CN117982497A - 萘酰亚胺-多胺缀合物在制备预防和/或治疗肺动脉高压及其并发症的产品中的应用 - Google Patents

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CN117982497A CN202410153429.8A CN202410153429A CN117982497A CN 117982497 A CN117982497 A CN 117982497A CN 202410153429 A CN202410153429 A CN 202410153429A CN 117982497 A CN117982497 A CN 117982497A
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Abstract

本发明属医药技术领域，公开了一种萘酰亚胺‑多胺缀合物在制备预防和/或治疗肺动脉高压及其并发症的产品中的应用，所述产品包括药品、食品或保健品；所述萘酰亚胺‑多胺缀合物及其药学上可接受的盐，对肺动脉高压及其并发症治疗效果显著，如平均肺动脉压与右心室收缩压高、右心扩大与右心功能紊乱、肺血管重构、肺小动脉中膜厚度与血管肌化增加及肺动脉平滑肌细胞增殖迁移等指征，对预防和/或治疗肺动脉高压的所起的作用包括扩大右心，改善肺小动脉血管中膜厚度、血管肌化水平，逆转肺血管重构，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移。

Description

萘酰亚胺-多胺缀合物在制备预防和/或治疗肺动脉高压及其 并发症的产品中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及萘酰亚胺-多胺缀合物在制备预防和/或治疗肺动脉高压及其并发症的产品中的应用。
背景技术
肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension, PAH）是一种由于肺血管重塑和进行性狭窄导致肺动脉阻力持续增高的恶性心血管疾病，也是指肺动脉压力升高超过一定界限的一种血流动力学和病理生理学状态。一般以海平面静息状态下，右心导管检测肺动脉平均压>20 mmHg为诊断标准。肺动脉高压异质性强、病因不明、症状隐匿、治疗棘手、预后恶劣。在西方国家，靶向药物治疗时代以前PAH患者中位生存时间仅为2.8年，超过60%的患者在确诊后5年内发生右心衰竭和死亡；在我国，未经有效治疗的PAH患者5年生存率也仅为20.8%。
近20年来，肺动脉高压从基础研究到临床诊断治疗均取得了快速进步，肺动脉高压患者的生活质量和生存率均得到了明显提高。随着国家引入靶向药物，我国肺动脉高压患者3年生存率已提升至75.1%。但由于缺乏对疾病确切发病机制的认识，肺动脉高压相关治疗药物的研发目前依然并不理想，加上专门从事肺动脉高压诊疗的医师队伍相对匮乏，现代肺动脉高压的诊治策略依然无法完全应对于现状，整体诊治水平依然无法满足需求。即便在靶向治疗药物已经趋于普及的今天，肺动脉高压患者的远期预后依然不良，核心问题在于现有药物的作用机制是扩张血管，无法逆转肺血管重构。因此，发现逆转疾病进程的新颖治疗药物，是广大医药科技工作者和制药厂商关注的热点；更是打破治疗瓶颈，改善患者生存质量的关键。
目前临床上用于治疗肺动脉高压的药物主要包括前列环素类药物、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶-5抑制剂、鸟苷酸环化酶（GC）激动剂以及生物制剂，这些药物仅能够在一定程度上缓解症状，无法彻底治愈疾病，同时又具有毒副作用大、不良反应多的缺点。
在中国发明专利申请CN112876414A中公开了一类基于多胺修饰的萘酰亚胺缀合物，公开了这类化合物在制备乳腺癌、肝癌或肺癌药物中的应用。没有公开其在制备预防和/或治疗肺动脉高压产品中的应用；并检索其他关于萘酰亚胺类化合物及其应用类文献，均未给出萘酰亚胺类化合物在治疗和/或预防肺动脉高压中的应用。
发明内容
针对的技术问题，本发明提出萘酰亚胺-多胺缀合物在制备预防和/或治疗肺动脉高压及其并发症的产品中的应用，这种药物可以通过抑制肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移，从而预防或者治疗肺动脉高压血管重构，改善肺小动脉血管中膜厚度、血管肌化水平。
一种萘酰亚胺-多胺缀合物在制备预防和/或治疗肺动脉高压及其并发症的产品中的应用，所述萘酰亚胺-多胺缀合物具有如式（I）所示的结构式：
（I）。
一种萘酰亚胺-多胺缀合物药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺动脉高压及其并发症的产品中的应用，所述萘酰亚胺-多胺缀合物具有如式（I）所示的结构式：
（I）。
