分胞外核苷酸酶抑制剂，并且所述化学成分组合用于制备一药物组合物、制剂或药盒；并且所述药物组合物、制剂或药盒用于：
(a)促进cGAMP进入T细胞；
(b)促进T细胞的活化和功能。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ENPP1抑制剂选自下组：STF1623、STF1084、RBS2418、MV626、SR-8314、SR-8541、Enpp-1-IN-11。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的胞外核苷酸酶抑制剂选自下组：CD39抑制剂、CD73抑制剂、CD38抑制剂。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物、制剂或药盒还具有以下中的一种或多种用途：
(1)增加T细胞中PDCA1、CD71和/或IFN-γ的表达量；
(2)增加CD45+细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞在肿瘤微环境中的数量；
(3)增加IFN-γ+T细胞、TNF-α+CD4+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞、GZMB+CD8+T细胞、TNF-α+CD8+T细胞在肿瘤微环境中的百分比及数量；
(4)增加巨噬细胞中IFN-β相关基因的表达量。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物、制剂或药盒作为单独的制剂联合其他有效的肿瘤治疗方法在肿瘤的综合治疗中的用途。
6.一种活性成分组合，其特征在于，所述组合由ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂构成。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括如权利要求6所述的活性成分组合和药学上可接受的载体。
8.一种药盒，其特征在于，所述药盒包括：
(a)第一制剂，所述第一制剂含有ENPP1抑制剂以及药学上可接受的载体；
(b)第二制剂，所述第二制剂含有胞外核苷酸酶抑制剂以及药学上可接受的载体；
(c)说明书，所述说明书描述了将ENPP1抑制剂和胞外核苷酸酶抑制剂进行联用的方法。
9.一种体外促进细胞外cGAMP进入T细胞的方法，其特征在于，包括步骤：在T细胞培养体系中，在第一活性成分ENPP1抑制剂和第二活性成分胞外核苷酸酶抑制剂存在下培养T细胞，从而促进cGAMP进入T细胞。
10.一种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，包括步骤：向肿瘤细胞培养体系中加入用如权利要求9所述方法培养的T细胞，从而抑制肿瘤细胞生长。
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