CN112569354B - tau蛋白及其基因作为药物靶点在制备治疗糖尿病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了tau蛋白及其基因作为药物靶点在制备治疗糖尿病药物中的应用,涉及糖尿病治疗技术领域。本发明公开以tau蛋白或tau基因为靶点的试剂在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用。本发明的实施例研究创造性地发现,tau蛋白在胰岛素分泌中具有重要的调控作用,通过靶向tau蛋白或tau基因能够实现糖尿病的治疗。本发明为糖尿病的治疗和药物研发或筛选提供了新的思路和策略。
Description
技术领域
本发明涉及糖尿病治疗技术领域,具体而言,涉及tau蛋白及其基因作为药物靶点在制备治疗糖尿病药物中的应用。
背景技术
糖尿病是一种常见的慢性疾病,全世界约有10%的成年人患有糖尿病,其并发症的产生也加剧了经济和医疗负担。2011年美国在糖尿病的支出达到4650亿美元,占成年人所有医疗保健费用的11%。中国是世界上糖尿病患者最多的国家,并且还在逐年上升,我国在1980年的患病率为0.67%,而到2013年,我国已有11%的成年人(约1.54亿)患有不同程度的糖尿病。这些数据都表明全世界糖尿病在的发病率都显著上升,并且造成了严重的医疗负担和经济负担。
糖尿病是一种代谢系统疾病,其主要的特征是高血糖,可通过外源性补充胰岛素和口服药物增加胰岛素的分泌、降低肝糖原的释放、增强骨骼肌和脂肪对糖的利用,以及降低日常饮食中糖量的摄入来改善症状。糖尿病主要分为Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病:Ⅰ型糖尿病患病较为少见,约为Ⅱ型糖尿病患者的十分之一,多发病于儿童和青少年时期,发病机制是胰岛β细胞的破坏,通常是自身免疫性胰岛β细胞的破坏,导致胰岛素缺乏或是分泌量较低,无法满足机体正常需求,需外源注射胰岛素降低血糖。Ⅱ型糖尿病是主要的糖尿病类型,发病机制是由于胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍。胰岛素抵抗需要胰岛β细胞产生更多的胰岛素才能满足需求量,从而导致短期内胰岛β细胞数量和功能的增加。此外,还有一种特殊的糖尿病类型-妊娠糖尿病,主要病因是妊娠期出现胰岛素耐受现象。
糖尿病的并发症历来是医学重点,糖尿病并发症分为急性代谢并发症和慢性并发症。急性代谢并发症包括异常高血糖引起的糖尿病酮症酸中毒(高血糖)和低血糖导致的昏迷(低血糖)。慢性并发症包括大血管(加速心血管疾病,导致心梗和脑血管疾病)和微血管并发症(例如,糖尿病会影响肾脏,视网膜和神经系统)。基于糖尿病干预和并发症流行病学研究,Ⅰ型糖尿病患者慢性并发症中约47%患有视网膜病变,17%患有肾病综合征,14%患有心血管疾病。而Ⅱ型糖尿病各种慢性并发症所占比例在不同人种中差异较大,亚洲人似乎有更高的肾病综合征患病率,但心血管疾病的发病率低于白种人。一项在亚洲、非洲、南美洲和欧洲包含27个国家的研究表明,约有50%的Ⅱ型糖尿病患者患有微血管并发症,27%的Ⅱ型糖尿病患者患有大血管并发症。此外,大血管和微血管疾病在糖尿病患者中的发病率比在正常人中分别至少高2-4倍和10-20倍。这些数据提示糖尿病不仅会影响机体的糖代谢系统,还具有很高的并发症患病风险。
但目前,针对糖尿病通常以使用胰岛素为主,靶点较少,对糖尿病仍需要更多的治疗靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供tau蛋白及其基因作为药物靶点在制备治疗糖尿病药物中的应用。本发明提供了新的糖尿病的治疗靶点,即tau蛋白或tau基因,通过靶向tau蛋白或tau基因抑制tau蛋白的活性、抑制tau基因和/或tau蛋白的表达、或者干扰tau蛋白的生物功能能够实现糖尿病的治疗。本发明为糖尿病的治疗和药物研发或筛选提供了新的思路和策略。
本发明是这样实现的:
本发明的实施例研究创造性地发现,tau蛋白在胰岛素分泌中具有重要的调控作用;并通过对tau蛋白的活性、tau基因的表达和tau蛋白的生物功能的调控等多种实验进行了验证,揭示抑制tau蛋白的活性、抑制tau基因的表达或抑制tau基因的表达能够促进胰岛素向胞外分泌,降低血糖水平。tau蛋白或tau基因为可以作为治疗糖尿病的靶点,本发明为糖尿病的治疗和药物研发或筛选提供了新的思路和策略。
基于此,一方面,本发明提供以tau蛋白或tau基因为靶点的试剂在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用,所述试剂具有如下作用中的一种或多种:
(1)抑制tau蛋白的活性;
(2)抑制tau基因和/或tau蛋白的表达;
(3)干扰tau蛋白的生物功能。
基于本发明公开的内容,可以将能够抑制tau蛋白的活性、抑制tau基因的表达或干扰tau蛋白的生物功能的试剂作为预防或治疗糖尿病药物,本发明为上述试剂提供了新的用途,也为糖尿病的治疗提供一种新的药物选择。
可选的,在本发明的一些实施方案中,具有抑制tau基因的表达作用的所述试剂为siRNA、shRNA、反义RNA、核酶或基因编辑载体。
可选的,在本发明的一些实施方案中,所述基因编辑载体为CRISPR-Cas9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体。
基于本发明公开的内容,本发明的一些实施方案中,本领域技术人员容易想到通过表达合适的核酸分子来抑制tau基因(哺乳动物例如人的tau基因序列是本领域技术人员容易获得的)表达。这类核酸分子包括但不限于siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体。siRNA是长20到25个核苷酸的双链RNA,参与RNA干扰(RNAi),以带有专一性的方式抑制tau基因的表达。siRNA也可经由多种不同转染技术导入对象细胞内,并对tau基因产生具专一性的敲弱效果。可采用本领域公知的siRNA设计原则设计siRNA。例如,可在tau mRNA中寻找一段20-25nt长、通常为21nt的以AA二核苷酸起始的序列作为siRNA靶位点。可采用化学合成、体外转录、siRNA表达载体以及PCR表达组件等方法制备感兴趣的siRNA。
