CN117959302A - 5-氟尿嘧啶联合美罗培南在抑制美罗培南耐药菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了5‑氟尿嘧啶联合美罗培南在抑制美罗培南耐药菌中的应用，属于医药技术领域。本发明通过微量肉汤稀释棋盘法、时间‑杀菌曲线试验发现5‑氟尿嘧啶联合美罗培南在抑制美罗培南耐药菌中的应用，证明5‑氟尿嘧啶能够协同美罗培南抑制bla NDM‑5阳性细菌（如大肠杆菌15NN1、肺炎克雷伯菌K57、鲍曼不动杆菌T650），在降低美罗培南使用量的同时，逆转耐药菌对美罗培南的耐药性。本发明首次发现5‑氟尿嘧啶可以提高bla NDM‑5阳性细菌对美罗培南敏感性，恢复美罗培南对bla NDM‑5阳性细菌的抑制作用，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及5-氟尿嘧啶联合美罗培南在抑制美罗培南耐药菌中的应用。
背景技术
美罗培南是一种碳青霉烯类抗生素，具有抗菌谱广和抗菌活性强的特点，是临床治疗严重混合感染及耐药菌感染的有效药物。美罗培南通过抑制细菌细胞壁的合成，从而抑制革兰阴性菌的生长。但近年来，随着新德里金属β-内酰胺酶NDM等碳青霉烯酶的出现和流行严重威胁了美罗培南的临床应用。世界卫生组织将碳青霉烯耐药肠杆菌（CRE）和碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）列为“关键病原体”。因此，急需找到提高细菌对美罗培南敏感性的增效剂，从而使细菌恢复对美罗培南的敏感性。
5-氟尿嘧啶是一种抗癌药物，在临床上被用于治疗多种常见癌症，包括结肠癌、乳腺癌和胃肠道癌症。它通过抑制胸腺嘧啶合成酶的合成，进而抑制核苷酸的合成，从而抑制癌细胞的生长。然而，截至目前，未见5-氟尿嘧啶与美罗培南联合使用抑制bla NDM-5阳性细菌的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供5-氟尿嘧啶联合美罗培南在抑制美罗培南耐药菌中的应用，为美罗培南耐药菌感染的治疗提供更多的药物选择。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了5-氟尿嘧啶在制备美罗培南增效剂中的应用。
本发明还提供了一种抑制美罗培南耐药菌的药物组合物，包括5-氟尿嘧啶和美罗培南。
优选的，所述美罗培南耐药菌为bla NDM-5阳性细菌。
优选的，所述bla NDM-5阳性细菌为携带bla NDM-5基因细菌，包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌或鲍曼不动杆菌。
优选的，所述5-氟尿嘧啶和美罗培南的质量比为2~64：1。
优选的，对于携带bla NDM-5基因的大肠杆菌，5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为16μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为8μg/mL。
优选的，对于携带bla NDM-5基因的肺炎克雷伯菌，5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为128μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为2μg/mL。
优选的，对于携带bla NDM-5基因的鲍曼不动杆菌，5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为32μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为1μg/mL。
本发明还提供了5-氟尿嘧啶和美罗培南在制备抗细菌感染的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过微量肉汤稀释棋盘法、时间-杀菌曲线试验发现5-氟尿嘧啶联合美罗培南在抑制美罗培南耐药菌中的应用，证明5-氟尿嘧啶能够协同美罗培南抑制bla NDM-5阳性细菌（如大肠杆菌15NN1、肺炎克雷伯菌K57、鲍曼不动杆菌T650），在降低美罗培南使用量的同时，逆转耐药菌对美罗培南的耐药性。本发明首次发现5-氟尿嘧啶可以提高bla NDM-5阳性细菌对美罗培南敏感性，恢复美罗培南对bla NDM-5阳性细菌的抑制作用，具有重要的应用价值。
附图说明
图1是三株美罗培南耐药菌的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
图2是采用微量肉汤稀释棋盘法检测5-氟尿嘧啶和美罗培南对bla NDM-5阳性大肠杆菌15NN1最小抑菌浓度的热图；
图3是采用微量肉汤稀释棋盘法检测5-氟尿嘧啶和美罗培南对bla NDM-5阳性肺炎克雷伯菌K57最小抑菌浓度的热图；
图4是采用微量肉汤稀释棋盘法检测5-氟尿嘧啶和美罗培南对bla NDM-5阳性鲍曼不动杆菌T650最小抑菌浓度的热图；
图5是不同处理组对bla NDM-5阳性大肠杆菌15NN1的时间-杀菌曲线图；
