CN117946870A - 一种高产球孢白僵菌胞外多糖的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物多糖技术领域，具体涉及一种高产球孢白僵菌胞外多糖的菌株及其应用。本发明通过T‑DNA插入的方法获得球孢白僵菌随机插入突变体库，结合苯酚‑硫酸法筛选得到一株高产胞外多糖的突变菌株，并将其命名为T‑BbPeps。该菌株能够在常规PDB培养基中高产球孢白僵菌胞外多糖(Bb‑EPS)，与野生型球孢白僵菌相比，其发酵液中胞外多糖Bb‑EPS产量提高450倍，产量达到500‑650mg/L，为球孢白僵菌胞外多糖的规模化生产打下基础。同时，本发明针对Bb‑EPS建立了高效、简便的高纯度多糖的生产提纯方法，为球孢白僵菌胞外多糖的大量合成及提纯提供了一个经济、高效的方案。
Description
技术领域
本发明属于微生物多糖技术领域，具体涉及一种高产球孢白僵菌胞外多糖的菌株及其应用。
背景技术
多糖是普遍存在于动植物及微生物中的一类大分子，研究发现其具有广泛的生物活性，能够抗肿瘤、抗放射、抗炎，同时还具有抗衰老、降血脂、降血糖以及促进伤口愈合等重要功能，已成为一种良好的生物效应调节剂，因而成为近年来研究的热点。其中，微生物多糖在细胞内主要有三种存在形式：①黏附在细胞表面上，即胞壁多糖；②分泌到培养基中，即胞外多糖(Extracellular polysaccharides，EPS)；③构成微生物细胞的成分，即胞内多糖；而其中的胞外多糖具有产生量大、易于与菌体分离、可通过深层发酵实现工业化生产优势。微生物胞外多糖是微生物在生长过程中为适应周围环境的变化产生的一种对自身具有保护作用的生物高聚物。微生物胞外多糖和植物多糖相比较具有以下优势：①生产周期短，不受季节、地域、病虫害等条件的限制；②具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景；③应用广泛。目前已有多种微生物胞外多糖已经发展成为一类新型的发酵产品，作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、保湿剂、胶凝剂、悬浮剂等广泛应用于石油、化工、食品和制药等多个领域。近年来有关海洋微生物和乳酸菌微生物胞外多糖研究活跃，不断有新型多糖结构被鉴定。微生物多糖作为天然活性大分子，在生物医药领域的潜在应用价值也日益受到人们的广泛关注。新菌种的进一步探索成为新型胞外多糖的一个重要来源。
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种昆虫病原真菌，能够产生多种天然活性产物，包括白僵菌素、卵孢素、纤细素、激素、抗菌肽、多糖等，因此其侵染家蚕后形成的白僵蚕作为传统中药已有2000年历史，其具有息风止痉，祛风止痛，消痰散结等功效。研究表明球孢白僵菌多糖也是僵蚕发挥药效的重要组分，但在实验室常规培养条件下，球孢白僵菌无法产生或只产生极少量的胞外多糖，因此无法实现球孢白僵菌多糖的规模化生产。
随机突变结合定向筛选是获得天然产物高产菌株的常用方法，目前已有多种产物通过随机突变获得高产菌株，例如非达霉素生产菌株及吡咯喹啉醌高产菌株等。鉴于多糖的应用价值较高，如果能够通过随机突变获得球孢白僵菌多糖高产菌株，对于多糖的大规模生产无疑意义重大的。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明通过农杆菌介导的T-DNA插入获得大量突变体，并结合苯酚-硫酸显色法，筛选能够高效产生多糖的突变体，最终获得一株能够高效合成真菌胞外多糖的菌株，该突变菌株与野生型相比，其发酵液中胞外多糖的产量可提高450倍，产量达到500-650mg/L，有望用于真菌多糖的大量生物合成，解决球孢白僵菌多糖产量低，无法大规模生产等问题。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了一株高产胞外多糖的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)T-BbPeps菌株，所述T-BbPeps菌株于2023年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No:64180；所述T-BbPeps菌株的ITS(Internal Transcribed Spacer)序列如SEQ IDNo：1所示。
本发明第二方面提供了第一方面所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)T-BbPeps菌株在制备微生物胞外多糖中的应用。
本发明通过T-DNA随机插入筛选得到一株高产真菌胞外多糖Bb-EPS的球孢白僵菌突变菌株，命名为T-BbPeps，该突变体T-BbPeps与野生型球孢白僵菌相比，其发酵液中胞外多糖Bb-EPS产量提高450倍，产量达到500-650mg/L，为球孢白僵菌胞外多糖的规模化生产打下基础。
本发明第三方面提供了一种发酵制备胞外多糖的方法，具体为：先将第一方面所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)T-BbPeps菌株的分生孢子接种于培养基中，于24-28℃、180-300rpm下培养2-4d作为种子液，再将种子液置于于24-28℃、180-300rpm培养5-7d，即获得多糖发酵产物。
优选地，T-BbPeps菌株的分生孢子的获取方法为：将T-BbPeps菌株接种于PDA培养基中，24-28℃下培养7-10d。
优选地，T-BbPeps菌株的分生孢子在接种前先用0.05％吐温-80配制成分生孢子悬液，并调整浓度至1-9×107conidial/mL，所述分生孢子悬液与培养基的比例为80-200μL:50mL。
优选地，所述培养基选自PDB培养基。
优选地，获得多糖发酵产物后，还包括分离纯化步骤：先通过离心去除菌体，并通过Sevag法脱蛋白，进而通过乙醇沉淀法获得多糖，最后干燥多糖。
更优选地，通过Sevag法脱蛋白具体为：先将多糖产物与Sevag试剂混合，150-200rpm振荡1-3小时后7000-10000rpm离心7-15min，保留上清，获得脱蛋白多糖溶液。
更优选地，所述Sevag试剂为氯仿：正丁醇＝4:1(v/v)，所述多糖产物与Sevag试剂的体积比为4-6:1。
更优选地，通过乙醇沉淀法获得多糖具体为：在搅拌状态下往脱蛋白多糖溶液中加入无水乙醇，至乙醇体积分数为55-65％，于4℃静置沉淀8-12小时，即得多糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
常规培养条件下，球孢白僵菌无法产生或产生极少量的胞外多糖Bb-EPS。为此，本发明通过T-DNA插入的方法获得球孢白僵菌随机插入突变体库，结合苯酚-硫酸法筛选得到一株高产胞外多糖的突变菌株，并将其命名为T-BbPeps。该菌株能够在常规PDB培养基中高产球孢白僵菌胞外多糖(Bb-EPS)，与野生型球孢白僵菌相比，其发酵液中胞外多糖Bb-EPS产量提高450倍，产量达到500-650mg/L，为球孢白僵菌胞外多糖的规模化生产打下基础。同时，本发明针对Bb-EPS建立了高效、简便的高纯度多糖的生产提纯方法，为球孢白僵菌胞外多糖的大量合成及提纯提供了一个经济、高效的方案。
附图说明
图1为胞外多糖高产菌株的筛选及产量分析；(A)、(C)48孔板发酵液总糖含量测定；(B)、(D)培养瓶发酵液胞外多糖含量测定；(E)葡萄糖含量标准曲线。
图1中，WT菌株指野生型球孢白僵菌；T-BbPeps菌株指通过随机突变获得的球孢白僵菌胞外多糖高产菌株。
图2为胞外多糖高产菌株T-BbPeps的鉴定分析；(A)菌株T-BbPeps的菌落表型分析；(B)DNA测序比对结果。
图3为T-BbPeps菌株胞外多糖的发酵及提取过程。采用PDB为发酵培养基，接种T-BbPeps菌株，在26℃，200rpm条件下培养5d，获得发酵液经离心除去菌体，通过Sevag法脱蛋白后，调整乙醇浓度为60％获得多糖沉淀，并用真空冷冻干燥或加热烘干方法得到胞外多糖(Bb-EPS)。
图4为Bb-EPS的单糖组成分析；(A)标准单糖的HPLC分析(Man,D-Mannose；GlcA,D-Glucuronic acid；Glc,D-Glucose；Gal,D-Galactose)；(B)多糖Bb-EPS的单糖组分分析：多糖Bb-EPS的单糖组成为葡萄糖。
图5为Bb-EPS的红外吸收光谱。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
下列实施例涉及的培养基如下：
(1)YEB培养基(农杆菌转化)：
