CN117946916A - 一种柠檬酸杆菌及其制剂与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种柠檬酸杆菌及其制剂与应用，属于生物修复技术领域。本发明在自然环境通过特定筛选方法获得一株具有去除六价铀功能的柠檬酸杆菌，其中该菌株的菌种保藏号为CGMCC No.40408，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还公开了一种利用该柠檬酸杆菌的制剂进行水体修复的方法，该方法在优选条件下能够达到最大的六价铀去除效率，铀的去除率达到最大值91.7％。
Description
技术领域
本发明涉及生物修复技术领域，尤其涉及一种柠檬酸杆菌及其制剂与应用。
背景技术
铀是元素周期表中放射性最强的锕系元素，同时也是一种具有高化学毒性的物质。它对生态环境和人类健康的危害极大，因此需要采取有效的措施来控制其使用和排放。随着工业和核能的发展，对铀的需求不断增加，这导致了铀矿冶过程中地下水污染问题日益严重。在自然条件下，六价铀具有高溶解度和流动性，因此它能够迅速地扩散和迁移，对地下水和土壤造成严重污染。六价铀具有强放射性，长期暴露可能引发癌症、生殖问题和免疫系统问题等健康风险。其次，六价铀在自然条件下具有高溶解度和流动性，容易扩散和迁移，对地下水和土壤造成严重污染。此外，六价铀在血液中主要与HCO3 -结合，易于扩散并主要沉积在肾脏，而六价铀化合物对肾有选择性毒性，可能造成肾小管上皮细胞损伤。因此，我们需要采取有效的措施来减少铀矿冶过程中对地下水的污染，保护生态环境和人类健康。
目前，针对铀污染废水的修复技术多种多样，涵盖了物理、化学和生物方法等多个领域。针对铀污染废水的修复技术，除了生物方法外，还包括物理和化学方法。物理修复技术主要包括吸附法、膜分离法和蒸发法等。吸附法是利用各种具有吸附作用的材料，如活性炭、树脂、矿物等，将废水中的铀离子吸附去除。膜分离法则是利用半透膜，使铀离子在压力驱动下透过膜，从而实现净化。蒸发法则是通过加热将废水蒸发，以浓缩和回收，但是物理修复技术中的吸附剂和膜容易饱和，需要定期更换或再生，增加了处理成本。化学修复技术主要包括沉淀法和氧化还原法。沉淀法是通过向废水中添加沉淀剂，使铀离子转化为不溶性沉淀物，再通过固液分离将其去除。氧化还原法则是利用氧化剂或还原剂将铀离子转化为无害或低毒性的形态，从而降低其对环境的影响，但是化学修复技术则可能引入新的化学物质，引发二次污染。同时，这些修复技术对于低浓度、大水体的铀污染处理可能不太经济有效。因此，需要一种解决上述问题的生物修复技术材料或方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种柠檬酸杆菌及其制剂与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种柠檬酸杆菌，所述菌株于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.40408，命名为柠檬酸杆菌Citrobactersp.DX1。
作为本发明所述菌株的优选实施方式，所述柠檬酸杆菌的16S rDNA如SEQID：NO.1序列所示。在NCBI数据库中对测定的DNA序列进行同源性比对，结果表明该菌株为Citrobacter属。
本发明的柠檬酸杆菌从自然环境中的土壤经特定筛选方法分离纯化而来，具有去除六价铀的能力。该柠檬酸杆菌能够快速地去除六价铀，从而有效地降低废水中的铀含量。这不仅可以提高铀的回收效率，还可以缩短处理时间，提高处理效率。本发明提供的柠檬酸杆菌Citrobacter sp.DX1对铀去除/铀去除的效率最高可达91.7％。
作为本发明所述菌株的优选实施方式，所述柠檬酸杆菌的应用包括以下a1)-a3)中的任一种：
a1)制备重金属污染水体的修复产品；
a2)用于修复铀污染水体；
a3)制备去除六价铀的生物制剂。
作为本发明应用的优选实施方式，a1)中所述重金属污染水体为铀污染的水体，进一步地，为六价铀污染的水体。