图6是不同处理组对bla NDM-5阳性肺炎克雷伯菌K57的时间-杀菌曲线图；
图7是不同处理组对bla NDM-5阳性鲍曼不动杆菌T650的时间-杀菌曲线图。
具体实施方式
本发明提供了5-氟尿嘧啶在制备美罗培南增效剂中的应用。
本发明还提供了一种抑制美罗培南耐药菌的药物组合物，包括5-氟尿嘧啶和美罗培南。
在本发明中，所述美罗培南耐药菌为bla NDM-5阳性细菌；所述bla NDM-5阳性细菌为携带bla NDM-5基因细菌，包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌或鲍曼不动杆菌；所述5-氟尿嘧啶和美罗培南的质量比为2~64：1；对于携带bla NDM-5基因的大肠杆菌，5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为16μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为8μg/mL；对于携带bla NDM-5基因的肺炎克雷伯菌，5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为128μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为2μg/mL；对于携带bla NDM-5基因的鲍曼不动杆菌，5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为32μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为1μg/mL。
本发明还提供了5-氟尿嘧啶和美罗培南在制备抗细菌感染的药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明所用到材料和试剂：
美罗培南为上海源叶生物科技有限公司的产品，有效含量为98%；
5-氟尿嘧啶为上海阿拉丁生化科技股份有限公司的产品，有效含量为99%；
美罗培南耐药菌（bla NDM-5阳性大肠杆菌15NN1、bla NDM-5阳性肺炎克雷伯菌K57、bla NDM-5阳性鲍曼不动杆菌T650）由国家兽药安全评价中心（北京）提供，已经鉴定为携带bla NDM-5基因的美罗培南耐药菌；
2 × Taq Master Mix为南京诺维赞生物科技股份有限公司的产品；
MH液体培养基：向适量蒸馏水中加入25 g MH肉汤培养基（北京陆桥技术股份有限公司），之后用蒸馏水定容至500 mL，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却。
实施例1
采用聚合酶链式反应（PCR）检测美罗培南耐药菌中bla NDM-5基因，具体步骤如下：
1、根据bla NDM-5基因的核酸序列，设计引物。引物序列如表1所示。
2、配置PCR反应体系：在PCR管中加入以下成分：1µL菌液，上下游引物各2µL，25µL的2 × Taq Master Mix和20µL的无核酸酶水。
3、于PCR仪上进行扩增，扩增程序为：95℃，10min+ （95℃，30s+60℃，30s+72℃1min）×30个循环+72℃，10min。
4、通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物：泳道1-6分别为15NN1、K57、T650，BW25113::pUC19-bla NDM-5、BW25113和未加菌液模板。
实验结果：如图1所示，所有检测菌株和阳性对照样本（BW25113::pUC19-bla NDM-5）均特异性扩增出710 bp的DNA条带，而在阴性对照样本中（BW25113和未加菌液模板）未观察到此条带，说明三株美罗培南耐药菌确实携带bla NDM-5基因。
表1 PCR引物序列
实施例2
参照CLSI规定，采用微量肉汤稀释法测定美罗培南和5-氟尿嘧啶对美罗培南耐药菌的最小抑菌浓度（MIC）。具体步骤如下：
1、取生长至对数生长期的美罗培南耐药菌菌液，用麦氏比浊仪调节至麦氏0.5，并用MH肉汤培养基稀释100倍，得到美罗培南耐药菌稀释液，此时，美罗培南耐药菌的浓度约为1×106CFU/mL。
2、称取美罗培南粉末，用去离子水稀释，得到浓度为5120μg/mL的美罗培南溶液；之后将美罗培南溶液用无菌滤膜（孔径为0.22µm）过滤，得到美罗培南储存液。称取5-氟尿嘧啶粉末，用去离子水稀释，得到浓度为5120μg/mL的5-氟尿嘧啶溶液；之后将5-氟尿嘧啶溶液用无菌滤膜（孔径为0.22µm）过滤，得到5-氟尿嘧啶储存液。
3、取96孔微孔板，以MH肉汤稀释药液使其成为2倍工作浓度，筛选美罗培南和5-氟尿嘧啶应用的浓度范围为0-512μg/mL。按浓度从低到高的顺序吸取100μL药物加入96孔板中，每孔再接种100μL美罗培南耐药菌稀释液。其中，阳性对照为只含菌液不含药物，空白对照为只含MH肉汤。
4、完成步骤3后，取所述96孔微孔板，37℃孵育16-18h。