胰蛋白胨10g，酵母提取物1g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g，加ddH2O定容至1L；固体培养基添加15g琼脂粉，按需加入相应抗生素。
(2)球孢白僵菌产孢及发酵培养基：
PDB成品培养基24g，加ddH2O定容至1L；固体培养基添加15g琼脂粉。
(3)球孢白僵菌转化IM培养基：
MES 7.8g，NaCl 0.3g，K2HPO4 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，甘油5mL，加ddH2O定容至1L，调pH至5.3，灭菌后待培养基冷却到60℃，加入过滤灭菌的1M葡萄糖10mL(固体培养基减半)，200mM AS100μL；固体培养基添加15g琼脂粉。
(4)球孢白僵菌筛选CZA培养基：
蔗糖30g，胰蛋白胨2.5g，NaNO3 3g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.001g，K2HPO41g，KCl 0.5g，加ddH2O定容至1L，pH调至7.0；固体培养基添加15g琼脂粉，按需加入相应抗生素。
实施例1高产球孢白僵菌胞外多糖的菌株的筛选鉴定
1、球孢白僵菌T-DNA插入突变体库的构建
1.1、pK2-Sur质粒转化根癌农杆菌
(1)取农杆菌感受态细胞AGL-1(购自擎科生物公司)冰上自然融化，并在冰上预冷电击杯。
(2)待感受态细胞融化后用移液器加入pK2-Sur质粒(西南大学生物技术中心提供)并用枪头搅拌混匀，质粒加入量为2-5μL，浓度为50ng/μL。
(3)用移液器将混有质粒的感受态细胞转入预冷的电击杯中，吹打混匀。
(4)调整电击仪参数，选择2.2KV电压进行电击转化。
(5)电击后，立即向电击杯中加入800μL YEB培养基，用移液器吹打混匀后，将菌液吸出转入1.5mL无菌离心管中，在28℃摇床中震荡培养2-4h复壮。
(6)待菌株复壮好后吸取50μL菌液涂布在含有卡那霉素(50μg/mL)和羧苄青霉素(50μg/mL)的YCK抗性固体培养基上，28℃倒置培养2d后筛选转化子。
1.2、根癌农杆菌介导的球孢白僵菌遗传转化
(1)将含有pK2-Sur质粒的根癌杆菌菌株AGL-1接种在添加卡那霉素(50μg/mL)和羧苄青霉素(50μg/mL)的YEB培养基中，置于28℃摇床上培养12-20h，待菌液浓度在OD600达到0.5左右时，取出备用。
(2)取10mL农杆菌菌液5000rpm离心5min，去上清保留沉淀。用10mL IM培养基(MES7.8g/L，MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 0.3g/L，NaCl 0.3g/L，甘油0.5％v/v，葡萄糖10mM，乙酰丁香酮200μm)悬浮农杆菌，并将菌悬液稀释至OD660＝0.15。
(3)将稀释好的菌悬液置于28℃摇床避光培养6h。
(4)在农杆菌诱导培养期间准备球孢白僵菌分生孢子悬液，以PDA培养基上26℃培养10d后的野生型球孢白僵菌(CGMCC 7.34,China General Microbiological CultureCollection Center)为材料，采集分生孢子分散于0.05％Tween-80中。通过四层擦镜纸过滤制备分生孢子悬液，血球计数调整孢悬液浓度为1×105conidia/mL。
(5)待农杆菌诱导完成后，将分生孢子悬液与农杆菌悬液等体积混合。取100μL菌株混合液涂布在铺有醋酸纤维素膜的IM固体培养基上，置于26℃避光培养2d。
(6)共培结束后将涂布有菌的醋酸纤维素膜转移到筛选培养基中，筛选培养基主要以CZA为基础培养基，并根据载体抗性标记添加不同抗生素。本实验以Sur为抗性标记添加10μg/mL氯嘧磺隆(Sulfonylurea)，同时为了抑制农杆菌的生长，在培养基中加入头孢噻肟(500μg/mL)。筛选培养于26℃下进行，共培养4～5d，直到有抗性菌落出现。
(7)选取具有抗性的单菌落分别转移到48孔CZA培养基上，26℃培养3-4d，直至菌落可见后待进一步筛选。
1.3、球孢白僵菌胞外多糖Bb-EPS高产菌株T-BbPeps的筛选
(1)48孔板微量发酵
