CN117965645A - 一种提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法及应用 - Google Patents
一种提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117965645A CN117965645A CN202410370019.9A CN202410370019A CN117965645A CN 117965645 A CN117965645 A CN 117965645A CN 202410370019 A CN202410370019 A CN 202410370019A CN 117965645 A CN117965645 A CN 117965645A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hydrogen production
- clostridium
- fermentation
- production rate
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 88
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 title claims abstract description 88
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 88
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- MSSUFHMGCXOVBZ-UHFFFAOYSA-N anthraquinone-2,6-disulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2C(=O)C3=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C3C(=O)C2=C1 MSSUFHMGCXOVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 17
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 14
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 13
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 11
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 11
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 10
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 9
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 9
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 claims description 7
- VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K aluminium trichloride Chemical compound Cl[Al](Cl)Cl VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 6
- RBCOYOYDYNXAFA-UHFFFAOYSA-L (5-hydroxy-4,6-dimethylpyridin-3-yl)methyl phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP([O-])([O-])=O)C(C)=C1O RBCOYOYDYNXAFA-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910021581 Cobalt(III) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910021577 Iron(II) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 5
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical class OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7, Chemical compound [Co+3].N#[C-].C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L 0.000 claims description 5
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L iron dichloride Chemical compound Cl[Fe]Cl NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims description 5
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 claims description 5
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims description 5
