CN117965591A - 一种提升放线菌抗逆性与抗生素产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提升放线菌抗逆性与抗生素产量的方法，属于合成生物学及分子生物学领域，该方法包括调控放线菌胞内环二腺磷酸苷c‑di‑AMP的浓度的步骤，具体为通过提高放线菌胞内环二腺磷酸苷c‑di‑AMP的浓度，以提升放线菌抗逆性与抗生素产量。本发明证明了利用提高放线菌胞内c‑di‑AMP浓度的基因工程策略进行菌株改造，可以实现提高放线菌抗逆性以及抗生素合成的目的，并证实了c‑di‑AMP和DasR的互作机制及其对孢子发育和次级代谢的影响在放线菌属中可能是保守的，具有普适性。可见，本发明为放线菌属的抗逆性和次级代谢产物合成量的提升，提供了新的改造策略和改造靶点。

Description

一种提升放线菌抗逆性与抗生素产量的方法

技术领域

本发明涉及合成生物学及分子生物学领域，特别是涉及一种提升放线菌抗逆性与抗生素产量的方法。

背景技术

细胞内第二信使通常具有“转换器”或“放大器”的作用，将外界信号转化为细胞内的信号，调节细胞应对各种环境刺激的变化。c-di-AMP(环二腺磷酸苷)由两分子的ATP在腺苷酸环化酶的作用下合成，并可被特异性的磷酸二酯酶降解。c-di-AMP通过与特定的蛋白质或核糖开关(riboswitch)受体结合，调节多种重要生理功能，例如维持细胞渗透平衡、调节中心代谢、检测DNA损伤、影响生物被膜的形成及控制芽胞发育等。同时，c-di-AMP在调控细菌对环境的适应性及诱发动物宿主的免疫反应等方面亦具有极其重要的作用。c-di-AMP作为一种重要的核苷酸第二信使，其参与调节多种生理功能，包括细菌的生长、细胞壁的代谢平衡以及细菌的致病力等。

N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)是土壤微生物碳氮养分的重要来源，也是参与细胞形态发育、铁载体合成、抗生素合成、孢子形成和毒性等细胞过程的重要信号分子。细胞内GlcNAc浓度对于新陈代谢至关重要，其信号的传输主要通过GntR-家族蛋白DasR介导实现。DasR是一种多效的碳调控因子，主要参与GlcNAc分解代谢调控，从而将基础碳代谢与链霉菌的形态发育关联起来。已有研究表明DasR是一种多效型调控因子，还参与调控放线菌的色素形成以及次级代谢合成等多种细胞功能。

但是，c-di-AMP与DasR是否存在关联，c-di-AMP相关的信号转导机制及其对细菌代谢的影响在革兰氏阳性菌属，尤其是放线菌属中的研究仍然知之甚少。

发明内容

本发明的目的是提供一种提升放线菌抗逆性与抗生素产量的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明利用提高放线菌胞内c-di-AMP浓度的基因工程策略进行菌株改造，可以实现提高放线菌抗逆性以及抗生素合成的目的，并证实了c-di-AMP和DasR的互作机制及其对孢子发育和次级代谢的影响在放线菌属中可能是保守的，具有普适性，为放线菌属的抗逆性和次级代谢产物合成量的提升，提供了有效的改造策略和改造靶点。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种提升放线菌抗逆性与抗生素产量的方法，包括调控放线菌胞内环二腺磷酸苷c-di-AMP的浓度的步骤。

进一步地，通过提高放线菌胞内环二腺磷酸苷c-di-AMP的浓度，以提升放线菌抗逆性与抗生素产量。

进一步地，利用包含调控合成酶DisA表达量的方式，提高放线菌胞内环二腺磷酸苷c-di-AMP的浓度。

进一步地，通过上调合成酶DisA的表达量，提高放线菌的环二腺磷酸苷c-di-AMP的浓度，以此增强全局性调控因子DasR与靶基因结合的能力，调控N-乙酰葡萄糖胺代谢，发挥提升放线菌抗逆性与抗生素产量的效果。

进一步地，上调所述合成酶DisA的表达量包含在放线菌中导入合成酶DisA的外源基因的步骤；所述合成酶DisA的外源基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，所述靶基因包括几丁质酶、葡萄糖-6-脱氢酶和N-乙酰-D葡萄糖胺激酶的编码基因。

