CN117946275A

CN117946275A - 用于早期检测子宫内膜异位症的特异性抗体及试剂盒

Info

Publication number: CN117946275A
Application number: CN202311789153.4A
Authority: CN
Inventors: 吕鹏; 李宝华; 潘晔; 施紫珺; 黄庆彤; 郑宇涵; 陈克平; 王慧英; 方杰
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2023-12-25
Filing date: 2023-12-25
Publication date: 2024-04-30

Abstract

本发明提供了一种用于早期检测子宫内膜异位症的特异性抗A1AT的Fab抗体及试剂盒，属于基因工程技术领域和医学检测领域。本发明利用真核细胞表达并纯化得到A1AT蛋白，经糖苷内切酶酶切得到A1AT亚型蛋白，并将其作为抗原用于免疫小鼠，提取脾细胞总RNA进行逆转录为cDNA，扩增得到Fab基因片段与噬菌体质粒pComb3Xλ连接后，构建抗A1AT Fab噬菌体抗体库，淘选富集得到亲和性高的噬菌体，表达纯化得到抗A1AT Fab抗体片段；同时本发明基于磁微粒‑吖啶酯的化学发光技术，构建了可以用于检测A1AT及其亚型的试剂盒，对早期子宫内膜异位症的检测有重要意义。

Description

用于早期检测子宫内膜异位症的特异性抗体及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于早期检测子宫内膜异位症的特异性抗体及试剂盒，属于基因工程技术领域和医学检测领域。

背景技术

子宫内膜异位症(Endometriosis)是一种流行性妇科疾病，患者的卵泡发育异常，卵子质量下降，卵巢结构被破坏，从而引起卵巢储备下降，卵巢加速衰老，最终影响卵巢功能，导致生育障碍。目前，子宫内膜异位症临床诊断最常见的是作为“金标准”的腹腔镜检查，属于侵入性诊断方式；影像分析可作为非侵入性的鉴别手段，但对于小于2mm病灶的敏感性和特异性较低；另有血液检测，通过检测血液中CA125水平达到诊断目的，但CA125水平无法作为早期子宫内膜异位症特异性诊断标准，且其水平易受激素药物的强烈影响，不利于临床辅助诊断。

α1-抗胰蛋白酶(Alpha-1 Antitrypsin,AIAT)，又称α1-蛋白酶抑制剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂A1，是一种单链糖蛋白，有两种主要的亚型结构，分别为糖基化修饰和未糖基化修饰。A1AT属于急性时相反应蛋白，其基因位于14号染色体上，会被炎症和感染过程中的副产物所激活，在急性反应期，A1AT水平会增加4倍，用于抗炎、免疫调节、抗感染和组织修复。A1AT作为最丰富的循环丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以保护组织免受炎症引起的蛋白水解性损伤，ISO-A1AT是A1AT的一种亚型，经研究证实ISO-A1AT在子宫内膜异位症患者的腹腔液中水平是升高的，在轻度子宫内膜异位症患者体内就能检测出显著变化，因此可能作为子宫内膜异位症诊断的生物标志物。因此，本领域迫切需要开发抗A1AT及其亚型的高特异性抗体，以A1AT作为生物标志物，对早期子宫内膜异位症进行诊断。

发明内容

针对子宫内膜异位症早期诊断存在的一些问题，本发明的目的在于提供一种用于早期检测子宫内膜异位症的特异性抗体及试剂盒。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案是：

本发明中利用真核细胞表达并纯化得到A1AT蛋白，经糖苷内切酶酶切得到A1AT亚型蛋白，并将其作为抗原用于免疫小鼠，对小鼠进行定期采血，用间接ELISA法测定其抗体效价及免疫效果；取最优效价小鼠脾脏，提取脾细胞总RNA进行逆转录为cDNA，以此为模板扩增得到Fab基因片段，所述Fab基因片段和噬菌体质粒pComb3Xλ连接后，通过电击构建抗A1AT Fab噬菌体抗体库，并进行淘选，富集得到亲和性高的噬菌体，表达纯化得到抗A1AT和A1AT亚型的Fab抗体片段。

本发明首先提供了一种用于早期检测子宫内膜异位症的特异性抗体，所述抗体包括抗A1AT和A1AT亚型的Fab抗体。

所述抗A1AT的Fab抗体，即能与A1AT特异性结合的Fab抗体，所述抗A1AT的Fab抗体包括Fab-1、Fab-2，所述Fab-1、Fab-2均由重链和轻链组成，所述重链的重链可变区具有三个互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链的轻链可变区具有三个互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3。

其中，所述抗体Fab-1的HCDR1的氨基酸序列为DTYMH(SEQ ID No:1)，HCDR2的氨基酸序列为RIDPANGNTKYDPKFQG(SEQ ID No:2)，HCDR3的氨基酸序列为RRYSMDY(SEQ ID No:3)；LCDR1的氨基酸序列为KASQSVSNDVA(SEQ ID No:4)，LCDR2的氨基酸序列为DASNRYT(SEQID No:5)，LCDR3的氨基酸序列为QQDHSFPYT(SEQ ID No:6)。