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 claims description 5
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 5
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 claims description 5
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940115134 folic acid 0.04 mg Drugs 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 claims description 2
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000193469 Clostridium pasteurianum Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N [4-fluoro-2-(hydroxymethyl)phenyl]methanol Chemical compound OCC1=CC=C(F)C=C1CO VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法及应用。本发明通过将将梭菌接种于暗发酵培养基，添加蒽醌‑2、6‑二磺酸盐，在振荡条件下厌氧避光发酵，得到氢气。本发明所提供的方法可以显著提高梭菌发酵产氢量与产氢速率，且操作简便，易于实现大规模的工业应用。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵领域，特别涉及一种提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法及应用。
背景技术
氢气是一种高能量密度的能源，其有氧燃烧的产物是水，作为燃料几乎不会对环境造成污染，是公认的清洁能源。可再生氢能是我国未来新能源技术发展的出路之一。目前氢气的主要来源于化石能源重整、电解盐溶液等方式，能量消耗巨大，碳排放高且不可持续。相较于传统的产氢方式，微生物暗发酵产氢具有反应条件温和，全天候进行、性能稳定、碳排放较低，不消耗矿物资源等诸多优点。微生物暗发酵产氢是一种可持续的、环境友好的制氢方式，适宜工业化的应用，在未来有望成为主要制氢方式。然而，目前微生物发酵产氢工业中的产氢成本较高、滞后期较长、反应周期较长、底物发酵转化率较低等是影响其应用的重要原因。
因此，需要研究更有利于微生物发酵产氢的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法。
本发明的另一目的在于提供上述提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法，包括如下步骤：将梭菌接种于暗发酵培养基，添加蒽醌-2、6-二磺酸盐（AQDS），在振荡条件下厌氧避光发酵，得到氢气。
所述的梭菌优选为巴氏梭菌DSM 525。
所述的梭菌优选为处于对数生长期的梭菌种子液。
所述的梭菌种子液优选通过如下步骤制备得到：将梭菌保藏菌种接种于种子培养基中，富集培养，得到梭菌种子液。
所述的梭菌保藏菌种接种的量为种子培养基体积的1～10%；优选为5%。
所述的种子培养基的组成优选如下：蛋白胨 0.5～1 g/L，NaCl 4～6 g/L，K2HPO41.8～2.2 g/L，KH2PO40.4～0.6 g/L，半胱氨酸盐酸盐 0.4～0.6 g/L，2-(N-吗啡啉)乙磺酸 38～42mM，微量元素浓缩液 9～11 mL/L，葡萄糖1.8～2.2 g/L，pH=5.8～6.2；更优选如下：蛋白胨 1 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO42.1 g/L，KH2PO40.544 g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L， 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 40mM，微量元素浓缩液 10 mL/L，葡萄糖2 g/L，pH=6。
所述的富集培养的条件优选如下：在厌氧条件下于35～40℃避光静置培养；更优选为在厌氧条件下于37℃避光静置培养。
所述的厌氧条件是将装有种子培养基的容器中的顶空气体置换为氮气得到。
所述的富集培养的培养时间优选为10～14 h；更优选为12 h。
所述的暗发酵培养基为磷酸盐缓冲、底物为葡萄糖的培养基；其组成优选如下：NaCl 4～6 g/L，K2HPO420～40mM，KH2PO420～40mM，蛋白胨 0.5～1 g/L，半胱氨酸盐酸盐0.4～0.6 g/L，微量元素浓缩液 9～11 mL/L，葡萄糖1.8～2.2 g/L，pH=6.5～7.5；更优选如下：NaCl 5 g/L，K2HPO430mM，KH2PO430mM，微量元素浓缩液 10 mL/L，半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，蛋白胨 1 g/L，葡萄糖2 g/L，pH=7。
微量元素浓缩液的组成如下：CaCl2·2H2O 0.2 g/L，MgCl2·6H2O 2 g/L，FeCl2·4H2O 40 mg/L，ZnCl21mg/L，MnCl2·4H2O 1 mg/L，CuCl2·2H2O 0.6 mg/L，Na2MoO41 mg/L，AlCl31 mg/L，CoCl3·6H2O 4 mg/L，硼酸饱和溶液 20 μL，浓度为12 mol/L的浓盐酸 20 μL，生物素0.04 mg/L，叶酸 0.04 mg/L，维生素B60.2 mg/L，核黄素0.1 mg/L，维生素B10.1mg/L，烟酸 0.1 mg/L，维生素B120.1 mg/L，对氨基苯甲酸（4-氨基苯甲酸） 0.1 mg/L，泛酸0.1 mg/L。