本发明的柠檬酸杆菌能够通过其生物吸附作用，将六价铀从水中去除。六价铀通常以溶解度较高的铀酰离子存在于水体中，这增加了其进入食物链的机会并可能对生物体造成更大的危害；六价铀不仅毒性大，而且不易被自然界的常规处理过程所去除，因此其积累可能对环境造成长期威胁。本发明通过柠檬酸杆菌其吸附铀离子的特性，实现铀污染废水的净化，从而减少重金属铀对水体生态系统的影响。
第二方面，本发明提供一种去除六价铀的生物制剂，包括一种柠檬酸杆菌，所述柠檬酸杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.40408。
作为本发明所述生物制剂的优选实施方式，所述柠檬酸杆菌在去除六价铀的生物制剂中的浓度为1.00×107CFU/mL-1.50×107CFU/mL；优选地，所述柠檬酸杆菌在去除六价铀的生物制剂中的浓度为1.25×107CFU/mL。
所述柠檬酸杆菌在去除六价铀的生物制剂中的浓度为1.25×107CFU/mL。所述去除六价铀的生物制剂中，每单位质量或每单位体积中含有柠檬酸杆菌的菌落总数为1.25×107CFU。将该菌株制成含菌量为1.25×107CFU/mL的菌悬液，可用于污水中六价铀的去除。在该柠檬酸杆菌的浓度下，所述去除六价铀的生物制剂对于铀的去除处理效果最佳，去除率为78.3％-91.7％，最终六价铀的去除处于动态平衡过程。
第三方面，本发明提供一种铀污染水体的修复方法，包括：向铀污染水体中投加所述去除六价铀的生物制剂进行处理。
作为本发明所述修复方法的优选实施方式，所述去除六价铀的生物制剂中所述柠檬酸杆菌的浓度为1.25×107CFU/mL；当所述铀污染水体中铀含量为20mg/L时，向铀污染水体中投加所述去除六价铀的生物制剂的体积比例为：铀污染水体体积：去除六价铀的生物制剂体积＝1mL：(0.1-0.2)mL。在上述铀污水浓度和生物制剂的柠檬酸杆菌浓度下，当铀污染水体体积：去除六价铀的生物制剂体积＝1mL：0.1mL时，所述铀的去除率达到最大值91.7％。
作为本发明所述修复方法的优选实施方式，投加所述去除六价铀的生物制剂前，调整所述铀污染水体的pH范围为7-9。优选地，所述去除六价铀的生物制剂适用pH为7。当投加所述去除六价铀的生物制剂前，调整所述铀污染水体的pH范围为7时，能够获得最佳的六价铀去除效率，最高达91.7％。
作为本发明所述修复方法的优选实施方式，所述去除六价铀的生物制剂在所述铀污染水体中的处理时间为7-10天。优选地，所述去除六价铀的生物制剂的处理时间为7天。本发明的所述修复方法在处理时间为7天时，其对六价铀的去除效率最大。
第四方面，本发明提供一种具有铀去除能力的微生物的筛选培养基，所述筛选培养基包括以下成分：基础培养基、硝酸铀酰溶液、微量金属液、抗坏血酸溶液和巯基乙酸钠溶液。
作为本发明所述筛选培养基的优选实施方式，所述硝酸铀酰溶液的浓度为1000mg/L；所述微量金属液中各成分按质量浓度包括：35.0mg/L CoCl2·6H2O、0.2mg/LCuCl2、6.0mg/L H3BO3、25.0mg/L MnCl2·4H2O、3.0mg/L Na2MoO4·2H2O、2.0mg/L NiCl2·2H2O、2.5mg/L ZnCl2；所述筛选培养基为液体培养基或固体培养基。
作为本发明所述筛选培养基的优选实施方式，所述硝酸铀酰溶液的浓度为1000mg/L。硝酸铀酰，亦称“硝酸双氧铀”，化学式为UO2(NO3)2·6H2O，其中硝酸铀酰中铀元素的化合价是+6价。本发明利用硝酸铀酰作为条件培养基的主要成分，能够模拟含六价铀污水的条件；通过高浓度的铀元素，筛选出那些能够利用硝酸铀酰作为能源或电子受体的微生物或者在铀污染环境中具有耐受性或降解能力的微生物。
作为本发明所述筛选培养基的优选实施方式，所述基础培养基的组成为：KH2PO4:0.5g/L，NH4Cl:1.0g/L，CaCl2·6H2O:0.06g/L，Na2SO4:4.5g/L，酵母浸膏:1.0g/L，MgSO4·7H2O:0.06g/L，Na3C6H5O7·2H2O:0.3g/L，C3H5O3Na:6g/L，FeSO4·7H2O:0.01g/L，刃天青:0.001g/L。