进一步地，所述提升放线菌抗逆性具体为促进放线菌的孢子分化；所述抗生素包含红霉素。

进一步地，所述放线菌包括红霉糖多孢菌和天蓝色链霉菌。

本发明公开了以下技术效果：

本发明研究发现DasR是c-di-AMP的受体蛋白，c-di-AMP能够变构激活DasR与靶基因的结合能力，影响GlcNAc代谢。为此，本发明以红色糖多孢菌(红霉素的工业生产菌株)为例，探究了细胞内c-di-AMP浓度对红色糖多孢菌生长、孢子分化和次级代谢产物红霉素合成的影响机制，筛选了可用于进行相关代谢工程改造，提高红霉素产量的新靶点。本发明证明了利用提高胞内c-di-AMP浓度的基因工程策略进行菌株改造，可以实现提高放线菌抗逆性以及抗生素合成的目的，并证实了c-di-AMP和DasR的互作机制及其对孢子发育和次级代谢的影响在放线菌属中可能是保守的，具有普适性。可见，本发明为放线菌属的抗逆性和次级代谢产物合成量的提升，提供了新的改造策略和改造靶点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为OdisA菌株构建及胞内c-di-AMP测定；(A)PCR验证质粒转入；(B)RT-PCR验证disA基因过表达；(C)对数生长期WT和OdisA菌株胞内c-di-AMP浓度测定；(D)生长稳定期WT和OdisA菌株胞内c-di-AMP浓度测定；

图2为WT和OdisA菌株抗逆性的比较；(A)添加Glucose后的孢子平板分化；(B)添加GlcNAc后的孢子平板分化；

图3为WT和OdisA菌株红霉素合成能力的测定；(A)平板抑菌圈；(B)HPLC测定红霉素产量；

图4为WT和OdisA菌株中GlcNAc代谢相关基因转录水平；(A)chiH转录水平；(B)nagB转录；(C)nagK转录水平；(D)nagKA转录水平；

图5为c-di-AMP与DasR互作在放线菌中保守性分析；(A)红色糖多孢菌和天蓝色链霉菌中DasR的dre序列比对及其在radA/disA簇启动子区域的分布；(B)EMSA实验验证天蓝色链霉菌DasR与radA/disA簇启动子区域的结合能力；(C)EMSA实验验证c-di-AMP对于DasR与radA/disA簇启动子区域结合能力的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明前期研究发现，DasR是c-di-AMP的受体蛋白，c-di-AMP能够变构激活DasR与靶基因的结合能力。但是，c-di-AMP相关的信号转导机制及其对细菌代谢的影响在革兰氏阳性菌属，尤其是放线菌属中的研究仍然知之甚少。本发明以红色糖多孢菌(红霉素的工业生产菌株)为例，探究了细胞内c-di-AMP浓度对红色糖多孢菌生长、孢子分化和次级代谢产物红霉素合成的影响机制，筛选了可用于进行相关代谢工程改造，提高红霉素产量的新靶点。证明了利用提高胞内c-di-AMP浓度的基因工程策略进行菌株改造，可以实现提高放线菌抗逆性以及抗生素合成的目的。

本发明的研究过程及思路如下：

首先，本发明通过在红色糖多孢菌中过表达c-di-AMP合成酶DisA蛋白，提高了胞内c-di-AMP浓度，在较高浓度c-di-AMP的条件下可能触发了对初级GlcNAc代谢和通过DasR介导的二级代谢的连续响应；接着，继续研究了胞内高浓度c-di-AMP影响GlcNAc代谢基因的转录水平，发现c-di-AMP增强了DasR对靶基因的调控作用，促进形态分化。其次，高浓度的c-di-AMP显著提高了红霉素的合成能力，由此获得了具有强抗逆性和高产红霉素的工程菌。最后，通过进化分析，比较了不同放线菌中DasR的序列差异发现，放线菌中DasR蛋白具有较高的序列保守性，其中，红霉糖多孢菌和天蓝色链霉菌的DasR高度同源，具有72％的相似性，并且其结合位点(dre)也表现出高度的序列相似性。此外，radA/disA簇在微生物中也是高度保守，在天蓝色链霉菌radA/disA簇的上游区域发现了多个dre位点，表明c-di-AMP和DasR的互作机制及其对孢子发育和次级代谢的影响在放线菌属中可能也是保守的。进一步说明，本发明建立的改变胞内c-di-AMP浓度提升放线菌抗逆性与抗生素产量的方法具有普适性。具体研究如下：