所述的梭菌接种的量为暗发酵培养基体积1～5%；更优选为暗发酵培养基体积1%。
所述的蒽醌-2、6-二磺酸盐的终浓度优选为30～120μmol/L；更优选为50～100μmol/L。
所述的振荡的转速优选为150～250rpm；更优选为200rpm。
所述的厌氧是将梭菌接种于暗发酵培养基后用氮气除氧得到，环境气氛为氮气。
所述的厌氧避光发酵的温度优选为35～40℃；更优选为37℃。
所述的厌氧避光发酵的时间优选为18 h以上；更优选为18～24 h。
上述提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法在氢气制备中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果
（1）本发明所提供的方法，可以高效提高梭菌发酵产氢量与产氢速率，有推广潜质；
（2）本发明所提供的方法具有操作简便、实用性强的特点，有利于大规模的工业应用。
附图说明
图1是在200rpm振荡培养或静置培养时巴氏梭菌DSM 525的生长代谢情况图；其中，(A)为生物量，(B)为产氢量。
图2是在200rpm振荡培养时巴氏梭菌DSM 525在含不同浓度AQDS的培养基中的生长代谢情况图；其中，(A)为生物量，(B)为产氢量，(C)为前15h平均产氢速率，(D)为氢气积累量。
图3是静置培养时巴氏梭菌DSM 525在含不同浓度AQDS的培养基中的生长代谢情况图；其中，(A)为生物量，(B)为产氢量。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
（1）以巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）DSM 525（购置于德国微生物菌种保藏中心DSMZ，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）为菌种，按5%（v/v）种子培养基的接种量将DSM 525接种于种子培养基，得到培养液，培养体系为20 mL培养液/120mL西林瓶，顶空气体置换为氮气，培养条件为37℃避光静置培养12h，获得梭菌种子液。
种子培养基，其配方如下：
胰蛋白胨1 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO42.1 g/L，KH2PO40.544 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐 0.5 g/L，2-(N-吗啡啉)乙磺酸 40mM，微量元素浓缩液 10 mL/L，葡萄糖2 g/L，pH=6。
微量元素浓缩液（1L）成分如下：
CaCl2·2H2O 0.2 g/L，MgCl2·6H2O 2 g/L，FeCl2·4H2O 40 mg/L，ZnCl21mg/L，MnCl2·4H2O 1 mg/L，CuCl2·2H2O 0.6 mg/L，Na2MoO41 mg/L，AlCl31 mg/L，CoCl3·6H2O 4mg/L，硼酸饱和溶液 20 μL，浓盐酸（12 mol/L） 20 μL，生物素0.04 mg/L，叶酸 0.04 mg/L，维生素B60.2 mg/L，核黄素0.1 mg/L，维生素B10.1 mg/L，烟酸 0.1 mg/L，维生素B120.1mg/L，对氨基苯甲酸 0.1 mg/L，泛酸 0.1 mg/L。
（2）将梭菌种子液按1%培养基体积比接种到梭菌暗发酵培养基，得到培养液。培养体系为40 mL培养液/120 mL西林瓶，顶空气体置换为氮气，培养条件为37℃避光，静置或摇床200rpm转速振荡培养。
暗发酵培养基，其配方如下：
NaCl 5 g/L，K2HPO430 mmol/L，KH2PO430 mmol/L，胰蛋白胨 1g/L，半胱氨酸盐酸盐 0.5 g/L，微量元素浓缩液 10 mL/L，葡萄糖2 g/L，pH=7。
微量元素浓缩液（1L）成分如下： CaCl2·2H2O 0.2 g/L，MgCl2·6H2O 2 g/L，FeCl2·4H2O 40 mg/L，ZnCl21mg/L，MnCl2·4H2O 1 mg/L，CuCl2·2H2O 0.6 mg/L，Na2MoO41mg/L，AlCl31 mg/L，CoCl3·6H2O 4 mg/L，硼酸饱和溶液 20 μL，浓盐酸（12 mol/L） 20 μL，生物素0.04 mg/L，叶酸 0.04 mg/L，维生素B60.2 mg/L，核黄素0.1 mg/L，维生素B10.1 mg/L，烟酸 0.1 mg/L，维生素B120.1 mg/L，对氨基苯甲酸 0.1 mg/L，泛酸 0.1 mg/L。
（3）通过测定培养液OD600反应梭菌生物量，通过气相色谱测定梭菌产氢量。
气相色谱分析方法：从西林瓶中取0.2 mL气体，利用气相色谱仪（安捷伦7820）对H2浓度进行测定。气相色谱仪以N2为载气，流速为10 mL·min-1，TCD检测器、进样口和柱温箱各温度设置分别为: 150℃、80℃和80℃。
产氢量计算方法：根据理想气体状态方程PV=nRT（P：气体分压；V：气体体积；n：气体物质的量；R：普适气体常数；T：气体温度），将气相色谱测定的数据换算成氢气摩尔质量。
最大产氢速率计算方法：根据Gompertz发酵模型H=Pexp{-exp[Rme(λ-t)/P+1]}（H：累积产氢量；P：氢势；Rm：最大产氢速率；λ：滞后期），将氢气随时间的变化趋势进行拟合获得最大产氢速率。
