CN117964728A

CN117964728A - 一种增强植物对生物胁迫和非生物胁迫的耐受性的GhGRPL蛋白

Info

Publication number: CN117964728A
Application number: CN202410072078.8A
Authority: CN
Inventors: 曾健晏; 肖月华; 余万厅; 代永露; 陈俊敏; 梁爱敏; 索庆伟; 陈忠
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2024-01-18
Filing date: 2024-01-18
Publication date: 2024-05-03

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种增强植物对生物胁迫和非生物胁迫的耐受性的GhGRPL蛋白。本发明提供的GhGRPL蛋白在纤维细胞的次生壁合成时期特异性表达，在其富含甘氨酸区域内缺失大部分甘氨酸残基。GhGRPL的表达与次生细胞壁的合成呈正相关，提高GhGRPL的表达水平增强了木质素的积累，增厚了次生壁，加强了植物对非生物胁迫(如干旱和盐胁迫)以及生物威胁(包括大丽轮支菌V.dahliae感染)的防御能力。总的来说，本发明揭示了GhGRPL通过参与木质素沉积促进次生细胞壁发育，从而加强细胞壁的稳固性和不透性，进而同时增强植物对非生物和生物胁迫的耐受性。

Description

一种增强植物对生物胁迫和非生物胁迫的耐受性的GhGRPL 蛋白

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种增强植物对生物胁迫和非生物胁迫的耐受性的GhGRPL蛋白。

背景技术

植物细胞壁在植物的生长、发育和抵御环境挑战中至关重要。它们通常被划分为初生细胞壁(PCW)和次生细胞壁(SCW)。初生细胞壁的动态特性促进各向的细胞扩展，对植物的生长起到重要作用。相比之下，次生细胞壁主要贡献于植物的生物量，赋予其结构刚性和支持。众多研究强调了木质素在增强植物细胞壁、加强其稳固性和不透性方面的关键作用。这种增强作为一道强大的屏障，强化了植物对病原体侵袭和各种环境胁迫的防御机制，通过阻碍初始病原体的寄生和减缓非生物胁迫的影响。因此，木质素在应对胁迫条件下迅速合成并沉积在细胞壁中是植物利用的关键策略，使其能够应对生存环境中各种形形色色的挑战。

植物中的富甘氨酸蛋白(GRPs)根据其富甘氨酸重复序列和特定保守蛋白结构被分类为五个主要亚类。I类GRPs的特征是含有富含甘氨酸的区域，其中重复出现(GGX)n序列。相反，II类GRPs在C-末端具有富含半胱氨酸的独特区域。III类GRPs通过较低的甘氨酸含量，具有(GXGX)n序列以及潜在包含油脂素结构域来区分。IV类GRPs，也称为RNA结合GRPs，其特征是具有RNA识别结构域或冷休克结构域，部分变异体还可能具有额外的锌指结构域。V类GRPs则通过其复合的甘氨酸重复模式与I类GRPs有所不同。这些蛋白质在植物对生物和非生物胁迫的应对中发挥着重要作用，包括干旱、极端盐度、寒冷和病原体挑战等方面。例如，在拟南芥中，AtGRP2的表达水平升高可以增强对寒冷、盐度和干旱的适应能力。同样地，增加AtGRP7表达量的植物对抗诸如软腐菌(Pectobacterium carotovorum)、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)和铁杆病假单胞菌(Pseudomonas syringae)等生物胁迫的耐受性得到改善。此外，在亚麻荠中，CsGRP7-a的过表达增强了植株对寒冷的耐受性，尽管也增加了其对盐碱条件的敏感性。在烟草中，cdiGRP的持续表达增加了维管系统中壁质多糖的积累，同时阻碍了芜菁叶病毒在系统中的传播。其中，I至III类和V类GRPs具有N-末端信号肽，暗示它们可能参与跨膜蛋白质转运。这些被认为定位在细胞外基质中的GRPs被广泛认为是细胞壁结构的重要组成部分。然而，目前的富甘氨酸蛋白无法同时提高植物对非生物和生物胁迫的适应性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种增强植物对生物胁迫和非生物胁迫的耐受性的GhGRPL蛋白。本发明提供的GhGRPL蛋白可以增强植物对生物胁迫和非生物胁迫的耐受性。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种增强植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性的GhGRPL蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种上述技术方案所述GhGRPL蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了上述技术方案所述GhGRPL蛋白或上述技术方案所述的编码基因在调控植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性中的应用。

优选的，所述调控包括：提高所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，增强植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性；降低所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，降低植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性。

优选的，所述增强植物对生物胁迫的耐受性包括：增强植物对大丽轮支菌(Verticillium dahliae)感染的抵抗性。

优选的，所述非生物胁迫包括干旱和/或盐胁迫。

优选的，所述植物包括拟南芥或棉花。

本发明提供了上述技术方案所述GhGRPL蛋白或上述技术方案所述的编码基因在调控植物木质素沉积和/或植物次生壁发育中的应用。

优选的，所述调控包括：提高所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，促进植物木质素沉积和/或植物次生壁发育；降低所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，抑制植物木质素沉积和/或植物次生壁发育。