所述抗体Fab-1重链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:7)：

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMALEVKLMESGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCGRRRYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSAFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS

所述抗体Fab-1轻链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:8)：

FATVAQAAELDVLMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYDASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDHSFPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC

其中，所述抗体Fab-2的HCDR1的氨基酸序列为QTYEH(SEQ ID No:9)，HCDR2的氨基酸序列为RIDPCQTNTKYNPKTQG(SEQ ID No:10)，HCDR3的氨基酸序列为RRDSMDY(SEQ ID No:11)；LCDR1的氨基酸序列为KGSESVLDNVA(SEQ ID No:12)，LCDR2的氨基酸序列为DASNRNT(SEQ ID No:13)，LCDR3的氨基酸序列为HEDHSFWYT(SEQ IDNo:14)。

所述抗体Fab-2重链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:15)：

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMALEVKLMESGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKQTYEHWVKQRPEQGLEWIGRIDPCQTNTKYNPKTQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCGRRRDSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSAFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS

所述抗体Fab-2轻链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:16)：

FATVAQAAELDVLMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKGSESVLDNVAWYQQKPGQSPKLLIYDASNRNTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCHEDHSFWYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC

所述抗A1AT亚型的Fab抗体，即能与A1AT亚型(A1AT2)特异性结合的Fab抗体，所述抗A1AT亚型的Fab抗体包括Fab-3、Fab-4，所述Fab抗体均由重链和轻链组成，所述重链的重链可变区具有三个互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链的轻链可变区具有三个互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3。

其中，所述抗体Fab-3的HCDR1的氨基酸序列为DTGEH(SEQ ID No:17)，HCDR2的氨基酸序列为RLDPANGNTKYDPKFEG(SEQ ID No:18)，HCDR3的氨基酸序列为RRYWMNY(SEQ IDNo:19)；LCDR1的氨基酸序列为KQSASVSNNVA(SEQ ID No:20)，LCDR2的氨基酸序列为NASNRNT(SEQ ID No:21)，LCDR3的氨基酸序列为HQDHSFPYT(SEQ ID No:22)。

所述抗体Fab-3重链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:23)

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMALEVKLMESGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTGEHWVKQRPEQGLEWIGRLDPANGNTKYDPKFEGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCGRRRYWMNYWGQGTSVTVSSASTKGPSAFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS

所述抗体Fab-3轻链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:24)

FATVAQAAELDVLMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKQSASVSNNVAWYQQKPGQSPKLLIYNASNRNTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCHQDHSFPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC

其中，所述抗体Fab-4的HCDR1的氨基酸序列为NTYMH(SEQ ID No:25)，HCDR2的氨基酸序列为RIDWGDADTKYDWKFQG(SEQ ID No:26)，HCDR3的氨基酸序列为RRYSENY(SEQ IDNo:27)；LCDR1的氨基酸序列为KGSESVSDDVA(SEQ ID No:28)，LCDR2的氨基酸序列为NASDRNT(SEQ ID No:29)，LCDR3的氨基酸序列为HEDHSQPIT(SEQ ID No:30)。

所述抗体Fab-4重链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:31)

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMALEVKLMESGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKNTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDWGDADTKYDWKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCGRRRYSENYWGQGTSVTVSSASTKGPSAFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS

所述抗体Fab-4轻链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:32)

FATVAQAAELDVLMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKGSESVSDDVAWYQQKPGQSPKLLIYNASDRNTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCHEDHSQPITFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC

进一步的，本发明所述的用于早期检测子宫内膜异位症的特异性抗体，其中，Fab-1、Fab-3为捕获抗体，Fab-2、Fab-4为配对抗体。

所述用于早期检测子宫内膜异位症的特异性抗抗体的制备方法如下：

(1)构建A1AT重组表达系统：在pcDNA3.1(+)载体中插入A1AT目的片段，构建A1AT重组表达载体，将重组表达载体转染入宿主细胞，构建获得瞬时表达系统，用以表达A1AT蛋白。

(2)A1AT亚型蛋白：采用糖苷内切酶酶切回收获得A1AT亚型蛋白。

(3)构建A1AT Fab和A1AT亚型Fab噬菌体抗体库：将A1AT和A1AT亚型蛋白作为抗原免疫小鼠，取其脾细胞RNA并合成cDNA，经过三轮SOE-PCR得到Fab抗体基因，构建A1AT Fab和A1AT亚型Fab载体，电转化XL1-Blue，构建Fab噬菌体抗体库。

本发明中A1AT Fab和A1AT亚型Fab抗体的筛选方法，包含以下步骤：

(1)用包被液将A1AT及其亚型抗原包被在免疫管中，将噬菌体加入包被和封闭后的免疫管中，进行“吸附、洗涤、洗脱、扩增”过程的重复，三轮淘选后富集A1AT特异性克隆。