反义RNA是指与mRNA互补后,能抑制基因表达的RNA。反义RNA通常包括3类:I类反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和/或部分编码区,直接抑制翻译,或与靶mRNA结合形成双链RNA,从而易被RNA酶III降解;II类反义RNA与mRNA的非编码区结合,引起mRNA构象变化,抑制翻译;III类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。
核酶是具有催化功能的小分子RNA,能降解特异的mRNA序列。核酶可通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂,特异性地剪切底物RNA分子,从而阻断靶基因的表达。
基因编辑载体可以是本领域常规的CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体。在一些实施方案中,所述基因编辑载体以AAV病毒载体为骨架载体构建得到。
可采用本领域周知技术制备适用于本发明的siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体,并给予需要的对象,用于抑制tau基因的表达。
可选的,在本发明的一些实施方案中,抑制tau蛋白的表达的试剂是SSA。
SSA是治疗类风湿性关节炎患者水杨酸盐的前体药物,可特异性抑制tau蛋白P300乙酰化位点,降低总tau蛋白水平。本发明的实施例通过实验验证了SSA治疗糖尿病的有效性。因此,在本发明公开的前提下,本领域技术人员可以合理预期和采用其他的降低tau蛋白表达水平的化合物用于治疗糖尿病,这也属于本发明的保护范围。
可选的,在本发明的一些实施方案中,具有抑制tau蛋白的活性作用的所述试剂为抗tau蛋白的抗体或其功能性片段。
tau蛋白活性的抑制可采用本领域常规的技术实现。例如,可通过给予tau蛋白的抗体拮抗其活性。tau抗体为本领域所周知,可使用市售抗体。上述抗体优选为人源化抗体。另外,抗体优选为单克隆抗体。
上述功能性片段是指抗体能够结合tau蛋白的部分功能结构域例如可以是Fab、scFV、F(ab’)、F(ab’)2和VHH等,本领域技术人员可以根据需要选择合适的功能性片段用于到本发明,无论何种形式的抗体功能性片段,只要其通过结合tau蛋白拮抗其活性以治疗糖尿病则属于本发明的保护范围。
可选的,在本发明的一些实施方案中,干扰tau蛋白的生物功能是指抑制微管聚集或促进微管解聚。
本发明实施例的研究显示,tau蛋白发挥调控胰岛素分泌的作用在于tau蛋白能够维持微管稳定性的作用,增强微管对胰岛素分泌的调控,进而抑制了胰岛细胞内胰岛素向胞外的分泌。本领域虽然普通知晓tau蛋白的主要功能是维持微管稳定,参与微管装配。但本发明进一步深入发现且是首次报道,tau蛋白的上述功能也同时增强了对胰岛素分泌的调控,抑制了胰岛素由胰岛细胞内向的分泌。该结果完全超乎了发明人的预料。基于此,通过干扰tau蛋白的生物功能例如抑制微管聚集或促进微管解聚就能够增加胰岛素的分泌,降低血糖水平,有效地起到治疗糖尿病的作用。本发明的实施例采用常见的具有促进微管解聚作用的秋水仙素验证了上述机理,其显著改善了糖尿病模型的糖耐量。
可选的,在本发明的一些实施方案中,具有抑制微管聚集作用的所述试剂为秋水仙碱(colchicin)、长春碱(vinblastine)或长春新碱(vincristine)。
可选的,在本发明的一些实施方案中,具有促进微管解聚作用的所述试剂为秋水仙素。
当然,需要说明的是,秋水仙素仅仅是促进微管解聚的化合物之一,本领域技术人员可根据本发明公开的内容,选用其他的抑制微管聚集或促进微管解聚的化合物作为治疗糖尿病的药物,也可以开发出新的目前现有技术并未揭示但通过本领域的化学知识可以设计合成的具有抑制微管聚集或促进微管解聚作用的化合物,以治疗糖尿病;这些化合物都是属于本发明的保护范围。
可选的,在本发明的一些实施方案中,所述糖尿病的类型为Ⅱ型糖尿病。
另一方面,本发明提供一种预防或治疗糖尿病的药物,所述药物含有以tau蛋白或tau基因为靶点具有如下作用中的一种或多种的试剂:
(1)抑制tau蛋白的活性;(2)抑制tau基因和/或tau蛋白的表达;(3)干扰tau蛋白的生物功能;
所述试剂不是SSA和秋水仙素。
基于本发明公开的内容,本领域技术人员可以设计出合适的以tau蛋白或tau基因为靶点的治疗糖尿病的药物,如果这些药物是在本发明申请之后的设计出的且不属于本申请日之前现有技术报道的药物,则这类药物属于本发明的保护范围。至于这些药物具体的分子结构等,本领域技术人员是可以容易实现设计的。只要这些药物以tau蛋白或tau基因为靶点,抑制tau蛋白的活性;抑制tau基因和/或tau蛋白的表达;或干扰tau蛋白的生物功能就可以实现治疗糖尿病的技术效果,这对本领域技术人员来说是可以合理预期的。
可选的,在本发明的一些实施方案中,所述干扰tau蛋白的生物功能是指抑制微管聚集或促进微管解聚。
可选的,在本发明的一些实施方案中,所述糖尿病的类型为Ⅱ型糖尿病。
另一方面,本发明提供一种设计或筛选用于预防或治疗糖尿病的药物的方法,该筛选方法包括:从待筛选的化合物中选择具有如下作用中的一种或多种的化合物作为预防或治疗糖尿病的候选药物:
(1)抑制tau蛋白的活性;(2)抑制tau基因和/或tau蛋白的表达;(3)干扰tau蛋白的生物功能。
基于本发明公开的内容,本领域技术人员容易想到将tau蛋白或tau基因作为药物靶点,从中筛选出具有上述(1)-(3)中一项或多项作用的药物以作为预防或治疗糖尿病的候选药物,这对本领域技术人员来说是容易实现的,因此,以tau蛋白或tau基因作为靶点筛选预防或治疗糖尿病的药物也属于本发明的保护范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1:热图分析Ins-1细胞内表达倍数变化的基因(a),火山图分析Ins-1细胞内差异表达基因(P<0.05)(b)(n=4)。
图2:聚类分析INS-1细胞内差异表达的下调基因(a),利用IPA工具进行String分析参与胰岛素分泌差异表达基因蛋白互作网络(b)(n=3)。
