CN117959286A - 土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂的应用 - Google Patents
土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及土荆皮乙酸作为miR‑137‑3p的表达调控剂的应用,发明人经大量研究发现了土荆皮乙酸可以导致miR‑137‑3p上调,miR‑137‑3p过表达可对LUAD细胞增殖产生显著的抑制效果,各实验结果进一步表明土荆皮乙酸作为miR‑137‑3p的表达调控剂可为LUAD治疗提供了潜在的调控机制,有助于开发新的癌症治疗策略和药物。同时,发明人经过大量实验验证了土荆皮乙酸作为miR‑137‑3p的表达调控剂在肺腺癌治疗中的抗癌特性,进一步表明土荆皮乙酸作为miR‑137‑3p的表达调控剂可以明显改善肺腺癌,在制备预防或治疗肺腺癌的药物方面具备很大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别是涉及土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂的应用。
背景技术
肺癌(LC)分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC),是最常见的恶性肿瘤之一,发病率和病死率呈现每年递增的趋势。肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是非小细胞肺癌最常见的亚型,远端转移是导致其复发和不良预后的主要原因。癌症转移具有高度器官选择性的特点,涉及到肿瘤细胞和宿主器官之间的许多相互作用。临床上,肺癌通常转移到大脑、骨骼和肝脏,导致预后不良,且肺癌的脑转移发生率可高达35%~50%。
microRNAs(miRNAs)是一种小的内源性非编码RNA,长度约为19nt-25nt。miRNAs作为参与转录后调节基因表达的单链RNA分子,存在于多细胞真核生物中,大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝和基因簇等多种形式存在于基因组中,且在进化上高度保守。目前研究认为miRNAs可调节1/3人类基因的表达,miRNAs在控制细胞发育、分化、增殖、凋亡、中扮演着关键性的角色。miRNAs可通过直接降解目标mRNA,或抑制其翻译,从而调控肿瘤细胞发生、迁移等相关基因的表达,进而参与肿瘤生长、转移、诱导血管形成等过程。基于此,临床上亟需通过关注肺癌的表观遗传学,探索治疗LUAD的有效方法,特别是通过干预miRNAs的表达来抑制肿瘤的生长和转移。
发明内容
基于此,本发明的目的包括提供土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂的应用。
为实现上述目的,特提出本申请的技术方案:
本发明的一方面,提供土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂的应用。
在其中一个实施例中,所述的应用包括土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂在制备预防或治疗肺腺癌的药物的应用。
在其中一个实施例中,所述预防或治疗是指降低肺腺癌细胞的增殖能力。
在其中一个实施例中,所述预防或治疗是指降低肺腺癌细胞的迁移能力;
可选地,所述迁移能力包括平面迁移能力和空间迁移能力。
在其中一个实施例中,所述预防或治疗是指降低肺腺癌细胞的侵袭能力。
在其中一个实施例中,所述预防或治疗是指诱导肺腺癌细胞凋亡;及/或
所述预防或治疗是指下调间充质标志物ZEB1、MMP2、N-cadherin和Vimentin的表达水平。
在其中一个实施例中,所述预防或治疗是指促进miR-137-3p过表达;及/或
所述预防或治疗是指下调肺腺癌细胞Src的表达水平。
本发明的又一方面,提供土荆皮乙酸在制备预防或治疗肺腺癌的药物中的应用。
在其中一个实施例中,所述药物包括土荆皮乙酸以及药学上可接受的辅料。
在其中一个实施例中,所述药物的剂型包括注射剂、口服液、丸剂、散剂、膏剂、片剂、颗粒剂、粉剂或胶囊剂。
本发明具有如下有益效果:
本申请提供土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂的应用,发明人经大量研究发现了土荆皮乙酸可以导致miR-137-3p上调,miR-137-3p过表达可对LUAD细胞增殖产生显著的抑制效果,各实验结果进一步表明土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂可为LUAD治疗提供了潜在的调控机制,有助于开发新的癌症治疗策略和药物。
同时,发明人经过大量实验验证了土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂在肺腺癌治疗中的抗癌特性,具体表现为:可降低肺腺癌细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力,可诱导肺腺癌细胞凋亡,可下调间充质标志物ZEB1、MMP2、N-cadherin和Vimentin的表达水平,可促进miR-137-3p过表达,下调肺腺癌细胞Src的表达水平,进一步表明土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂可以明显改善肺腺癌,在制备预防或治疗肺腺癌的药物方面具备很大的应用潜力。