(2)挑取上一步骤中的特异性克隆，诱导表达抗体片段。

(3)以A1AT及其亚型作为抗原，通过ELISA筛选与之特异性结合的抗体片段，将OD₄₅₀的值大于OD₆₅₀的值两倍作为判断阳性克隆的标准。

本发明还提供所述抗A1AT Fab抗体或抗A1AT亚型Fab抗体在制备子宫内膜异位症早期诊断产品中的应用。

本发明还提供一种子宫内膜异位症早期诊断产品，所述产品包括用于早期子宫内膜症的检测试剂盒。

进一步地，所述试剂盒包括包被生物素标记的A1AT或A1AT亚型捕获抗体的磁性微球反应液、吖啶酯标记的抗A1AT或A1AT亚型Fab配对抗体片段和发光底物。

其中，所述包被生物素标记的A1AT或A1AT亚型捕获抗体的的磁珠反应液通过如下方法制得：

(1)抗体的生物素标记：将生物素-聚乙二醇-活性酯(Biotin-PEG-NHS)与抗体溶液混合孵育得到生物素标记的抗体溶液；

(2)将步骤(1)所得的生物素标记的抗体溶液与链霉亲和素磁性微球溶液混合孵育得到包被生物素标记的A1AT或A1AT亚型捕获抗体的磁性微球反应液。

进一步地，所述吖啶酯标记的A1AT或A1AT亚型Fab抗体片段。其通过如下方法制备得到：

将吖啶酯与抗A1AT或A1AT亚型Fab抗体片段在磷酸盐缓冲溶液中混合孵育，得到吖啶酯标记的抗体。

进一步地，所述发光底物由NaOH溶液(A液)和H₂O₂溶液(B液)组成；优选地，所述NaOH溶液的浓度为0.05～0.25mol/L，所述H₂O₂溶液的浓度为0.05～0.2mol/L。

进一步地，所述试剂盒还包括样本稀释液，所述样本稀释液含有质量浓度1％-2％牛血清白蛋白(BSA)和质量浓度1％-2％聚醚改性聚硅氧烷的Tris缓冲液。

进一步优选地，所述试剂盒还包括阳性校准液，所述阳性校准液为含有A1AT或A1AT亚型抗原片段的阳性混合血清。

进一步地，步骤(1)中所述的Biotin-PEG-NHS的重均分子量为500-5000。

进一步地，步骤(1)中所述的Biotin-PEG-NHS与所述抗体溶液混合的摩尔比为1-5:1。

进一步地，步骤(2)中所述链霉亲和素磁性微球的粒径为0.05-1μm。

进一步地，步骤(2)中所述生物素标记的抗体溶液与链霉亲和素磁性微球溶液混合孵育的质量比为1:2～2:1。

本发明的有益效果包括：

(1)本发明选用的A1AT作为生物标志物，提供的抗体能检测到Ⅰ期、Ⅱ期子宫内膜异位症早期或轻症患者，检测灵敏度高，检测限低，能为早期患者提供风险预估。

(2)本发明的检测试剂盒采用吖啶酯化学发光体系，具有体系简单、激发液成本低，检测灵敏度高、稳定性好的优势。

(3)本发明使用A1AT作为检测靶点，尤其是A1AT亚型A1AT2作为检测靶点，比CA125显著提高了检测准确度、灵敏度和重复性。

附图说明

图1为Secrecon-A1AT-TwinstrepⅡ目的片段的PCR产物核酸电泳胶图；图中1-4均为Secrecon-A1AT-TwinstrepⅡ目的片段。

图2为pcDNA3.1(+)-Secrecon-A1AT-TwinstrepⅡ重组质粒图谱。

图3为大规模细胞培养及A1AT蛋白表达纯化SDS-PAGE和Western-Blot分析结果；图中A为HEK293FT悬浮细胞培养照片；B为A1AT蛋白的SDS-PAGE电泳结果，图中M为marker，数字1-8为不同浓度梯度的洗脱液洗脱得到的蛋白；C为不同浓度梯度洗脱A1AT蛋白的Western-Bolt结果。

图4为A1AT蛋白酶切纯化的SDS-PAGE电泳结果；图中1和3泳道为由PNGase F酶切18h后超滤纯化后的A1AT亚型蛋白。

图5为免疫小鼠体内抗体滴度变化趋势图。

图6为三轮SOE-PCR过程示意图。

图7A-C为一、二、三轮淘选的Output和Input平板，左为Output平板，右为Input平板。

图8为对188个克隆用ELISA法验证的65个阳性克隆结果图；图中，图A为ELISA显色结果，黄色为30个阳性克隆；图B为图A中阳性克隆的OD_450-650值；图C为ELISA显色结果，黄色为35个阳性克隆，D为图C中阳性克隆的OD_450-650值。