图3:WesternBlot检测INS-1细胞中tau蛋白的表水平。不同浓度葡萄糖刺激INS-1细胞后tau蛋白的表达(上图)以及蛋白定量分析(下图),与GAPDH进行标准化处理。数据采用平均数±标准误表示(n=4)。
图4:WsternBlot检测WT和db/db小鼠胰腺中tau蛋白的表达水平。WT,6周龄和12周龄db/db小鼠胰腺中tau蛋白的表达(上图)和蛋白定量分析(下图),与β-actin进行标准化处理。数据采用平均数±标准误表示(n=4)。
图5:INS-1细胞中tau蛋白水平的降低增加胰岛素的分泌。WesternBlot检测INS-1细胞中tau蛋白的表达。WT和tau-KO细胞中tau蛋白的表达(上图)和蛋白定量分析(下图)(a)。2.8mM和16.7mM葡萄糖刺激INS-1细胞(WT和tau-KD)后胰岛素的分泌水平(b)(n=6)。数据采用平均数±标准误表示。
图6:水杨酸处理胰腺降低tau蛋白的表达水平。小鼠胰腺中tau蛋白的表达(上图)和蛋白定量分析(下图),与β-actin进行标准化处理,数据采用平均数±标准误表示(n=6)。
图7:胰腺注射SSA改善db/db小鼠(5周龄)糖耐量(a),增加胰岛素的分泌(b)。*P<0.05,***P<0.001。数据采用平均数±标准误表示(n=5)。
图8:SSA的注射改善db/db小鼠(10周龄)糖耐量(a)。体重在SSA注射后显著减低(b)。*p<0.05,**P<0.01,***P<0.001。数据采用平均数±标准误表示(n=5)。
图9:tau蛋白缺失促进血糖的降低和胰岛素的分泌。GTT检测WT和tau-KO小鼠(6月龄)糖耐受(a)。Elisa测定GTT实验中WT和tau-KO小鼠(6月龄)胰岛素的分泌(b)。*P<0.05,**P<0.01。
图10:Elisa检测在16.7mM葡糖糖刺激下INS-1细胞(WT和tau-KD)在Nocodazole的处理下胰岛素的分泌水平。数据采用平均数±标准误表示(Ctrl:WT(n=4),tau-KD(n=6);Nocodazole:WT(n=6),tau-KD(n=4))。
图11:秋水仙素的注射显著改善db/db小鼠(5周龄)的糖耐量。**P<0.01,***P<0.001。数据采用平均数±标准误表示(n=5)。
图12:db/db小鼠(5周龄)注射秋水仙素后,免疫荧光染色检测小鼠胰腺中胰岛素和微管蛋白的表达。微管用微管蛋白标记。
图13:免疫荧光染色检测db/db(5周龄和10周龄)小鼠注射DMSO和SSA后胰腺中胰岛素和微管蛋白的表达。对照小鼠是db/db同遗传背景的正常小鼠。与微管用微管蛋白标记。
图14:免疫荧光染色检测WT和tau-KO小鼠(6月龄)胰腺中胰岛素,tau和微管蛋白的表达。微管用微管蛋白标记。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
胰岛细胞INS-1(tau-KD)细胞定量蛋白质组学分析
蛋白质是生命活动的主要承担者,蛋白质组学可以从整体水平上研究所有蛋白的表达水平和蛋白之间的相互作用。为从整体蛋白水平上探究tau蛋白在胰岛素分泌过程中的重要,本发明实施例构建了tau蛋白水平降低的胰岛INS-1(大鼠胰岛瘤细胞)进行定量蛋白质组学分析(N=4)。
定量蛋白质组学分析中共有5933个蛋白被量化。从定量蛋白中分别选取了倍数差异最大的100个上调和下调蛋白进行整体蛋白表达热图分析,热图分析显示WT组和tau-KD组的每个重复样本呈现较好的均一性,说明该数据具有良好的重复性和可性度,可以进行后续的生物信息学分析(图1中a)。此外,热图分析显示胰岛细胞INS-1中tau蛋白水平的降低改变了INS-1细胞整体蛋白表达模式(图1中a)。火山图可以较为直观的显示基因表达的分布,我们筛选P<0.05的差异蛋白,根据差异表达的基因构建火山图,结果显示INS-1(tau-KD)细胞内Ins1基因的表达下调(图1中b)。胰岛素是由Ins1基因编码的,这一结果表明胰岛细胞内tau蛋白水平的减低降低了胞内胰岛素的含量,暗示tau蛋白的缺失可能会增加胰岛素向胞外的分泌。针对定量蛋白质组学内表达具有差异显著性(P<0.05)的下调基因进行KEGG通路富集分析,并列出了10个具有统计学意义的生物过程。分析结果显示差异表达基因显著富集到胰岛素分泌过程中(图2中a),提示胰岛细胞INS-1内tau蛋白水平的降低导致胰岛素分泌通路发生显著改变。STRING(Search tool for the retrieval ofinteracting)是一个可用于预测蛋白互作(PPI)的数据库。我们挑选参与调控胰岛素分泌的差异表达蛋白进行STRING分析,结果显示差异蛋白发生的蛋白互作较多(图2中b)。以上的结果提示tau蛋白可能在胰岛素分泌调控中具有重要作用。
实施例2
tau蛋白水平在胰岛素分泌过程中的变化
2.1 tau蛋白水平在胰岛细胞中呈糖依赖性下调
为从体外确定胰岛素分泌过程中tau蛋白水平的变化,本实施例利用不同浓度的葡萄糖:低浓度(2.8mM),中浓度(11.1mM)和高浓度(16.7mM)葡萄糖刺激胰岛细胞INS-1(大鼠胰岛细胞瘤细胞)进行葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(Glucose-stimulated insulinsecretion test,GSIS)。GSIS实验结束后,利用WesternBlot检测INS-1细胞中tau蛋白表达水平的变化。实验结果显示,随着葡萄糖浓度的增加,tau蛋白的表达水平逐渐下调(图3)。这一现象表明tau蛋白水平在胰岛细胞胰岛素分泌过程中发生改变,提示tau蛋白可能参与胰岛素分泌的调控。
2.2 tau蛋白水平在db/db小鼠胰腺中呈周龄依赖性上调
为从体内确定Ⅱ型糖尿病患病进程中tau蛋白水平的变化,我们利用WesternBlot检测了6w(周龄)和12w(周龄)db/db小鼠胰腺中tau蛋白的表达。结果显示,与db/db同背景正常小鼠(WT)相比,6w和12w db/db小鼠tau蛋白的表达水平均显著上调,并随小鼠周龄的增加,tau蛋白的表达水平也逐渐上调(图4)。以上结果显示tau蛋白在糖尿病小鼠胰腺内呈周龄依赖性上调,提示tau蛋白可能参与调控糖尿病的发病进程。