优选的，所述植物包括拟南芥或棉花。

有益效果：

本发明提供了一种增强植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性的GhGRPL蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明在棉花纤维中成功克隆了一个细胞壁蛋白，命名为类甘氨酸富含蛋白(GhGRPL)，它在纤维细胞的次生壁合成时期特异性表达。GhGRPL蛋白与拟南芥同源蛋白AtGRP不同，因为它在其富含甘氨酸区域内缺失大部分甘氨酸残基。GhGRPL的表达与次生细胞壁的合成呈正相关，提高GhGRPL的表达水平增强了木质素的积累，增厚了次生壁，加强了植物对非生物胁迫(如干旱和盐胁迫)以及生物威胁(包括大丽轮支菌V.dahliae感染)的防御能力。总的来说，本发明揭示了GhGRPL通过参与木质素沉积促进次生细胞壁发育，从而加强细胞壁的稳固性和不透性，进而同时增强植物对非生物和生物胁迫的耐受性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为GhGRPL:YFP融合蛋白在本氏烟叶片表皮细胞中的细胞壁定位结果；其中，L中的比例尺为50μm，P中的比例尺为20μm；

图2为GhGRPL蛋白的序列比对和结构示意图；

图3为GhGRPL的转录结果和茎的横截面染色结果；

图4为异源表达GhGRPL促进拟南芥花序茎中次生壁的沉积的实验结果；Wildtype，野生型；

图5为35S:GhGRPL转基因和野生型拟南芥花序茎中GhGRPL的转录水平结果；AtActin2被用作内参基因；WT，野生型；

图6为干扰GhGRPL基因表达后棉花GhGRPL、与次生壁沉积相关的基因的转录结果以及茎的横截面染色结果

图7为干扰GhGRPL基因表达后棉花植株表型和高度结果；

图8为受盐和干旱胁迫诱导后棉花叶片中GhGRPL的表达结果；

图9为35S:GhGRPL转基因拟南芥的耐旱性实验结果；

图10为表达GhGRPL对植物抗逆性促进效应的模式图；

图11为35S:GhGRPL转基因拟南芥的耐盐性实验结果；

图12为35S:GhGRPL转基因拟南芥的对V.dahliae的抗性实验结果；

图13为干扰GhGRPL基因表达后，棉花对V.dahliae的抗性的实验结果；

图14为35S:GhGRPL转基因拟南芥种子在高盐胁迫下的发芽率结果。

具体实施方式

本发明提供了一种增强植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性的GhGRPL蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：MASLYTVGKSWVLAVTIVCMSIFWFHLCKADEDFPETGSVGDDPAQIVAKALLCFNDKYIYSSCEES NRLSASGNLDVPPEYTEEYCSGPCLSETHLVLNCIENIMKNFVFYNKATIHDIRDTIKAGCSYGPERG NFDVEEHLEAEESGSNKAGTGILFGVGSIIIGLTPFL。

本发明提供了一种上述技术方案所述GhGRPL蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5'-ATGGCGTCCTTGTATACAGTCGGGAAATCATGGGTTTTAGCAGTAACCATAGTATGCATGTCTAT TTTCTGGTTCCACTTGTGTAAGGCTGATGAAGATTTTCCCGAAACAGGCAGTGTTGGTGATGATCCAGCTCAAATTGTCGCCAAGGCGTTGCTATGTTTCAATGATAAATATATTTATAGCAGCTGTGAAGAATCTAACAGATTGAGTGCAAGTGGAAATCTAGACGTCCCACCTGAATACACCGAAGAATATTGCAGTGGACCTTGCCTCTCAGAGACCCACCTTGTTCTCAACTGTATAGAGAACATCATGAAAAACTTTGTGTTCTACAACAAGGCAACCATTCACGATATCAGAGACACAATTAAGGCTGGATGTAGCTATGGTCCTGAAAGAGGTAATTTCGACGTTGAAGAGCACCTTGAAGCTGAGGAAAGCGGTTCAAACAAGGCAGGCACTGGCATTTTGTTTGGGGTTGGGTCCATTATTATAGGGCTCACCCCATTCCTTTGA-3'。

在本发明中，所述调控优选包括：提高所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，增强植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性；降低所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，降低植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性。本发明所述增强植物对生物胁迫的耐受性优选包括：增强植物对大丽轮支菌(Verticillium dahliae)感染的抵抗性。本发明所述非生物胁迫优选包括干旱和/或盐胁迫；所述植物优选包括拟南芥或棉花。

本发明提供了上述技术方案所述GhGRPL蛋白或上述技术方案所述的编码基因在调控植物木质素沉积和/或植物次生壁发育中的应用。在本发明中，所述调控优选包括：提高所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，促进植物木质素沉积和/或植物次生壁发育；降低所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，抑制植物木质素沉积和/或植物次生壁发育。本发明所述植物优选包括拟南芥或棉花

本发明在不同次生壁发育阶段的棉纤维和茎中的表达分析和观察结果表明，GhGRPL参与了次生壁的沉积，其表达模式与次生壁发育的进展呈显著正相关。木质素染色和观察结果显示，与野生型和突变型拟南芥相比，GhGRPL的异源表达促进了拟南芥花序茎中木质素的沉积和次生壁的增厚。然而，在野生型对照组和拟南芥突变体之间没有明显的表型差异，这是由于拟南芥中与AtGRP相关的功能冗余基因的存在。当然，这也是由于拟南芥中AtGRP和棉花中GhGRPL之间的功能差异。

此外，对GhGRPL沉默的棉花植株次生壁形态的观察结果提供了额外的证据，支持GhGRPL与次生壁沉积之间的正相关。

在本发明中，RT-qPCR实验表明GhGRPL可以同时响应干旱和高盐胁迫。此外，无论是在MS培养基还是土壤中，GRPa的异源表达都有益于植物生长，并增强植物对干旱和高盐胁迫的耐受性。此外，GhGRPL的过表达增强了拟南芥对黄萎病的抗性(生物胁迫)，而干扰GhGRPL表达则减弱了棉花对黄萎病的抗性。