图9为ELISA验证的与A1AT亚型结合的阳性克隆；其中编号为A4、D9、F9、H4、H5为阴性。

图10为ELISA验证的只与A1AT亚型结合的阳性克隆。图A显示C1、D1、D2、E1、H1为阳性，图B为以A1AT总蛋白验证5个阳性克隆，其中D2、H1为阴性。

图11为纯化的抗A1AT Fab抗体和抗A1AT2 Fab抗体的SDS-PAGE电泳结果；其中泳道1-2为抗A1AT Fab抗体Fab-1、Fab-2，3-4为抗A1AT2 Fab抗体Fab-3、Fab-4。

图12为本发明实施例4的检测试剂盒得到的标准曲线图。

具体实施方法

为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。

本发明的实施例中，没有多作说明的都是采用常规实验方法完成，实施例中所涉及过程没有多作说明的都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，因此不再详细描述。

为了本发明的目的，定义以下术语，以同本技术领域通常理解的含义保持一致。

术语“抗体”指免疫球蛋白分子，是指表现所需生物学活性的抗体的任何形式。抗体结构优选包含4条多肽链，通常通过二硫键相互连接2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包括重链可变区和重链恒定区。每条轻链包括轻链可变区和轻链恒定区。

术语“抗原结合片段”，称为Fab片段，是在抗体中可以与抗原高亲和力结合的部分，用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白可以得到两个Fab片段和一个Fc片段，每一个Fab片段都能结合抗原。Fab主要包含一个完整的轻链和一个重链的V区和CH1区，进一步可以划分为VH和VL的结构域组成的可变区(Variable Fragment，Fv)与CL和CH1结构域组成的恒定区(Constant Fragment，Fb)。

根据本发明的内容，本发明提供一种可以分别与A1AT及其亚型专一结合的配对抗体。

本发明中借由糖苷内切酶消化A1AT上的N-糖苷链而获得所述A1AT亚型。糖苷内切酶为一种可以催化水解寡糖及多糖的内部糖苷键的酶，常用的糖苷内切酶包括糖苷内切酶F、H、S。本发明中以PNGase F酶切水解A1AT上的N-糖苷链，水解后得到的两种A1AT的亚型分子量分别为72kDa和58kDa，分别被命名为“A1AT1”和“A1AT2”，本发明中所提A1AT亚型为58kDa大小的A1AT2。在本发明中可被当作与A1AT Fab抗体结合的抗原，或用以在一个体的生物性样品内检测子宫内膜异位症。

根据本发明的内容，为制备单克隆抗体，将筛选得到的阳性克隆接种于6mL LB含氨苄青霉素抗性的液体培养基37℃过夜培养，第二天取5mL接种于新鲜500mL LB培养基中37℃放大培养，至OD值达到0.5时加入1mM IPTG诱导表达4小时，收获上清，利用Protein G进行Fab抗体的纯化。并利用ELISA实验验证了抗体结合性能和配对性能。

另外，根据本发明的内容，利用以上获得的抗体，基于磁微粒-吖啶酯化学发光技术，制备一种能检测血液中A1AT及其亚型的试剂盒。

以下将详细陈述本发明可识别A1AT及其亚型的Fab抗体、获得该抗体的方法及其在生物样品内(如：人的血清样品)检验和/或检测子宫内膜异位症的用途。

实施例1：构建A1AT重组真核表达载体并表达重组A1AT蛋白

(1)A1AT重组真核表达载体的构建

在A1AT序列(NCBI：AAB59375.1)前端融合Secrecon分泌肽序列，使多肽链经过加工、修饰后释放到细胞膜外，提高蛋白产量；在A1AT序列后融合TwinstrepⅡ标签序列，提高与目的蛋白的亲和力，增加纯化后的蛋白得率和纯度。引物和标签序列皆由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

Secrecon核酸序列(SEQ ID No:33)：

5’-ATGTGGTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCGCCGCC-3’

TwinstrepⅡ核酸序列(SEQ ID No:34)：

5’-GAGAACCTGTACTTTCAGGGAGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGGTGGAGGTTCTGGCGGTGGATCGGGAGGTTCAGCGTGGAGCCACCCGCAGTTCGAGAAAGGTGCTTCTGGTGAACACCACCACCACCACCACCACCACCACCAC-3’

用SOE-PCR拼接分泌肽secrecon、A1AT片段和TwinstrepⅡ标签得到目的片段(目的片段胶图如图1)：第一轮PCR以250ng Secrecon(分泌肽)序列和250ng A1AT序列作为模板，以Sec-F为正向引物，A1AT-R为反向引物，用于拼接扩增Secrecon(分泌肽)序列和A1AT目的序列；以250ng第一轮PCR产物和250ng TwinstrepⅡ标签序列作为模板，以Sec-F为正向引物，以Tag-R为反向引物，用于拼接扩增整段序列得到Secrecon-A1AT-TwinstrepⅡ目的片段。引物序列如表1所示，按表2配制反应体系，按表3设置反应程序。