实施例3
tau蛋白水平的降低对胰岛素分泌和葡萄糖耐量的作用
3.1 tau蛋白水平的降低增加INS-1细胞胰岛素的分泌
在确定了tau蛋白水平在胰岛素分泌过程中的发生显著改变后,本实施利用INS-1tau-KD胰岛细胞模型探究tau蛋白对胰岛素分泌的调控作用。首先利用Westernblot验证了INS-1细胞内tau蛋白水平的降低(图5中a)。INS-1细胞在葡萄糖的刺激下可分泌胰岛素,因此为确定tau蛋白水平的降低是否会影响INS-1细胞胰岛素的分泌,我们利用INS-1tau-KD细胞进行了葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(GSIS),GSIS结果显示,与WT组相比,INS-1(tau-KD)细胞在低浓度葡萄糖(2.8mm)和高浓度葡萄糖(16.7mm)刺激下胰岛素的分泌均显著增加(图5中b)。以上结果提示tau蛋白水平的降低显著促进胰岛细胞INS-1胰岛素的分泌。
3.2胰腺局部注射SSA显著改善db/db小鼠糖耐量
SSA是治疗类风湿性关节炎患者水杨酸盐的前体药物,可特异性抑制tau蛋白P300乙酰化位点,降低总的tau蛋白水平。本实施例也采用胰腺局部注射SSA的方法降低db/db小鼠胰腺中tau蛋白的表达。WesternBlot验证了小鼠胰腺中tau蛋白表达量的降低(图6)。小鼠糖耐量实验(GTT)的结果显示,与WT组相比,胰腺中SSA的注射显著改善了db/db小鼠(5周龄,5w)糖耐量(图7中a),促进了胰岛素的分泌(图7中b)。db/db小鼠(10周龄,10w)胰腺注射SSA后GTT的结果显示糖耐量显著改善(图8中a),10天内SSA组小鼠体重明显下降(图8中b)。以上结果表明SSA降低胰腺中tau蛋白的表达可显著改善db/db小鼠的糖耐量。
3.3tau蛋白缺失促进血糖浓度的降低和胰岛素的分泌
tau-KO小鼠是将exon1删除的全身tau蛋白敲除小鼠,为确定tau蛋白缺失对小鼠糖耐受和胰岛素分泌的影响,本实施例对6月龄tau-KO小鼠进行了GTT实验,并收集血液样本进行了胰岛素含量的测定。GTT的结果显示与WT小鼠相比,tau-KO小鼠血糖降低更快(图9中a),同时胰岛素含量的测定也显示,在腹腔注射葡萄糖后的15min和30min,tau-KO小鼠胰岛素的分泌显著高于WT小鼠,从而更快地降低血糖浓度(图9中b)。以上结果提示tau蛋白缺失可通过增加胰岛素的分泌,降低血糖浓度。
实施例4
tau蛋白通过维持微管的稳定性抑制胰岛素的分泌
4.1 tau蛋白降低抑制Nocodazole处理下胰岛素分泌的增加
Nocodazole是一种抗肿瘤药物,可促进微管解聚,增加胰岛素的分泌。在GSIS实验中,通过Nocodazole(10μg/mL)处理INS-1细胞,加剧INS-1细胞微管的解聚,增加胰岛素的分泌。GSIS的实验结果显示,在16.7mm葡萄糖的刺激下,INS-1(tau-KD)胰岛素的分泌水平显著高于INS-1(WT);INS-1(WT)Nocodazole处理组胰岛素的分泌水平显著高于未预处理组,而INS-1(tau-KD)在Nocodazole处理下胰岛素的分泌并未进一步增加(图10)。这一现象提示tau蛋白可能通过维持微管稳定性抑制胰岛素的分泌。
4.2 Colchicine显著改善db/db小鼠糖耐量
秋水仙素(colchicine,Col)是一种生物碱,具有干扰微管装配的作用。db/db小鼠腹腔注射Col(1mg/kg)后6h进行GTT,结果显示Col可显著改善db/db小鼠糖耐量(图11)。这一结果验证了微管稳定性对糖耐量的抑制效应。
4.3 tau蛋白通过稳定微管抑制胰岛细胞内胰岛素的释放
为进一步明确tau蛋白是否通过稳定微管抑制胰岛素的分泌,我们首先收集了腹腔注射Col的db/db(5w)小鼠胰腺进行免疫荧光染色,免疫荧光染色结果表明,与Sham组相比,注射Col的db/db小鼠胰岛内微管蛋白Tubulin明显下调,胰岛细胞内胰岛素含量也显著降低(图12)。这一现象表明Col对微管稳定性的干扰增加了胰岛细胞内胰岛素向胞外的分泌。SSA可特异性抑制tau蛋白P300乙酰化位点,降低总的tau蛋白含量。因此,我们还对胰腺局部注射SSA的db/db(5w和10w)小鼠胰腺进行了免疫荧光染色,结果显示,与同背景的正常小鼠相比,db/db小鼠(5w和10w)胰岛内微管蛋白Tubulin均显著上调,胰岛内胰岛素颗粒的分布密度也明显增加;与DMSO组相比,SSA组胰岛(5w和10w)内胰岛素颗粒的分布降低,微管蛋白Tubulin也显著下调(图13)。这一现象提示,注射SSA后db/db胰岛内胰岛素的降低可能是tau蛋白水平的改变导致的。因此,我们又对tau-KO(6w)小鼠胰腺进行了免疫荧光染色。与预期的结果一致,tau蛋白缺失显著降低了细胞内微管蛋白Tubulin和胰岛素的含量(图14)。以上结果提示,tau蛋白具有维持微管稳定性的作用,增强微管对胰岛素分泌的调控,进而抑制了胰岛细胞内胰岛素向胞外的分泌。
总的来说,本发明实施例选用了db/db小鼠作为Ⅱ型糖尿病的动物模型,tau-KO小鼠以及大鼠胰岛细胞INS-1作为细胞模型。从体内外探究tau蛋白在胰岛素分泌中的作用。db/db小鼠为瘦素受体缺陷型小鼠,在一个月时开始贪食及发胖,继而发生高血糖、高血胰岛素,胰高血糖素也随之升高,是应用较为广泛的Ⅱ型糖尿病动物模型。tau-KO小鼠特异性删除编码区exon1,敲除tau蛋白在全身中的表达。INS-1细胞是大鼠胰岛细胞瘤细胞,源自X射线照射的移植胰岛瘤的大鼠,广泛用于β细胞功能的研究。
定量蛋白质组学可定量定性分析基因组所产生的所有蛋白表达水平和蛋白之间的相互作用。我们对胰岛细胞INS-1(WT和tau-KO)进行了定量蛋白质组学分析,蛋白质组学分析的结果显示tau蛋白表达量的降低影响INS-1细胞内蛋白的表达,降低胞内胰岛素的蛋白水平,富集分析显示差异表达蛋白显著富集到胰岛素分泌过程中。此外参与胰岛素分泌调控的差异表达蛋白也存在较多的蛋白相互作用,明确了tau蛋白在胰岛分泌过程中具有调控作用。
