CN117959413A - 载脂蛋白e在制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体讲，涉及载脂蛋白E在视神经脊髓炎谱系疾病药物中的应用。本发明实施例提出在视神经脊髓炎谱系疾病患者中发现星形胶质细胞外囊泡内APOE蛋白升高，以及APOE蛋白在治疗NMOSD中的应用。APOE蛋白是一种多肽糖蛋白，在中枢神经系统中具有免疫调节作用。本发明实施例经研究发现，APOE蛋白可以明显减少NMOSD颅内脱髓鞘病灶，减少病灶周围的促炎型小胶质细胞，同时减少脑内免疫细胞浸润，从而抑制中枢炎症。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体讲，涉及载脂蛋白E（APOE）在制备视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的药物中的应用。
背景技术
视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）是一种中枢神经系统的自身免疫性炎症性疾病。NMOSD的主要发病机制是水通道蛋白 4（AQP4）抗体通过与星形胶质细胞足突表面的水通道蛋白AQP4结合损伤星形胶质细胞，伴随小胶质细胞活化与补体系统激活，继而发生髓鞘脱失和神经元损伤，因此NMOSD也被认为是一种星形胶质细胞病。
NMOSD的治疗主要分为急性期治疗与缓解期预防复发的免疫调节治疗。急性期主要为激素冲击治疗与血浆置换治疗，虽然可以缓解急性期的炎性反应并改善症状，但药物副作用较大，患者耐受度差。载脂蛋白E（APOE）是一种含有299个氨基酸的单链多肽糖蛋白，在中枢神经系统中主要星形胶质细胞、小胶质细胞、血管壁细胞和脉络丛细胞中大量表达，APOE蛋白可以作为配体与特定的细胞表面受体结合，从而调节脂蛋白从血浆中清除，同时具有抗炎作用。目前，APOE蛋白在神经系统疾病中已显示出巨大的治疗潜能。而其在NMOSD中的治疗未见报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了载脂蛋白E（APOE）和/或重组铁蛋白载脂蛋白E在治疗视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）中的应用。
本发明提供了载脂蛋白E（APOE）和/或重组铁蛋白载脂蛋白E在制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的药物中的应用。
本发明提供了载脂蛋白E和/或重组铁蛋白载脂蛋白E在制备用于抑制脑内外周免疫细胞向中枢神经系统的星形胶质细胞浸润的药物中的应用。
本发明提供了载脂蛋白E和/或重组铁蛋白载脂蛋白E在制备用于减少脑内病灶体积的药物中的应用。
可选的，载脂蛋白E为至少包括第130个氨基酸到第149个氨基酸的肽段。
可选的，重组铁蛋白载脂蛋白E中铁蛋白亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
可选的，重组铁蛋白载脂蛋白E包括24个铁蛋白亚基，每个所述铁蛋白亚基上均连接有载脂蛋白E肽段。
可选的，载脂蛋白E肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
可选的，重组铁蛋白载脂蛋白E的制备方法至少包括以下步骤：将SEQ ID No:3所示的核苷酸序列克隆到质粒中构建表达载体，将所述表达载体转化至宿主细胞中后，经诱导表达和纯化，得到所述重组铁蛋白载脂蛋白E。
本发明还提出一种重组铁蛋白载脂蛋白E，重组铁蛋白载脂蛋白E的制备方法至少包括以下步骤：将SEQ ID No:3所示的核苷酸序列克隆到质粒中构建表达载体，将表达载体转化至宿主细胞中后，经诱导表达和纯化，得到重组铁蛋白载脂蛋白E。
可选的，重组铁蛋白载脂蛋白E包括24个铁蛋白亚基，每个铁蛋白亚基上均连接有载脂蛋白E肽段。