所述药学上可接受的盐为由药学上可接受的无毒碱或酸制备的盐。
所述药学上可接受的盐为与以下酸形成的盐：磷酸、碳酸、盐酸、氢溴酸、硫酸、乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘液酸、硝酸、帕莫酸、泛酸、琥珀酸、酒石酸或对甲苯磺酸中的一种或多种。
所述药物为萘酰亚胺-多胺缀合物或其药学上可接受的盐与本领域常规辅料复配制成的产品。
所述产品包括药品、食品和保健品。
所述肺动脉高压及其并发症具有以下一种或多种指征：平均肺动脉压与右心室收缩压升高、右心扩大与右心功能紊乱、肺血管重构、肺小动脉中膜厚度与血管肌化增加以及肺动脉平滑肌细胞增殖迁移。
所述的化合物及其药学上可接受的盐对预防和/或治疗肺动脉高压的所起的作用包括扩大右心，改善肺小动脉血管中膜厚度、血管肌化水平、改善高压血管重构，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移。
所述产品的中式（I）萘酰亚胺-多胺缀合物或其药学上可接受的盐日有效剂量为1mg/kg-10mg/kg体重。
所述药品的给药途径为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。
所述产品的使用对象为包括人的哺乳动物。
为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。载体中：稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化纳、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素纳、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。载体中：例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。载体中：例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酶、明胶、半合成甘油酶等。
为了将给药单元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如，将本发明的组合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酶等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。
此外如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
本发明药用组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数等，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。可以根据本发明药用组合物中最后的制剂中所含有的实际有效药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求。
本发明提供的预防和/或治疗肺动脉高压药物，以每千克体重1-10mg如通式（I）所示的萘酰亚胺-多胺缀合物类化合物及其药学上可接受的盐的给药剂量，优选3mg/kg体重-6mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其它治疗药物或对症药物合并使用。
本发明具有以下有益效果：
1. 本发明提供萘酰亚胺-多胺缀合物类化合物及其药学上可接受的盐在预防和/或治疗肺动脉高压中的应用，本发明的研究结果表明，在哺乳动物雄鼠实验中，萘酰亚胺-多胺缀合物类化合物及其药学上可接受的盐在预防和/或治疗肺动脉高压中可以逆转重构血管，显著改善肺小动脉血管中膜厚度、血管肌化水平，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移；对于肺动脉高压血流动力学紊乱，矫正正平均肺动脉压、右心室收缩压、右心功能障碍、右心扩大方面效果显著。
2. 相对于现有技术中的药物，本发明提供的萘酰亚胺-多胺缀合物类化合物可以逆转血管重构，更是打破治疗瓶颈，改善患者生存质量的关键。
3. 上述药物给药后2周时间内即可产生显著的预防和/或治疗肺动脉高压效果，这种药物具有预防和/或治疗肺动脉高压效果显著、起效快、用药量少、副作用小等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为萘酰胺-多胺缀合物M2对5%FBS或PDGF-BB诱导的大鼠PASMCs细胞活力的影响；其中A：M2结构式；B：M2对5%FBS诱导的PASMCs细胞活力的影响；C：M2对PDGF-BB诱导的PASMCs细胞活力的影响。n=5，所有数据采用mean ± SEM，n = 5；*p<0.05，**p<0.01。