准备48孔板，每孔加入1.5mL PDB液体培养基，用牙签挑取少量随机插入突变体的菌丝，接种于48孔板中，密封盖子，防止干燥，于26℃、80rpm条件下摇培7d后，保留发酵液待测。
(2)苯酚-硫酸法检测发酵液总糖及胞外多糖含量
配制95.5％浓硫酸(分析纯)和5％苯酚(于棕色瓶4℃冰箱保存)。以葡萄糖标准溶液绘制糖含量标准曲线，如图1E，用苯酚-硫酸法测定总糖含量，方法如下：取步骤(1)中微孔板的发酵液100μL，加入500μL浓硫酸和100μL 5％苯酚，置于金属浴100℃下加热20min后取出，冰浴冷却，以WT菌株发酵液为空白，通过分光光度计在490nm的波长处测定吸光度，以筛选产糖含量高的菌株。
正常条件下反应液为深棕色，糖含量越高颜色越深，可初步通过肉眼辨别，并通过苯酚硫酸法进行显色，结果如图1A、C所示，最终筛选得到T-1、T-2两株产多糖较多的菌株。通过分光光度计在490nm的波长处测定吸光度，其中菌株T-2显色反应最明显，即多糖产量最高，将该菌株命名为T-BbPeps菌株，经测定T-BbPeps菌株对应的孔板发酵液中的糖含量为215mg/mL。最后将该菌株稀释涂布于Sur抗性培养基中，获得单菌落待进一步验证。
(3)T-BbPeps菌株的确认
首先在筛选得到的T-BbPeps菌株单菌落上挑取少量菌丝，配置分生孢子悬液，采用点接的方法于PDA培养基上26℃培养7d后获得单菌落，然后对菌落、菌丝形态进行观察，对获得的菌株进行初步鉴定。结果如图2A所示，该菌株的菌落形态与野生型球孢白僵菌的形态相符，均为白色菌落。同时，以NCBI中的Beauveria bassiana ARSEF 2860(GCF_000280675.1)菌株序列为参考合成引物ITS-1(ITS-1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS-4(ITS-4:TCCTCCGCTTATTGATATGC)，以T-BbPeps菌株DNA为模板进行扩增，将获得的片段进行测序，并将所测得的序列与ARSEF 2860菌株进行比对。结果如图2B所示，该菌株与ARSEF2860菌株的序列同源性为99.45％，进一步确定T-BbPeps菌株为球孢白僵菌。
T-BbPeps菌株的ITS序列(SEQ ID No：1)如下：
ATTACGGAGCTTTCACTCCCTAACCCTTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTGAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGAGGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGGACCCCGACGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAA。
最后，对菌株T-BbPeps进行保藏，保藏信息如下：保藏时间：2023年12月22日；保藏单位名称：广东省微生物菌株保藏中心(GDMCC)；保藏号：GDMCC No:64180；保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；分类命名：Beauveria bassiana。
实施例2球孢白僵菌胞外多糖Bb-EPS的生产及分析
1、球孢白僵菌胞外多糖Bb-EPS的发酵
(1)取培养7-10d所得球孢白僵菌气生菌丝于1.5mL离心管中，用0.05％(v/v)Tween-80配制成悬液，用无菌擦镜纸过滤，获得分生孢子悬浮液。
(2)用血球计数板计数并将孢子悬液浓度稀释到1×107conidia/mL，每50mL PDB液体培养基中接种100μL分生孢子悬浮液，26℃、200rpm培养3d作为种子液。
(3)准备1L三角瓶，每瓶盛300mL PDB培养基，高温高压灭菌(压力103.4kPa，温度121℃，维持15min)后每瓶接种5mL步骤(2)中的种子液，于26℃，200rpm条件下培养5-7d后8000rpm离心10min，弃沉淀即获得多糖发酵清液。
2、胞外多糖Bb-EPS的分离纯化及产量分析
选择野生型球孢白僵菌和T-BbPeps菌株，发酵生产胞外多糖Bb-EPS，并对野生型球孢白僵菌和T-BbPeps菌株产生的Bb-EPS进行分离纯化，具体工艺流程如图3所示。先通过离心去除菌体，并通过Sevag法脱蛋白，进而通过乙醇沉淀法获得多糖，进一步通过真空冷冻干燥或加热方式干燥多糖样品。具体操作如下：