本发明最近的研究表明，棉花GhGRPL的过表达可以促进木质素的沉积和次生壁的增厚，从而同时提高植物对非生物和生物胁迫的抗性。此外，与应激相关基因表达的变化进一步验证了GhGRPL的功能。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种增强植物对生物胁迫和非生物胁迫的耐受性的GhGRPL蛋白进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

质粒构建和植物材料

为了构建pLGN-35S:GhGRPL:YFP质粒(记为35S:GhGRPL:YFP)，从陆地棉品种“冀棉14”开花后20天(20-DPA，day post anthesis)的纤维cDNA中扩增了GhGRPL的编码序列(不包括终止密码子)。使用以下引物对进行扩增：

GhGRPL-F：5'-ACAGGGTACGGATCCATGGCGTCCTTGTATACAGTC-3'，SEQ ID NO.3；

GhGRPL-R：5'-AGAACCTCCTCCACCAAGGAATGGGGTGAGCCCTA-3'，SEQ ID NO.4。

同时，从质粒pLGN-pro35S:GhPIN3a:YFP(保藏于西南大学农学与生物科技学院作物逆境生物学团队实验室，公开于文献【J.Zeng,M.Zhang,L.Hou,W.Bai,X.Yan,N.Hou,H.Wang,J.Huang,J.Zhao,Y.Pei,Cytokinin inhibits cotton fiber initiation bydisrupting PIN3a-mediated asymmetric accumulation of auxin in the ovuleepidermis,J Exp Bot,70(2019)3139-3151.】)中使用YFP-F1和YFP-R1扩增了YFP，引物序列如下：

YFP-F1：5'-GGTGGAGGAGGTTCTGGAGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGAGGTAGCATGGTGAGCAAGGG-3'，SEQ ID NO.5；

YFP-R1：5'-GGGAATTCTGGTACCTCACTTGTACAGCTCGTCCAT-3'，SEQ ID NO.6。

随后，将GhGRPL编码区域与YFP的5'端区域使用诺唯赞公司ClonExpress MultiSOne Step Cloning Kit(C113，Vazyme，中国)试剂盒通过同源重组连接的方式进行融合，并使用BamHI和KpnI位点插入pLGN-35s质粒中。

为了构建pLGN-35S:YFP质粒(记为35S:YFP)，从pLGN-pro35S:GhPIN3a:YFP质粒中使用引物对YFP-F2和YFP-R2扩增了YFP，随后，使用BamHI和SalI位点，将其插入pLGN质粒中。引物序列如下：

YFP-F2：5'-GACAGGGTACGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'，SEQ ID NO.7；

YFP-R2：5'-CTGGTACCATGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'，SEQ ID NO.8。

为了构建TRV2-GhGRPL质粒，从陆地棉品种“冀棉14”的20-DPA纤维cDNA中使用引物对TRV2-GRPL-F和TRV2-GRPL-R扩增了GhGRPL的部分编码序列(17-224bp)。随后，使用EcoRI和SpeI位点将其插入TRV2质粒中。引物序列如下：

TRV2-GRPL-F：5'-GTGAGTAAGGTTACCGAATTCCAGTCGGGAAATCATGGGTT-3'，SEQ IDNO.9；

TRV2-GRPL-R：5'-GTTTTGCCATCCCACAAACACTAGTTTCCACTTGCACTCAATCTG-3'，SEQID NO.10。

pLGN-35S:GhGRPL:YFP、TRV2-GhGRPL和pLGN-pro35S:YFP质粒分别转化为农杆菌株GV3101，用于进行蛋白亚细胞定位实验、VIGS实验和拟南芥遗传转化。通过浸花法(参见文献【S.J.Clough,A.F.Bent,Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana,Theplantjournal,16(1998)735-743.】)获得转基因拟南芥(Columbia 0，Col-0)系，并在21±2℃的温室中以16h光/8h暗的光周期下培养。

拟南芥(Col-0)AT5G49350基因的T-DNA插入突变体atgrp(SALK库编号：SALK_072132C)从SALK库中获得，并使用基于PCR的方法进行基因分型，方法描述在http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html中，引物对如下：

atgrp-F：5'-GTAATGGAGGTTTCGGAGGAG-3'，SEQ ID NO.11；

atgrp-R：5'-TGTAGTTAAAGCCAGCCTCCC-3'，SEQ ID NO.12；

LB1.3：5'-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3'，SEQ ID NO.13。

蛋白质定位分析

四周龄的烟草叶片(Nicotiana benthamiana)通过瞬时表达进行瞬时转化，方法参见【J.Zeng,X.Yan,W.Bai,M.Zhang,Y.Chen,X.Li,L.Hou,J.Zhao,X.Ding,R.Liu,F.Wang,H.Ren,J.Zhang,B.Ding,H.Liu,Y.Xiao,Y.Pei,Carpel-specific down-regulationofGhCKXs in cotton significantly enhances seed and fiber yield,J Exp Bot,73(2022)6758-6772.】。35S:AtPIP2A:RFP被用作质膜标记物(公开于文献【H.-Y.Ko,L.-H.Ho,H.E.Neuhaus,W.-J.Guo,Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem andseed coat for fruit and seed development in tomato,Plant Physiol,187(2021)2230-2245.】)，而35S:YFP被用作阳性对照，pLGN-35S载体为阴性对照。将共转化了35S:GhGRPL:YFP和35S:AtPIP2A:RFP的烟草叶下表皮细胞浸泡在0.4％(w/v)氯化钠(NaCl)溶液中质壁分离，持续5分钟后利用激光扫描共聚焦显微镜(SP8，Leica，德国)进行荧光分析。激发波长设置为514nm，激光功率为5％，可视化蛋白质荧光对YFP记录在520-560nm范围内，RFP记录在600-680nm范围内，方法参见【J.Zeng,D.Yao,M.Luo,L.Ding,Y.Wang,X.Yan,S.Ye,C.Wang,Y.Wu,J.Zhang,Y.Li,L.Ran,Y.Dai,Y.Chen,F.Wang,H.Lai,N.Liu,N.Fang,Y.Pei,Y.Xiao,Fiber-specific increase of carotenoid content promotes cottonfiber elongation by increasing abscisic acid and ethylene biosynthesis,TheCrop Journal,(2023).】。结果见图1。