作为本发明所述筛选培养基的优选实施方式，所述抗坏血酸溶液的浓度为100g/L。抗坏血酸本身是一种能够清除自由基，减少氧化应激，从而保护细胞免受氧化损伤的物质。通过在条件培养基中加入一定量的抗坏血酸，能够作为电子供体，参与微生物的呼吸过程，为其提供能量。这有助于微生物在营养物质有限的环境中更好地生长。促进生长繁殖和对重金属的耐受性，有助于保护环境、治理污染和提高筛选获得的微生物的应用价值。
作为本发明所述筛选培养基的优选实施方式，所述巯基乙酸钠溶液的浓度为100g/L。在微生物的筛选中，能够巯基乙酸钠能够良好地缓冲培养基，使培养基的pH值不会发生明显的变化，从而保证微生物生长环境的稳定性；同时缓解高重金属含量对于微生物的毒性。
作为本发明所述筛选培养基的优选实施方式，能够利用上述筛选培养基进行厌氧培养，获得具有铀去除能力的微生物；所述具有铀去除能力的微生物为柠檬酸杆菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.40408。
进一步地，所述本发明所述筛选方法的优选实施方式，具体包括以下步骤：
(1)在自然环境中取土壤，对土壤中的微生物进行富集驯化培养，得到污泥悬液；
(2)用液体培养基对步骤(1)所述的污泥悬液在N2环境下重复进行筛选培养，得到混合液；
(3)用固体培养基对步骤(2)获得的混合液重复进行涂布培养，得到具有铀去除能力的微生物。
进一步地，步骤(2)中，所述筛选培养包括以下步骤：
(2a)将10mL污泥悬液加入液体培养基中，N2吹托20min后密封；在N2环境下置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到培养混合液；
(2b)取1mL培养混合液于新配置的液体培养基中进行新一轮培养，新一轮培养条件同步骤(2a)，重复培养至第七轮，获得第七轮的培养混合液。
进一步地，步骤(3)中，所述涂布培养包括以下步骤：
(3a)取步骤(2b)获得的第七轮的培养混合液，加入固体培养基中进行涂布培养，培养条件为30℃，20天，得到单菌落；
(3b)挑取步骤(3a)得到的单菌落接种到含液体培养基的血清瓶中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到待涂布的培养混合液；
(3c)将步骤(3b)得到的待涂布的培养混合液加入新配置的固体培养基中进行新一轮涂布培养，重复培养至第七轮，得到具有铀去除能力微生物的菌液。
本发明的筛选方法通过厌氧筛选模拟了铀污染废水中的重金属以及含氧量低的条件，能够进一步筛选出能够利用铀酸盐作为电子受体进行呼吸，从而对其进行去除的微生物；固体培养基可以提供更好的微生物生长的空间和限制，使微生物形成可见的菌落，方便计数和分离。通过多轮次的连续筛选，可以避免目标菌株经历适应性降低和衰退的过程。而连续筛选可以保持微生物的活力和适应性，避免了微生物铀去除能力衰退的问题。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明提供一种柠檬酸杆菌，所述柠檬酸杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.40408。所述柠檬酸杆菌具有将毒性大的六价铀从水体中去除的能力。该柠檬酸杆菌具有高效铀去除功能，在优选条件下，六价铀去除率最大为91.7％。
2.本发明提供一种具有铀去除能力的微生物的筛选培养基及筛选方法，通过所述筛选方法能够在普通生境中筛选出所需的微生物。本发明利用硝酸铀酰作为条件培养基的主要成分，能够模拟含六价铀污水的条件；通过高浓度的铀元素，筛选出那些能够利用硝酸铀酰作为能源或电子受体的微生物或者在铀污染环境中具有耐受性或降解能力的微生物。
3.本发明提供了一种去除六价铀的生物制剂和铀污染水体的修复方法；该生物制剂能够可用于污水中六价铀的去除。同时该产品制备及其应用方法简单，无需添加其他助剂一起使用造成水体的二次污染；该铀污染水体的修复方法能够利用特定的微生物菌种，能够快速去除水体中的六价铀，有效降低铀的浓度，达到修复铀污染水体的目的。与传统的物理化学方法相比，微生物修复方法在处理过程中产生的有害物质较少，对环境和人体健康的影响较小。该方法操作简单，对操作人员的技术要求较低，易于推广和应用。最终在20mg/L铀浓度的水体中对于六价铀的去除率最高达91.7％。
附图说明
图1为柠檬酸杆菌Citrobacter sp.DX1菌落形态图；