此外,本申请利用网络药理学研究和生物信息学调查揭示了Src可能是土荆皮乙酸的中心靶点,且Src可作为miR-137-3p的潜在中心靶点,验证了miR-137-3p与Src的关联:土荆皮乙酸可以下调LUAD细胞Src表达,而下调Src的表达可以抑制LUAD细胞活性,即土荆皮乙酸可通过促进miR-137-3p过表达来抑制Src从而调控LUAD相关疾病的进展,该研究结果可为LUAD治疗中的分子调控提供了新的理解。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本申请的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1的实验结果汇总图;其中,图1A为土荆皮乙酸的化学结构式;图1B为MTT法检测PAB对A549、H1299、PC9和H1975细胞的IC50值的结果图;图1C为EdU实验测定PAB抑制LUAD细胞的增殖的结果图;图1D为PAB诱导LUAD细胞凋亡的实验结果图。
图2为实施例2的实验结果汇总图;其中,图2A为划痕实验检测土荆皮乙酸对LUAD细胞平面迁移能力的影响的结果图;图2B为Transwell实验检测土荆皮乙酸对LUAD细胞空间迁移和侵袭能力的影响的结果图;图2C为Western blot实验检测土荆皮乙酸对LUAD细胞EMT关键蛋白表达的影响的结果图。
图3为实施例3的实验结果汇总图;其中,图3A为qRT-PCR实验检测土荆皮乙酸可以上调miR-137-3p的表达的结果图;图3B为CCK-8实验检测过表达miR-137-3p对细胞活性的影响的结果图;图3C为EdU实验检测miR-137-3p对LUAD细胞增殖的影响的结果图;
图3D为划痕实验检测miR-137-3p对LUAD细胞平面迁移能力的影响的结果图;图3E为Transwell实验检测miR-137-3p对LUAD细胞空间迁移和侵袭能力的影响的结果图。
图4为实施例4中数据库预测土荆皮乙酸作用于LUAD的作用靶点的结果图。
图5为实施例5的实验结果汇总图;其中,图5A为Western blot实验检测敲低Src的转染效率的结果图;图5B为CCK-8实验检测敲低Src对细胞活性的影响的结果图;图5C为EdU实验检测敲低Src对LUAD细胞增殖的影响的结果图;图5D为划痕实验检测敲低Src对LUAD细胞平面迁移能力的影响的结果图;图5E为Transwell实验检测敲低Src对LUAD细胞空间迁移和侵袭能力的影响的结果图;图5F为Western blot实验检测土荆皮乙酸对细胞Src表达的影响的结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另外说明或存在矛盾之处,本文中使用的术语或短语具有以下含义:
本文中,“药学上可接受的”指在合理医学判断范围内适于施用患者且与合理益处/风险比相称的那些配体、材料、组合物和/或剂型。
本文中,“药学上可接受的载体”指药学上可接受的材料、组合物或媒剂,例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。如本文所用,语言“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的缓冲剂、注射用无菌水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及诸如此类。在与配制物中其他成分兼容且对患者无害的意义上,每种载体必须为“药学上可接受的”。合适的实例包括但不限于:(1)糖,例如乳糖、葡萄糖及蔗糖;(2)淀粉,例如玉米淀粉、马铃薯淀粉及经取代或未经取代的β-环糊精;(3)纤维素及其衍生物,例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素及乙酸纤维素;(4)粉状黄蓍胶;(5)麦芽;(6)明胶;(7)滑石;(8)赋形剂,例如可可脂及栓剂蜡;(9)油类,例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油及大豆油;(10)二醇,例如丙二醇;(11)多元醇,例如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇;(12)酯类,例如油酸乙酯及月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,例如氢氧化镁及氢氧化铝;(15)海藻酸;(16)无热原水;(17)等渗盐水;(18)林格氏溶液;(19)乙醇;(20)磷酸盐缓冲液;(21)药物配制物中所采用的其他无毒兼容物质。
本文中,“一种或多种”指所列项目的任一种、任两种或任两种以上。