图2为萘酰胺-多胺缀合物M2抑制5%FBS或PDGF-BB诱导的大鼠PASMCs细胞增殖图；其中A：M2对5%FBS诱导的PASMCs细胞增殖的影响；B：EdU定量分析结果；C：M2对PDGF-BB诱导的PASMCs细胞增殖的影响；D：EdU定量分析结果；所有数据采用mean ± SEM，n = 5；**p<0.01。
图3为萘酰胺-多胺缀合物M2抑制5%FBS或PDGF-BB诱导的大鼠PASMCs细胞迁移图；其中A：M2对5%FBS诱导的PASMCs细胞迁移的影响；B：划痕24 h和48 h定量分析结果；C：M2对PDGF-BB诱导的PASMCs细胞迁移的影响；D：划痕24h和48h定量分析结果。所有数据采用mean± SEM，n = 5；**p<0.01。
图4为萘酰胺-多胺缀合物M2抑制5%FBS或PDGF-BB诱导的大鼠PASMCs细胞迁移图；其中A：M2对5%FBS诱导的PASMCs细胞迁移的影响；B：Transwell定量分析结果；C：M2对PDGF-BB诱导的PASMCs细胞迁移的影响；D：Transwell定量分析结果。所有数据采用mean ± SEM，n = 5；**p<0.01。
图5为萘酰胺-多胺缀合物M2对MCT诱导的PAH大鼠血流动力学的影响；A-D：各组RVSP代表性波形图；其中E：RVSP统计结果（n=12）；F：mPAP统计结果（n=12）；G：RVHI统计结果（n=12）。数据以mean ± SEM表示，bar = 50μm，***p<0.001。
图6为萘酰胺-多胺缀合物M2对MCT诱导的PAH大鼠肺血管重构的影响图；A：HE染色代表图；B：EVG染色代表图；C：免疫荧光双染代表图，绿色为VWF，红色为α-SMA。bar =50μm。
图7为萘酰胺-多胺缀合物M2对PDGF-BB诱导的大鼠PASMCs细胞转录组学研究图；其中A：PCA图，图中同一颜色的点表示组内的各个生物学重复，点与点之间的距离代表样品的整体表达差异。PC1、PC2等代表不同主成分；括号内数字代表主成分解释度；B：差异基因表达分布火山图，图中的散点代表不同基因，下调的显著差异基因用绿色表示，上调的显著差异基因用红色表示，无显著性差异的基因用蓝点表示；C：差异基因GO富集柱状图，横坐标为-log10处理后的p-value值，横坐标代表不同类型GO功能，红色表示生物学过程，蓝色表示分子功能，绿色表示细胞组分，纵坐标为具体功能描述；D：差异表达基因的KEGG富集气泡图，纵坐标表示pathway名称，横坐标表示pathway对应的p-value值。Rich factor的大小用点的颜色来表示，值越大则颜色越接近红色，每个pathway下包含的差异基因的多少用散点的大小来表示。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例及对比例实验对象为SD大鼠，购买于北京斯贝福实验动物科技有限公司，6-8周，雄性，体重在250 g左右，动物质量合格证编号：SCXK（京）2019-0010。
本发明实施例中的英文缩写为：
PASMCs细胞：大鼠肺动脉平滑肌细胞；
PBS：磷酸缓冲盐溶液；
PDGF-BB：血小板衍生因子；
FBS：胎牛血清；
DMEM：低糖培养基；
MCT：野百合碱；
Trizol试剂：总RNA提取试剂；
EVG染色：组织病理学染色；
PCA：主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法，又称主分量分析。
Triton-100：是一种常用的非离子型的表面活性剂和乳化剂，经常用于生化应用以溶解蛋白质。它被视为一种不变性的相对温和的洗涤剂，它用于裂解细胞以提取蛋白和细胞器，还可通透活细胞膜用于转染；
SPF级实验大小鼠：即无特定病原体的大小鼠，是指除清洁大小鼠应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的实验大小鼠；
Transwell实验：细胞迁移与侵袭实验，将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酷膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酷膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究；
EdU：一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性；
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
本发明实施例所用试剂耗材如表1所示：
表1：
本发明实施例主要仪器如表2所示：
表2 ：
本发明实施例所采用的分析软件如表3所示：
表3：
实施例1
实验一：MTT法检测大鼠PASMCs细胞活力的影响
1.实验过程