转录分析

使用RT-qPCR检测GhGRPL在不同的野生型陆地棉组织中的转录水平。组织样本包括根(播种后10天)、茎(播种后110天棉花植株的第三节间的茎)、叶(离顶端的第三片叶)、开花期的花瓣、雄蕊和子房。GhACT7被用作内参基因。结果见图3中的A。

使用RT-qPCR检测了GhGRPL在野生型棉花茎横截面的第一节间在不同发育阶段的转录表达。GhACT7被用作内参基因。结果见图3中的H。

使用RT-qPCR检测了35S:GhGRPL转基因和野生型拟南芥花序茎中与次生壁沉积相关的基因的转录水平。AtActin2被用作内参基因，结果见图4中的O。

为了获得RNA样本，本发明使用天根生物科技有限公司(中国)提供的TIANGEN RNAsimple Total RNAkit从各种棉花和拟南芥组织中提取总RNA。随后，通过PrimeScript RT试剂盒与gDNA Eraser(Takara Bio，日本)降解基因组DNA(gDNA)，并合成第一链cDNA。实时定量PCR(RT-qPCR)分析使用CFX96实时PCR系统(Bio-Rad，美国)和SYBR-Green PCRMastermix(Vazyme，中国)进行。PCR循环条件包括在95℃下进行3分钟的预变性步骤，然后40个循环，在95℃下进行5秒的变性，57℃下进行20秒的退火，并进行标准的熔解曲线程序以评估PCR的特异性。为了归一化，选择了AtActin2和GhACT7作为拟南芥和棉花的内参基因。基因表达相对变化使用ΔΔCt方法确定。每个RT-qPCR实验独立重复三次。通过供应商提供的Bio-Rad CFX Manager 2.0软件(Bio-Rad，美国)对得到的RT-qPCR数据进行了分析。RT-qPCR使用的基因特异引物的详细信息见表1。

表1用于RT-qPCR测定的引物序列

病毒诱导基因沉默(VIGS)实验

VIGS实验利用烟草脆裂病毒(TRV)作为载体系统，抑制目标基因的表达，从而实现对基因功能的快速验证，方法参见【L.Xu,W.Zhang,X.He,M.Liu,K.Zhang,M.Shaban,L.Sun,J.Zhu,Y.Luo,D.Yuan,Functional characterization ofcotton genes responsive toVerticillium dahliae through bioinformatics andreverse genetics strategies,JExp Bot,65(2014)6679-6692.】。TRV2-GhGRPL载体含有GhGRPL部分编码序列的片段(17-224bp)，同TRV1载体分别转化为农杆菌菌株GV3101。然后，这些载体用于共注射萌发后5d(5-DAS)棉花子叶，从而抑制目标基因的表达。

显微观察和组织学分析

利用Stereo Discovery V20立体显微镜(Zeiss，德国)观察木质化细胞壁的定位，按照Wang等人的方法进行【Y.Wang,W.Yu,L.Ran,Z.Chen,C.Wang,Y.Dou,Y.Qin,Q.Suo,Y.Li,J.Zeng,DELLA-NAC interactions mediate GA signaling to promote secondarycell wall formation in cotton stem,Frontiers inplant science,(2021)1123.】。简而言之，使用间苯三酚(Phloroglucinol-HCl)染色对不同发育阶段(播种后7-21天；DAS)的野生型棉花第一节间的茎的横截面进行染色，结果见图3中的B～G，其中E～G依次为B～D所选区域的放大图，比例尺为500μm(B～D中)和100μm(E～G中)。

使用间苯三酚和甲苯胺蓝(toluidine blue)染色对播种后42天拟南芥花序茎基部的组织进行染色观察。结果见图4中的A～L，A～D为间苯三酚溶液染色结果，E～H为甲苯胺蓝溶液染色结果，I～L为紫外光(UV)下观察结果，比例尺均为20μm。

对于自发荧光成像，使用光学显微镜(IX81，Olympus，日本)在紫外(UV)条件下可视化切片中的木质素聚合物。对于木质素染色，切片使用5％间苯三酚溶液(在95％乙醇中)处理5分钟或0.025％甲苯胺蓝溶液(在去离子水中)处理1分钟。随后，染色的切片在可见光条件下使用光学显微镜(BX41TF，Olympus，日本)拍摄照片。