实验结果：如表2所示，美罗培南耐药菌对5-氟尿嘧啶的MIC为64-512μg/mL，对美罗培南的MIC为32-64 μg/mL，说明三株菌株均具有美罗培南的耐药性。
表2 美罗培南耐药菌的MICs（µg/mL）
实施例3
采用微量肉汤稀释棋盘法检测5-氟尿嘧啶联合美罗培南对美罗培南耐药菌的联合抑菌指数：
采用微量肉汤稀释棋盘法检测5-氟尿嘧啶单用、美罗培南单用和“5-氟尿嘧啶和美罗培南联用”对美罗培南耐药菌（bla NDM-5阳性大肠杆菌15NN1、bla NDM-5阳性肺炎克雷伯菌K57、bla NDM-5阳性鲍曼不动杆菌T650）的抑菌活性，进而获得5-氟尿嘧啶联合美罗培南对美罗培南耐药菌的联合抑菌指数。具体步骤如下：
1、取生长至对数生长期的美罗培南耐药菌菌液，用麦氏比浊仪调节至麦氏0.5，并用MH肉汤培养基稀释100倍，得到美罗培南耐药菌稀释液，此时，美罗培南耐药菌的浓度约为1×106CFU/mL。
2、称取美罗培南粉末，用去离子水稀释，得到浓度为5120μg/mL的美罗培南溶液；之后将美罗培南溶液用无菌滤膜（孔径为0.22µm）过滤，得到美罗培南储存液。称取5-氟尿嘧啶粉末，用去离子水稀释，得到浓度为5120μg/mL的5-氟尿嘧啶溶液；之后将5-氟尿嘧啶溶液用无菌滤膜（孔径为0.22µm）过滤，得到5-氟尿嘧啶储存液。
3、取96孔微孔板，每孔接种100μL美罗培南耐药菌稀释液和100μL药物溶液（由5-氟尿嘧啶储存液和美罗培南储存液按比例稀释混合而成）。
对于bla NDM-5阳性大肠杆菌15NN1，96孔微孔板中，从左至右每列中每孔的5-氟尿嘧啶的浓度依次为0µg/mL、2.0µg/mL、4.0µg/mL、8.0µg/mL、16.0µg/mL、32.0µg/mL、64.0µg/mL、128.0µg/mL；从上至下每行中，每孔的美罗培南的浓度依次为0µg/mL、1.0µg/mL、2.0µg/mL、4.0µg/mL、8.0µg/mL、16.0µg/mL、32.0µg/mL、64.0µg/mL。
对于bla NDM-5阳性肺炎克雷伯菌K57，96孔微孔板中，从左至右每列中每孔的5-氟尿嘧啶的浓度依次为0µg/mL、8.0µg/mL、16.0µg/mL、32.0µg/mL、64.0µg/mL、128.0µg/mL、256.0µg/mL、512.0µg/mL；从上至下每行中，每孔的美罗培南的浓度依次为0µg/mL、0.5µg/mL、1.0µg/mL、2.0µg/mL、4.0µg/mL、8.0µg/mL、16.0µg/mL、32.0µg/mL。
对于bla NDM-5阳性鲍曼不动杆菌T650，96孔微孔板中，从左至右每列中每孔的5-氟尿嘧啶的浓度依次为0µg/mL、4.0µg/mL、8.0µg/mL、16.0µg/mL、32.0µg/mL、64.0µg/mL、128.0µg/mL、256.0µg/mL；从上至下每行中，每孔的美罗培南的浓度依次为0µg/mL、1.0µg/mL、2.0µg/mL、4.0µg/mL、8.0µg/mL、16.0µg/mL、32.0µg/mL、64.0µg/mL。
4、完成步骤3后，取所述96孔微孔板，37℃孵育16-18h。
5、完成步骤4后，计算每个药物的最小抑菌浓度（MIC），联合抑菌指数（FICI）值以确定5-氟尿嘧啶与美罗培南是否具有协同作用。
FICI＝（MIC美罗培南联合/MIC美罗培南单用）+（MIC5-氟尿嘧啶联合/MIC5-氟尿嘧啶单用）。
判定标准为：当FICI≤0.5时，判定为两者具有协同作用。
检测结果：如图2~4所示。以FICI法换算的药物最佳组合用圆形标注。
实验重复三次，结果取平均值。统计结果见表3。
表3 5-氟尿嘧啶联合美罗培南对美罗培南耐药菌的联合抑菌效果
结果表明，5-氟尿嘧啶和美罗培南联用均能显著降低美罗培南对bla NDM-5阳性大肠杆菌15NN1、bla NDM-5阳性肺炎克雷伯菌K57和bla NDM-5阳性鲍曼不动杆菌T650的MIC值。
对于bla NDM-5阳性大肠杆菌15NN1，5-氟尿嘧啶和美罗培南的最优质量比为2：1；此时5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为16μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为8μg/mL。
对于bla NDM-5阳性肺炎克雷伯菌K57，5-氟尿嘧啶和美罗培南的最优质量比为64：1；此时5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为128μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为2μg/mL。
对于bla NDM-5阳性鲍曼不动杆菌T650，5-氟尿嘧啶和美罗培南的最优质量比为32：1；此时5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为32μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为1μg/mL。
上述结果表明，5-氟尿嘧啶能协同美罗培南发挥抗菌作用，从而治疗美罗培南耐药菌引发的感染。
实施例4