图2为不同反应条件下菌株除铀率，其中(a)为初始铀浓度对柠檬酸杆菌除铀性能的影响；(b)为pH值对柠檬酸杆菌除铀性能的影响；(c)为菌液投加量对柠檬酸杆菌除铀性能的影响；(d)为处理时间对柠檬酸杆菌除铀性能的影响。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1柠檬酸杆菌Citrobacter sp.DX1的筛选方法
从自然环境中分离纯化所述六价铀去除菌的步骤如下：
(1)于自然环境中取土壤100g，带回实验室后立即放置于4℃冰箱中保存备用；
(2)向体积为1000mL的开口玻璃瓶中加入900mL基础培养基，其中基础培养基的组成为：KH2PO4:0.5g/L，NH4Cl:1.0g/L，CaCl2·6H2O:0.06g/L，Na2SO4:4.5g/L，酵母浸膏:1.0g/L，MgSO4·7H2O:0.06g/L，Na3C6H5O7·2H2O:0.3g/L，C3H5O3Na:6g/L，FeSO4·7H2O:0.01g/L，刃天青:0.001g/L；
(3)向由步骤(2)得到的开口玻璃瓶中加入50g土壤，并用橡胶塞密封；然后置于温度为30℃的环境中，在转速为100r/min的条件下搅拌富集驯化培养，直至悬液变成墨汁色，瓶口有臭鸡蛋味。在培养期间定期更换基础培养基以维持玻璃瓶中营养物质充足供给；
(4)将90mL基础培养基、2mL质量浓度为1000mg/L的硝酸铀酰溶液、0.1mL微量金属液、0.1mL质量浓度为100g/L的抗坏血酸溶液和0.1mL质量浓度为100g/L的巯基乙酸钠溶液加入到250mL锥形瓶中，N2吹托20min，然后用橡胶塞密封，得到锥形瓶1A；其中微量金属液的组成为：CoCl2·6H2O:35mg·L-1，CuCl2:0.20mg·L-1，H3BO3:6.0mg·L-1，MnCl2·4H2O:25mg·L-1，Na2MoO4·2H2O:3.0mg·L-1，NiCl2·2H2O:2.0mg·L-1，ZnCl2:2.5mg·L-1；
(5)在N2环境下，将10mL由步骤(3)驯化得到的污泥悬液加入到锥形瓶1A中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶1B；
(6)将90mL基础培养基、2mL质量浓度为1000mg/L的硝酸铀酰溶液、0.1mL微量金属液、0.1mL质量浓度为100g/L的抗坏血酸溶液和0.1mL质量浓度为100g/L的巯基乙酸钠溶液加入到250mL锥形瓶中，N2吹托20min，然后用橡胶塞密封，得到锥形瓶2A；
(7)在N2环境下，将1mL锥形瓶1B中的混合液加入到锥形瓶2A中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶2B；
(8)将90mL基础培养基、2mL质量浓度为1000mg/L的硝酸铀酰溶液、0.1mL微量金属液、0.1mL质量浓度为100g/L的抗坏血酸溶液和0.1mL质量浓度为100g/L的巯基乙酸钠溶液加入到250mL锥形瓶中，N2吹托20min，然后用橡胶塞密封，得到锥形瓶3A；
(9)在N2环境下，将1mL锥形瓶2B中的混合液加入到锥形瓶3A中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶3B；
(10)将90mL基础培养基、2mL质量浓度为1000mg/L的硝酸铀酰溶液、0.1mL微量金属液、0.1mL质量浓度为100g/L的抗坏血酸溶液和0.1mL质量浓度为100g/L的巯基乙酸钠溶液加入到250mL锥形瓶中，N2吹托20min，然后用橡胶塞密封，得到锥形瓶4A；
(11)在N2环境下，将1mL锥形瓶3B中的混合液加入到锥形瓶4A中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶4B；
(12)将90mL基础培养基、2mL质量浓度为1000mg/L的硝酸铀酰溶液、0.1mL微量金属液、0.1mL质量浓度为100g/L的抗坏血酸溶液和0.1mL质量浓度为100g/L的巯基乙酸钠溶液加入到250mL锥形瓶中，N2吹托20min，然后用橡胶塞密封，得到锥形瓶5A；