实施例1

1、质粒构建

从红色糖多孢菌基因组(GenBank登录号：GCF_000062885.1)中将disA基因片段克隆到NdeⅠ/XbaⅠ双酶切的pIB139质粒主链上，构建pIB139-PermE-his-DisA-his质粒。

酶切体系为：5μLBuffer、4μLNdeⅠ限制性内切酶、4μL XbaⅠ限制性内切酶、30μLpIB139质粒和7μL ddH₂O。通过琼脂糖电泳对酶切产物进行胶回收，用胶回收试剂盒对切割好的线性质粒进行回收。

通过PCR的方法扩增目的基因，引物序列分别为(按照5'-3'方向)：disA-F：aatgggtcgcggatccgaattcGTGAACGAGAAGCTGCGCGCCACG；disA-R：gctcgagtgcggccgcaagcttTCAGGCGTAGCGGTCCATGATCGAGG；注：引物序列中小写碱基为酶切位点。PCR反应体系为：25μLbuffer、1μL dNTP、2μL上游引物、2μL下游引物、1μL模板、1μL高保真DNA聚合酶以及20μLddH₂O。PCR反应程序为：95℃预变性10分钟，95℃变性15秒，56℃退火15s，72℃延伸30秒/1000bp，将变性到延伸的过程循环34次，循环结束后72℃延伸8分钟，最后降温至12℃。在琼脂糖凝胶电泳后，将PCR产物与marker比对大小，大小正确后使用胶回收试剂盒进行纯化回收。

所述disA基因的核苷酸序列如SEQ NO：1所示：

gtgaacgagaagctgcgcgccacgctcgcctggctcgcgcccggcacggcgctgcgcgacggcctggaacgcatcctgcgcggccgcaccggcgggctggtcgtgctcggctacgacgaggtggtggagtcgctgtgcgacggcggcttccacctcgacgtcgagttcagcgcgacccggctgcgcgagctgtccaagatggacggtgcggtggtgctctcctccgacgcgacccggatcgtgcgcgccaacgtgcagctcgtccccgacgccagcatccggaccgacgagtcgggaacgcggcaccgctcggccgagcgcaccgccatccataccggctacccggtggtctcggtgagccagtcgatgagcatcatcagcctctacttccagggccaccgccacctgctcatcggttcgccggacatcctctcccgcgccaaccaggcgctggccacgctggagcgctacacggcgcggctggccgaggtcgcccagaccctgtcggcgctggagatcgaggactacgtgacgctgcgggacgcgatgaccgtcgtgcagcgactggagatggtgcgccgcatcgccgacgagatcgaggtcgacgtggtcgagctcggccaggacggcaggctgatcgagctccagctcgacgagctggtcggcgccgagcgggacactcgcggcaccgggaagcgcggccggacgctggaccgggtcgacgtcgaccgggagctgatcgtgcaggagtacctgccgaccggcggtccgatgccgacgtccgaggaggtcgccgaggcgctggccaagctggacgggaccgagctgctggacctcaccgcgatcgcgaaggcgttcggctaccccggtacgcccgaggtgctggaccagcacctccagccgcgcggctaccggctgctggccagggtgccgaggctgcccgcggtggcccgcaagcagctcgtcgagcacttcggttcgctgcagaacctgctggcggcgaccgccgaggacctgagcgtggtggagtcggtcggcgagtcgcgggcgcggcaggtccgcgagggcctgtcccggctggccgaagcctcgatcatggaccgctacgcctga(SEQ ID NO：1)。

将得到的酶切质粒和扩增后的目的片段通过多片段同源重组酶进行连接，重组反应条件为：6μL同源重组酶、4μL目的片段、2μL酶切质粒混匀后在50℃环境下水浴30min，冰上放置5分钟后，将全部体系加入DH5α感受态中轻柔混匀，冰上放置30分钟后42℃水浴热激90秒，冰上放置3分钟后加入750μL LB培养液，在37℃，220rpm摇床中活化45分钟；将活化好的菌液涂布在含有50μg/mL安普霉素的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养12-18小时，挑取单克隆测序，与设计序列比对后，保留测序正确的单克隆即可获得含有pIB139-PermE-his-DisA-his质粒的菌液。

2、过表达质粒转导红色糖多孢菌

抽提质粒：将50μL含有过表达质粒的DH5α大肠杆菌菌液，加入到5mL的LB液体培养基试管中，于37℃、220rpm摇床培养24小时，培养好的菌液通过质粒抽提试剂盒将质粒抽提并纯化。