用NheⅠ和NotⅠ酶切pcDNA3.1(+)载体(市售购买)和目的片段，将酶切产物连接后获得分泌型重组A1AT真核表达载体pcDNA3.1(+)-Secrecon-A1AT-TwinstrepⅡ，载体图谱如图2所示。

表1.引物序列信息

引物名称	引物序列(5’to 3’)	酶切位点
			Sec-F(SEQ ID No:35)	AGACCCAAGCTGGCTAGCATGT	NheⅠ
Sec-R(SEQ ID No:36)	GACAGAAGACGGCATGGCGGCGGCCCACAC
			A1AT-F(SEQ ID No:37)	GTGTGGGCCGCCGCCATGCCGTCTTCTGTC
A1AT-R(SEQ ID No:38)	TACAGGTTCTCTTTTTGGGTGGGATTCACC
			Tag-F(SEQ ID No:39)	GGTGAATCCCACCCAAAAAGAGAACCTGTA
Tag-R(SEQ ID No:40)	TAGACTCGAGCGGCCGCTCAGT	NotⅠ

表2.PCR反应体系

模板	按需求
		正向引物	1μL
反向引物	1μL
		PrimeSTAR Max Premix(2×)	25μL
ddH₂O	Up to 50μL

表3.PCR反应条件

(2)重组A1AT蛋白的表达与纯化

将800μg重组A1AT表达载体pcDNA3.1(+)-Secrecon-A1AT-TwinstrepⅡ质粒瞬时转染1L的HEK293FT细胞(购于爱必梦中国(公司))，培养基为含1％青霉素-链霉素混合液的无血清悬浮细胞培养基(购买)，72h后收集细胞培养基上清液，用超滤管浓缩后，与带有TwinstrepⅡ纯化标签的填料过夜结合，次日进行蛋白纯化得到A1AT蛋白。将过纯化柱的每一个组分收集后，用SDS-PAGE和Western-Blot验证蛋白纯化效果(图3)。

(3)糖苷内切酶酶切蛋白

用1μL PNGase F酶切5μg的A1AT蛋白，用50mM碳酸氢铵(pH 7.8)补齐至20μL酶切反应体系。混匀后，于37℃水浴18h。用0.5mL型号的Millipore超滤管浓缩蛋白，以14000×g、4℃、10-30min条件离心；弃管中液体，收集滤膜内液体，倒扣滤膜于新Ep管，以1000×g离心2min，弃上清。最终得到A1AT亚型A1AT2蛋白(58kDa)(图4)。

实施例2：噬菌体抗体库的构建及筛选

(1)Balb/c小鼠免疫与抗体效价分析

取3只6-8周的Balb/c小鼠(江苏大学实验动物中心)，首次免疫取100μg实施例1得到的重组A1AT蛋白与弗氏佐剂(美国Sigma-Aldrich公司)混合并充分乳化后的溶液，在小鼠背部多处皮下注射。间隔三周后，进行第二次免疫。之后每间隔两周免疫一次，每次免疫剂量为50μg，每次免疫后四天进行眼眶静脉取血200μL，37℃静置1h后，3000rpm离心20min，用ELISA方法检测抗体效价(结果如图5所示，第九周效价最高，A1AT抗体效价达到1：64000)。

(2)Fab抗体基因的扩增与噬菌体抗体重组质粒的构建

为获取Fab基因片段，取效价最高时的小鼠脾脏组织，立即获取脾细胞，用TRIzol试剂提取总RNA，用反转录试剂盒进行反转录获得cDNA。

经过三轮SOE-PCR(图6)得到Fab抗体基因片段：

第一轮，以250ng脾细胞cDNA为模板，分别以V_κ、V_λ、V_H的上下游引物进行PCR(表4)，扩增V区序列；以10ng pComb3XTT质粒(购于addgene公司)DNA为模板，以C_K-pelB的上下游引物和C_H1的上下游引物进行PCR扩增，按表5配制反应体系，表6设置反应条件，得到C区序列。

第二轮，以第一步中扩增出的V区和C区基因为模板，分别以RSC-F为上游引物和Lead-B为下游引物进行PCR扩增轻链Fd片段；以V_H和C_H1为模板，LeadV_H为上游引物和dpseq为下游引物，按表5配制反应体系，表6设置反应条件，扩增重链Fd基因片段。

第三轮，以得到的重链和轻链为模板，以RSC-F为上游引物，dp-Ex为下游引物进行PCR，组装Fab基因片段。按表5配制反应体系，表6设置反应条件，其中延伸时间改为3min。

通过限制性内切酶SfiⅠ酶切后，将Fab基因片段连接到噬菌体载体pComb3Xλ(美国Addgene公司)中，构建重组质粒。

表4.Fab抗体基因扩增引物序列表

表5.PCR反应体系

模板	—
		上游引物	1μL
下游引物	1μL
		2×Vazyme Lamp Master Mix	25μL
ddH₂O	Up to 50μL

表6.PCR反应条件

(3)抗A1AT Fab噬菌体抗体库的构建与筛选

将步骤(2)得到的重组质粒采用电转化方法导入至XL1-Blue感受态细胞(Soucebioscience公司)，以构建Fab噬菌体展示抗体库。

将构建好的Fab噬菌体抗体库菌液加入48mL的25％葡萄糖和含有100mg/mL氨苄青霉素的192mL的2×YT培养基中，于37℃摇床，250rpm进行培养至OD₆₀₀达0.5，加入10¹²-10¹³的VCSM13为辅助噬菌体(购于安捷伦科技有限公司)，混合后37℃水浴1h。

把重组A1AT抗原(AIAT蛋白)包被在免疫管中，按照“淘选-去除非特异性噬菌体-下一轮洗脱和扩增”的流程进行循环，三轮淘选后获得抗A1AT阳性抗体富集的噬菌体文库。

具体的，淘选过程如下：

Fab抗体库淘选：将240mL Fab噬菌体抗体库菌液离心弃上清后，加入10mL无菌PBS和2mL PEG(200g PEG-600和146gNaCl，定容至1L)溶液，3200×g，30min离心，冰浴，弃上清。重复上述步骤三次，加入1mL PBS重悬得到纯化噬菌体并计算噬菌体滴度。

取1μL滴度为10^-8和10^-9的噬菌体加入至100μLOD₆₀₀为0.5的XL1-Blue(购买)菌液中，37℃水浴1h后涂布LB氨苄平板，计算Input。在免疫管加入4mL包被液，分别加入1μg、10μg、20μg A1AT抗原(AIAT蛋白)，4℃过夜，次日加入PBS清洗三次，用0.1％酪蛋白封闭。将免疫管中的液体除去，PBS清洗3次后，加入纯化后噬菌体，用PBS补齐至4mL，加入4mL胰酶稀释液(胰酶原液与TBSC溶液1:1稀释)洗脱1h，吸取洗脱后的噬菌体全部转移至XL1-Blue菌液中，37℃水浴1h后3200×g离心5min，弃上清，用1mL 2-YT无抗培养基重悬并取1μL稀释100倍，涂布LB培养板，计算Output和富集比(图7)。将剩余的菌液涂2个TYE氨苄葡萄糖大平板，于37℃培养过夜。

第二轮淘选：在TYE大板中多次加入2×YT无抗培养基，用无菌涂布棒将菌落悉数刮下，多次收集刮下的菌液，直至菌液变澄清，收集至一个15mL离心管中，接种于240mL的2×YT培养基中，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.1，加入100mg/mL的氨苄青霉素240μL，37℃摇床培养使得OD₆₀₀为0.5，重复第一轮淘选步骤，同样计算Input、Output和富集比。

第三轮淘选：操作同第二轮淘选，淘选结果见表7。

表7.淘选结果

淘选次数	Input(cfu)	Input(cfu)	Ratio
				1	1.23×10¹⁴	1.00×10⁵	8.14×10^-10
2	5.61×10¹³	1.10×10⁵	1.96×10^-9
				3	1.06×10¹⁴	2.59×10⁶	2.45×10^-8

(4)噬菌体阳性克隆的ELISA鉴定

从富集的文库中挑选单克隆至200μL含有20％葡萄糖的2×YT培养基中(酶标板A)37℃培养12h，次日接种5μL菌液至新200μL的2×YT(含葡萄糖)培养基中(酶标板B)于37℃培养3h，后3200×g离心10min，弃上清，用含5mM IPTG的2×YT培养基以200μL重悬沉淀，25℃培养16h，即得含有Fab抗体的上清。

在96孔板上(抗原板)包被每孔0.1μg的A1AT抗原(AIAT蛋白)，每孔100μL，4℃过夜；次日，弃液体，用2％PBST洗板三次，每孔加入120μL 0.2％酪蛋白室温摇晃封闭1h后；洗板，加入50μL含抗体的上清和50μL 4％ M-PBS，室温摇晃孵育1.5h；洗板，37℃孵HA一抗1h，每孔100μL；洗板，37℃孵鼠二抗，每孔100μL；洗板，显色，黑暗中37℃、30min；终止液每孔50μL。

设置波长450nm和650nm，测定吸光度。OD₄₅₀的数值大于OD₆₅₀数值的两倍，即为阳性克隆(图8、图9)，以酶标板对应孔位对克隆进行编号。ELISA验证后共有65个能稳定表达的阳性克隆。以A1AT2为抗原，将与A1AT结合的阳性克隆抗体作为待测抗体，检测与A1AT2结合情况，阳性克隆为能结合A1AT而不能结合A1AT2的抗体。同理筛选获得能够识别A1AT2而不能结合A1AT的抗体(图10)。

实施例3：A1AT及其亚型特异性Fab抗体表达纯化

将筛选得到的阳性克隆接种于6mL LB含氨苄青霉素抗性的液体培养基37℃过夜培养，第二天取5mL培养液接种于新鲜500mLLB培养基中37℃放大培养，至OD值达到0.5时加入1mM IPTG诱导表达4小时，收获上清，利用Protein G进行Fab抗体的纯化(图11)。

经测序和分析后，得到抗体信息如下：

本发明得到抗A1AT和A1AT亚型的Fab抗体：

所述抗体Fab-1重链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:7)：

所述抗体Fab-1轻链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:8)：

所述抗体Fab-2重链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:15)：

所述抗体Fab-2轻链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:16)：

所述抗体Fab-3重链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:23)

所述抗体Fab-3轻链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:24)

所述抗体Fab-4重链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:31)

所述抗体Fab-4轻链全长氨基酸序列为(SEQ ID No:32)

实施例4：一种磁微粒-吖啶酯化学发光的A1AT检测试剂盒制备

本实施例的一种基于磁微粒-吖啶酯化学发光的A1AT检测试剂盒，通过如下方法制备得到：

(1)包被A1AT抗体的磁性微球反应液的制备：

选用两个阳性克隆表达的Fab抗体(Fab-1、Fab-3)作为捕获抗体，将生物素-聚乙二醇-活性酯(Biotin-PEG-NHS)与A1AT Fab捕获抗体(或A1AT亚型捕获抗体)的磷酸盐缓冲溶液混合孵育，Biotin-PEG-NHS与抗体混合的摩尔比为2:1～5:1，纯化后得到生物素标记的捕获抗体溶液；然后将所得生物素标记的抗体溶液分别和链霉亲和素磁性微球溶液(超顺磁性Dynabeads链霉亲和素，平均粒径为0.5μm)按质量比为1:2～1:5混合孵育，洗涤后磁分离，重悬于Tris缓冲液中，得到包被A1AT Fab捕获抗体(或A1AT亚型捕获抗体)的磁性微球反应液。

(2)吖啶酯标记抗体的制备

另选两个阳性克隆表达的Fab抗体(Fab-2、Fab-4)作为配对抗体，将吖啶酯(NSP-SA-NHS)与A1AT Fab配对抗体(A1AT亚型配对抗体)在磷酸盐缓冲溶液中混合孵育，纯化后得到吖啶酯标记的A1AT Fab配对抗体(或者A1AT亚型配对抗体)。

(3)将步骤(1)所得的磁性微球反应液、步骤(2)所得的吖啶酯标记抗体，发光底物A液0.1mol/L NaOH溶液、B液0.1mol/L H₂O₂溶液，样本稀释液(含有1％wt.BSA和1％wt.聚醚改性聚硅氧烷Tris缓冲液)和含有A1AT Fab抗体的阳性混合血清校准液分别置于试剂盘的微孔中封装，得到基于磁微粒-吖啶酯化学发光的A1AT(或A1AT亚型)检测试剂盒。

采用所述检测试剂盒对待测样品进行检测，具体步骤为：

(1)将A1AT(或A1AT亚型)蛋白采用样本稀释液稀释至一定浓度梯度(0pg/mL、2pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL)，然后分别与试剂盒中的包被A1AT捕获抗体(或者A1AT亚型捕获抗体)的磁性微球反应液混合孵育，磁分离并洗涤除去未结合的抗体及杂质；然后加入所述吖啶酯标记抗体混合孵育，磁分离并洗涤除去未结合的抗体及杂质，再依次加入发光底物A液和B液，测定A1AT(或A1AT亚型)蛋白不同浓度下的相对发光强度(采用重庆博迈斯SMART500S自动发光检测仪检测)后绘制标准曲线(图12)。

(2)取待测的人血清样本采用样本稀释液稀释，然后按步骤(1)的方法测试样本的相对发光强度，根据相应抗体标准曲线计算样本中的A1AT或A1AT2浓度。

实施例5：A1AT检测试剂盒的性能评价

(1)最低检测限检测

同一次实验中重复测定零浓度校准品20次，得到20次测量结果的相对发光值(RLU)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值代入实施例4中得到的方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限，经验证，本发明的抗体最低检测限结果值A1AT为0.445pg/mL，A1AT2为0.328pg/mL。

(2)准确度

将靶值在2pg/mL、50pg/mL、1000pg/mL浓度水平的校准品利用本发明的试剂盒重复测定各3次，平均值即为浓度实测值，计算浓度实测值与靶值的相对偏差，结果测值偏差均在-7.0％～7.7％之间。

(3)重复性检测

同一次实验中重复测定(2±0.4)pg/mL、(100±20)pg/mL及(1000±200)浓度水平样本各10次，计算测定值的平均值(M)、标准差(SD)和变异系数(CV)，试验使用三个批次试剂进行检测，结果批内变异系数最大值A1AT为4.6％，A1AT2为3.8％。

实施例6：A1AT检测试剂盒的临床验证

使用实施例4建立的试剂盒验证对于子宫内膜异位症的检测效果。

在本实施例中，共采集了38例女性血清样本，其中有15个为子宫内膜异位症Ⅰ或Ⅱ期患者血清，9个为子宫内膜异位症Ⅲ或Ⅳ期患者血清，14个为未患子宫内膜异位症女性的血样。

利用实施例4的检测试剂在重庆博迈斯SMART500S自动发光检测仪上检测血清样本中的A1AT和A1AT2值，并用子宫内膜异位症的另一种生物标志物CA125作为对比。表8总结了本发明试剂盒在诊断或检测38例子宫内膜异位症抗原时的敏感性、特异性和准确性。

表8.试剂盒检测子宫内膜异位症结果

检测物质	疾病时期	临界值	p-value*	敏感性	特异性	准确性
							CA125	Ⅰ、Ⅱ	35	0.000432	22.35	91	37.74
CA125	Ⅲ、Ⅳ	35	0.017153	68.23	92	82.85
							A1AT	Ⅰ、Ⅱ	17.158	0.000039	86.55	92.33	82.36
A1AT	Ⅲ、Ⅳ	17.277	0.000058	95.8	94.12	93.25
							A1AT2	Ⅰ、Ⅱ	15.158	0.000021	90.54	94.02	91.04
A1AT2	Ⅲ、Ⅳ	13.158	0.000012	94.65	96.02	98.42

*如果P＜0.05，则表示各组之间的差异显著。

结果表明，本发明所提供的抗体在检测所有阶段子宫内膜异位症的敏感性都远高于CA125，对于子宫内膜异位症所有阶段的检测敏感性都超过90％，而CA125对于早期Ⅰ、Ⅱ期子宫内膜异位症的检测敏感性较低，为22％，对于严重的子宫内膜异位症的敏感性为68％。另外，本发明的抗体对于子宫内膜异位症检测的特异性和准确性也高于CA125。因此，本发明所选用的A1AT作为检测子宫内膜异位症的生物标志物比CA125的检测效果更佳，本发明得到的抗体检测效果更优。

Claims

1.一种用于早期检测子宫内膜异位症的特异性抗体，其特征在于，所述抗体包括抗A1AT Fab抗体和抗A1AT亚型Fab抗体；所述抗A1AT Fab抗体包括Fab-1、Fab-2，所述抗A1AT亚型Fab抗体包括Fab-3、Fab-4；

所述Fab-1的重链可变区包括三个互补决定区，其氨基酸序列如SEQ ID No:1-3所示；所述轻链的轻链可变区包括三个互补决定区，其氨基酸序列如SEQ ID No:4-6所示；

所述Fab-2的重链可变区包括三个互补决定区，其氨基酸序列如SEQ ID No:9-11所示；所述轻链的轻链可变区包括三个互补决定区，其氨基酸序列如SEQ ID No:12-14所示；

所述Fab-3的重链可变区包括三个互补决定区，其氨基酸序列如SEQ ID No:17-19所示；所述轻链的轻链可变区包括三个互补决定区，其氨基酸序列如SEQ ID No:20-22所示；

所述Fab-4的重链可变区包括三个互补决定区，其氨基酸序列如SEQ ID No:25-27所示；所述轻链的轻链可变区包括三个互补决定区，其氨基酸序列如SEQ ID No:28-30所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述Fab-1重链全长氨基酸序列为如SEQID No:7所示，轻链全长氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；

所述Fab-2重链全长氨基酸序列为如SEQ ID No:15所示，轻链全长氨基酸序列如SEQIDNo:16所示；

所述Fab-3重链全长氨基酸序列为如SEQ ID No:23所示，轻链全长氨基酸序列如SEQIDNo:24所示；

所述Fab-4重链全长氨基酸序列为如SEQ ID No:31所示，轻链全长氨基酸序列如SEQIDNo:32所示。

3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述Fab-1、Fab-3为捕获抗体，Fab-2、Fab-4为配对抗体。

4.权利要求1-3任一项所述抗体在制备子宫内膜异位症早期诊断产品中的应用。

5.一种子宫内膜异位症早期诊断产品，其特征在于，所述产品包括检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述抗体。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括包被生物素标记的A1AT或A1AT亚型捕获抗体的磁性微球反应液、吖啶酯标记的抗A1AT或A1AT亚型Fab配对抗体片段和发光底物。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述发光底物由NaOH溶液和H₂O₂溶液组成；所述NaOH溶液的浓度为0.05～0.25mol/L，所述H₂O₂溶液的浓度为0.05～0.2mol/L。

8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒还包括样本稀释液，所述样本稀释液含有质量浓度1％-2％牛血清白蛋白(BSA)和质量浓度1％-2％聚醚改性聚硅氧烷的Tris缓冲液。

9.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性校准液，所述阳性校准液为含有A1AT或A1AT亚型抗原片段的阳性混合血清。

10.权利要求1-3任一项所述的抗体或权利要求4-9任一项所述的产品在非诊断目的的早期检测子宫内膜异位症中的应用。