本文中,“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目,也包括相关所列项目的任意的和所有的组合,所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本文中,“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的,表示内容上的差异,但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中,涉及到数值区间,如无特别说明,上述数值区间内视为连续,且包括该范围的最小值及最大值,以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地,当范围是指整数时,包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外,当提供多个范围描述特征或特性时,可以合并该范围。换言之,除非另有指明,否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中涉及的百分比含量,如无特别说明,对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比,对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度,如无特别说明,均指终浓度。所述终浓度,指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数,如无特别限定,既允许为恒温处理,也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±2℃、±1℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃的范围内波动。本发明中的常温指不施加温度控制操作,一般指4℃~35℃,较佳地指20±5℃。
说明书中涉及的简写与对应的中文名称:
RNA:核糖核酸。
mRNA:信使核糖核酸。
cDNA:互补(拷贝)脱氧核糖核酸。
EdU实验:5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶(EdU)实验用于检测DNA合成活性,可用于评估细胞增殖。通过测定EdU标记的细胞数量,可以了解PAB对NSCLC细胞增殖的影响。
Transwell实验:通过模拟细胞穿过基底膜的过程,评估细胞的侵袭能力。
Wound Healing实验:通过划痕观察细胞迁移能力。
Western blot:蛋白印迹分析,一种用于检测特定蛋白质在样本中存在并确定其相对量的技术。在该研究中,用于分析与上皮间质转化(EMT)相关的蛋白质表达,揭示PAB对NSCLC细胞生物学行为的调控机制。
Luciferase实验:被用于确认miR-137-3p与Src之间的关联;在此实验中,通常将miR-137-3p的mRNA序列与Src基因的3'非翻译区(UTR)结合,通过测量荧光素酶活性来验证二者的相互作用,有助于确认Src作为miR-137-3p的真实靶点。
CCK-8实验:CCK-8(cell counting kit-8)为细胞计数试剂盒,该实验通常用于测定细胞的代谢活性,通过检测细胞内还原型吸收的变化,间接反映细胞的增殖和生存状态。在本申请中,CCK-8实验被用于评估PAB对NSCLC细胞增殖能力的影响。
MMP:matrix metalloproteinase,即基质金属蛋白酶。
BCA蛋白定量:通过比色检测进行总蛋白质定量的常用方法。基于双缩脲原理,碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+,BCA鳌合Cu+作为显色剂,产生蓝紫色并在562nm有吸收峰,单价Cu+与蛋白质呈剂量相关性。可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。
TBST:即Tris盐缓冲液(TBS)加入了Tween-20,是生物学中常使用的等渗缓冲盐溶液。TBST作为一种非离子型去污剂,有复性抗原的作用,可以用于免疫印迹(WB)、免疫荧光(IF)、免疫组化(IHC)和免疫细胞化学(IC)等试验中封闭液的配制、一抗二抗的配制、一抗二抗孵育后的洗涤等。封闭和洗涤可以降低背景,增强信噪比。
Nase free ddH2O:用DEPC即焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压灭菌的双蒸水,不含杂质RNA、DNA和蛋白质,其中DEPC对核酸酶有积极地抑制作用。
PVDF膜:即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride),是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的,膜孔径有大有小,随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