质粒转入红色糖多孢菌：冰上将50μL pIB139-PermE-his-DisA-his质粒加入50μL红色糖多孢菌原生质体中，然后加入200μL PEG-T轻柔混匀，混匀后将所有液体涂布在无抗性的R3M固体培养基平板上，30℃培养24小时，在平板上均匀涂布1mL稀释至125μg/mL的安普霉素液体，30℃培养3-5天，培养后将平板上长出的单克隆体涂在预先涂有1mL稀释至125μg/mL安普霉素液体的无抗性R3M固体培养基平板上，30℃培养2-3天，挑取长出的菌体，加入到5mL的含有50μg/mL安普霉素的TSB液体培养基试管中，30℃，220rpm摇床培养48小时，吸取正常生长的菌液测序，通过M13F/R(M13F：5’-GTGCTGCAA GGCGATTAAGTT-3’；M13R：5’-TTATGCTTCCGGCTCGTATGT-3’)引物进行扩增，与设计序列比对后，保留测序正确的菌液即可获得含有pIB139-PermE-his-DisA-his质粒的转化子菌株OdisA。

3、红色糖多孢菌培养方式

取50μL保存的红色糖多孢菌菌液，将其接种于5mLTSB液体试管中，试管中预先加入玻璃珠，30℃，220rpm摇床培养48小时，取500μL试管中培养好的菌液，将其接种于30mLTSB液体培养基中，摇瓶中预先加入玻璃珠，30℃，220rpm摇床培养48小时，最后取0.5～1mL上述种子液接种于含50mLTSB培养基的500mL三角瓶中，使初始OD₆₀₀为0.05，在30℃、220rpm的摇床培养。

4、孢子平板分化实验：

取对数生长期的OdisA、WT活化菌株均匀涂布在分别含有15mM GlcNAc和20mMGlucose的R2YE平板上，在30℃培养箱中培养3-4天，期间需频繁观察其分化状态。

5、抑菌圈实验

(1)将活化后的OdisA和WT接到含有100mL的培养基溶液中，30℃，220rpm培养120h。

(2)离心收集红色糖多孢菌120h发酵液，离心后取上清，上清中含有红霉素。

(3)将枯草芽孢杆菌接种到含5mL LB液体培养基的试管中，在37℃，220rpm条件下培养12h，测定OD₆₀₀。

(4)将活化好的枯草芽孢杆菌OD₆₀₀调至0.5左右后涂布到无抗的LB固体培养基中，静置吹干5min，加入5μL上述红色糖多孢菌发酵液，随后在37℃条件下静置培养12h左右，观察抑菌圈大小，注意生长时间不可太长。

(5)通过比较抑菌圈的大小进而可定性地判定发酵液中红霉素浓度大小。

6、RT-PCR实验

(1)收集对数生长后期的WT和OdisA菌体，严格按照天根生化科技有限公司的RNA提取试剂盒操作方法抽提RNA，抽提完成后需要核酸电泳验证条带大小，并用酶标仪对抽提的RNA定量，随后使用Taraka公司的反转录试剂盒逆转录为cDNA。对cDNA进行稀释后，将其作为实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的模板。

首先在目的基因的上游编码区设计相应的RT-PCR引物，RT-PCR产物一般在300bp左右，本实施例设计的RT-PCR引物如下：

PchiH-fw：TTCACCCTCGCCTTCATCCTGG，

PchiH-rev：CGTTCTCGAACTCGGTCGCCTC；

pnagB-II-fw：AGGTGCGGACATCTGCGCCATC，

pnagB-II-rev：CAGGGCGTCGATCAGGTTCA；

pnagK-fw：GCGGGGCATGGGCGTCTACT，

pnagK-rev：CGATGGGCATCACGATCACGT；

pnagKA-fw：GCGGGGCATGGGCGTCTACT，

pnagKA-rev：CGATGGGCATCACGATCACGT；

PdisA-fw：ACGGTGCGGTGGTG CTC，

PdisA-rev：CCGACAGGGTCTGGGCG。

利用引物进行PCR扩增，按照下列体系加入PCR体系：正向引物1μL，反向引物1μL，2×qPCR Mix 10μL，模板1μL，去离子水7μL；上述体系混匀后使用BIO-RAD CFX96荧光定量PCR仪进行PCR反应，按照以下qRT-PCR程序进行PCR扩增：