1.1 大鼠PASMCs的分离获取
用戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉SD大鼠，75%酒精消毒，在无菌条件下依次切开胸部皮肤、胸壁、肌层，剪断肋骨，暴露胸腔，用眼科镊提起肺叶，剪断肺门。分离的肺叶立即放入装有青链霉素及PBS的培养皿中，迅速转入细胞培养室的超净工作台。在超净台内迅速分离出肺主动脉血管，剔除粘连在血管周围脂肪和纤维结缔组织，预冷PBS冲洗血管内残余血液，沿肺动脉纵轴剪开暴露内壁，刮去内膜，切成1.5 mm × 1.5 mm的小动脉片，将小动脉片贴于10 cm细胞培养皿。置于超净台中晾干数分钟使组织片粘于培养皿底部，缓慢加入含10%FBS的 DMEM培养基 8 mL，置于37°C，5% CO2培养箱培养。每3天更换一次培养基，约1周后，细胞融合达到70～80%，0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，传代。
1.2 MTT法检测大鼠PASMCs的细胞活力
接种原代培养的大鼠PASMCs细胞悬液至96孔板，8×103个/孔，37°C，5% CO2培养箱中培养。待细胞汇合度至70~80%，撤血清进行“饥饿”培养24 h使细胞同步化，加入萘酰胺-多胺缀合物M2（3 μmol/L）或相应的对照预处理1 h。然后加入5%FBS或PDGF-BB（20 ng/mL）或相应的对照处理24 h。用MTT法检测PASMCs的细胞活力。
2.实验结果
首先通过MTT法检测萘酰胺-多胺缀合物M2对5%FBS或PDGF-BB诱导的大鼠PASMCs细胞活力的影响。结果发现，与对照组（control）相比，5%FBS或PDGF-BB可显著增加大鼠PASMCs的细胞活力，而M2（3 μmol/L）预处理可显著降低细胞活力（如图1所示）。
实验二：Edu法检测大鼠PASMCs增殖能力的影响
1.实验过程
1.1大鼠PASMCs的分离获取
用戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉SD大鼠，75%酒精消毒，在无菌条件下依次切开胸部皮肤、胸壁、肌层，剪断肋骨，暴露胸腔，用眼科镊提起肺叶，剪断肺门。分离的肺叶立即放入装有青链霉素及PBS的培养皿中，迅速转入细胞培养室的超净工作台。在超净台内迅速分离出肺主动脉血管，剔除粘连在血管周围脂肪和纤维结缔组织，预冷PBS冲洗血管内残余血液，沿肺动脉纵轴剪开暴露内壁，刮去内膜，切成1.5 mm×1.5 mm的小动脉片，将小动脉片贴于10 cm细胞培养皿。置于超净台中晾干数分钟使组织片粘于培养皿底部，缓慢加入含10% FBS的 DMEM培养基8 mL，置于37°C，5% CO2培养箱培养。每3天更换一次培养基，约1周后，细胞融合达到70～80%，0.25 %胰蛋白酶消化制成细胞悬液，传代。
1.2 EdU法检测大鼠PASMCs增殖能力的影响
接种原代培养的大鼠PASMCs细胞悬液至96孔板，8×103个/孔，37°C，5%CO2培养箱中培养。待细胞汇合度至70~80%，撤血清进行“饥饿”培养24 h使细胞同步化，加入萘酰胺-多胺缀合物M2（3 μmol/L）或相应的对照预处理1 h。然后加入5% FBS或PDGF-BB（20 ng/mL）或相应的对照处理24 h。
处理结束后，用细胞完全培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液（试剂A），制备适量50 μM EdU培养基，继续孵育细胞4 h。弃培养基，PBS清洗1-2次，每次5 min；每孔加入50 μL4%多聚甲醛室温孵育30 min，弃固定液；加入50 μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5 min后，弃甘氨酸溶液，加入100 μL PBS，脱色摇床清洗5 min，弃PBS；加入100μL渗透剂（0.5%TritonX-100的PBS）脱色摇床孵育10 min，PBS清洗1次，5 min；加入100μL的1×Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；加入100μL渗透剂（0.5%TritonX-100的PBS）脱色摇床清洗2-3次，每次10 min，弃渗透剂，PBS洗5 min；100:1比例稀释F，制备适量1×Hoechst，每孔100μL，避光孵育30min，PBS清洗1次5min；加100μL PBS，使用荧光显微镜进行拍照，并使用软件image J计算各个图像内Edu着色阳性百分比。
2. 实验结果
PASMCs过度增殖和迁移是肺血管重构的主要病理驱动因素。因此，我们观察了萘酰胺-多胺缀合物M2对大鼠PASMCs增殖和迁移的影响。我们通过EdU实验检测M2对5%FBS或PDGF-BB诱导的大鼠PASMCs增殖的影响，结果提示5%FBS或PDGF-BB刺激可诱导大鼠PASMCs过度增殖，而使用M2（3μmol/L）预处理可显著抑制5%FBS或PDGF-BB刺激诱导的大鼠PASMCs过度增殖（如图2所示）。
实验三：划痕实验和Transwell法检测大鼠PASMCs的迁移能力
1.实验过程
1.1 大鼠PASMCs的分离获取
用戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉SD大鼠，75%酒精消毒，在无菌条件下依次切开胸部皮肤、胸壁、肌层，剪断肋骨，暴露胸腔，用眼科镊提起肺叶，剪断肺门。分离的肺叶立即放入装有青链霉素及PBS的培养皿中，迅速转入细胞培养室的超净工作台。在超净台内迅速分离出肺主动脉血管，剔除粘连在血管周围脂肪和纤维结缔组织，预冷PBS冲洗血管内残余血液，沿肺动脉纵轴剪开暴露内壁，刮去内膜，切成1.5mm×1.5mm的小动脉片，将小动脉片贴于10 cm细胞培养皿。置于超净台中晾干数分钟使组织片粘于培养皿底部，缓慢加入含10%FBS的 DMEM培养基8mL，置于37°C，5% CO2培养箱培养。每3天更换一次培养基，约1周后，细胞融合达到70～80%，0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，传代。
1.2 划痕实验：接种原代培养的大鼠PASMCs细胞悬液至6孔板，5×105个/孔，37°C，5% CO2培养箱中培养。待细胞汇合度至70~80%，撤血清进行“饥饿”培养24h使细胞同步化，加入萘酰胺-多胺缀合物M2（3μmol/L）或相应的对照预处理1 h。用200μL枪头划痕，拍0h照片，5%FBS或PDGF-BB诱导24h，拍24h照片和48 h照片。
1.3 Transwell实验：
收集提前饥饿好的细胞（含0.5%FBS的DMEM培养基饥饿24 h）于离心管中，800 r/min离心5 min，加入1mL培养基重悬细胞。用计数板进行细胞计数。接种200μL含萘酰胺-多胺缀合物M2（3μmol/L）、5%FBS或PDGF-BB（20ng/mL）或对照预处理PASMCs悬液（细胞密度为5×104/孔）于Transwell上层嵌入式小室。下层加入600μL 5%FBS的DMEM培养基，将细胞板置入37°C，5% CO2孵育24 h。随后用棉签去除上层嵌入式小室内多余细胞，小室下层用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤2遍，然后用0.1%结晶紫溶液染色小室下层面的细胞30 min，PBS洗涤2遍，小室自然风干室温放置过夜，次日于倒置显微镜下拍照记录，统计各处理组PASMCs迁移率。
2. 实验结果
采用划痕实验验证萘酰胺-多胺缀合物M2对5%FBS或PDGF-BB诱导的大鼠PASMCs细胞迁移的影响，如图3所示，相比于正常对照组细胞，5% FBS或PDGF-BB处理的细胞迁移数目明显增多；而加入M2（3 μmol/L）干预后，细胞迁移的数目较5% FBS或PDGF-BB组明显减少（图3）。表明5%FBS或PDGF-BB可以引起细胞迁移数量增加，增强细胞迁移能力；M2可以减少5% FBS或PDGF-BB诱导的细胞迁移。
为了进一步验证萘酰胺-多胺缀合物M2对5%FBS或PDGF-BB诱导的大鼠PASMCs细胞迁移的影响，采用Transwell实验评估各组细胞的迁移能力。如图4所示，相比于正常对照组细胞，5%FBS或PDGF-BB处理的细胞迁移数目明显增多；而加入M2（3 μmol/L）干预后，细胞迁移的数目较5%FBS或PDGF-BB组明显减少（图4）。表明5% FBS或PDGF-BB可以引起细胞迁移数量增加，增强细胞迁移能力；M2可以减少5% FBS或PDGF-BB诱导的细胞迁移。
实验四、动物实验分组设计及肺动脉高压模型的建立
1. 实验过程
1.1 实验动物分类处理
将48只SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组、对照+给药组、MCT造模组和MCT造模+给药组。MCT造模组和MCT造模+给药组SD大鼠皮下注射55 mg/kg MCT，对照组和对照+给药组SD大鼠用等量的生理盐水代替。在第3周给药组腹腔注射3 mg/kg萘酰胺-多胺缀合物M2，其余组腹腔注射等体积生理盐水，给药2周。
1.2 右心导管法测定右心室收缩压（RVSP）和平均肺动脉压（mPAP）
给药结束后对所有SD大鼠进行右心导管插管，检测右心室收缩压（RVSP）和平均肺动脉压（mPAP）。步骤简述如下：各组SD大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠，等待数分钟大鼠完全麻醉后置于木板固定架上，将大鼠仰卧然后固定其四肢和头部。血管钳钝性分离周围组织并充分暴露右颈外静脉，在远心端结扎颈外静脉，预留牵引线，近心端用动脉夹固定。在右颈外静脉近心端呈45°角斜行剪开血管直径的1/3，并迅速沿此切口方向将备用的预先充满含肝素钠生理盐水的PE50导管插入血管0.5-1.0 cm，期间不断调整导管尖端朝向以顺畅通过。随即继续插入2-3 cm到达右心房后，再缓慢提拉转动导管，使其进入右心室，待监视器出现典型的右心室波形后，稳定2 min记录RVSP，往前再进入约5 mm就可以到达肺动脉。当出现典型的肺动脉压力波形时，稳定2 min记录mPAP。并通过Powerlab数据采集和分析系统对数据进行处理。如图4所示。
1.3 右心室肥厚指数（RVHI）的测定
右心导管插管结束后，处死大鼠，取出心脏，剪去左右心房及大血管根部组织，将右心室游离壁小心分离，再将分离下来的右心室游离壁（RV）及剩余的左心室和室间隔（LV+S）用滤纸吸去水分后称重，将重量代入公式计算右心室肥厚指数：RVHI＝RV/（LV+S）。
1.4 石蜡包埋
新鲜肺组织固定于4%多聚甲醛48 h以上，将肺组织从固定液取出，放于脱水盒内，流水过夜。第二天在脱色摇床上用PBS清洗组织3次，每次15 min。然后将脱水盒依次放进梯度酒精进行脱水，酒精浓度梯度依次递增，分别为50%、60%、70%、80%、90%、95% Ⅰ、95% Ⅱ、100% Ⅰ和100% Ⅱ，各0.5 h，脱水后再将肺组织放置于二甲苯I、II中透明10 min，待肺组织透明充分后浸蜡，软蜡2 h，硬蜡I和硬蜡II各1.5 h。将浸好蜡的肺组织置于包埋模具中进行石蜡包埋，石蜡凝固后将蜡块从包埋模具中取出，并用小刀修整蜡块。
1.4.1 染色
使用石蜡切片机将肺组织切成5 μm的切片，切片在42℃恒温水浴锅中充分展片，待组织伸展后黏附于一次性载玻片上。将肺组织切片放置于65 °C电热鼓风干燥箱中烘烤1.5 h以去除水分，在二甲苯I和Ⅱ中分别放置20 min脱去切片样本中的石蜡，然后将切片依次在100%乙醇I、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇I和95%乙醇Ⅱ中放置5 min，在80%乙醇、60%乙醇、蒸馏水中放置3min以达到复水的目的。用滤纸条将载玻片擦干，向肺组织上滴加适量苏木精进行染色（约3min），水洗终止染色，使细胞核着色，将切片放置在1%盐酸乙醇溶液中（约5min），使细胞核颜色分化为蓝色。将切片依次放置在60%、70%和80%的乙醇溶液2min进行脱水，将载玻片用滤纸条擦干，向肺组织上滴加适量伊红进行染色（约2min），水洗终止染色，使细胞质着色。之后将载玻片经100%乙醇脱水5min，二甲苯透明5min后，滴加中性树胶进行封片，最后用正置显微镜拍照记录。
1.4.2 EVG染色
将切片依次放入环保型脱蜡液Ⅰ 20min—环保型脱蜡液Ⅱ 20min—无水乙醇Ⅰ5min—无水乙醇Ⅱ 5 min—75%酒精5min，自来水洗。然后将EVG染液A：EVG染液B：EVG染液C= 5：2：2混合成EVG染液（提前2天配置），切片入EVG染液染5 min，自来水冲洗。EVG染液B稀释1倍后稍分化一下，自来水洗一下，如此反复操作，在显微镜下控制分化程度，至弹力纤维呈紫黑色，背景呈灰白色近无色。EVG染液E 9 mL加入EVG染液D 1mL混合成EVG染液（按比例配制用多少配多少），染1-3min（染色时间视组织中弹力纤维成分而定，染色时间过短胶原颜色浅，染色时间过长弹力纤维会褪色），快速水洗，无水乙醇三缸快速脱水。最后使用两缸干净的二甲苯透明各20s、5min（二甲苯专用不与其他二甲苯共用），中性树胶湿封。显微镜镜检，图像采集分析。
1.4.3免疫荧光双染
将5 μm肺组织石蜡切片放置于80℃烘箱烘烤1.5 h，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各脱蜡15min后，于一系列浓度递减的酒精溶液（100% Ⅰ、100% Ⅱ、95% Ⅰ、95% Ⅱ、90%、85%、80%、75%、和70%）中复水5 min；PBS清洗3次，5 min/次；滴加3%H2O2室温避光孵育10 min，PBS冲洗3次，3min/次，滤纸吸干，再滴加0.3%Triton-100溶液，室温孵育10 min，PBS（磷酸缓冲液）冲洗3次，5 min/次，滤纸吸干，微波修复，高火（微波炉P100）修复，6 min/次，每次修复后需要冷却至室温，补加EDTA(乙二胺四乙酸二钠)修复溶液再进行下一次。PBS冲洗3次，5 min/次，滤纸吸干，滴加5%BSA(牛血清蛋白)滴加覆满组织，室温孵育30 min。孵一抗，于湿盒中，4℃过夜。第二天早上，补加一抗，37℃烘箱放置45 min，PBS清洗3次，3 min/次，滤纸吸干，孵育二抗，室温避光孵育1 h左右；滴加DAPI(荧光染料)（10 μg/mL）溶液，避光孵育10 min，PBS清洗3次，3 min/次，滴加适量防荧光猝灭剂，盖玻片进行封片，荧光显微镜下进行观察。
2.实验结果