本发明提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明提出载脂蛋白E（APOE）及工程化铁蛋白APOE多肽在制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的药物中的应用。载脂蛋白E（APOE）是一种含有299个氨基酸的单链多肽糖蛋白，结构简单清晰。目前有多种APOE模拟肽段，易获得。通过对APOE肽段与铁蛋白载体连接从而增强其稳定性，更具临床应用优势。
本发明经研究发现，载脂蛋白E（APOE）及工程化铁蛋白APOE多肽可以明显减少NMOSD小鼠颅内病灶面积，在免疫系统方面，可明显减少病灶周围的促炎型小胶质细胞，同时减少脑内免疫细胞浸润。即，采用载脂蛋白E（APOE）治疗NMOSD的过程中，可以抑制中枢炎症，从而改善患者残障功能缺损。
附图说明
图1为实施例1中工程化铁蛋白APOE多肽的构建后的SDS-PAGE图；
图2为实施例1中工程化铁蛋白APOE多肽的构建后的洗脱结果；其中左侧峰为HFn的峰，右侧峰为铁蛋白-APOE130-149的峰；
图3为实施例1中工程化铁蛋白APOE多肽的构建后的DLS结果；
图4为实施例2中为视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）患者星形胶质细胞外泌体中载脂蛋白E（APOE）蛋白浓度显著升高；
图5为实施例3中不同实验组NMOSD小鼠在高峰期脑内病灶的核磁照片；
图6为实施例3中不同实验组NMOSD小鼠在高峰期脑内病灶体积对比图；
图7为实施例3中不同实验组NMOSD小鼠在高峰期脑内小胶质细胞数量、淋巴细胞、髓系细胞数量的对比结果；
图8为实施例3中不同实验组NMOSD小鼠应用工程化铁蛋白-APOE多肽治疗后在高峰期脑内病灶的核磁照片；
图9为实施例3中不同实验组NMOSD小鼠应用工程化铁蛋白-APOE多肽治疗后在高峰期脑内病灶的对比结果。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本公开，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例提出了载脂蛋白E在用于制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病的药物中的应用。本发明实施例研究发现，在视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）中，多种蛋白或者因子的水平会发生变化。在NMOSD中，外周血浆和星形胶质细胞来源的外泌体蛋白质组学鉴定出19种上调蛋白和22种下调蛋白，经实验验证，NMOSD患者血浆中APOE、SRGN、CD59、HABP2、PRG4、FGA、S100A8、LTF、CXCL10和CXCL12等蛋白浓度显著高于健康对照血浆中蛋白浓度。发明人通过对患者体内发生变化的蛋白进行了深入研究及筛选，惊喜的发现在视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）患者星形胶质细胞外泌体中载脂蛋白E（APOE）蛋白浓度显著升高。通过实验发现，载脂蛋白E（APOE）对于视神经脊髓炎谱系疾病具有显著的治疗作用，从而完成本发明。
载脂蛋白E（APOE）是一种含有299个氨基酸的单链多肽糖蛋白，在中枢神经系统中主要星形胶质细胞、小胶质细胞、血管壁细胞和脉络丛细胞中大量表达，APOE蛋白可以作为配体与特定的细胞表面受体结合，从而调节脂蛋白从血浆中清除，同时具有抗炎作用。APOE在中枢神经系统中主要星形胶质细胞、小胶质细胞、血管壁细胞和脉络丛细胞中大量表达。其结构简单清晰，有多种模拟肽段，可改善其抗炎功能、增强其稳定性，更具临床应用优势，为中枢神经系统疾病等的治疗提供新靶点、新方向。通过对APOE肽段与铁蛋白载体连接从而增强其稳定性，更具临床应用优势。
具体的，载脂蛋白E至少包括第130个氨基酸到第149个氨基酸的肽段，具体氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2的氨基酸序列如下：Ac-TEELRVRLASHLRKLRKRLL-NH2。