（4）结果如图1所示：培养至18h，振荡培养条件下梭菌的最大氢气积累量为0.61mmol，相较静置培养（0.52mmol）提高17.3%。然而，振荡条件下细菌的最大OD600值（1.0）相较静置培养（1.1）降低了9%；振荡条件下到达最大OD600值所需时间（15h）相较静置培养（12h）培养延长了25%；环境适应期，振荡培养为4h，静置培养为2h，可见振荡培养相较静置培养增长50%。结果表明，梭菌暗发酵引入振荡操作可以提高梭菌产氢总量，但会降低梭菌的生长速度，增加延滞期，延长发酵时间。
实施例2
（1）梭菌菌种、富集方法及种子培养基配方同上。
（2）将梭菌种子液按1%培养基体积比接种到梭菌暗发酵培养基（暗发酵培养基成分同上），添加不同终浓度的AQDS（0、50、100 μmol/L），得到培养液。培养体系为40 mL培养液/120 mL西林瓶，顶空气体置换为氮气，培养条件为37℃避光，摇床200 rpm振荡培养。对照组条件为静置且不添加AQDS。梭菌生物量及产氢量的测定方法同上。
（3）结果如图2所示：200 rpm振荡培养条件下，0、50、100 μmol/L AQDS实验组的培养液最大OD600值均约为0.83，氢气产量依次为0.60、0.57、0.60 mmol，可见在不同AQDS浓度下振荡培养最大OD600值和氢气产量无显著性差异；到达最大OD600值的时间依次为26、21、21h，可见AQDS可以加快梭菌生长速率；最大产氢速率分别为0.09、0.12、0.16 mmol/h，而前15h平均产氢速率分别为0.009、0.029、0.035 mmol/h，可见，最大产氢速率和前15h平均产氢速率随着AQDS浓度的增加而增加。这一结果说明在振荡培养条件下，AQDS的添加可以在加快梭菌生长速度与产氢速度的同时维持其较高的产氢量。
发酵培养24h，相比于静置培养条件，200rpm振荡培养时额外添加50 μmol/L和100μmol/L AQDS使梭菌DSM 525发酵产氢的产氢量分别提高了11.8%、17.6%，发酵至中期（15h）平均产氢速率分别提高了70.6%、105.9%。这一结果说明相比于静置培养，振荡培养加AQDS的组合可以同时提升DSM525的产氢量和产氢速率。由于该方法效果突出、操作简单、且成本低廉，具有极佳的应用前景。
实施例3
（1）梭菌菌种、富集方法及种子培养基配方同上。
（2）将梭菌种子液按1%培养基体积比接种到梭菌暗发酵培养基（暗发酵培养基成分同上），添加不同终浓度的AQDS（0、50、100 μmol/L），得到培养液。培养体系为40 mL培养液/120 mL西林瓶，顶空气体置换为氮气，培养条件为37℃避光，静置培养。梭菌生物量及产氢量的测定方法同上。
（3）结果如图3所示：静置培养30h，0、50、100 μmol/L AQDS实验组氢气产量与培养液最大OD600（均约为0.83）无显著性差异，最大产氢速率（均约为0.09 mmol/h）同样无明显差异。该结果显示在静置培养时，AQDS的添加无法对巴氏梭菌暗发酵产生明显的性影响。AQDS常被作为一种电子穿梭体进行研究，考虑到静置培养时，AQDS也可以发挥其电子穿梭体的作用，而静置条件下其无法发挥促进梭菌生长的作用，暗示AQDS促进振荡条件下梭菌的机制可能与其电子穿梭体的作用无关。
综上说明：当且仅当振荡培养时，AQDS可以促进巴氏梭菌生长和产氢效率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法，其特征在于包括如下步骤：将梭菌接种于暗发酵培养基，添加蒽醌-2、6-二磺酸盐，在振荡条件下厌氧避光发酵，得到氢气。
2.根据权利要求1所述的提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法，其特征在于：所述的梭菌为巴氏梭菌DSM 525。
3.根据权利要求1所述的提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法，其特征在于：所述的梭菌为处于对数生长期的梭菌种子液。
4.根据权利要求3所述的提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法，其特征在于：
所述的梭菌种子液通过如下步骤制备得到：将梭菌保藏菌种接种于种子培养基中，富集培养，得到梭菌种子液；
所述的种子培养基的组成如下：蛋白胨 0.5～1 g/L，NaCl 4～6 g/L，K2HPO4 1.8～2.2g/L，KH2PO4 0.4～0.6 g/L，半胱氨酸盐酸盐 0.4～0.6 g/L，2-(N-吗啡啉)乙磺酸 38～42mM，微量元素浓缩液 9～11 mL/L，葡萄糖1.8～2.2 g/L，pH=5.8～6.2；
微量元素浓缩液的组成如下：CaCl2·2H2O 0.2 g/L，MgCl2·6H2O 2 g/L，FeCl2·4H2O40 mg/L，ZnCl2 1mg/L，MnCl2·4H2O 1 mg/L，CuCl2·2H2O 0.6 mg/L，Na2MoO4 1 mg/L，AlCl3 1 mg/L，CoCl3·6H2O 4 mg/L，硼酸饱和溶液 20 μL，浓度为12 mol/L的浓盐酸 20 μL，生物素0.04 mg/L，叶酸 0.04 mg/L，维生素B6 0.2 mg/L，核黄素0.1 mg/L，维生素B1 0.1mg/L，烟酸 0.1 mg/L，维生素B12 0.1 mg/L，对氨基苯甲酸0.1 mg/L，泛酸 0.1 mg/L；
所述的富集培养的条件如下：在厌氧条件下于35～40℃避光静置培养。
5.根据权利要求4所述的提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法，其特征在于：
所述的梭菌保藏菌种接种的量为种子培养基体积的1～10%；
所述的厌氧条件是将装有种子培养基的容器中的顶空气体置换为氮气得到；
所述的富集培养的培养时间为10～14 h。
6.根据权利要求1所述的提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法，其特征在于：