PAH的重要表型之一是肺血管阻力升高，表现为异常的肺血流动力学指标。右心导管是测量肺血流动力学指标的重要检测方法，是评估PAH严重程度的主要方法之一。为了全面评估萘酰胺-多胺缀合物M2对MCT诱导的肺动脉高压的表型关系，本研究首先利用右心导管检测肺血流动力学指标，主要指标包括RVSP和mPAP，并通过检测RVHI来体现大鼠右心室重构的变化。结果显示与对照组相比，MCT造模组RVSP、mPAP和RVHI都升高，说明该模型建立成功。其次，萘酰胺-多胺缀合物M2给药组与模型组相比，各项肺血流动力学指标都减轻，差异具有明显的统计学意义（图5）。总之，该结果表明萘酰胺-多胺缀合物M2可以明显降低MCT诱导的肺血流动力学指标升高和右心肥厚。
除了肺血流动力学指标，PAH的主要病理改变是肺血管重构，尤其是肺小动脉和肺微血管的改变，表现为肺血管内膜增殖、中膜增厚，严重时可导致血管管腔狭窄甚至完全闭塞。肺血管病理是评估PAH严重程度的金标准，因此，本研究利用肺组织切片HE染色和EVG染色评估肺血管重构的严重程度。结果表明与对照组相比，MCT造模组血管壁厚度明显增厚，而M2治疗后血管壁厚度明显降低（图6 A-B）。
最后将各组肺组织切片进行内皮细胞标记物（VWF，绿色）和平滑肌标记物（α-SMA，红色）免疫荧光染色，可以观察到与对照组切片相比，MCT造模组内皮细胞层明显的不规则化，原有的平滑内壁消失，内皮层由平滑肌细胞层层包裹、增厚，血管腔变狭窄，一定程度上也造成右心室后阻力增大，导致肺动脉压力升高，而萘酰胺-多胺缀合物M2治疗后可以改善上述现象（图6 C）。
实验五 转录组学研究
1.实验过程
1.1 样本的收集
接种原代培养的大鼠PASMCs细胞悬液至10 cm培养皿中，37°C，5% CO2培养箱中培养。待细胞汇合度至70~80%，撤血清进行“饥饿”培养24 h使细胞同步化，加入萘酰胺-多胺缀合物M2（3 μmol/L）或相应的对照预处理1 h。然后加入PDGF-BB（20 ng/mL）或相应的对照处理24 h。细胞用PBS清洗2次，加入1 mL Trizol裂解液，用细胞刮刮下细胞，转移至1.5 mLEP管中。
1.2 RNA的提取
使用Trizol试剂从细胞沉淀中提取总RNA。采用Nanodrop ND-2000检测RNA样本的A260/A280吸光度比，Agilent Bioanalyzer 4150测定RNA的RIN值。
1.3 建库和测序
按照ABclonal mRNA-seq Lib Prep Kit说明书制备PE文库。使用oligo磁珠从1 μg总RNA中纯化mRNA，然后在ABclonal First Strand Synthesis Reaction Buffer中进行mRNA片段化。随后，以mRNA片段作为模板，使用随机引物和逆转录酶合成cDNA的第一链，然后使用DNA聚合酶I，RNAseH，缓冲液和dNTPs合成cDNA的第二链。将合成的双链cDNA片段连接接头序列，用于PCR扩增，纯化PCR产物，并使用Agilent Bioanalyzer 4150评估文库质量。 最后，使用NovaSeq 6000测序平台PE150进行测序。
1.4 数据分析
在Illumina平台生成的数据用于生物信息学分析。fastq格式的原始数据首先通过perl脚本进行处理，过滤掉低质量和无法确定信息的碱基比大于5％的reads，得到cleanreads再与参考基因进行对比，获得用于后续分析的mapped reads 5%。Feature Counts根据基因的长度计算每个基因的FPKM值。使用DESeq2筛选差异表达基因，对差异基因进行GO和KEGG富集分析。
1.5 统计分析
使用GraphPad Prism 8进行数据分析，实验结果以平均值 ± 标准误（mean ±SEM）表示。采用one-way ANOVA方差分析进行数据统计，任意组间差异使用Kruskal–Wallis多重比较检验法进行分析，p<0.05认为差异具有统计学意义。
2. 结果分析
为将各组间数据进行差异性对比分析，使用R语言的DESeq软件包，根据表达量对各样品进行PCA主成分分析，具有相似性质的样本聚类至统一区域，组间差异样本将具有区别性区分。如图所示，PDGF-BB模型组和PDGF-BB+M2给药组组间样本有明显的分离，组内比较聚集，说明模型稳定且可靠（图7 A）。
为进一步筛选萘酰胺-多胺缀合物M2治疗PAH的差异基因，采用R语言ggplots2软件包绘制差异表达基因的火山图（图7B），以p<0.05和|log2foldchange|>1作为差异基因的阈值筛选各组间差异基因。如图7B所示，PDGF-BB+M2给药组和PDGF-BB模型组相比，共筛选出7075个差异基因，其中上调差异基因4846个，下调差异基因2211个。