为了进一步增加载脂蛋白E（APOE）的治疗效果，本发明实施例经过实验发现，重组铁蛋白载脂蛋白E可以增加稳定性，显著提高治疗效果。重组铁蛋白载脂蛋白E包括24个铁蛋白亚基，每个所述铁蛋白亚基上均连接有载脂蛋白E肽段。铁蛋白亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述载脂蛋白E肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1的氨基酸序列如下：
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES。
本发明通过研究发现，选用上述铁蛋白肽链与上述载脂蛋白E第130个氨基酸到第149个氨基酸的肽段连接，所获得的工程化铁蛋白APOE多肽具有显著提高的生物活性。具体的连接方式为：载脂蛋白E多肽与铁蛋白肽链依次连接，即将载脂蛋白E多肽连接于铁蛋白肽链的N端。本发明实施例经研究后惊喜的发现，载脂蛋白E（APOE）和工程化铁蛋白APOE多肽可以明显减少NMOSD小鼠颅内病灶面积，在免疫系统方面，可明显减少病灶周围的促炎型小胶质细胞，同时减少脑内免疫细胞浸润。即，采用载脂蛋白E（APOE）治疗NMOSD的过程中，可以抑制中枢炎症，从而改善患者残障功能缺损。NMOSD小鼠模型是通过NMOSD患者血浆中抗体诱导而来的动物模型，模拟了NMOSD抗体介导的免疫机制，在临床神经免疫学的研究中具有重要意义。采用载脂蛋白E（APOE）蛋白在用于制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的药物的过程中，可显著抑制中枢炎症、减少疾病损伤。
具体的，本发明的应用包括用于抑制脑内的促炎型小胶质细胞。还包括抑制脑内外周免疫细胞向中枢神经系统的浸润星形胶质细胞。还可以用于减少脑内病灶体积。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下述实施例中涉及到的试剂耗材如下：
雌性C57BL/6小鼠（8 ~ 10周龄）购自斯贝福生物科技技术有限公司；C57BL/6J背景的APOE-/-小鼠（雌性，8周龄，B6/JGpt-Apoeem1Cd82/Gpt）购自南京Gem-Pharmatech公司（中国南京）。小鼠脑立体定位仪采用RWD Life Science，APOE多肽（APOE130-149），购自金斯瑞；7T核磁采用Siemens ClinScan scanner；流式细胞仪Aria采用BD Biosciences。
实施例1：铁蛋白-APOE130-149的构建与表征
1、铁蛋白-APOE130-149重组质粒的构建。
应用基因工程技术，选用铁蛋白工程化载脂蛋白E多肽中HFn的氨基酸序列（SEQID No.1）和载脂蛋白E第130个氨基酸到第149个氨基酸的肽段（SEQ ID No.2），将APOE130-149肽段展示在铁蛋白表面。将APOE130-149重组质粒序列和HFn的DNA序列经全基因合成后（SEQ ID No.3），使用NdeI和BamH1限制性内切酶酶切，将其克隆到具有NdeI和BamHI限制酶切位点的大肠杆菌(E.coli)表达载体pET22b(+)质粒中，经DNA测序鉴定序列正确。
SEQ ID No.3的核苷酸序列如下：
atgacgacagctagtacttcacaagtaaggcaaaactatcaccaggacagcgaagcggcaattaaccgtcagattaatctggagttgtacgcatcctacgtttatctgtctatgagctactacttcgatcgtgacgatgttgccctgaagaactttgcgaaatatttccttcaccaaagccacgaagaacgtgagcacgcggaaaagctgatgaaattgcagaaccaacgtggcggccgtatttttctgcaagacatcaagaaaccggattgtgacgactgggagagcggcctgaatgcgatggagtgcgctctgcacctggagaagaacgtgaatcagtcgctcctggagctccacaaattggcgaccgataagaacgatccgcatttatgcgacttcatcgaaacccattatctgaacgaacaggttaaagccatcaaagagctgggcgatcatgtcaccaatctgcgcaaaatgggtggtggtagcggtacggaagagttgcgcgtgagattagcttcccatctgcgtaagttgcgcaagcgcctgctg
2、铁蛋白-APOE130-149的表达和纯化。
蛋白表达：将上述获得的质粒转入E. coli BL21表达菌株，转化后的大肠杆菌在含100 mg/L氨苄的LB培养基中生长过夜，然后用0.5 mM的IPTG，30℃培养8 h来诱导蛋白表达。
蛋白纯化：4000 rpm 4℃离心20 min收集菌体，并在Tris缓冲液（20 mM Tris，pH8.0）中重悬。重悬的大肠杆菌菌体高压匀浆破碎后，上清液72℃热处理15 min，再次12000rpm离心30 min收集上清。
随后用阴离子交换柱Q-Sepharose Fast Flow纯化分离铁蛋白-APOE130-149蛋白，最后用superdex200（10/300GL，GE Healthcare）分子筛纯化分离，每个铁蛋白亚基上连接一个APOE130-149多肽，即铁蛋白表面展示24个APOE130-149多肽。以牛血清白蛋白为标准，采用BCA蛋白检测试剂盒测定铁蛋白-APOE130-149的浓度。
结果表征：通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和体积排阻色谱（SEC）验证铁蛋白-APOE130-149是否构建表达成功以及蛋白纯度，通过动态光散射（DLS）进一步表征铁蛋白-APOE130-149的组装结构尺寸。结果如图1~图3所示。
如图1所示，SDS-PAGE分析表明，铁蛋白-APOE130-149在稍高于21 kDa左右的分子量处出现与HFn相似的单一条带，与理论值吻合。
如图2所示，铁蛋白-APOE130-149在SEC柱上的洗脱体积与24聚体HFn蛋白笼相似，证明铁蛋白-APOE130-149成功自组装成笼状结构，且蛋白纯度在97%。
如图3所示，DLS结果显示铁蛋白-APOE130-149的平均粒径在19 nm左右，表明组装成功形成笼状结构。
实施例2：载脂蛋白E（APOE）蛋白检测
1、实验方法：
酶联免疫测定（ELISA）
使用人载脂蛋白E（APOE）ELISA试剂盒（abcam，ab108813）来测量AQP4抗体阳性NMOSD患者体液中APOE蛋白的表达。按照制造商的建议稀释样品，并使用相应的标准曲线计算浓度。通过在三个重复中测量血浆的 QC 来评估测定内变异系数（CV），获得的CV低于10%，而有效分析必须达到低于10%的CV。超出范围值的样品被稀释并再次测量。
APOE蛋白测定在室温（20 ~ 25℃）下进行。取96孔板复温，立即将剩余孔板放回装有干燥剂的铝箔袋中。重新密封袋子以尽量减少接触水蒸气并储存在真空干燥器中，保存在4℃。每孔加入50 μL APOE的标准品或待检测样品。用密封胶带盖住孔板，并孵育两小时。用200 μL 1×洗涤缓冲液手动洗涤 5 次。每次倒转孔板，倒出内容物，在吸水纸巾上轻拍4~ 5次以完全去吸干残余液体。每孔加入50 μL 1×生物素化APOE抗体，孵育1 h。用200 μL1×洗涤缓冲液手动洗涤5次。每次倒转孔板，倒出内容物，在吸水纸巾上轻拍4-5次以完全去吸干残余液体。每孔加入50 μL 1×SP Conjugate，孵育30 min。打开酶标仪并提前设置程序。再次用200 μL 1×洗涤缓冲液手动洗涤5次。每次倒转孔板，倒出内容物，在吸水纸巾上轻拍4 ~ 5次以完全去吸干残余液体。每孔加入50 μL Chromogen Substrate，在环境光下孵育约25 min或直到出现最佳蓝色浓度。轻轻敲击板以确保彻底混合并用移液器吸头打破孔中的气泡。每孔加入50 μL终止液。当颜色将从蓝色变为黄色时，立即在酶标仪上读取450 nm波长处的吸光度。如果可以进行波长校正，请从450 nm的读数中减去570 nm的读数以校正。通过所检测的浓度生成标准曲线，使用x轴上的标准浓度和 y 轴上相应的平均450nm吸光度(OD)绘制图表。最佳拟合线可以通过使用四参数逻辑曲线拟合的回归分析来确定。从标准曲线确定待测样品浓度，并将该值乘以稀释系数最终获得样本最终浓度。
采用上述方法检测正常人和神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）患者的星形胶质细胞外泌体。实验结果如图4所示。
如图4所示，与健康对照组相比，NMOSD患者的星形胶质细胞外泌体中APOE蛋白含量显著升高。说明载脂蛋白E（APOE）在视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）患者星形胶质细胞外泌体中高表达。
实施例3：NMOSD模型小鼠的病灶和脑炎症检测
1、实验动物：C57/BL6小鼠，10周龄，雌性，随机分为5组，每组9只，分别为：
（1）模型组对照组（NMOSD + Vehicle）：造模后给予生理盐水；
（2）模型组给药组（NMOSD + APOE130-149）：造模后给予APOE多肽（APOE130-149）；
（3）APOE基因敲除模型组对照组（APOEko Vehicle）：APOE基因敲除小鼠造模后给予生理盐水；
（4）APOE基因敲除模型组铁蛋白对照组（APOEko Ferrin）：APOE基因敲除小鼠造模后给予铁蛋白载体；
（5）APOE基因敲除模型组铁蛋白-APOE130-149组（APOEko Fe-APOE）：APOE基因敲除小鼠造模后给予工程化铁蛋白APOE多肽；
2、动物实验方法：
2.1模型建立：
实验动物：雌性C57BL/6小鼠（8 ~ 10周龄）、具有C57BL/6J背景的ApoE-/-小鼠（雌性，8周龄，B6/JGpt-Apoeem1Cd82/Gpt）。所有实验程序均按照北京天坛医院动物护理和使用委员会和中国小动物保护协会实验规程的指导方针进行。
首先制备抗体补体混合液：将NMOSD抗体和补体按2：1体积比混合，每只小鼠注射15 μL混合液，冰上储存备用。
对两种实验动物分别进行如下造模实验，获得野生型NMOSD小鼠和APOE基因敲除型（APOE ko）-NMOSD小鼠。
使用1.25％即用型无菌麻醉剂（2,2,2-三溴乙醇，Sigma），腹腔注射，注意操作前进行消毒和操作过程中的无菌操作。小鼠按0.2 mL/10 g体重计算注射剂量。判断麻醉满意，即小鼠生命体征平稳，夹趾反射消失后，将小鼠头部固定在小鼠脑立体定位仪（RWDLife Science，深圳，中国），使其头顶与台面保持水平且稳定牢固，头顶皮肤进行剪毛备皮，碘伏消毒。于小鼠大脑中部沿颅缝用镊子提起小鼠头部皮肤，用剪子纵向剪开皮肤，切口大约0.5 cm左右，左右分开切口的皮肤，寻找前囟区域，然后将微量注射器针尖部移动至前囟区域，通过定位仪标尺定位，将针尖向右移动2.5 mm，然后向前移动0.5 mm。在此针尖定位处的小鼠颅骨表面进行标记，然后用露骨钻（RWD Life Science）在该点进行钻孔，钻孔过程中，注意打磨深度并避开血管，小心深入，避免损伤硬膜以及脑组织。随后，用立体定位仪垂直将带有30号针头（Hamilton, Reno, NV）的50 μL微量注射器针尖插入小鼠颅内3mm深。固定微量注射器，并使针保持原位，静静等待5分钟，然后开启注射泵，以速度1 μL/min，进行注射，注射液体为15 μL抗体补体混合液+ 5 μL APOE（130-149）（4 mg/ml，即为原位注射APOE的NMO小鼠模型），或15 μL抗体补体混合液+ 5μL PBS（即为对照组）。注射完成后，微量注射器原位静静等待10 min后，缓慢向上拔针，每向上拔出1mm后停针5 min，直至全部拔出，用0.9%生理盐水轻轻擦拭，清理小鼠头部伤口，对位缝合切口皮肤，用碘伏再次消毒。注射完毕后腹腔给予小鼠0.2 mL 0.9%生理盐水补充体液损失，观察小鼠生命体征，注意保温保暖，一旦小鼠恢复翻正反射，则立即放回笼子。
3、实验方法：
3.1 在NMOSD小鼠模型治疗5天后，分析脑内炎症，同时检测了脑内免疫细胞的浸润情况：
（1）小鼠颅内病灶体积：
使用是德国Bruker公司的7.0T超高场磁共振扫描仪及辅助设备，进行小鼠神经系统的扫描及后处理。7.0T小动物核磁凭借强大的梯度系统和超高场的磁体，不仅具有对小鼠大脑、神经血管等有极高的分辨力和优秀的成像效果，同时还可在活体器官的细胞水平进行定性与定量成像。本设备主要应用于小动物疾病模型早期诊断脑功能成像、共振波谱成像及脑科学与神经功能分子影像学等研究。该设备硬件设备主要包括各种线圈、吸入式气体麻醉装置、小动物生命体征监控和同步触发扫描装置等。与其搭载的ParaVision 6是临床MRI软件中的最新标配，其全新直观的工作流程为用户提供了优化检查方案选择、主动参数冲突处理、全自动系统优化、快速数据采集以及图像后处理等功能。
实验小鼠所有的MRI图像扫描均应用7T的小动物MRI，采用31cm孔径UltraShielded Refrigerated磁体和BioSpecAvanceIII波谱仪，布鲁克梯度和匀场线圈（梯度场强为290 mT/m，切换率为1160 T/m/s）。小鼠使用异氟烷气体吸入式麻醉，先进行诱导麻醉，诱导麻醉浓度为3 ~ 4%，约3分钟后小鼠可完全麻醉，通过轻轻摇晃诱导麻醉盒，判断小鼠麻醉状态，若小鼠身体翻到为侧卧姿势且未尝试翻正则表明小鼠已经完全麻醉。然后调节异氟烷浓度为维持浓度，即1.0 ~ 1.5%异氟烷面罩维持。在MRI扫描过程中，小动物生命体征监控器和门控系统通过放置在小鼠腹部下的传感器来持续监测小鼠的呼吸频率及幅度。将小鼠放置在加热的保温毯上，保持小鼠处于正常体温。小鼠脑的轴位多层面T2加权像由弛豫增强快速采集序列获取（TR = 3080 ms，TE = 31 ms，平均次数= 1，FOV = 24 mm×30mm，矩阵= 192×320，层面厚度= 0.5 mm）。本实验通过7.0T核磁获得的所有MRI数据应用Image J软件分析（National Institutesof Health, MD, USA）。获取病灶面积并计算病灶面积大小进行分析。
（2）流式细胞术检测：
制备脑组织单细胞悬液：
腹腔注射1.25％即用型无菌麻醉剂（2,2,2-三溴乙醇，Sigma）深度麻醉小鼠并妥善固定，沿胸腹连线中点向上纵向剪开皮肤，充分暴露出胸腔且游离出心脏，剪破右心耳，而后剪破肝脏开放静脉通道，灌注针经左心尖插入，灌注20 mL PBS至肝脏等腹腔脏器完全变白，灌注成功后剥离出小鼠脑组织并放在冰PBS中浸泡备用；
小鼠脑组织放于1.5 mL EP管中，加入提前配置好的胶原酶1 mL，在37℃温箱中消化半小时，15 min时拿出温箱并用移液枪轻轻吹打在放回，消化完毕后1500 rpm离心5min；弃上清，加入提前配置好的30%的precool工作液7 mL，涡匀后700 g离心 10min，慢升慢降；首先用移液枪吸弃上层髓鞘，再弃去上清，加入1 mL PBS，充分吹匀细胞悬液随后均分转移至不同组别干净的流式管中，再加入1 mL PBS洗涤细胞，1500 rpm离心5 min；弃去上清，加入100 µL 1% BSA重悬细胞，计数。
流式抗体染色流式抗体的荧光染料配色选用了以下通道：异硫氰酸荧光素（fluoresce Isothiocyanate，FITC），藻红蛋白（Phycoerythrin，PE），别藻青蛋白（allophycocyanin，APC），别藻青蛋白-花青素7（APC-Cy7）和藻红蛋白-花青素7（PE-Cy7）。针对小鼠目的抗原的特异性流式抗体：抗小鼠CD45抗体、抗小鼠CD11b抗体、抗小鼠CD206抗体、抗小鼠CD86抗体、抗小鼠Zombie Dyes抗体。
表面抗体染色：在100 μL单细胞悬液流式管中加入表面抗体并涡匀，（严格按照说明书剂量依次加入），加入完毕后，4℃避光孵育30 min。加入1 mL PBS洗涤，1500 rpm离心5min，弃去上清，加入400 μL PBS重悬吹匀，过滤上机。
本实验中流式抗体染色采用了空白对照、单阳补偿、同型对照及荧光扣除对照（Fluorescence minus one，FMO）的设置。使用FACS Aria II来收集流式细胞术的数据，选取FlowJoV10（Version 10，FlowJo，LLC）分析所得的流式数据。
4、实验结果：
4.1、载脂蛋白E（APOE）用药对NMOSD小鼠脑内病灶的影响
在NMOSD小鼠中分别颅内注射治疗生理盐水和APOE多肽（APOE130-149）4天后，通过核磁观察APOE多肽对小鼠脑内病灶体积的影响结果。实验结果如图5和图6。
如图5和图6所示，与对照组相比，APOE多肽给药组的NMOSD小鼠的脑内病灶体积减小。
4.3、流式细胞术检测。
在NMOSD小鼠中，通过流式细胞术检测小胶质细胞、淋巴细胞及髓系细胞的数量，说明对中枢神经系统内各种免疫细胞浸润的影响，实验结果如图7。
如图7所示，APOE多肽（APOE130-149）用药组脑内促炎型小胶质细胞减少，外周免疫细胞浸润减少。
4.4、工程化铁蛋白-载脂蛋白E（APOE）用药对NMOSD小鼠脑内病灶的影响
在APOE ko-NMOSD小鼠中分别颅内注射治疗生理盐水（vehicle）、铁蛋白（Ferrin）和工程化铁蛋白-APOE多肽（Fe-APOE）4天后，通过核磁观察APOE多肽对小鼠脑内病灶体积的影响结果。实验结果如图8和图9。
以上结果表明，载脂蛋白E（APOE）和工程化铁蛋白-载脂蛋白E（Fe-APOE）均能够改善视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）小鼠模型病灶体积，抑制促炎性小胶质细胞，减少外周免疫细胞向中枢神经系统的浸润，最终抑制NMOSD小鼠的中枢神经系统炎症，减少神经系统的损伤，对于治疗NMOSD具有重要的临床应用价值。
以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.载脂蛋白E和/或重组铁蛋白载脂蛋白E在制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病的药物中的应用。
2.载脂蛋白E和/或重组铁蛋白载脂蛋白E在制备用于抑制脑内外周免疫细胞向中枢神经系统的星形胶质细胞浸润的药物中的应用。
3.载脂蛋白E和/或重组铁蛋白载脂蛋白E在制备用于减少脑内病灶体积的药物中的应用。
4.根据权利要求1~3任一项所述的应用，其特征在于，所述载脂蛋白E为至少包括第130个氨基酸到第149个氨基酸的肽段。
5.根据权利要求1~3任一项所述的应用，其特征在于，所述重组铁蛋白载脂蛋白E包括24个铁蛋白亚基，每个所述铁蛋白亚基上均连接有载脂蛋白E肽段。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述铁蛋白亚基的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述载脂蛋白E肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组铁蛋白载脂蛋白E的制备方法至少包括以下步骤：
将SEQ ID No:3所示的核苷酸序列克隆到质粒中构建表达载体，将所述表达载体转化至宿主细胞中后，经诱导表达和纯化，得到所述重组铁蛋白载脂蛋白E。
9.一种重组铁蛋白载脂蛋白E，其特征在于，重组铁蛋白载脂蛋白E的制备方法至少包括以下步骤：
将SEQ ID No:3所示的核苷酸序列克隆到质粒中构建表达载体，将所述表达载体转化至宿主细胞中后，经诱导表达和纯化，得到所述重组铁蛋白载脂蛋白E。
10.根据权利要求9所述的重组铁蛋白载脂蛋白E，其特征在于，所述重组铁蛋白载脂蛋白E包括24个铁蛋白亚基，每个所述铁蛋白亚基上均连接有载脂蛋白E肽段。
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