(13)在N2环境下，将1mL锥形瓶4B中的混合液加入到锥形瓶5A中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶5B；
(14)将90mL基础培养基、2mL质量浓度为1000mg/L的硝酸铀酰溶液、0.1mL微量金属液、0.1mL质量浓度为100g/L的抗坏血酸溶液和0.1mL质量浓度为100g/L的巯基乙酸钠溶液加入到250mL锥形瓶中，N2吹托20min，然后用橡胶塞密封，得到锥形瓶6A；
(15)在N2环境下，将1mL锥形瓶5B中的混合液加入到锥形瓶6A中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶6B；
(16)将90mL基础培养基、2mL质量浓度为1000mg/L的硝酸铀酰溶液、0.1mL微量金属液、0.1mL质量浓度为100g/L的抗坏血酸溶液和0.1mL质量浓度为100g/L的巯基乙酸钠溶液加入到250mL锥形瓶中，N2吹托20min，然后用橡胶塞密封，得到锥形瓶7A；
(17)在N2环境下，将1mL锥形瓶6B中的混合液加入到锥形瓶7A中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶7B；
(18)向体积为1000mL的锥形瓶内加入450mL基础培养基、0.5mL微量金属液、0.5mL质量浓度为100g/L的抗坏血酸溶液、0.5mL质量浓度为100g/L的巯基乙酸钠溶液和7.5g琼脂，在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，冷却至60℃，然后在超净工作台中将其倒入到7个直径9cm的无菌培养皿中，冷却后得到培养皿1、培养皿2、培养皿3、培养皿4、培养皿5、培养皿6、培养皿7；
(19)在超净工作台中分别向培养皿1、培养皿2、培养皿3、培养皿4、培养皿5、培养皿6、培养皿7中加入0.5mL质量浓度为1000mg/L的硝酸铀酰溶液，来回倾斜转动培养皿使硝酸铀酰溶液均匀分布，将7个培养皿在超净工作台冷却后转移至厌氧手套箱，得到培养皿1A、培养皿2A、培养皿3A、培养皿4A、培养皿5A、培养皿6A、培养皿7A；
(20)分别向7个体积为250mL的血清瓶中加入98mL基础培养基，121℃灭菌后，放入厌氧手套箱，得到血清瓶1C、血清瓶2C、血清瓶3C、血清瓶4C、血清瓶5C、血清瓶6C、血清瓶7C；
(21)在厌氧手套箱中，分别向血清瓶1C、血清瓶2C、血清瓶3C、血清瓶4C、血清瓶5C、血清瓶6C、血清瓶7C中加入2mL质量浓度为质量浓度为1000mg/L的硝酸铀酰溶液、0.1mL微量金属液、0.1mL质量浓度为100g/L的抗坏血酸溶液和0.1mL质量浓度为100g/L的巯基乙酸钠溶液，摇匀后得到血清瓶1D、血清瓶2D、血清瓶3D、血清瓶4D、血清瓶5D、血清瓶6D、血清瓶7D；；
(22)在厌氧手套箱中将1mL锥形瓶7B中的混合液加入到培养皿1A中，来回倾斜转动培养皿使接种的菌液均匀分布，得到培养皿1B；将培养皿1B密封后，放入温度为30℃的培养箱中培养20天，得到培养皿1C；
(23)在厌氧手套箱中挑取培养皿1C中的菌落接种到血清瓶1D中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到血清瓶1E；
(24)在厌氧手套箱中将1mL血清瓶1E中的混合液加入到培养皿2A中，来回倾斜转动培养皿使接种的菌液均匀分布，得到培养皿2B；将培养皿2B密封后，放入温度为30℃的培养箱中培养20天，得到培养皿2C；
(25)在超净工作台中挑取培养皿2C中的菌落接种到血清瓶2D中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到血清瓶2E；
(26)在厌氧手套箱中将1mL血清瓶2E中的混合液加入到培养皿3A中，来回倾斜转动培养皿使接种的菌液均匀分布，得到培养皿3B；将培养皿3B密封后，放入温度为30℃的培养箱中培养20天，得到培养皿3C；
(27)在厌氧手套箱中挑取培养皿3C中的菌落接种到血清瓶3D中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到血清瓶3E；
(28)在厌氧手套箱中将1mL血清瓶3E中的混合液加入到培养皿4A中，来回倾斜转动培养皿使接种的菌液均匀分布，得到培养皿4B；将培养皿4B密封后，放入温度为30℃的培养箱中培养20天，得到培养皿4C；
(29)在厌氧手套箱中挑取培养皿4C中的菌落接种到血清瓶4D中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到血清瓶4E；
(30)在厌氧手套箱中将1mL血清瓶4E中的混合液加入到培养皿5A中，来回倾斜转动培养皿使接种的菌液均匀分布，得到培养皿5B；将培养皿5B密封后，放入温度为30℃的培养箱中培养20天，得到培养皿5C；
(31)在厌氧手套箱中挑取培养皿5C中的菌落接种到血清瓶5D中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到血清瓶5E；
(32)在厌氧手套箱中将1mL血清瓶5E中的混合液加入到培养皿6A中，来回倾斜转动培养皿使接种的菌液均匀分布，得到培养皿6B；将培养皿6B密封后，放入温度为30℃的培养箱中培养20天，得到培养皿6C；
(33)在厌氧手套箱中挑取培养皿6C中的菌落接种到血清瓶6D中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到血清瓶6E；
(34)在厌氧手套箱中将1mL血清瓶6E中的混合液加入到培养皿7A中，来回倾斜转动培养皿使接种的菌液均匀分布，得到培养皿7B；将培养皿7B密封后，放入温度为30℃的培养箱中培养20天，得到培养皿7C；
(35)在厌氧手套箱中挑取培养皿7C中的菌落接种到血清瓶7D中，然后置于温度为30℃转速为150r/min的振荡器中培养7天，得到血清瓶7E；血清瓶7E中的菌液即包括高效六价铀的纯菌种。
对所述六价铀的纯菌种进行鉴定，菌株的16S rDNA测序由北京博迈德基因技术有限公司完成，测得的菌株16s r DNA如序列表中SEQ ID：NO.1序列所示，在NCBI数据库中对测定的DNA序列进行同源性比对，结果表明该菌株为Citrobacter属。培养基上多次涂布培养后，得到纯菌，菌落形态如图1所示。菌落呈点状分布，浅黄色，中间有突起，不透明，边缘不整齐。
实施例2
分离纯化得到的六价铀的菌种柠檬酸杆菌Citrobacter sp.DX1制成菌悬液，含菌量为1.25×107CFU/mL，进行六价铀的去除试验。在50mL含铀废水体系中，所述含铀废水体系中pH＝7，菌液投加量为2mL，反应时间为3天，含铀废水体系中初始铀含量为20mg/L。检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率为78.3％。
实施例3
分离纯化得到的六价铀的菌种柠檬酸杆菌Citrobacter sp.DX1制成菌悬液，含菌量为1.25×107CFU/mL，进行六价铀的去除试验。在50mL含铀废水体系中，所述含铀废水体系中pH＝7，菌液投加量为5mL，反应时间为3天，含铀废水体系中初始铀含量为20mg/L。检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率为87.8％。
实施例4
分离纯化得到的六价铀的菌种柠檬酸杆菌Citrobacter sp.DX1制成菌悬液，含菌量为1.25×107CFU/mL，进行六价铀的去除试验。在50mL含铀废水体系中，所述含铀废水体系中pH＝7，菌液投加量为5mL，反应时间为7天，含铀废水体系中初始铀含量为20mg/L。检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率为91.7％。
实施例5
实施例5进行六价铀的去除试验时，设置所述含铀废水体系的pH＝8，其余方法和条件同实施例2，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(b)所示，所述铀的去除率为70.9％。
实施例6
实施例6进行六价铀的去除试验时，设置所述含铀废水体系的pH＝9，其余方法和条件同实施例2，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(b)所示，所述铀的去除率为72.0％。
实施例7
实施例7进行六价铀的去除试验时，设置菌液投加量为3.0mL，其余方法和条件同实施例3，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(c)所示，所述铀的去除率为80.1％。
实施例8
实施例8进行六价铀的去除试验时，设置菌液投加量为10.0mL，其余方法和条件同实施例3，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(c)所示，所述铀的去除率为86.9％。
实施例9
实施例9进行六价铀的去除试验时，设置菌液反应时间为5天，其余方法和条件同实施例4，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(d)所示，所述铀的去除率为79.7％。
实施例10
实施例10进行六价铀的去除试验时，设置菌液反应时间为9天，其余方法和条件同实施例4，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(d)所示，所述铀的去除率为90.4％。
对比例1
对比例1进行六价铀的去除试验时，所述初始铀浓度为5mg/L，其余方法和条件同实施例2，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(a)所示，所述铀的去除率为11.1％。
对比例2
对比例2进行六价铀的去除试验时，所述初始铀浓度为10mg/L，其余方法和条件同实施例2，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(a)所示，所述铀的去除率为60.8％。
对比例3
对比例3进行六价铀的去除试验时，所述初始铀浓度为50mg/L，其余方法和条件同实施例2，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(a)所示，所述铀的去除率为39.1％。
对比例4
对比例4进行六价铀的去除试验时，所述初始铀浓度为100mg/L，其余方法和条件同实施例2，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(a)所示，所述铀的去除率为17.2％。
对比例5
对比例5进行六价铀的去除试验时，设置所述含铀废水体系的pH＝5，其余方法和条件同实施例2，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(b)所示，所述铀的去除率为13.7％。
对比例6
对比例6进行六价铀的去除试验时，设置所述含铀废水体系的pH＝6，其余方法和条件同实施例2，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(b)所示，所述铀的去除率为40.1％。
对比例7
对比例7进行六价铀的去除试验时，设置菌液投加量为0.5mL，其余方法和条件同实施例3，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(c)所示，所述铀的去除率为31.3％。
对比例8
对比例8进行六价铀的去除试验时，设置菌液投加量为1.0mL，其余方法和条件同实施例3，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(c)所示，所述铀的去除率为60.7％。
对比例9
对比例9进行六价铀的去除试验时，设置菌液反应时间为3天，其余方法和条件同实施例4，检测反应后的水体中的铀含量，所述铀的去除率如图2(d)所示，所述铀的去除率为48.9％。
根据图2(a)、实施例2和对比例1-4的结果显示，铀污染水体中初始铀浓度在10mg/L-30mg/L时，六价铀的去除率在60％以上。但随着初始铀浓度增加，柠檬酸杆菌对铀的处理效果下降。当铀污染水体中初始铀浓度在20mg/L时，柠檬酸杆菌对铀的去除率达到最大值，说明该铀初始浓度下，柠檬酸杆菌能够最大化通过其生物吸附作用去除六价铀，铀的去除率达到最大值78.3％。
根据图2(b)、实施例2、实施例5-6和对比例5-6的结果显示，当铀污水的pH小于7时处于酸性环境时，柠檬酸杆菌对六价铀的去除率较低；而当铀污水pH大于7时，柠檬酸杆菌对于六价铀的去除率均达到70％-75％，其中当铀污水pH＝7时，具有最好的处理效果，达到78.3％。
根据图2(c)、实施例3、实施例7-8和对比例7-8的结果显示，在修复产品中柠檬酸杆菌浓度为1.25×107CFU/mL，且柠檬酸杆菌中初始铀浓度在20mg/L时，修复产品的投加量在3-10mL有较好的效果。当投加量低于3mL时，柠檬酸杆菌的浓度不足以对六价铀进行高效处理；投加量在3mL-5ml时，处理率在80％-90％左右；而随着投加量的增加至大于5mL时，所述柠檬酸杆菌对六价铀的处理效率均达到85％左右，并最终达到动态平衡。其中在投加量为5mL时，铀的去除率达到最大值87.8％。
根据图2(d)、实施例4、实施例9-10和对比例9的结果显示，在优选浓度和条件下，当处理时间在3-5天时，随着修复产品的处理时间增加，柠檬酸杆菌对六价铀的处理效率增强；当处理时间在5-10天时，柠檬酸杆菌对六价铀的处理效率达到80％以上；当处理时间在第7天时，柠檬酸杆菌对六价铀的处理效率达到最大值91.7％；之后铀的去除一直处于动态平衡过程，对六价铀的处理效率维持在85％-90％左右。
综上所述，在50mL铀污染水体中，当去除六价铀的制剂中柠檬酸杆菌浓度为1.25×107CFU/mL，且铀污染水体中初始铀浓度在20mg/L时，调整铀污染水体pH为7，并向铀污染水体中投加5mL浓度为1.25×107CFU/mL的修复产品，处理时间在7天即可达到最佳的六价铀去除效果，去除率达到最大值91.7％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种柠檬酸杆菌，其特征在于，所述菌株于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.40408，命名为柠檬酸杆菌Citrobacter sp.DX1。
2.如权利要求1所述的柠檬酸杆菌，其特征在于，所述柠檬酸杆菌的16SrDNA如SEQ ID：NO.1序列所示。
3.一种去除六价铀的生物制剂，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的柠檬酸杆菌Citrobacter sp.DX1。
4.如权利要求3所述的生物制剂，其特征在于，所述去除六价铀的生物制剂中柠檬酸杆菌的浓度为1.00×107CFU/mL-1.50×107CFU/mL；优选地，所述去除六价铀的生物制剂中柠檬酸杆菌的浓度为1.25×107CFU/mL。
5.一种铀污染水体的修复方法，其特征在于，包括：向铀污染水体中投加权利要求3所述的去除六价铀的生物制剂进行处理。
6.如权利要求5所述的修复方法，其特征在于，所述去除六价铀的生物制剂中所述柠檬酸杆菌的浓度为1.25×107CFU/mL；当所述铀污染水体中铀含量为20mg/L时，向铀污染水体中投加所述去除六价铀的生物制剂的体积比例为：
铀污染水体体积：去除六价铀的生物制剂体积＝1mL：(0.1-0.2)mL。
7.如权利要求5所述的修复方法，其特征在于，投加所述去除六价铀的生物制剂前，调整所述铀污染水体的pH范围为7-9。
8.如权利要求5所述的修复方法，其特征在于，所述去除六价铀的生物制剂在所述铀污染水体中处理时间为7-10天。
9.一种具有铀去除能力的微生物的筛选培养基，其特征在于，所述筛选培养基包括以下成分：基础培养基、硝酸铀酰溶液、微量金属液、抗坏血酸溶液和巯基乙酸钠溶液；所述具有铀去除能力的微生物为权利要求1-2任一项所述的柠檬酸杆菌Citrobacter sp.DX1。
10.如权利要求9所述的筛选培养基，其特征在于，所述硝酸铀酰溶液的浓度为1000mg/L；所述微量金属液中各成分按质量浓度包括：35.0mg/L CoCl2·6H2O、0.2mg/L CuCl2、6.0mg/L H3BO3、25.0mg/L MnCl2·4H2O、3.0mg/L Na2MoO4·2H2O、2.0mg/L NiCl2·2H2O、2.5mg/L ZnCl2；所述筛选培养基为液体培养基或固体培养基。
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