内源木质素的定量分析

拟南芥花序的茎部经过65℃干燥24小时，随后研磨成细粉，然后通过80目筛子进行颗粒大小的均匀化。精确称取50毫克的样品放入试管中。随后，在80℃的水浴中用5毫升80％(V/V)乙醇处理2小时。在此步骤之后，提取物经过10分钟、10,000×g的离心，去除上清液。这个提取过程重复两次。得到的沉淀在4mL氯仿中重新悬浮，并在62℃孵化1小时。经过另一轮10分钟、10,000×g的离心后，沉淀在50℃的条件下干燥2天，然后溶解在2.6毫升的溴化乙酰和乙酸(1:3，V/V)溶液中。然后，该溶液在设定为70℃的水浴中孵化1小时。随后，加入580微升混合溶液，其中含有17.24％(V/V)的2N氢氧化钠和82.76％(V/V)的乙酸，然后小心地将每个样品的100微升转移到新的管中。最后，通过在管中加入20微升的7.5M盐酸羟胺停止反应，并用乙酸调整总体积为2毫升。在Varioskan LUX多模式读数器(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)上测量在280纳米处的吸光度。这些测量是通过三个独立的生物学重复进行的。结果见图4中的M和N，其中M为42天时拟南芥花序茎基部相对木质素含量，野生型拟南芥花序茎木质素含量作为参照；N为使用厚壁细胞指数对茎横截面组织中的厚壁细胞层进行定量结果。

干旱胁迫处理

为了在MS培养基中模拟干旱胁迫，来自野生型(Col-0)、atgrp和GhGRPL过表达(OE-2和OE-4)拟南芥株系的种子被灭菌并均匀分布在含有300mM甘露醇的1/2MS培养基上，以诱导干旱胁迫，与此同时，阴性对照组同时在不含甘露醇的1/2MS固体培养基上培养。在4℃的2天低温处理后，将种子转移到正常的生长条件(21℃)，并垂直放置在培养皿上。测量主根的长度，并在2周后进行基因表达分析。为了在土壤中诱导干旱胁迫，拟南芥幼苗在土壤中生长2周，然后通过停水直至大约一半的叶片显示脱水或萎缩的迹象来模拟干旱胁迫。在复水后，确定存活率，并记录植物地上部分的新鲜重量和干重。这些测量是通过三个独立的生物学重复进行的。

盐胁迫处理

为了在MS培养基中模拟盐胁迫，来自野生型(Col-0)、atgrp和GhGRPL过表达(OE-2和OE-4)拟南芥株系的种子被灭菌并均匀分布在含有150mM NaCl的1/2MS培养基上，以诱导盐胁迫。阴性对照组同时在不含盐的1/2MS固体培养基上培养。在4℃的2天低温春化处理后，将种子转移到正常的生长条件(21℃)，并垂直放置在培养皿上。在7天后测量了发芽率，并在2周后评估了主根的长度，同时进行了基因表达分析。为了在土壤中诱导盐胁迫，拟南芥幼苗在土壤中生长了4周，并通过用150mM NaCl溶液灌溉来施加盐胁迫。在7天后，观察了植物的表型，并计算了存活率。这些测量是通过三个独立的生物学重复进行的。

病原体引入和病症评估

表达GFP的V.dahliae菌株(V991-GFP)在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上培养，并在26℃孵育5～7天。随后，从培养皿中收集分生孢子，转移到马铃薯葡萄糖汤(PDB)培养基中，并在26℃下以每分钟200转的转速摇动培养5天。随后，将分生孢子悬浮液通过四层纱布过滤，以5000×g离心10分钟。然后，得到的分生孢子在无菌水中重新悬浮。

对于拟南芥的接种，经过人工根部损伤的3周大拟南芥幼苗每盆接种4毫升的V.dahliae孢子悬浮液(1×10⁷孢子/mL)。在接种后的第10天评估了黄萎病症状。使用每个处理至少21株植物对黄萎病进行了病程指数(DI)评分。疾病症状的严重程度按照0到4的等级进行评定。其中，等级0表示没有可见的枯萎或叶绿素缺乏症状；等级1表示真叶的0-25％枯萎或叶绿素缺乏；等级2表示真叶的25-50％枯萎或叶绿素缺乏；等级3表示真叶的50-75％枯萎或叶绿素缺乏；等级4表示真叶的75-100％枯萎或叶绿素缺乏。DI的计算公式为：DI＝100×[(病程等级×植物数量的总和)/(总植物数×4)]，如Xu等人所述【L.Xu,W.Zhang,X.He,M.Liu,K.Zhang,M.Shaban,L.Sun,J.Zhu,Y.Luo,D.Yuan,Functionalcharacterization of cotton genes responsive to Verticillium dahliae throughbioinformatics andreverse genetics strategies,J Exp Bot,65(2014)6679-6692.】，为了观察在拟南芥中表达GFP的V.dahliae菌株(V991-GFP)的寄生情况，于接种后第7天，在距离地表约0.5厘米处对主根的横截面进行检查，以检测GFP荧光，表示该菌株的存在。

对于棉花的接种，经过5天生长的棉花幼苗经过VIGS实验以干扰GhGRPL的表达。在15天后，在人工根部损伤后，它们被用1×10⁸孢子/mL浓度的v991-GFP分生孢子悬浮液接种在土壤中，每个孔口10毫升。用水模拟接种的子叶(只使用水)作为未处理对照。在接种后的第15天评估了黄萎病症状。使用每个处理至少30株植物对黄萎病进行了DI评分。症状严重程度评估使用了一个从0到4的等级。其中，等级0表示没有可见的枯萎或叶绿素缺乏症状；等级1表示1-2子叶变黄或枯萎；等级2表示1片真叶变黄或枯萎；等级3表示2片真叶变黄或枯萎；等级4表示所有叶子变黄或植物死亡[39,40]。DI的计算使用了上述拟南芥方法中描述的公式。为了观察在棉花植物中表达GFP的V.dahliae菌株(V991-GFP)的寄生情况，于接种后第10天，在距离茎约3厘米的主根的纵截面下，使用共聚焦显微镜观察GFP荧光。利用RT-qPCR方法，使用引物ITS1-F和ST-VE1-R，定量真菌相对生物量，方法参见【U.Ellendorff,E.F.Fradin,R.De Jonge,B.P.Thomma,RNA silencing is required forArabidopsis defence against Verticillium wilt disease,J Exp Bot,60(2009)591-602.】。植物使用的参考基因是GhACT7，所用引物序列见表1；所述ITS1-F和ST-VE1-R的引物序列如下：