接下来为探究萘酰胺-多胺缀合物M2治疗对生物进程的影响，我们对得到的差异表达基因进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析。GO富集主要分为生物过程（Biological process，BP）、细胞组成（Cellular component，CC）和分子功能（Molecularfunction，MF）3大类。如图7 C所示，差异基因在BP中主要差异基因体现在通过质膜粘附的细胞-细胞粘附（cell-cell adhesion via plasma-membrane adhesion）、血液循环（bloodcirculation）、核分裂（nuclear division）、有丝分裂核分裂（mitotic nucleardivision）和循环系统过程（circulatory system process）等。差异基因在CC中主要差异基因体现在DNA包装复合物（DNA packagingcomplex）、核小体（nucleosome）、受体复合物（receptor complex）、蛋白质-DNA复合物（protein-DNAcomplex）和细胞外基质（extracellular matrix）等。差异基因在MF中主要差异基因体现在受体配体活性（receptor ligand activity）、生长因子活性（growth factoractivity）、受体调节活性（receptor regulator activity）、门控通道活性（gated channel activity）和离子门控通道活性（iongated channel activity）等。
最后对PDGF-BB+M2给药组和PDGF-BB模型组组间差异基因进行了KEGG pathway富集分析。富集分析中将富集最显著的前20个通路进行展示，如图7 D所示，其中主要涉及钙离子信号通路（Calcium signaling pathway）、细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokinereceptor interaction）、Rap1信号通路（Rap1 signaling pathway）和ECM-受体相互作用（ECM-receptor interaction）等信号通路，这些信号通路与PAH的发展密切相关。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种萘酰亚胺-多胺缀合物在制备预防和/或治疗肺动脉高压及其并发症的产品中的应用，其特征在于，所述萘酰亚胺-多胺缀合物具有如式（I）所示的结构式：
（I）。
2.一种萘酰亚胺-多胺缀合物药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺动脉高压及其并发症的产品中的应用，其特征在于，所述萘酰亚胺-多胺缀合物具有如式（I）所示的结构式：
（I）。
3.根据权利要求2所述的萘酰亚胺-多胺缀合物药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺动脉高压及其并发症的产品中的应用，其特征在于：所述药学上可接受的盐为由药学上可接受的无毒碱或酸制备的盐。
4.根据权利要求3所述的萘酰亚胺-多胺缀合物药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺动脉高压及其并发症的产品中的应用，其特征在于：所述药学上可接受的盐为与以下酸形成的盐：磷酸、碳酸、盐酸、氢溴酸、硫酸、乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘液酸、硝酸、帕莫酸、泛酸、琥珀酸、酒石酸或对甲苯磺酸中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：所述产品为萘酰亚胺-多胺缀合物或其药学上可接受的盐与本领域常规辅料复配制成的产品。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述产品包括药品、食品和保健品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肺动脉高压及其并发症具有以下一种或多种指征：平均肺动脉压与右心室收缩压升高、右心扩大与右心功能紊乱、肺血管重构、肺小动脉中膜厚度与血管肌化增加以及肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述产品的中式（I）萘酰亚胺-多胺缀合物或其药学上可接受的盐日有效剂量为1mg/kg-10 mg/kg体重。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药品的给药途径为肠道或非肠道。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述产品的使用对象为包括人的哺乳动物。
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