在从整体蛋白水平上确定了tau蛋白水平降低影响胰岛素分泌过程后,接着我们从体内外分别检测了tau蛋白在糖尿病和胰岛素分泌过程中蛋白的变化。db/db小鼠糖代谢异常,与同遗传背景的正常小鼠相比,其胰腺中tau蛋白的表达量显著上升,并且表达量随着糖尿病的严重程度而增加。此外,我们还用不同浓度的葡萄糖去刺激INS-1细胞分泌胰岛素,tau蛋白的表达量随葡萄糖浓度的增加(胰岛素分泌的增加)而下调。体内外的结果均一致提示tau蛋白可能参与糖尿病的患病进程和胰岛素的分泌。
在证实了tau蛋白在糖尿病和胰岛素分泌作用中表达量的变化后,我们进一步确定了tau蛋白对胰岛素分泌的调控作用。研究表明SSA可特异性抑制tau蛋白P300乙酰化位点,降低总tau蛋白的水平,我们通过局部胰腺注射SSA降低db/db小鼠胰腺中tau蛋白的表达。GTT的结果显示SSA可显著改善db/db小鼠糖耐量,增加胰岛素的分泌。同时我们还对tau-KO小鼠进行了GTT实验,GTT的结果显示tau蛋白缺失可促进血糖的降低,增加胰岛素的分泌。胰岛细胞INS-1中tau蛋白水平降低显著增加胰岛素向胞外的分泌。这一系列的结果证实tau蛋白水平的降低可增加胰岛素的分泌,改善糖耐量症状。
tau蛋白作为表达量最高的微管相关蛋白,具有稳定微管和协助微管装配的作用。由此我们猜想tau蛋白可能是通过维持微管的稳定性来抑制胰岛素的分泌。Nocodazole是一种抗肿瘤药物,可以通过促进微管的解聚增加胰岛素的分泌。在Nocodazole处理下,INS-1细胞胰岛素的分泌显著增加,但tau蛋白水平的降低抑制了Nocodazole处理下胰岛素分泌的增加。Colchicine是一种生物碱,可干扰微管的解聚和装配,db/db小鼠腹腔注射Colchicine后可显著提高对血糖的控制能力,改善糖耐受症状。再次验证了微管对胰岛素分泌的调控。以上结果提示tau蛋白可通过维持微管的稳定性抑制胰岛素的分泌。
随后我们又通过免疫荧光染色再次证明了这一猜想。腹腔注射Colchicine可干扰微管的稳定性,免疫荧光染色结果显示,Colchicine可显著降低db/db小鼠胰岛内微管蛋白β-Tubulin和胰岛素的含量。同时,局部胰腺注射SSA的免疫荧光染色的结果也显示db/db小鼠胰岛内β-Tubulin和胰岛素的含量显著下调,与腹腔注射colchicine的结果一致。由于SSA可特异性降低tau蛋白的表达,因此该结果提示SSA的作用可能是由于tau蛋白水平降低干扰了微管的稳定性,从而促进了胰岛内胰岛素向胞外的分泌。tau-KO小鼠胰腺免疫荧光染色的结果再次验证了tau蛋白的作用方式,tau蛋白的缺失影响了微管的稳定性,降低了胞内胰岛素的含量。
综上所述,把本发明实施例的研究发现tau蛋白可通过维持微管的稳定性,抑制胰岛素向胞外的分泌作用,为进一步揭示tau蛋白的生理功能,为正确理解tau蛋白的生理功能和致病机制提供理论依据。
上述实施例涉及的材料和相关实验方法参考如下:
1.实验动物
实施例所用db/db模型小鼠购自集萃药康,是瘦素受体缺陷型小鼠,属Ⅱ型糖尿病模型。该小鼠自1月龄开始较正常小鼠体重升高,血糖升高。tau-KO小鼠信息如第一部分材料方法1.0所述。购买的小鼠于本实验室SPF级动物饲养间饲养繁殖。饲养环境如下:饲养温度为18~22℃,饲养湿度为50~60%。所有小鼠实验均得到动物伦理委员会的许可。
2.小鼠基因型鉴定
2.1实验试剂
(1)三(羟甲基)氨基甲烷(Tris),Na2 EDTA.2H2O,(NH4)2SO4,MgCl2,Triton X:生工生物工程(上海)股份有限公司;
(2)冰醋酸;
(3)β-巯基乙醇;
(4)蛋白酶K:USA,Sigma;
(5)Green PCR mix,琼脂粉:擎科生物。
2.2实验仪器
(1)金属浴:
(2)聚合酶链反应核酸扩增仪:Germany,Eppendorf;
(3)凝胶成像系统;
(4)电泳仪;
(5)电泳槽;
2.3溶液配制
(1)TAE(50×):称取242g Tris和37.2g Na2 EDTA.2H2O溶于600ml Milli-Q水中,溶解后加入57.1ml冰醋酸,充分搅拌后用Milli-Q水定容至1L。
(2)鼠尾裂解液:
10X MGB体系:
鼠尾裂解液体系:
3.INS-1稳定敲低tau蛋白细胞系(tau knockdown,tau-KD)的构建
3.1细胞培养
3.1.1实验试剂
(1)RPMI 1640培养液,0.25%胰酶,PBS溶液,青链霉素双抗,胎牛血清(FBS):Invitrogen Life Technologies。
3.1.2实验仪器
(1)细胞培养箱:Invitrogen Life Technologies。
3.1.3实验步骤
INS-1(大鼠胰岛细胞瘤细胞)细胞由四川大学生物治疗国家重点实验室傅湘辉教授赠送。RPMI 1640(10%FBS,1%双抗)培养液培养INS-1细胞,放置于37℃,5%CO2细胞培养箱中。
3.2sgRNA重组构建
3.2.1实验试剂
(1)BsmBI,CIP,T4 DNA连接酶,T4多聚核苷酸激酶:New England Biolabs。
(2)琼脂粉,NaCl,蛋白胨,酵母粉,氨苄:生工生物工程(上海)股份有限公司。
(3)感受态细胞:北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司。
(4)质粒提取试剂盒,胶回收试剂盒:Omega。
3.2.2实验步骤
(1)在线设计网站http://crispr.mit.edu/设计大鼠tau sgRNA,其靶标序列为:GGGCGTCGTGAAGGCCAGGC。
(2)12-2EFS载体的酶切
酶切反应体系:
反应条件:55℃酶切2h,酶切结束后待酶切产物冷却到室温,加入1μL CIP 37℃反应1h。酶切结束后,按胶回收试剂盒说明书回收酶切产物。
(3)磷酸化和Oligo退火成双链DNA
反应体系(5μL):
反应条件:37℃30min→95℃5min,然后按照5℃/min降到25℃。
(4)双链oligo与酶切的载体连接
载体:载体酶切后的回收产物。
插入片段:Oligo退火双链DNA稀释200倍。
反应条件:16℃过夜或25℃1h
(5)转化后挑取单菌落,提取质粒后测序验证载体构建成功。
3.3构建INS-1tau-KD细胞系