ITS1-F：5'-AAAGTTTTAATGGTTCGCTAAGA-3'，SEQ ID NO.54；

ST-VE1-R：5'-CTTGGTTCATTTAGAGGAAGTAA-3'，SEQ ID NO.55。

统计分析

使用GraphPad Prism 8.0中的Student's t检验进行了统计分析。符号*，**和***表示统计学上的显著性，分别表示两组数据之间的定量差异为*p<0.05，**p<0.01或***p<0.001。

结果

GhGRPL的分子特征分析

表达GhGRPL:YFP的本氏烟N.benthamiana细胞在细胞表面呈现出明显的点状YFP荧光，而质壁分离实验支持GhGRPL在细胞壁内定位(图1)。

将GhGRPL蛋白和拟南芥的GRP蛋白(AtGRP)进行对比分析，结果见图2，其中，图2中的A为GhGRPL蛋白的序列比对结果；B为GhGRPL蛋白的结构示意图；SP，信号肽；富甘氨酸的重复序列用GGX、GGGX、GGGGX、GXXG、GXXXGXXXG和GXGX表示，其中G代表甘氨酸，X代表任何氨基酸。结果显示，GhGRPL包含一个N-端SP信号肽序列和一个富含甘氨酸的结构域，然而甘氨酸含量仅为8.1％，属于Class III GRP。

GhGRPL的表达模式与次生壁的发育呈正相关

RT-qPCR结果表明，GhGRPL主要在棉花晚期纤维细胞中表达，并且在根、茎和叶中也有表达，其中在根部表达最高(图3中的A)。这表明GhGRPL不仅参与纤维品质的形成，还影响植物的胁迫响应。利用间苯三酚染色次生壁(木质素)和RT-qPCR在不同生长阶段的棉花茎的第一节间进行分析表明，次生壁的染色强度和GhGRPL的表达水平均呈一致增加的趋势(图3中的B～H)。这些发现与从棉纤维中获得的RT-qPCR数据一致(图3中的A)。这些结果表明GhGRPL参与了次生壁沉积，并且其表达模式与次生壁的发育呈正相关。

为进一步研究GhGRPL在植物次生壁发育中的作用，本发明创建了GhGRPL的组成型过表达的拟南芥植株，其在花椰菜花叶病毒35S启动子(35S)的调控下表达。本发明从不同的转化子(T₁代)中选择了两株(OE2和OE4)，它们表现出较高的GhGRPL表达水平，用于进一步的研究(图5)。

使用间苯三酚和甲苯胺蓝染色，以及在紫外光下观察的结果表明，转基因植物中的木质素信号明显强于野生型和atgrp突变拟南芥植株(图4中的A～L)。含量检测的结果进一步确认了与野生型对照组(100.0％)和突变组(97.3％)相比，35S:GhGRPL系列拟南芥植株(117.8％和121.0％)中花序茎部的木质素沉积显著增加(图4中的M)。硬化细胞层的统计结果显示，35S:GhGRPL转基因植株中茎部横截面组织中硬化细胞的指数(6.6±0.8和7.1±0.7)显著高于野生型(5.2±1.0)和突变拟南芥植株(5.2±0.7)(图4中的N)。此外，RT-qPCR结果显示木质素合成相关基因(At4CL、AtPAL、AtF5H)的表达水平显著增加(图4中的O)。这些结果表明，GhGRPL的异源表达促进了木质素沉积和次生壁的发育。

为了确认GhGRPL在棉花次生壁发育中的作用，本发明采用了病毒诱导基因沉默(VIGS)来沉默棉花中GhGRPL的表达。结果见图6和图7(检测方法同上)，其中，图6中的A～L检测了棉花第一节间的木化细胞壁的定位；观察了在15天时徒手切片棉花第一节间的组织，其中在紫外光下观察(图6中I～L)，或者分别使用间苯三酚溶液(图6中A～D)和甲苯胺蓝溶液(图6中E～H)染色，右侧图显示了左侧图所选区域的放大图，比例尺均为100μm；图6中M为使用RT-qPCR检测了TRV:GhGRPL棉花茎横截面的第一节间和阴性对照(TRV:00)中GhGRPL的转录水平结果；GhACT7被用作内参基因；N为使用RT-qPCR检测了TRV:GhGRPL棉花茎横截面的第一节间和阴性对照(TRV:00)中与次生壁沉积相关的基因的转录水平结果；图7中的A为干扰GhGRPL基因表达后15天生长的棉花植株的表型，比例尺为5cm；图7中的B为干扰GhGRPL基因表达后棉花植株高度的统计结果。由结果可知，在感染后的15天和20天(dpi)，与阴性对照组(TRV:00)相比，GhGRPL的表达水平明显降低(图6中的M)。表型观察结果显示，与阴性对照组相比，感染后15天的GhGRPL沉默棉花植株高度略有增加(图7)。同时，对次生壁形态的观察表明，感染后15天的GhGRPL沉默棉花植株主茎的次生壁厚度明显较阴性对照组的植株更薄(图6中的A～L)。次生壁发育相关基因(GhPER4、GhPER21、GhPER64)的表达也被抑制(图6中的N)。这进一步证明了GhGRPL与次生壁沉积呈正相关。