(1)多糖溶液脱蛋白处理
三氯甲烷等有机溶剂可以使蛋白质变性，利用这一特点可将蛋白变性后离心去除，该方法条件温和，不会引起多糖的变性。具体方法如下：先配制Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1(v/v)，然后将多糖提取液与Sevag试剂以5:1的体积比混合，180rpm振荡1-2小时后8000rpm离心10min，变性后的蛋白质介于提取液与Sevag试剂交界处，保留上清，重复该步骤3次，获得脱蛋白多糖溶液。
(2)乙醇分级沉淀多糖
多糖因结构和分子量差异，在乙醇中的溶解度不同，可以逐渐增加乙醇浓度，将多糖按分子量从大到小沉淀出来。往脱蛋白后的多糖溶液中加入磁力转子，在磁力搅拌器上一边搅拌，一边加入无水乙醇，至乙醇体积分数为60％，于4℃静置过夜，大量粗多糖沉淀出来。离心获得沉淀并采用真空冷冻进行干燥，待胞外粗多糖Bb-EPS完全干燥后，分别对WT和T-BbPeps菌株发酵产生的多糖通过苯酚-硫酸法测定含量。结果如图1B、1D所示，WT胞外粗多糖Bb-EPS的产量为1.5mg/L，T-BbPeps菌株胞外粗多糖Bb-EPS的产量为675mg/L，T-BbPeps菌株产量较WT提高约450倍。
3、球孢白僵菌胞外多糖Bb-EPS的初步鉴定
获得多糖样品后，对样品纯度及组分进行初步鉴定，首先通过2M三氟乙酸将多糖完全水解，再通过柱前1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生法测定多糖的单糖组成。结果显示，球孢白僵菌胞外多糖Bb-EPS由葡萄糖组成(图4)。进一步对多糖进行了傅里叶红外光谱测定，结果说明胞外多糖Bb-EPS由具有β构型的吡喃糖组成(图5)。具体操作方法如下：
(1)多糖的单糖组成鉴定
将多糖经三氟乙酸完全水解后，采用柱前衍生法分析多糖的单糖组成，具体方法如下：
1)单糖标准溶液的制备：分别精密称取4种单糖(D-Mannose；D-Glucuronic acid；D-Glucose,D-Galactose)各10mg，分别溶于水中配置成质量浓度约为10mg/L的单糖溶液。并分别取75μL D-Glucose，50μL D-Mannose，25μL D-Glucuronic acid，25μL D-Galactose混合后转移至5mL顶空瓶中，先加入200μL 0.5mol/L NaOH混匀，再加入200μL 0.5mol/LPMP甲醇溶液(现配现用)，移液枪混匀后于70℃烘箱反应1h，反应完全后冷却至室温，再加入200μL 0.5mol/L HCl溶液调pH值至中性。混匀后加1.00mL三氯甲烷，涡旋1min，于8000rpm离心5min，弃下层液萃取掉过多的PMP，此操作重复3次，保留上层清液待测。
2)供试品溶液的制备：准确称取5mg球孢白僵菌胞外多糖Bb-EPS于2mL水中过夜溶解，8 000r/min离心5min后取1mL多糖样品于顶空瓶中，再加入2.00mL三氟乙酸(2.00mol/L)，迅速密封，在110℃下水解5h，冷却至室温后用5mol/L NaOH调pH至7.0，并定容至5mL备用。取200μL多糖水解液至5mL顶空瓶中，先加入200μL 0.5mol/L NaOH混匀，再加入200μL0.5mol/L PMP甲醇溶液(现配现用)，移液枪混匀后于70℃烘箱反应1h，反应完全后冷却至室温，再加入200μL 0.5mol/L HCl溶液调pH值至中性。混匀后加1.00mL三氯甲烷，涡旋1min，于8000rpm离心5min，弃下层液萃取掉过多的PMP，此操作重复3次，保留上层清液待测。
3)色谱条件：色谱柱为岛津ODS-3(150mm×4.6mm，5μm)；配备PDA检测器；流动相为50Mmol/L磷酸盐缓冲液-乙腈(81∶17)，等度洗脱，柱温为30℃；流速为1.0mL/min；检测波长为249nm；进样量为10μL。
结果如图4所示，显示球孢白僵菌胞外多糖Bb-EPS的单糖组成为葡萄糖。
(2)多糖的红外光谱测定
红外光谱可以检测不同官能团的特征吸收来判定多糖的结构。将多糖样品冷冻干燥后直接经压片机制成薄片，于400-4000cm-1波数下扫描，获得红外光谱图(图5)。
由图5可知该物质具有典型的多糖红外吸收峰，波数在3322cm-1处有较强的O-H伸缩振动，在2938cm-1处有CH3、CH2、CH等基团的C-H伸缩振动，其伸缩振动相对较弱，在波数1633cm-1处有C＝O伸缩振动，波数1031cm-1、892cm-1有吸收峰，证明多糖中单糖由吡喃环特征糖组成，其中波数为1031cm-1处有非常强的振动，证明多糖的组成为葡萄糖，在892cm-1处有弱的振动，证明糖苷键的组成类型为β构型。上述结果表明，该多糖是由具有β构型的吡喃糖组成。
综上可见，本发明通过农杆菌介导的T-DNA插入法建立突变体库，采用孔板液体发酵，结合苯酚-硫酸快速显色法，筛选能够高效产生多糖的突变体，最终获得一株能够高效合成真菌胞外多糖的菌株，并将其命名为T-BbPeps菌株，该突变菌株与野生型相比，显著提高了真菌胞外多糖的产量，为球孢白僵菌胞外多糖的规模化合成提供一个经济高效的方案。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一株高产胞外多糖的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)T-BbPeps菌株，其特征在于，所述T-BbPeps菌株于2023年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No:64180；所述T-BbPeps菌株的ITS序列如SEQ ID No：1所示。
2.权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)T-BbPeps菌株在制备微生物胞外多糖中的应用。
3.一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，先将权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)T-BbPeps菌株的分生孢子接种于培养基中，于24-28℃、180-300rpm下培养2-4天作为种子液，再将种子液置于24-28℃、180-300rpm培养5-7d，即获得多糖发酵产物。
4.根据权利要求3所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，T-BbPeps菌株的分生孢子的获取方法为：将T-BbPeps菌株接种于PDA培养基中，24-28℃下培养7-10d。
5.根据权利要求3所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，T-BbPeps菌株的分生孢子在接种前先用0.05％吐温-80配制成分生孢子悬液，并调整浓度至1-9×107conidial/mL，所述分生孢子悬液与培养基的比例为80-200μL:50mL。
6.根据权利要求3所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，所述培养基选自PDB培养基。
7.根据权利要求3所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，获得多糖发酵产物后，还包括分离纯化步骤：先通过离心去除菌体，并通过Sevag法脱蛋白，进而通过乙醇沉淀法获得多糖，最后干燥多糖。
8.根据权利要求7所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，通过Sevag法脱蛋白具体为：先将多糖产物与Sevag试剂混合，150-200rpm振荡1-3小时后7000-10000rpm离心7-15min，保留上清，获得脱蛋白多糖溶液。
9.根据权利要求8所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，所述Sevag试剂为氯仿：正丁醇＝4:1(v/v)，所述多糖产物与Sevag试剂的体积比为4-6:1。
10.根据权利要求7所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，通过乙醇沉淀法获得多糖具体为：在搅拌状态下往脱蛋白多糖溶液中加入无水乙醇，至乙醇体积分数为55-65％，于4℃静置沉淀8-12小时，即得多糖沉淀。
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