3.3.1实验试剂
(1)DMEM,PBS溶液,0.25%胰酶,胎牛血清(FBS),青链霉素双抗:Invitrogen LifeTechnologies。
(2)CaCl2,NaCl,KCl,Na2HPO4,HEPES:生工生物工程(上海)股份有限公司。
(3)葡萄糖:Biosharp。
(4)Polybrene:Sigma-Aldrich。
(5)基因组提取试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司。
3.3.2溶液配制
(1)293T细胞培养液:DMEM(10%FBS+1%双抗)。
(2)2M CaCl2溶液:称取22.196g CaCl2溶于100mL无菌水中,0.22μM滤器过滤除菌,分装后-20℃保存。
(3)2×HBS溶液(100mL):
适量无菌水溶解后调节pH值至7.00-7.45,定容至100mL。0.22μM滤器过滤除菌,分装后-20℃保存。
(4)polybrene(10mg/mL):称取1g polybrene溶解于100mL无菌水中,0.22μM过滤除菌,分装后-20℃保存。
3.3.3实验步骤
1.慢病毒的包装
(1)293T细胞90%左右1:3传代,传至6孔板。
(2)次日细胞密度达到70-90%左右时,换新鲜培养液,配制转染溶液(6孔板):
溶液1:
溶液2:2×HBS溶液100μL。
将溶液1慢慢滴加到溶液2中,滴加同时震荡混匀。转染溶液配制好后均匀滴加到293T细胞孔板内,细胞放置细胞培养箱内。
(3)细胞转染后24h换新鲜培养液。
(4)细胞转染后48h前后收集细胞培养液,0.45μM滤器过滤,分装后-80℃保存。
2.慢病毒转染
(1)INS-1细胞密度达到90%左右时以1:3比例传代。
(2)次日细胞密度为70%左右时,换新鲜培养液,加入适量慢病毒,再加入polybrene溶液(终浓度为10μg/mL),2000rpm离心60min。离心结束后放入细胞培养箱内。
(3)慢病毒感染24h后换新鲜的培养液。
3.INS-1tau蛋白敲除单克隆细胞的挑取和鉴定
(1)慢病毒感染后72h,利用梯度稀释法将细胞种于96孔细胞培养板中,培养单克隆细胞。
(2)待细胞数量足够时提取基因组DNA进行PCR扩增,测序鉴定存在基因编辑的单克隆细胞。
(3)收集细胞利用WesternBlot鉴定单克隆细胞tau蛋白的表达水平。
4.INS-1细胞(tau-KD)蛋白质组学分析
4.1INS-1细胞样品的收集
收集INS-1细胞(WT和tau-KD),1000rpm离心5min后弃上清,-80℃保存。
4.2蛋白质组学分析
4.2.1实验试剂
(1)TMT标签:Invitrogen Life Technologies。
4.2.2实验仪器
(1)高效液相色谱(Agilent 1260):Agilent。
(2)质谱仪(QE Pluse):Invitrogen Life Technologies。
4.2.3实验步骤
4.2.3.1.蛋白的提取
蛋白样品中加入1mL含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液,涡旋使其充分裂解,并置于冰上继续裂解20min。随后利用超声破碎仪进行超声裂解。经离心后,转移上清至新的1.5mL离心管。
4.2.3.2.蛋白浓度的测定
利用Bradford法进行浓度测定,随后利用SDS-PAGE验证浓度测定是否准确。
4.2.3.3.蛋白样品的处理
在保证各样品浓度测定准确后,取等量蛋白,按照TMT-6标试剂盒中的方法进行还原、烷基化、沉淀、酶解以及TMT试剂标记和淬灭。完成后混合样品,利用SPE小柱脱盐并浓缩干后,进行反向HPLC碱性条件分级,收集不同时间出峰的多肽,并按照错位混合的方式将样品分别合并。
4.2.3.4.样品上机
蛋白分级完成后使用浓缩仪进行浓缩,使用ZipTip除盐后利用质谱仪上机检测。
4.2.3.5.数据分析
对于质谱检测得到的raw文件,使用MaxQuant软件进行搜库得到原始数据。
5.蛋白质免疫印迹技术(WesternBlot)检测tau蛋白的表达水平
5.1实验试剂
(1)蛋白预制胶,电泳缓冲液粉末(1L):金斯瑞生物科技股份有限公司
(2)三(羟甲基)氨基甲烷(Tris),甘氨酸,十二烷基硫酸钠(SDS),Tween-20:生工生物工程(上海)股份有限公司
(3)TBS:Biosharp
(4)0.22um PVDF膜:USA,Millipore
(5)RIPA裂解液,BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型):上海碧云天生物技术有限公司
(6)LDS Sample Buffer,Sample Reducing Agent,超敏化学发光液:USA,Thermo
(7)Tau抗体:USA,Abcam
(8)β-actin,兔源二抗,鼠源二抗:USA,Sigma
(9)脱脂奶粉:
5.2实验仪器
(1)样品匀浆仪
(2)电泳槽:USA,Biorad
(3)电泳仪:USA,Thermo
(4)WesternBlot自动显影仪
5.3溶液配制
(1)电泳缓冲液:将粉末加入到Milli-Q水中,溶解后定容至1L。
(2)转膜缓冲液体系:
Milli-Q水定容至1L
(3)TBST缓冲液:用Milli-Q水溶解TBS粉末,溶解后加入2ml Tween-20,Milli-Q水定容至2L。
(4)5%脱脂奶粉:称取0.5g脱脂奶粉溶解于10mlTBST缓冲液中。
5.4实验步骤
5.4.1.蛋白样品的制备
(1)组织样品中加入适量RIPA裂解液后利用样品匀浆仪将组织匀浆,提取总蛋白;细胞去除培养液后,加入PBS漂洗细胞,将RIPA裂解液加入细胞培养皿内,待细胞脱落后收集样品,提取总蛋白。
(2)利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白样品浓度。
(3)按照蛋白浓度取等量蛋白(20-50ug),加入LDS Sample Buffer,SampleReducing Agent后配制为相同终浓度蛋白,95℃蛋白变性5min,-80℃保存。
5.4.2.电泳