qRT-PCR:即实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR),是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法,是一种通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶,是参与糖酵解的一种关键酶,由4个30-40kDa的亚基组成,分子量146kDa,检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达,广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。
U6:可作为mRNA和miRNA定量的内参基因校准。
HE:苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining),简称HE染色法,是石蜡切片技术里常用的染色法之一。其中,苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色;伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。
IHC:免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)。
本发明中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
肺癌是最常见的肿瘤疾病,全世界每年有超过200万例病例和近180万人死亡,其中大约85%的肺癌患者被诊断为非小细胞肺癌(NSCLC),肺腺癌(LUAD)是NSCLC最常见的亚型之一。LUAD主要起源于支气管粘膜上皮,少数起源于大支气管的粘液腺,是在非吸烟者中最常见的肺癌类型,在女性中比在男性中更常见,并且比其他类型的肺癌更容易发生在年轻人中。
尽管miRNA在参与转录后基因表达调控中起着重要作用,但目前在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA分子,数量众多且种类复杂;同时在治疗中可能引起非预期的副作用。因此,确定适当的miRNA靶点是一个复杂的问题,研究人员需要深入了解肺腺癌的分子机制,以找到最有效的miRNA治疗靶点,且需要更深入的了解miRNA与其他基因调控网络之间的复杂相互作用。其中,MicroRNA(miR)-137在大脑中高度表达,主要通过影响细胞周期和促进干细胞分化来调节细胞增殖,在肿瘤的发展和预后中起着至关重要的作用。
土荆皮乙酸(pseudolaric acid B,PAB)也称为土槿皮乙酸,分子式为C23H28O8,为中国特有松科植物金钱松的近根树皮提取物,属于二萜类化合物。始载于赵学敏的《本草纲目拾遗》,亦是《中华人民共和国药典》收载的常用中药,近年对PAB的研究越来越多,尽管已有研究表明土荆皮乙酸在多种癌症中发挥作用,但仍然未充分发掘土荆皮乙酸抗肺腺癌的潜力,关于其可以导致miR-137-3p上调的研究却鲜有报道。本研究的技术人员在实验过程中对miRNA介导的基因调控的肺癌治疗方法进行了大量研究发现,miR-137-3p在LUAD中具有强烈抑制作用,可对LUAD细胞增殖产生显著的抑制效果,而以土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂可以导致miR-137-3p上调,而miR-137-3p过表达可对LUAD细胞增殖产生显著的抑制效果,可为LUAD治疗提供了潜在的调控机制。
本发明的一方面,提供土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂的应用。
在其中一个具体示例中,所述的应用包括土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂在制备预防或治疗肺腺癌的药物的应用。
可以理解地,所述miR-137-3p的表达调控剂的组成还可包含行业内根据需要添加的其他药学上可接受的盐或载体。
在其中一个具体示例中,所述预防或治疗是指降低肺腺癌细胞的增殖能力。
在其中一个具体示例中,所述预防或治疗是指降低肺腺癌细胞的迁移能力。
在其中一个具体示例中,所述迁移能力包括平面迁移能力和空间迁移能力。
在其中一个具体示例中,所述预防或治疗是指降低肺腺癌细胞的平面迁移能力。
在其中一个具体示例中,所述预防或治疗是指降低肺腺癌细胞的空间迁移能力。
在其中一个具体示例中,所述预防或治疗是指降低肺腺癌细胞的侵袭能力。
在其中一个具体示例中,所述预防或治疗是指诱导肺腺癌细胞凋亡。
在其中一个具体示例中,所述预防或治疗是指下调间充质标志物ZEB1、MMP2、N-cadherin和Vimentin的表达水平。
在其中一个具体示例中,所述预防或治疗是指通过EMT通路抑制肺腺癌细胞的迁移侵袭。
在其中一个具体示例中,所述预防或治疗是指降低EMT关键蛋白表达的水平。
具体地,在肺癌转移过程中,上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)涉及原发部位的癌细胞通过血流扩散转化为转移性癌细胞,并通过间充质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)在远处器官中形成次级肿瘤灶。由于治疗选择有限,肺癌转移患者的预后极差。因此,下调间充质标志物ZEB1、MMP2、N-cadherin和Vimentin表达水平,通过EMT通路抑制肺腺癌细胞的迁移侵袭也是治疗肺腺癌的有效策略之一。