表1qRT-PCR扩增程序

每个样品重复三次，使用2^-ΔΔCt法处理数据比较WT及OdisA菌株不同基因的转录水平。

7、结果与分析

(1)过表达DisA蛋白提升胞内c-di-AMP浓度

经过PCR验证，目的DNA条带大小为1113kb，表明过表达菌株构建成功(图1中A)。通过RT-PCR分析OdisA和WT菌株中disA基因的转录水平，结果表明OdisA菌中disA的转录水平是WT的20倍左右(图1中B)，利用HPLC测定OdisA和WT在对数生长期和生长稳定期的胞内c-di-AMP水平，结果显示，胞内c-di-AMP水平明显提高(图1中C、D)。综上所述，通过在体内过表达DisA蛋白提高了胞内c-di-AMP浓度。

(2)高浓度c-di-AMP增强了红色糖多孢菌的抗逆性

结果显示，OdisA与WT在孢子分化能力上具有明显差异，OdisA孢子分化能力比WT更好(图2)。并且在孢子分化培养基中分别加入了Glucose和GlcNAc后，GlcNAc显著抑制了WT的孢子分化，而OdisA的孢子分化不受GlcNAc的影响。以上结果表明，胞内高水平c-di-AMP能够屏蔽GlcNAc对红色糖多孢菌孢子分化的不利影响。

(3)高浓度c-di-AMP提高了红色糖多孢菌红霉素的合成

抑菌圈实验发现，相比于WT，OdisA菌株合成抗生素的能力明显提升，表明DisA过表达促进了红霉素的合成(图3)。此外，通过研究不同碳源添加对红霉素合成的影响发现，OdisA能够显著削弱GlcNAc对红色糖多孢菌红霉素合成的抑制作用。

(4)DasR介导c-di-AMP抑制GlcNAc代谢相关基因转录

为了进一步探究c-di-AMP如何影响DasR对GlcNAc代谢相关基因的调控，我们利用RT-PCR对OdisA菌株中有关GlcNAc代谢的相关基因转录水平进行了分析发现，几丁质酶(chiH)、葡萄糖-6-脱氢酶(nagB)、N-乙酰-D葡萄糖胺激酶(nagK/nagKA)的表达水平均发生了显著下调(图4)。这些结果进一步证实，高浓度c-di-AMP增强了DasR作为抑制子对其靶基因的转录调控，抑制了GlcNAc代谢相关基因的转录，从而增强了OdisA菌株的形态分化与次级代谢。

(5)c-di-AMP与DasR互作影响放线菌形态分化与抗生素合成具有普遍性

通过进化分析，比较了不同放线菌中DasR的序列差异发现，放线菌中DasR蛋白具有较高的序列保守性，其中，红霉糖多孢菌和天蓝色链霉菌的DasR高度同源，具有72％的相似性，并且dre也表现出高度的序列相似性(图5中A)。此外，radA/disA簇在微生物中也是高度保守，在天蓝色链霉菌radA/disA簇的上游区域发现了多个dre位点(图5中A)，并且天蓝色链霉菌DasR也能够与radA/disA簇的启动子区域结合(图5中B)。通过EMSA实验进一步证实，c-di-AMP对DasR-DNA结合的增强效应对于天蓝色链霉菌同样适用(图5中C)，这表明c-di-AMP和DasR的互作机制及其对孢子发育和次级代谢的影响在放线菌属中可能是保守的，具有普适性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种提升放线菌抗逆性与抗生素产量的方法，其特征在于，包括调控放线菌胞内环二腺磷酸苷c-di-AMP的浓度的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过提高放线菌胞内环二腺磷酸苷c-di-AMP的浓度，以提升放线菌抗逆性与抗生素产量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用包含调控合成酶DisA表达量的方式，提高放线菌胞内环二腺磷酸苷c-di-AMP的浓度。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过上调合成酶DisA的表达量，提高放线菌的环二腺磷酸苷c-di-AMP的浓度，以此增强全局性调控因子DasR与靶基因结合的能力，调控N-乙酰葡萄糖胺代谢，发挥提升放线菌抗逆性与抗生素产量的效果。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，上调所述合成酶DisA的表达量包含在放线菌中导入合成酶DisA的外源基因的步骤；所述合成酶DisA的外源基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶基因包括几丁质酶、葡萄糖-6-脱氢酶和N-乙酰-D葡萄糖胺激酶的编码基因。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提升放线菌抗逆性具体为促进放线菌的孢子分化；所述抗生素包含红霉素。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述放线菌包括红霉糖多孢菌和天蓝色链霉菌。