GhGRPL的上调表达提高植物对非生物胁迫的抗性

非生物胁迫，如干旱和高盐含量，对植物生长和产量产生负面影响，导致作物产量降低高达70％。本发明使用甘露醇和氯化钠分别模拟干旱和高盐胁迫，以探究GhGRPL是否参与了对非生物胁迫的响应。在不同时间点处理过150mM NaCl和300mM甘露醇的棉花叶片中的GhGRPL的转录水平。GhACT7被用作内参基因，结果见图8。

RT-qPCR结果表明，在150mM NaCl和300mM甘露醇诱导处理3小时后，GhGRPL的表达水平显著增加，且这种增加趋势在检测阶段保持恒定(图8)。

为进一步研究GhGRPL在植物非生物胁迫响应中的作用，对35S:GhGRPL转基因拟南芥、野生型和atgrp突变体在干旱和高盐胁迫下的表现进行了分析。

干旱胁迫结果见图9，其中，A为野生型(Col-0)、AtGRP突变体(atgrp)和GhGRPL过表达(OE-2和OE-4)拟南芥幼苗的耐旱实验结果，比例尺为1cm；B为图9中的A所示Col-0、atgrp、GhGRPL过表达(OE-2和OE-4)拟南芥幼苗的主根长度测量结果，误差棒表示从每个组中至少29株幼苗中收集的数据的标准偏差(SD)；C～F为Col-0、atgrp、GhGRPL过表达(OE-2和OE-4)拟南芥系的耐旱表型、存活率(D)、植物地上部分的鲜重(E)和干重(F)的实验结果，比例尺为2cm；误差棒表示从每个组中至少21个株系中收集的数据的标准偏差(SD)；G为使用RT-qPCR检测了野生型和GhGRPL过表达的2周龄拟南芥幼苗中与干旱应激相关的基因的转录水平结果，AtActin2被用作内参基因。

高盐胁迫结果见图11，其中，A为野生型(Col-0)、AtGRP突变体(atgrp)和GhGRPL过表达(OE-2和OE-4)拟南芥幼苗的盐胁迫耐受实验结果，比例尺为1cm；B图11中的A所示Col-0、atgrp、GhGRPL过表达(OE-2和OE-4)拟南芥幼苗的主根长度测量结果，误差棒表示从每个组中至少30株幼苗中收集的数据的标准偏差(SD)；C和D为Col-0、atgrp、GhGRPL过表达(OE-2和OE-4)拟南芥系的盐胁迫耐受表型和存活率结果，比例尺为1cm，误差条表示从每个组中至少21个株系中收集的数据的标准偏差(SD)；E为使用RT-qPCR检测了野生型和GhGRPL过表达的2周龄拟南芥幼苗中与盐胁迫相关的基因的转录水平结果，AtActin2被用作内参基因。

首先，在含有300mM甘露醇的MS培养基中模拟拟南芥幼苗的干旱条件，结果显示，在2周的处理后，35S:GhGRPL转基因拟南芥的主根长度分别为2.4±0.5cm和2.3±0.4cm，显著长于野生型对照组(1.8±0.3cm)和突变体(1.7±0.5cm)。此外，在35S:GhGRPL转基因植株中，负调控干旱胁迫应答的基因AtAAO3和AtNCED3的表达水平相比野生型对照组显著降低。相反，与野生型对照组相比，正调控干旱胁迫应答的基因，如AtABI1、AtABI15、AtDREB2A、AtSOS2和AtMYB2，表达水平呈不同程度增加(图9中的A，B，G)。此外，还在土壤中分析了拟南芥在干旱胁迫下的表型。移植2周后，拟南芥植株被暴露在3周不浇水的条件下，直到约一半的叶片出现干燥或萎蔫的迹象模拟干旱胁迫；在复水后，调查存活率，并记录植物地上部分的鲜重和干重。结果显示，野生型和突变体的存活率分别为36.1％和37.5％，而GhGRPL转基因植株OE2和OE4的存活率分别为96.7％和94.8％(图9中的C，D)。此外，在重新浇水后，GhGRPL转基因植株OE2和OE4的鲜重和湿重显著高于野生型对照组和突变体(图9中的E，F)。这些发现表明，GhGRPL的异源表达有助于在水分不足的条件下促进植物生长，并增强植物对干旱胁迫的耐受性(图10)。

同样地，使用含有150mM NaCl的MS培养基模拟拟南芥幼苗的高盐条件。结果显示，在35S:GhGRPL转基因拟南芥OE2和OE4中，经过灭菌处理的拟南芥种子的发芽率分别为84.2％和83.6％，显著高于野生型对照组(78.1％)和突变体(78.0％)。在含有150mM NaCl的MS培养基上进行为期2周的处理后，35S:GhGRPL转基因拟南芥的主根长度分别为2.3±0.3cm和2.2±0.2cm，显著长于野生型对照组(1.7±0.5cm)和突变体(1.7±0.5cm)。此外，在35S:GhGRPL转基因植株中，与野生型对照组相比，对干旱胁迫应答产生积极影响的AtJUB1的表达水平显著增加。相反，与野生型对照组相比，与负调控干旱胁迫应答有关的基因的表达水平，如AtSAG29、AtORE1和AtGI，呈现出不同程度的降低(图11中的A，B，E)。此外，在土壤中进行的高盐胁迫实验，拟南芥幼苗在土壤中培养4周，然后通过灌溉300mM NaCl溶液诱导盐胁迫，经过7天，观察了植物的表型，并计算了存活率，结果显示，与对照组和突变体相比，过表达GhGRPL的拟南芥表现出更好的耐盐性和显著增强的存活能力(图11中的C，D)。综合而言，GhGRPL的异源表达有助于在高盐条件下促进植物生长，并增强植物对盐胁迫的耐受性(图10)。