所述的暗发酵培养基的组成如下：NaCl 4～6 g/L，K2HPO4 20～40mM，KH2PO4 20～40mM，蛋白胨 0.5～1 g/L，半胱氨酸盐酸盐 0.4～0.6 g/L，微量元素浓缩液 9～11 mL/L，葡萄糖1.8～2.2 g/L，pH=6.5～7.5；
微量元素浓缩液的组成如下：CaCl2·2H2O 0.2 g/L，MgCl2·6H2O 2 g/L，FeCl2·4H2O40 mg/L，ZnCl2 1mg/L，MnCl2·4H2O 1 mg/L，CuCl2·2H2O 0.6 mg/L，Na2MoO4 1 mg/L，AlCl3 1 mg/L，CoCl3·6H2O 4 mg/L，硼酸饱和溶液 20 μL，浓度为12 mol/L的浓盐酸 20 μL，生物素0.04 mg/L，叶酸 0.04 mg/L，维生素B6 0.2 mg/L，核黄素0.1 mg/L，维生素B1 0.1mg/L，烟酸 0.1 mg/L，维生素B12 0.1 mg/L，对氨基苯甲酸0.1 mg/L，泛酸 0.1 mg/L。
7.根据权利要求1所述的提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法，其特征在于：
所述的接种的量为暗发酵培养基体积1～5%；
所述的蒽醌-2,6-二磺酸盐的终浓度为30～120μmol/L；
所述的厌氧是将梭菌接种于暗发酵培养基后用氮气除氧得到，环境气氛为氮气；
所述的避光发酵的温度为35～40℃；
所述的避光发酵的时间为30 h 以上。
8.根据权利要求1所述的提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法，其特征在于：
所述的振荡的转速为150～250rpm。
9.权利要求1～8任一项所述的提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法在氢气制备中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410370019.9A CN117965645B (zh) | 2024-03-29 | 一种提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410370019.9A CN117965645B (zh) | 2024-03-29 | 一种提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117965645A true CN117965645A (zh) | 2024-05-03 |
| CN117965645B CN117965645B (zh) | 2024-07-05 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101988075A (zh) * | 2010-12-14 | 2011-03-23 | 东南大学 | 一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法 |
| CN102199651A (zh) * | 2011-04-22 | 2011-09-28 | 东南大学 | 一种利用兼性产氢菌与厌氧菌复配制氢的方法 |
| US20170226536A1 (en) * | 2016-02-08 | 2017-08-10 | Indian Oil Corporation Limited | Formulation and process for biohydrogen production |
| CN114703233A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-07-05 | 广东省科学院生态环境与土壤研究所 | 一种提高梭菌发酵产氢效率的方法及其应用 |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101988075A (zh) * | 2010-12-14 | 2011-03-23 | 东南大学 | 一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法 |
| CN102199651A (zh) * | 2011-04-22 | 2011-09-28 | 东南大学 | 一种利用兼性产氢菌与厌氧菌复配制氢的方法 |
| US20170226536A1 (en) * | 2016-02-08 | 2017-08-10 | Indian Oil Corporation Limited | Formulation and process for biohydrogen production |
| CN114703233A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-07-05 | 广东省科学院生态环境与土壤研究所 | 一种提高梭菌发酵产氢效率的方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JL HATCH等: "Influence of Reduced Electron Shuttling Compounds on Biological H2 Production in the Fermentative Pure Culture Clostridium beijerinckii", 《CURRENT MICROBIOLOGY》, vol. 56, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 268, XP019587464 * |