将预制胶取出后放置于电泳槽中,倒入1*电泳缓冲液(内槽液高于外槽液),按10-20ul/孔的上样量加样,140V恒压电泳,至溴酚蓝染料跑至凝胶末端时停止电泳。
5.4.3.转膜
(1)在甲醇溶液中活化PVDF膜
(2)按照从负极到正极:海绵-三层滤纸-蛋白胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵的结构组装转膜夹。
(3)将转膜槽移入4℃层析柜内,100V恒压转膜。
5.4.4.封闭
转膜结束后将膜放入5%脱脂奶粉中室温封闭1h。
5.4.5.孵育一抗
TBST洗去膜上残留的奶粉后,按照抗体说明书稀释一抗,将膜放入一抗中4℃封闭过夜。
5.4.6.孵育二抗
(1)用TBST漂洗膜5次,每次5min。
(2)按照抗体说明书稀释二抗,将膜放于二抗中室温孵育1h。
(3)二抗孵育结束后,用TBST漂洗膜3次,每次10min。
5.4.7.显影
将显影液A液和B液按照体积比1:1混合后,均匀滴加至膜表面,室温避光孵育数分钟后利用自动显影仪显影。
6.小鼠葡萄糖耐受实验(Glucose tolerance test,GTT)
6.1实验试剂
(1)葡萄糖:Biosharp。
(2)生理盐水:四川科伦药业股份有限公司。
6.2实验仪器
(1)血糖试纸,血糖仪:三诺。
6.3溶液配制
(1)葡萄糖溶液(0.25g/mL):称取2g葡萄糖溶解于8mL生理盐水中。
6.4实验步骤
(1)小鼠实验前禁食6h。
(2)禁食结束后称量小鼠体重,尾静脉采血测定基础血糖并收集血液样品。
(3)按小鼠体重2g/kg剂量腹腔注射葡萄糖溶液(0.25g/mL)。
(4)注射葡萄糖溶液后15min,30min,60min,90min和120min尾静脉采血测定血糖。注射后15min,30min和60min尾静脉采血收集血样测定胰岛素。
7.葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(Glucose stimulates insulin secretion,GSIS)
7.1实验试剂
(1)NaCl,KCl,KH2PO4,MgSO4,HEPES,CaCl2,NaHCO3:生工生物工程(上海)股份有限公司。
(2)牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA):Biosharp。
7.2溶液的配制
(1)SAB缓冲液(Secretion Assay Buffer):
调节pH值至7.2,0.22μM滤器过滤除菌后4℃保存,现用现配
(2)SAB缓冲液(2.8Mm,11.1mM,16.7mM葡萄糖):分别称取50.4mg,200mg,300.9mg葡萄糖溶于100mL SAB缓冲液中,0.22μM滤器过滤除菌,4℃保存,现用现配。
7.3实验步骤
(1)将INS-1细胞种于6孔板中,培养过夜。
(2)次日将培养液吸去后,用预热的SAB漂洗细胞两次。
(3)每个6孔板中加入2mL SAB缓冲液(2.8mM葡萄糖)预处理2h。
(4)预处理结束后,吸去SAB缓冲液(2.8mM葡萄糖),分别在不同孔板中加入1mL含2.8mM,11.1mM和16.7mM葡萄糖的SAB缓冲液糖刺激细胞1h。
(5)糖刺激结束后,小心吸取培养液上清,利用酶联免疫吸附法测定胰岛素含量。收集细胞提取总蛋白,利用WesternBlot鉴定tau蛋白的表达量
8.Nocodazole刺激INS-1细胞分泌胰岛素实验
8.1实验试剂
(1)Nocodazole:Sigma-Aldrich。
8.2试剂的配制
(1)10mg/mL Nocodazole:称取2mg Nocodazole溶解于200μL DMSO中,0.22μM滤器过滤除菌后-80℃保存。
8.3实验步骤
(1)将INS-1细胞种于6孔板中,培养过夜。
(2)次日将培养液吸去后,用预热的SAB缓冲液漂洗细胞两次。
(3)对照组孔板和实验组孔板内均中加入2mL SAB缓冲液(2.8mM葡萄糖)低糖预处理2h。
(4)低糖预处理后,吸取缓冲液,在不同孔板中分别加入1mL SAB培养液(2.8mM葡萄糖+10μg/mL Nocodazole)和1mLSAB培养液(16.7mM葡萄糖+10μg/mL Nocodazole)葡萄糖刺激1h。
(5)葡萄糖刺激结束后,吸取培养液上清,利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定胰岛素含量。
9.小鼠血浆和细胞上清液中胰岛素的测定
9.1实验试剂
(1)Mouse Insulin ELISA Kit(#90080):Crystal Chem。
(2)EDTA:生物工程(上海)股份有限公司。
9.2实验仪器
(1)全自动多功能微孔板检测仪(Cytation3MFV):Biotek。
9.3实验步骤
9.3.1.小鼠血浆样品的收集
提前用EDTA处理200μL PCR管,尾静脉采取血液后静置2h,2000rpm离心30min,吸取淡黄色上清液即为血浆,-80℃保存。
9.3.2.细胞培养液上清的收集
GSIS实验结束后,小心吸取培养液上清,1000rpm离心5min后,吸取上清液加入至新的1.5mL离心管中,-80℃保存。
9.3.3.小鼠血浆和细胞培养液上清中胰岛素的测定
(1)按照实验要求提前配制好标准品。
(2)每孔内加入95μL稀释液,再加入5μL标准品和样品。4℃中孵育2h。
(3)提前用Milli-Q水将Wash Buffer稀释成工作液。
(4)孵育结束后,每孔中加入200μL Wash Buffer清洗酶标板,最后一次拍干酶标板中残留的液体。
(5)每孔加入100μL工作液,室温孵育30min。
(6)重复步骤4。
(7)每孔加入100μL显色液,室温孵育40min。
(8)孵育结束后,每孔加入100μL终止液。在30min内使用酶联免疫检测仪检测450nm和630nm OD值。绘制标准曲线后,根据标准曲线计算样品种胰岛素的浓度。
10.小鼠胰腺局部注射水杨酸(salsalate,SSA)
10.1实验试剂
(1)SSA:Abcam。
(2)DMSO:MP。
10.2实验仪器
(1)小动物麻醉机(吸入式气体麻醉机):深圳市瑞沃德生命科技有限公司。
10.3溶液配制