另外，本发明将经过3天低温(4℃)春化处理的拟南芥种子被播种并在含有150mMNaCl的MS培养基中培养7天，测定在盐胁迫下，野生型(Col-0)、AtGRP突变体(atgrp)和GhGRPL过表达(OE-2和OE-4)拟南芥种子的发芽率，结果见图14。其中，A为培养7天后的拟南芥种子的发芽结果，比例尺为1cm；B为发芽率测定结果。误差棒表示从每个相应组内至少256颗种子收集的数据的标准差。虚线圆圈为框选的未萌发的种子；星号用于指示与野生型对照组相比的显著差异，由Student's t-test检验确定。***p<0.001。由图14可知，GhGRPL过表达增强了拟南芥种子在盐胁迫下的发芽率。

GhGRPL的上调表达提高了植物对生物胁迫的抵抗力

为了研究GhGRPL在植物对黄萎病的抵抗性中的作用，将三周龄的拟南芥植株接种V.dahliae菌株V991-GFP(4mL，1×10⁷孢子mL^-1)10天，观察拟南芥系的黄萎病症状，结果见图12中的A，比例尺为1cm，并统计接种10天的拟南芥植株的病情指数和病情等级，结果见图12中的C和D，误差棒表示从每个组中至少21个株系中收集的数据的标准偏差(SD)；接种后7天观察转基因系中由表达GFP的V.dahliae菌株(V991-GFP)的根部寄生情况，结果见图12中的B，比例尺为100μm。由结果可知，接种后10天，与野生型对照组和突变体相比，35S:GhGRPL拟南芥转基因植株表现出明显较轻的症状，包括较少的坏死和萎蔫(图12中的A)。在接种后的第7天，野生型棉花植株的根部存在大量荧光标记的菌丝，相比之下，在35S:GhGRPL转基因拟南芥植株的根部观察到较少的菌丝(图12中的B)。与野生型对照组相比，OE2和OE4转基因拟南芥的病害指数分别降低了37.7％和36.1％(图12中的C，D)。这些结果表明，上调GhGRPL的表达能够增强拟南芥对V.dahliae感染的抵抗性。

为确认GhGRPL在对抗黄萎病中的作用，本发明采用VIGS技术来抑制棉花中GhGRPL的表达，方法如下：棉花幼苗在土壤中培养3周，然后接种V.dahliae V991-GFP菌株(4mL，1×10⁷孢子mL^-1)15天，同时设置阴性对照(TRV:00)，模拟接种组为用水接种(未处理对照)，观察棉花植株的黄萎病症状，结果见图13中的A，比例尺为5cm；使用RT-qPCR检测TRV:GhGRPL棉花茎横截面和阴性对照(TRV:00)的第一节间的GhGRPL的转录表达，GhACT7被用作内参基因，结果见图13中的B；在接种后15天观察解剖的棉花植株茎，结果见图13中的C，比例尺为1cm(上面板)和100μm(下面板)；在接种后15天观察表达GFP的V.dahliae菌株(V991-GFP)在棉花须根纵向切片中的寄生情况，结果见图13中的D，比例尺为50μm；使用总基因组DNA作为模板，通过实时PCR测量了根和叶中V.dahliae的相对生物量，在接种后15天，从根和叶中提取DNA，GhACT7被用作内参基因，结果见图13中的E，星号用于表示与阴性对照组(TRV:00)相比的显着差异，**p<0.01；图13中的F和G为图13中的A所示的TRV:GhGRPL棉花植株和阴性对照(TRV:00)植株的病情指数(F)和病情等级(G)。误差棒表示从每个组中至少30个株系中收集的数据的标准偏差(SD)。星号用于表示与野生型对照组相比的显着差异，*p<0.05。

在接种后16天，与阴性对照组相比，GhGRPL的表达水平显著降低至少70.7％(图13中的B)。经过与V.dahliae菌株V991的15天接种后，与阴性对照组相比，GhGRPL的抑制导致疾病症状恶化，如叶片脱落增加、坏死、萎蔫和木质部变褐(图13中的A，C)。接种后第15天，观察到GhGRPL沉默植株根部存在更多菌丝(图13中的D)。基于RT-qPCR的叶片真菌生物量估计证实，与阴性对照组相比，GhGRPL沉默植株中真菌的寄生量更多(图13中的E)。GhGRPL沉默植株的病害指数显著高于阴性对照组(图13中的F，G)。这些结果强有力地支持了该基因在增强植物对黄萎病抵抗力方面的作用(图10)。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种增强植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性的GhGRPL蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述GhGRPL蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述GhGRPL蛋白或权利要求2所述的编码基因在调控植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调控包括：提高所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，增强植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性；降低所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，降低植物对生物胁迫和/或非生物胁迫的耐受性。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述增强植物对生物胁迫的耐受性包括：增强植物对大丽轮支菌(Verticillium dahliae)感染的抵抗性。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述非生物胁迫包括干旱和/或盐胁迫。

7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥或棉花。

8.权利要求1所述GhGRPL蛋白或权利要求2所述的编码基因在调控植物木质素沉积和/或植物次生壁发育中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述调控包括：提高所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，促进植物木质素沉积和/或植物次生壁发育；降低所述GhGRPL蛋白或所述的编码基因的表达量，抑制植物木质素沉积和/或植物次生壁发育。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥或棉花。