5-氟尿嘧啶联合美罗培南对美罗培南耐药菌的时间-杀菌曲线：
美罗培南耐药菌为bla NDM-5阳性大肠杆菌15NN1、bla NDM-5阳性肺炎克雷伯菌K57、bla NDM-5阳性鲍曼不动杆菌T650。
1、取生长至对数生长期的美罗培南耐药菌菌液，用麦氏比浊仪调节至麦氏0.5，并用MH肉汤培养基稀释100倍，得到美罗培南耐药菌稀释液。此时，美罗培南耐药菌的浓度约为1×106CFU/mL。
2、取12只试管，每只加入2970μL MH液体培养基和30μL美罗培南耐药菌稀释液，涡旋混匀；将12只试管随机分为5-氟尿嘧啶组、美罗培南组、联合组和空白组4组，每组3只试管，进行如下处理：
5-氟尿嘧啶组：根据各株美罗培南耐药菌对5-氟尿嘧啶的MIC值，加入5120μg/mL的5-氟尿嘧啶配置溶液，使5-氟尿嘧啶在体系中的终浓度为该美罗培南耐药菌对5-氟尿嘧啶的1/4×MIC；
美罗培南组：根据各株美罗培南耐药菌对美罗培南的MIC值，加入5120μg/mL的美罗培南配置溶液，使美罗培南在体系中的终浓度为该美罗培南耐药菌对美罗培南的1/4×MIC；
联合组：向体系中加入美罗培南和5-氟尿嘧啶，使终浓度为该美罗培南耐药菌对美罗培南或5-氟尿嘧啶的1/4×MIC；
空白组：试管中不加入任何药物。
此时为0h，放置于37℃摇床中，200rpm振荡培养24h。培养期间，分别在第0h、第2h、第4h、第8h、第12h和第24h吸取100μL培养液进行十倍梯度稀释，并涂布于MH固体培养基（向适量蒸馏水中加入19 g MH琼脂培养基（北京陆桥技术股份有限公司），之后用蒸馏水定容至500mL，121℃高压蒸汽灭菌20min，倒平板，冷却），37℃培养24h，进行菌落计数。
3、完成步骤2后，以培养时间为横坐标，菌落数的log10值为纵坐标，绘制时间-杀菌曲线。
bla NDM-5阳性大肠杆菌15NN1的时间-杀菌曲线见图5（CFU为菌落形成单位）。
bla NDM-5阳性肺炎克雷伯菌K57的时间-杀菌曲线见图6（CFU为菌落形成单位）。
bla NDM-5阳性鲍曼不动杆菌T650的时间-杀菌曲线见图7（CFU为菌落形成单位）。
结果表明，与5-氟尿嘧啶组、美罗培南组和空白组相比，作用24h后，联合组可显著增强美罗培南对美罗培南耐药菌的抗菌活性，且菌落形成单位下降了5-8个log10值。
由以上实施例可知，5-氟尿嘧啶联合美罗培南能恢复美罗培南对美罗培南耐药菌（如bla NDM-5阳性大肠杆菌15NN1、bla NDM-5阳性肺炎克雷伯菌K57、bla NDM-5阳性鲍曼不动杆菌T650）的抑制作用，即5-氟尿嘧啶联合美罗培南可以抑制美罗培南耐药菌（如bla NDM-5阳性大肠杆菌15NN1、bla NDM-5阳性肺炎克雷伯菌K57、bla NDM-5阳性鲍曼不动杆菌T650）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.5-氟尿嘧啶在制备美罗培南增效剂中的应用。
2.一种抑制美罗培南耐药菌的药物组合物，其特征在于，包括5-氟尿嘧啶和美罗培南。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述美罗培南耐药菌为bla NDM-5阳性细菌。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述bla NDM-5阳性细菌为携带bla NDM-5基因细菌，包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌或鲍曼不动杆菌。
5.根据权利要求2~4任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述5-氟尿嘧啶和美罗培南的质量比为2~64：1。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，对于携带bla NDM-5基因的大肠杆菌，5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为16μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为8μg/mL。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，对于携带bla NDM-5基因的肺炎克雷伯菌，5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为128μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为2μg/mL。
8.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，对于携带bla NDM-5基因的鲍曼不动杆菌，5-氟尿嘧啶的最低抑菌浓度为32μg/mL，美罗培南的最低抑菌浓度为1μg/mL。
9.5-氟尿嘧啶和美罗培南在制备抗细菌感染的药物中的应用。
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