(1)SSA溶液(67.7mg/mL):称取67.7mg SSA溶于1mL DMSO中,终浓度为67.7mg/mL,现用现配。
10.4实验步骤
(1)利用小动物麻醉剂麻醉小鼠,从小鼠左背侧剪开小鼠皮肤,暴露小鼠胰腺,将等量的DMSO和SSA溶液(225mg/kg)分别均匀注射到对照和实验组db/db小鼠胰腺内。
(3)利用一次性可吸收缝合线缝合小鼠。3天后利用Western Blot检测胰腺中tau蛋白的表达。
11.小鼠腹腔注射秋水仙素(Colchicine,Col)
11.1实验试剂
(1)Colchicine:生工生物工程(上海)股份有限公司。
(2)无水乙醇:成都市科隆化学品有限公司。
11.2溶液配制
(1)Colchicine溶液(0.3mg/mL):称取3mg Colchicine溶于10mL无水乙醇中,终浓度为0.3mg/mL。
11.3实验步骤
称量小鼠体重并记录小鼠基础血糖,用胰岛素针吸取Colchicine溶液(0.3mg/mL),,按1mg/kg的剂量腹腔注射Colchicine。禁食6h后进行GTT实验。
12.免疫荧光染色检测胰腺中tau蛋白,β-tublin和insulin的表达
12.1实验试剂
(1)PBS缓冲液,自发荧光淬灭剂,BSA,荧光二抗,DAPI,抗荧光淬灭封片剂,EDTA抗原修复缓冲液(pH8.0):Servicebio。
(2)多聚甲醛:Sigma-Aldrich。
(3)无水乙醇,二甲苯:国药集团化学试剂有限公司。
(4)tau(#ab80579),insulin(#ab7842),β-tubulin(#ab15568)抗体:Abcam
12.2实验仪器。
(1)脱水机(JJ-12J),包埋机(JB-P5),冻台(JB-L5):武汉俊杰电子有限公司。
(2)病理切片机(RM2016):上海徕卡仪器有限公司。
(3)组织摊片机(KD-P):浙江省金华市科迪仪器设备有限公司。
(4)烤箱(DHG-9140A):上海慧泰仪器制造有限公司。
(5)正置荧光显微镜(NIKON ECLIPSE C1),成像系统(NIKON DS-U3):日本尼康。
12.3溶液配制
(1)4%多聚甲醛溶液:称取40g多聚甲醛粉末,加入适量PBS溶液溶解,搅拌溶解后定容至1L。
12.4实验步骤
1.胰腺组织的处理
(1)小鼠处死后将四肢固定在平板上。
(2)用剪刀剪开小鼠皮肤,打开小鼠腹腔,找到小鼠脾脏,将脾脏轻轻提起,可见胰腺一端粘附在脾脏上,小心剥离,放入4%多聚甲醛溶液中固定。
(3)固定好的胰腺用流水冲洗,洗去残留的固定液。
(4)胰腺放入自动脱水机内脱水。
(5)利用石蜡包埋机包埋胰腺,冷固后将蜡块修理整齐。
(6)利用石蜡切片机以0.3μM的厚度切片,并将切片贴于载玻片上。
2.免疫荧光步骤
(1)石蜡切片脱蜡:依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。
(2)抗原修复:将切片置于EDTA抗原修复缓冲液(pH8.0)的中,于微波炉内加热进行抗原修复,自然冷却后将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。
(3)封闭:利用组化笔在组织周围画圈,滴加BSA室温封闭30min。
(4)一抗孵育:吸去抗体封闭液,按照抗体说明书稀释比例稀释一抗,4℃封闭过夜。
(5)二抗孵育:PBS洗涤玻片3次,每次5min。按照抗体说明书稀释比例稀释二抗,室温避光孵育50min。
(6)DAPI复染细胞核:PBS洗涤玻片3次,每次5min。滴加DAPI染液,避光室温孵育10min。
(7)淬灭组织自发荧光:PBS洗涤玻片3次,每次5min。滴加自发荧光淬灭剂5min,流水冲洗10min。
(8)封片:用抗荧光淬灭封片剂封片。
(9)镜检拍照:切片置于荧光显微镜下观察并采集图像。
13.统计学分析
实验数据采用Graphpad Prism软件进行处理。两组数据采用t-检验分析,两组以上数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA),全部数据采用平均数±标准误(Mean±SEM)表示,P<0.05表示数据具有统计差异性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.以tau蛋白或tau基因为靶点的试剂在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用,其特征在于,所述试剂具有如下作用中的一种或多种:
(1)抑制tau蛋白的活性;
(2)抑制tau基因和/或tau蛋白的表达;
(3)干扰tau蛋白的生物功能,干扰tau蛋白的生物功能是指促进微管解聚。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,具有抑制tau基因的表达作用的所述试剂为siRNA、shRNA、反义RNA、核酶或基因编辑载体。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,具有抑制tau蛋白的表达作用的所述试剂为SSA。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述基因编辑载体为CRISPR-Cas9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,具有抑制tau蛋白的活性作用的所述试剂为抗tau蛋白的抗体或其功能性片段。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,具有促进微管解聚作用的所述试剂为秋水仙素。
7.根据权利要求1-6任一项所述的应用,其特征在于,所述糖尿病的类型为Ⅱ型糖尿病。
8.一种设计或筛选用于预防或治疗糖尿病的药物的方法,其特征在于,该方法包括:从待筛选的化合物中选择具有如下作用中的一种或多种的化合物作为预防或治疗糖尿病的候选药物:
(1)抑制tau蛋白的活性;(2)抑制tau基因和/或tau蛋白的表达;(3)干扰tau蛋白的生物功能,干扰tau蛋白的生物功能是指促进微管解聚。
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