在其中一个具体示例中,所述预防或治疗是指促进miR-137-3p过表达。
在其中一个具体示例中,所述预防或治疗是指下调肺腺癌细胞Src基因的表达水平。
在其中一个具体示例中,所述miR-137-3p的表达调控剂的作用靶点为原癌基因Src。
在其中一个具体示例中,土荆皮乙酸的中心靶点为原癌基因Src。
Src基因(sarcoma gene)即鸡肉瘤病毒(RSV)基因组中的基因,可使鸡产生肉瘤。是第一个鉴定的病毒癌基因。Src基因编码的蛋白属于SRC家族激酶(SFKs),该家族由9个成员组成,分别是SCR、LYN、FYN、LCK、HCK、FGR、BLK、YRK和YES,其中Src是目前研究最多的成员,也是与人类疾病联系最为密切的蛋白。SRC蛋白是非受体酪氨酸激酶,可被多条信号转导途径所激活,而激活后的Src激酶又通过磷酸化相应靶蛋白的酪氨酸残基使之激活,从而活化相应的信号通路,包括MAPK、STAT、PI3K/AKT和EGFR等。异常激活的SRC蛋白与许多肿瘤相关,并且其活性的高低与肿瘤的发展密切相关,具体机制包括促进癌细胞增殖、对癌细胞激动蛋白骨架的重组、引发生长机制侵袭转移以及诱导血管形成等。具体地,在本申请中以土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂时可通过促进miR-137-3p过表达来抑制Src表达从而调控肺腺癌相关疾病的进展。
在其中一个具体示例中,所述肺腺癌细胞包括A549细胞、H1299细胞、PC9细胞和H1975细胞中的一种或多种。
本发明的又一方面,提供一种土荆皮乙酸在制备预防或治疗肺腺癌的药物中的应用。
在其中一个具体示例中,所述药物包括土荆皮乙酸以及药学上可接受的辅料。
在其中一个具体示例中,所述药物可以根据临床的需求,制备成合适的剂型。可以理解地,所述药物的剂型包括注射剂、口服液、丸剂、散剂、膏剂、片剂、颗粒剂、粉剂或胶囊剂。
在其中一个具体示例中,所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗调节剂和等张调节剂中的一种或多种。所述稀释剂可以选自,包括但不限于:淀粉类、糖类、纤维素类、无机盐类。所述润湿剂可以选自,包括但不限于:水、乙醇。所述黏合剂可以选自,包括但不限于:淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮、聚乙二醇。所述崩解剂可以选自,包括但不限于:淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、泡腾崩解剂。所述润滑剂可以选自,包括但不限于:滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇。所述色香味调节剂可以选自,包括但不限于:色素、香料、甜味剂、胶浆剂、矫臭剂。所述溶剂可以选自,包括但不限于:水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油、乙酸乙酯。所述增溶剂可以选自,包括但不限于:吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、磺酸化物。所述助溶剂可以选自,包括但不限于:有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮、甘油。所述乳化剂可以选自,包括但不限于:司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅、皂土。所述助悬剂可以选自,包括但不限于:甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、聚乙烯醇、触变胶。所述抗氧剂可以选自,包括但不限于:亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸、酯类。所述金属络合剂可以选自,包括但不限于:乙二胺四乙酸二钠、多羧酸化合物。所述惰性气体可以选自,包括但不限于:氮气、二氧化碳。所述防腐剂可以选自,包括但不限于:尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类、挥发油。所述局部止痛剂可以选自,包括但不限于:苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因、普鲁卡因。所述pH调节剂可以选自,包括但不限于:盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐、枸橼酸盐。所述等渗或等张调节剂可以选自,包括但不限于:葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇、木糖醇。
在其中一个具体示例中,所述药物可以根据临床的需求,采用合适的给药途径进行给药。可以理解地,所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或经皮给药。
以下结合具体实施例进行进一步说明,以下具体实施例中所涉及的原料,若无特殊说明,均可来源于市售;所使用的仪器,若无特殊说明,均可来源于市售;所涉及到的工艺,如无特殊说明,均为本领域技术人员常规选择。
实施例采用的部分试剂的参数如下:
土荆皮乙酸可购于MedChemExpress,批号为CAS No.82508-31-4,其结构如图1A所示;
实施例中的药物指土荆皮乙酸溶液,土荆皮乙酸溶液的浓度为100mM;配制方法为:取4.3246mg土荆皮乙酸粉末,溶于100μL DMSO溶液中混匀配制成100mM土荆皮乙酸溶液。
96孔板可购于SAINING/赛宁,批号为1014010;
6孔板可购于Cellpro/赛普,批号为N803006;
24孔板可购于CORNING/康宁,批号或型号为3524;
DMSO可购于MedChemExpress,型号为CAS No.67-68-5;
PBS可购于森瑞生物有限公司,批号或型号为CR-10010;
酶标仪为Epoch-多功能酶标仪;
基础培养基:RPMI 1640培养基,可购于美国Gibco公司;
胎牛血清:可购于美国Gibco公司;
双抗(青-链霉素):可购于碧云天公司,型号为C0222。
实施例1
本实施例研究土荆皮乙酸抑制肺腺癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡,具体如下:
(1)细胞株与细胞培养
LUAD细胞H1299、A549、H1975和PC-9均为广州医科大学药理实验室自有,培养于RPMI-1640完全培养基中,并于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养,取生长状态良好的细胞用于实验。完全培养基的配制方法为基础培养基+10%胎牛血清+1%双抗(青-链霉素)。
(2)细胞活力检测
3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴(3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)粉末购自美国MP Biomedicals公司,用PBS(磷酸缓冲盐溶液)配成5mg/mL母液备用。接种约3×103个LUAD细胞至含有适量完全培养基的96孔板中,待细胞贴壁后加入土荆皮乙酸溶液进行药物处理,72h后加入20μLMTT溶液,在培养箱中孵育4h后弃上清液,每孔加入100μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液溶解甲瓒沉淀,于37℃条件下振荡10min,使用酶标仪检测540nm和655nm波长处的吸光度,并计算药物对LUAD细胞的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。
(3)EdU实验
将细胞种于24孔板中,待细胞密度约为70%时进行转染操作。转染24h后,进行EdU实验以检测细胞的增殖活性。步骤如下:
1.预热EdU染料并等体积加入细胞原有的培养基中,使EdU的终浓度为10μM,每孔加入300μL含EdU染料的培养基,孵育细胞2h后弃去培养基;
2.PBS清洗细胞两次,以去除未掺入DNA的残留EdU。每孔加入4%多聚甲醛以固定细胞,室温培养30min后弃固定液;
3.每孔加入150μL浓度为2mg/mL的甘氨酸溶液,摇床孵育5min,中和过量的多聚甲醛固定液;
4.弃甘氨酸溶液,加入PBS清洗细胞。清洗完毕后每孔加入300μL0.5% Triton X-100细胞通透液室温通透10min,再使用PBS清洗细胞一次。
5.参照说明书配制EdU检测混合液,加入孔板中覆盖住细胞即可,室温避光孵育30min。
6.弃检测混合液,每孔加入300μL 0.5% Triton X-100细胞通透液清洗细胞3次,每次10min。PBS清洗细胞3次。
7.将Hoechst染色液加入至孔板中,室温孵育30min。PBS清洗细胞3次。
8.染色完成后立即使用荧光显微镜拍照观察,并统计阳性细胞率。
(4)流式细胞术
1.收集5×105个细胞于EP管中,1000rpm离心5min,然后用PBS清洗2次。
2.轻轻吸取并弃掉上清,加入100μL PBS重悬细胞,然后每管加入5μLAnnexin V-FITC和10μL碘化丙啶染色液,轻轻混匀,于冰上避光孵育15min-20min。
3.用PBS清洗2次,1000rpm离心5min,然后用100μL PBS重悬,流式仪上机检测。
4.结果分析,用CytExpert软件分析结果并作图。
(5)结果分析
相关实验结果汇总如图1所示。MTT研究结果表明土荆皮乙酸可以很好地抑制包括A549、H1299、PC9和H1975细胞等多种LUAD细胞活性,药物作用呈浓度依赖性关系,具体见图1B,其中药物对肺腺癌A549细胞(IC50=1.86±0.07μM)以及对肺腺癌H1299细胞(IC50=1.20±0.17μM)活性较好,因此作为后续实验的研究对象。
进一步采用EdU实验研究土荆皮乙酸对LUAD细胞体外增殖能力的影响。如图1C所示,研究结果表明土荆皮乙酸作用24h后,LUAD细胞增殖数目减少,这说明土荆皮乙酸能够抑制LUAD细胞的体外增殖能力。采用流式细胞术分析土荆皮乙酸对LUAD细胞凋亡能力的影响,Annexin V-FITC标记检测磷脂酰丝氨酸外翻的凋亡特征,PI标记坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞,如图1D所示,研究结果表明随着药物浓度的升高,早期凋亡和晚期凋亡的LUAD细胞比例逐步升高,这说明土荆皮乙酸能够以浓度依赖性的方式诱导LUAD细胞凋亡。
实施例2
本实施例研究土荆皮乙酸通过EMT通路抑制肺腺癌细胞的迁移侵袭,具体如下:
(1)细胞划痕实验
采用细胞划痕实验(Wound Healing实验)研究不同处理后细胞的平面迁移能力。接种约3×105个LUAD细胞至含有适量完全培养基的6孔板中,使第二天划痕时细胞密度达到90%;取200μL枪头垂直于孔板底部划痕,用PBS轻柔洗去未贴壁的细胞团,根据实验目的进行不同的转染操作,于0、12h、24h在光学显微镜拍照观察细胞创面。
(2)Transwell实验
采用Transwell迁移和侵袭实验研究不同处理后细胞的空间迁移能力和侵袭能力。对于Transwell侵袭实验,按照基础培养基:基质胶=8:1稀释基质胶,并取45μL铺于小室底部,于培养箱放置2h使基质胶凝固;接种约5×104个LUAD细胞至含有适量基础培养基的小室中,往24孔板中加入600μL完全培养基;培养24h后弃去细胞原有培养基,加入甲醇溶液固定30min,加入0.1%结晶紫溶液染色30min,用超纯水洗去小室上的染液,用棉签轻轻刮掉。
(3)蛋白印迹分析
采用蛋白印迹分析(Western blot)实验评估细胞在不同处理后检测EMT关键蛋白表达水平。接种约2×105个LUAD细胞至含有适量完全培养基的6孔板中,根据实验目的进行不同的转染操作,转染24h后用配制好的裂解液(RIPA裂解液:蛋白酶抑制剂PMSF:磷酸酶抑制剂混合物=100:1:2)在冰上裂解30min,于4℃、12000rpm条件下离心20min,取上清液加入5倍质量的上样缓冲液,于100℃水浴加热10min。BCA蛋白定量试剂盒购自美国ThermoFisherScientific公司,按照说明书进行蛋白定量,具体操作如下:配制定量工作液(A液:B液=50:1),每孔100μL加入酶标板中,加入2μL待测蛋白样品和标准蛋白样品,37℃振荡孵育30min后使用酶标仪检测562nm波长处的吸光度,计算蛋白上样量。细胞蛋白样品在10%SDS-PAGE胶上分离,转移至甲醇活化的PVDF膜上,根据目的蛋白调整转膜条件,5%脱脂奶粉室温封闭1h,一抗4℃过夜,TBST高速摇床洗膜3次,二抗室温孵育1h,TBST高速摇床洗膜3次,使用凝胶成像仪对蛋白条带进行化学发光成像。
(4)结果分析
相关实验结果汇总如图2所示。采用划痕和Transwell实验研究土荆皮乙酸对LUAD细胞迁移侵袭能力的影响,结果如图2A和图2B所示,研究结果表明,土荆皮乙酸作用24h后,LUAD细胞迁移速度减慢,穿过小室膜的细胞数量减少说明土荆皮乙酸能够显著抑制LUAD细胞的平面迁移能力和空间迁移和侵袭能力。为了进一步探究土荆皮乙酸抑制LUAD细胞迁移侵袭的作用机制,通过Western blot实验检测土荆皮乙酸是否能够影响EMT标志蛋白的表达。结果如图2C所示,研究结果表明,药物处理后,间充质标志物ZEB1、MMP2、N-cadherin和Vimentin的表达下调,这说明土荆皮乙酸对LUAD细胞EMT关键蛋白表达具有影响,可能通过EMT通路抑制LUAD细胞的迁移侵袭。
实施例3
本实施例研究土荆皮乙酸通过上调miR-137-3p抑制LUAD细胞的进展,具体如下:
(1)实时荧光定量PCR检测
总RNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,按照说明书进行贴壁细胞总RNA提取。具体操作如下:弃去细胞原有培养基,用PBS清洗2-3次,每1×106个LUAD细胞加入1mL裂解液,吹打混匀,室温放置5min,使核酸蛋白复合物完全分离。加入200μL氯仿,盖好管盖,剧烈振荡15s,室温放置5min,4℃离心10min;RNA主要分布在上层无色的水相中,将水相转移到新管中,避免吸到沉淀。在吸附柱中加入500μL洗柱液,室温放置2min,4℃离心2min,弃废液;往水相中加入200μL无水乙醇混匀,转移至吸附柱静置2min,4℃离心2min,弃废液。向吸附柱中加入600μL漂洗液,4℃离心2min,弃废液,并重复1次漂洗操作;4℃离心2min,弃掉收集管,将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱放入新管中,向膜中央分2次滴加40μLRNase free ddH2O,室温放置5min,室温离心2min即可得到细胞总RNA,上述离心操作均在12000rpm转速下进行。第一链cDNA合成试剂盒和miRNA加尾法逆转录试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,按照说明书进行逆转录操作,通用型高灵敏度染料法定量PCR检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,按照说明书进行qRT-PCR操作,对每一个样品进行3次的平行重复检测,以最终平均值作为检测的结果。采用2-△△Ct方法计算基因的相对表达水平,分别将GAPDH和U6作为mRNA和miRNA定量的内参基因校准。
(2)细胞活力检测
细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒购自日本同仁化学研究所(Dojindo Laboratories)。接种约3×103个LUAD细胞至含有适量完全培养基的96孔板中,根据实验目的进行不同的转染操作,于0、24h、48h、72h加入稀释后的CCK-8溶液(培养基:CCK-8=10:1),在培养箱中孵育1h后使用酶标仪检测450nm波长处的吸光度。
(3)细胞划痕实验
方法参考实施例2。
(4)Transwell实验
方法参考实施例2。
(5)结果分析
相关实验结果汇总如图3所示。qRT-PCR测定的结果如图3A所示,该研究结果表明,LUAD细胞经过土荆皮乙酸作用后miR-137-3p表达显著上调,即土荆皮乙酸可以上调miR-137-3p的表达;为了进一步研究miR-137-3p在LUAD中的作用,采用CCK8、EdU、划痕和Transwell实验评估miR-137-3p对LUAD细胞体外增殖、迁移、侵袭能力的影响;随后向LUAD细胞转染miR-137-3p模拟物来提高LUAD细胞中miR-137-3p的表达,结果如图3B-图3E所示,研究结果表明,过表达miR-137-3p可显著抑制细胞活性,即过表达miR-137-3p可以抑制LUAD细胞的增殖和迁移侵袭能力。
实施例4
本实施例研究Src可能是土荆皮乙酸作用的重要靶点,具体如下:
(1)生物信息学分析
利用GeneCards(https://www.genecards.org)和Comparative Taxonomic数据库(CTD,http://ctdbase.org)进行LUAD相关靶标的预测,而SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)则根据化合物的二维或三维结构预测药物靶标,即进行网络药理学分析,以确定miR-137-3p的潜在靶点,同时也是LUAD细胞中土荆皮乙酸的中心靶点。首先,使用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)来预测与土荆皮乙酸相关的100个靶点。之后从GeneCards(https://www.genecards.org)中获得了12,820个靶标(相关性得分为≥2),并从OMIM数据库中获得了另外519个靶标。结合靶标并去重后,总共发现了13155个与LUAD相关的靶点,具体如图4所示。
(2)细胞活力检测
方法参考实施例2。
(3)细胞划痕实验
方法参考实施例2。
(4)Transwell实验
方法参考实施例2
(5)蛋白印迹分析
采用蛋白印迹分析(Western blot)实验评估细胞在不同处理后检测Src表达水平,方法参考实施例2
(6)结果分析
相关实验结果如图5所示。为了验证Src下调是否与土荆皮乙酸的抗LUAD作用密切相关,进一步检测了土荆皮乙酸对LUAD的抑制作用是否下调Src表达。研究结果表明,土荆皮乙酸可以下调LUAD细胞Src表达,而下调Src的表达可以抑制LUAD细胞的增殖和迁移侵袭能力,这表明了Src可能是土荆皮乙酸抑制LUAD进展的关键靶点。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准,说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,包括土荆皮乙酸作为miR-137-3p的表达调控剂在制备预防或治疗肺腺癌的药物的应用。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述预防或治疗是指降低肺腺癌细胞的增殖能力。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述预防或治疗是指降低肺腺癌细胞的迁移能力;
可选地,所述迁移能力包括平面迁移能力和空间迁移能力。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述预防或治疗是指降低肺腺癌细胞的侵袭能力。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述预防或治疗是指诱导肺腺癌细胞凋亡;及/或
所述预防或治疗是指下调间充质标志物ZEB1、MMP2、N-cadherin和Vimentin的表达水平。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述预防或治疗是指促进miR-137-3p过表达;及/或
所述预防或治疗是指下调肺腺癌细胞Src的表达水平。
8.土荆皮乙酸在制备预防或治疗肺腺癌的药物中的应用。
9.根据权利要求1-8任一项所述的应用,其特征在于,所述药物包括土荆皮乙酸以及药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求1-8任一所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型包括注射剂、口服液、丸剂、散剂、膏剂、片剂、颗粒剂、粉剂或胶囊剂。
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