| 薛晓梅等: "丁酸梭菌及巴氏梭菌产氢的应用研究", 《河北省科学院学报》, no. 1, 31 January 1993 (1993-01-31), pages 43 - 46 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lamed et al. | Effects of stirring and hydrogen on fermentation products of Clostridium thermocellum | |
| Özgür et al. | Biohydrogen production from beet molasses by sequential dark and photofermentation | |
| Demler et al. | Reaction engineering analysis of hydrogenotrophic production of acetic acid by Acetobacterium woodii | |
| Seol et al. | Sustained hydrogen production from formate using immobilized recombinant Escherichia coli SH5 | |
| Zhao et al. | Improving biogas upgrading and liquid chemicals production simultaneously by a membrane biofilm reactor | |
| CN107904263B (zh) | 一种提高产氢菌氢产量的方法 | |
| Wang et al. | Efficiency enhancement of H2 production by a newly isolated maltose-preferring fermentative bio-hydrogen producer of Clostridium butyricum NH-02 | |
| Jayasinghearachchi et al. | Fermentative hydrogen production by two novel strains of Enterobacter aerogenes HGN-2 and HT 34 isolated from sea buried crude oil pipelines | |
| CN117965645B (zh) | 一种提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法及应用 | |
| CN102041274A (zh) | 一种利用专性厌氧丁酸梭菌发酵制氢的方法 | |
| CN106635887B (zh) | 一种嗜热解糖厌氧杆菌及其在生物制氢中的应用 | |
| CN117965645A (zh) | 一种提升梭菌发酵产氢速率及产氢量的方法及应用 | |
| US8241882B2 (en) | Hydrogen-producing bacterium, Clostridium perfringens | |
| CN118006694B (zh) | 利用希瓦氏菌提高梭菌发酵产氢效率的方法及其应用 | |
| CN114703233B (zh) | 一种提高梭菌发酵产氢效率的方法及其应用 | |
| CN118006694A (zh) | 利用希瓦氏菌提高梭菌发酵产氢效率的方法及其应用 | |
| Oliveira et al. | Insights Into the effect of carbon and nitrogen source on hydrogen production by photosynthetic bacteria | |
| US20220177932A1 (en) | Process and composition for controlling ethanol production | |
| Sato et al. | Water-insoluble material from apple pomace makes changes in intracellular NAD+/NADH ratio and pyrophosphate content and stimulates fermentative production of hydrogen | |
| CN117402918A (zh) | 一种利用食气菌发酵高效固碳产醇的方法 | |
| Phillips et al. | Mass transfer and kinetic limitations during synthesis gas fermentation by acetogenic bacteria | |
| Phommakod et al. | Effect of Substrate Concentration on Biohydrogen Production by Clostridium manihotivorum CT4 in Batch Culture | |
| Welsh et al. | A note on the effect of nitrogen source on growth of and solvent production by Clostridium acetobutylicum | |
| Li et al. | Comparative analysis and improvement of C/N on hydrogen production with the bacterium strain B49 | |
| CN116042478A (zh) | 一种发酵产氢细菌、定向筛选及强化产氢的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |