CN117940154A - 产生编码患者肿瘤新抗原的双链dna池的方法 - Google Patents
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Abstract
一种合成的DNA分子，包含在转录成相应的RNA分子的启动子控制下编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的一个片段，以及将所述翻译的RNA分子翻译成肽的片段。
Description
技术领域
本公开涉及将提取自患者基因组的信息用于产生肿瘤新抗原的用途。特别是，发现了一种合成的DNA分子，该分子包含一个编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的片段。这种合成的DNA分子可用作RNA疫苗中的模板，例如包含患者肿瘤的肿瘤新抗原的个体化疫苗或包含来自感染因子的表位的疫苗。
更具体地，但不排他地，本公开涉及一种制备能够被转录到RNA疫苗中的DNA分子的方法。
本公开还涉及根据本发明的DNA分子池(pool)。
本公开还涉及产生针对影响患者的癌症的RNA疫苗的方法，包括产生根据本发明的DNA分子或根据本发明的池的步骤。
本公开还涉及可通过根据本发明的产生RNA疫苗的方法获得的疫苗。
背景技术
文献US2015038373A1提供了一种从头合成基因的方法。具体而言，该文献提供了能够以低错误率高效地快速合成大的基因文库或相对较长的寡核苷酸片段的方法、装置和系统。用于从头合成基因的基底是硅。
文献WO2016126987A1提供了核酸组装的方法，包括：提供预定的核酸序列；提供多个前体双链核酸片段，每个前体双链核酸片段具有两条链，其中两条链中的每一条包含5'-A(Νx)Τ-3'或5'-G(Nx)C-3'的粘性末端序列，其中N是核苷酸，其中x是核苷酸A和T之间或G和C之间的核苷酸数，并且其中x是1至10，并且其中不超过两个前体双链核酸片段包含相同的粘性末端序列。
文献WO2016172377A1提供了用于合成寡核酸的装置，包括：板；主通道，其中所述主通道从所述板的顶侧上的开口垂直延伸到所述板中，并且其中所述主通道具有0.5至2mm的宽度；以及连接到主通道的多个微通道，其中多个微通道中的每个微通道从板的底侧上的开口垂直延伸到主通道中。
文献US2020222875提供了用于高效从头合成高度准确和均匀的多核苷酸文库的系统、方法及组合物。特别地，该文献提供了用于多核苷酸合成的方法，包括：a)提供包含表面的结构；b)将至少一种核苷与连接至所述表面的多核苷酸偶联；c)在所述表面上沉积氧化溶液；d)在所述表面上沉积洗涤溶剂，其中所述洗涤溶剂包括酮、酯、醚、烃或其功能等同物；和e)重复步骤b-d以合成多个多核苷酸。
文献EP3576751提供了一种核糖核酸(RNA)癌症疫苗，其可以安全地引导身体的细胞机制产生几乎任何目的癌症蛋白或其片段。该文献举例说明了具有20个表位或52个表位的癌症疫苗。该文献描述了具有编码表位串联体的开放阅读框的mRNA癌症疫苗。
文献WO2020/097291描述了一种用mRNA疫苗治疗患者癌症的方法，其中疫苗核酸在给定长度内具有最大的抗癌功效。
Kreiter Sebastian等人的文献(The Journal ofImmunology，第180卷，2008年，第309-318页)提到通过将抗原偶联到MHC分子上来提高抗原呈递的效率，其中所描述的载体具有启动子、聚-A尾部和3’UTR序列。
Nielsen等人的文献(Journal ofImmunological Methods，第360卷，2010年，第149-156页)描述了编码CMV、EBV和流感的32个表位的多表位mRNA构建体的体外转录，其中mRNA构建体包含DC-LAMP信号序列、3’-UTR序列和聚-A尾部。
文献WO2018/183922描述了用于抗疟疾疫苗的方法和组合物，其中所述疫苗可以包含使用质粒或腺病毒表达载体产生的几种抗原的混合物。
不幸的是，尽管这些文献描述了其技术的优点，但目前不存在下述DNA分子(优选长度大于200个核苷酸的长DNA分子)的从头合成，该DNA分子编码从患者肿瘤中鉴定的肿瘤特异性抗原(新抗原)或编码来自感染因子的表位。特别地，不存在在池中制备所述DNA分子的方法，所述方法允许在池中产生编码多种不同肿瘤新抗原的或来自感染性疾病的表位的多种DNA分子。事实上，疾病，例如癌症，可能以多种疾病特异性抗原为特征。高效个体化RNA疫苗的制备依赖于疫苗的开发，该疫苗包含足够大量的疾病特异性(例如肿瘤特异性)抗原，能够在患者中引发适当的免疫应答。目前，个体化疫苗的效力不高，部分原因是可整合到疫苗中的个体化表位或新抗原的数量有限。事实上，现有技术中的个体化疫苗依赖于编码具有表位串联体的开放阅读框的DNA或RNA。DNA或RNA的大小受其相应质粒的最大尺寸限制。由于尺寸有限，其不能掺入引发大规模免疫应答所需的非常大量的不同表位，所述免疫应答的特征是产生靶向不同表位的特异性T细胞。现有技术还提到可用作疫苗模板的包含串联表位的DNA片段的从头生产，但这种从头生产受限于长度小于或等于200个核苷酸的短DNA片段的合成，其中这些短DNA片段通过多次连接进一步组装。因此，现有技术中当前方法的另一个重要限制是存在多个连接步骤，这可能在所得DNA片段中引入错误。
发明内容
因此，需要处理包含一个片段的合成DNA分子，所述片段编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位，其中，优选地，所述DNA分子具有等于或大于200个核苷酸的长度，并且可以在DNA分子池中制备，而不受池中存在的不同DNA分子的数量的限制。
根据本发明，提供了一种合成的DNA分子，所述合成的DNA分子包含在转录成相应的RNA分子的启动子控制下编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的一个片段，以及将所述翻译的RNA分子翻译成肽的片段。
根据本发明，还提供了(互补的)DNA分子，包含(i)编码肽的(第二)部分的片段，所述肽用于将抗原导向MHC分子，(ii)用于增加转录的RNA的稳定性或用于增加转录的RNA翻译成蛋白质的片段，和(iii)编码聚A尾的片段。如将在详细描述中进一步描述的，根据本发明的所述(互补的)DNA分子将用作反向引物，所述反向引物允许仅使用一个反向引物在池中产生多个双链DNA分子。
本发明还涉及制备根据本发明的DNA分子的方法，包括在启动子的控制下进行编码肿瘤新抗原的DNA分子的化学合成的步骤。
本发明的另一个目的是根据本发明的DNA分子池或可通过根据本发明的方法获得的池，所述池包含多种不同的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位。事实上，根据本发明的包含多种不同肿瘤新抗原或多种来自感染因子的不同表位的DNA分子池在池中存在的不同新抗原或表位的数量上不受限制。因此，根据本发明的DNA分子池可用作患者的个体化疫苗的模板，所述个体化疫苗可掺入无限数量的患者新抗原，从而可以引发确保个体化疫苗高效力的最佳免疫应答。
本发明还涉及一种产生针对影响患者的癌症的RNA疫苗的方法，所述方法包括产生根据本发明的DNA分子或根据本发明的池的步骤，以及将所述DNA分子体外转录成RNA分子的步骤。
本发明还涉及可通过本发明方法获得的疫苗。
从属权利要求涉及其他有利的实施方案。
图1是根据本发明的DNA分子的示意图，包括不同的片段以及相应的转录的RNA和翻译的多核苷酸。
图2说明了根据本发明的DNA分子的不同变体。
图3示出了根据本发明的DNA分子以及两个单链DNA分子的重叠区域。
图4示出了说明第一和第二单链DNA分子之间部分重叠杂交的方案。
图5说明了根据本发明的DNA分子池。
图6示出了根据本发明的DNA分子的序列的示例。
图7示出了根据本发明的DNA分子的序列和相应的蛋白质序列的示例。
图8示出了根据本发明的DNA分子的序列和相应的蛋白质序列以及正向和反向引物的示例。
在附图中，相同的附图标记表示相同的或类似的元件。
通过参考附图和实施例，本发明的其他特征和优点将从以下非限制性的描述中得到。
图1说明了根据本发明的合成DNA分子1.10的方案，其包含编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的一个片段1.13，其在启动子1.11的控制下转录成相应的RNA分子1.20，以及用于将所述转录的RNA分子1.20翻译1.12成肽1.30的片段。优选地，根据本发明的合成DNA分子1.10包含一个且仅一个片段1.13，所述一个且仅一个片段1.13编码一种且仅一种肿瘤新抗原或一种且仅一种来自感染因子的表位。
优选地，所述DNA分子1.10被合成为单链DNA分子。
优选地，编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的片段1.13是包含21至504个核苷酸、优选51至201个核苷酸、更优选63至84个核苷酸、优选81个核苷酸的序列，其中片段1.13优选编码患者肿瘤的肿瘤特异性抗原。
图2表明，根据本发明的DNA分子1.10优选还包含片段2.11，所述片段2.11编码用于将肿瘤新抗原或来自感染因子的表位导向和/或稳定和/或靶向和/或转运到囊泡区或细胞表面的序列。优选地，DNA分子1.10包含片段2.21，所述片段2.21编码用于将编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位导向MHC分子的序列。有利地，DNA分子1.10还包含编码翻译增强子的片段2.31。优选地，DNA分子1.10包含3’-UTR和/或3’-聚A尾片段2.41和/或5’-UTR。有利地，根据本发明的DNA分子不限于图1和图2所示的DNA分子。事实上，根据本发明的DNA分子至少包含启动子1.11、翻译片段1.12和编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的片段1.13。优选地，所述DNA分子可以进一步包含片段2.11和/或片段2.21和/或片段2.31和/或3’-UTR和/或3’-聚A尾片段2.41和/或5’-UTR，或片段2.11和/或2.21和/或2.31和/或2.41的任意组合，所述片段2.11编码用于稳定肿瘤新抗原或来自感染因子的表位和/或将其靶向和/或转运到囊泡区和/或细胞表面的序列，所述片段2.21编码用于将编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位导向MHC分子的序列，所述片段2.31编码翻译增强子。根据本发明，DNA分子的不同片段1.11和/或1.12和/或2.11和/或1.13和/或2.21和/或2.31和/或2.41的5’至3’的连续顺序可以变化，并且不限于图1至3所示的DNA分子中所示的连续顺序。有利地，本发明人发现添加到DNA分子1.10的每个DNA片段2.11和/或2.21和/或2.31和/或2.41各自将肿瘤新抗原或来自感染因子的表位1.13的肽表达增加约5倍。
有利地，包含编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的一个片段的合成DNA分子(所述片段在用于转录成相应RNA分子的启动子的控制下)和用于将所述转录的RNA分子翻译成肽的片段还包含编码用于稳定和/或靶向和/或转运来自囊泡区中的肿瘤新抗原或感染因子的表位的序列的片段，并且优选地还包含编码用于将编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位导向MHC分子的序列的片段、编码翻译增强子的片段和3’-UTR和/或3’-聚A尾片段和/或5’-UTR。
或者，包含编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的一个片段的合成DNA分子(所述片段在用于转录成相应RNA分子的启动子的控制下)和用于将所述转录的RNA分子翻译成肽的片段还包含编码用于将编码的肿瘤新抗原或来自感染因子表位导向MHC分子的序列的片段，并且优选地，还包含编码用于稳定和/或靶向和/或转运来自囊泡区中的肿瘤新抗原或感染因子的表位的序列的片段，编码翻译增强子的片段，和3’-UTR和/或3’-聚A尾片段和/或5’-UTR。
或者，包含编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的一个片段的合成DNA分子(所述片段在用于转录成相应RNA分子的启动子的控制下)和用于将所述转录的RNA分子翻译成肽的片段还包含编码翻译增强子的片段，并且优选地，还包含编码用于稳定和/或靶向和/或转运来自囊泡区中的肿瘤新抗原或感染因子的表位的序列，编码用于将编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位导向MHC分子的序列的片段，和3’-UTR和/或3’-聚A尾片段和/或5’-UTR。
或者，包含编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的一个片段的合成DNA分子(所述片段在用于转录成相应RNA分子的启动子的控制下)和用于将所述转录的RNA分子翻译成肽的片段还包含3’-UTR和/或3’-聚A尾片段和/或5’-UTR，优选地，还包含用于稳定和/或靶向和/或转运来自囊泡区中的肿瘤新抗原或感染因子的表位的序列，用于将编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位导向MHC分子的序列，以及编码翻译增强子的片段。
优选地，启动子1.11是噬菌体RNA聚合酶启动子。更优选地，启动子1.11属于包含T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、Syn5 RNA聚合酶、KP34 RNA聚合酶的启动子序列的一组启动子。甚至更优选地，根据本发明，T7 RNA聚合酶的启动子序列是在其整个序列长度上对SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的T7 RNA聚合酶的结合序列，SP6 RNA聚合酶的启动子序列是在其整个序列长度上对SEQ ID NO:73具有至少95％同一性的SP6 RNA聚合酶的结合序列，T3 RNA聚合酶的启动子序列是在其整个序列长度上对SEQ ID NO:74具有至少95％同一性的T3 RNA聚合酶的结合序列，Syn5 RNA聚合酶的启动子序列是在其整个序列长度上对SEQ ID NO:75具有至少95％同一性的Syn5 RNA聚合酶的结合序列，KP34 RNA聚合酶的启动子序列是在其整个序列长度上对SEQ ID NO:76(强启动子1)具有至少95％同一性的KP34 RNA聚合酶的结合序列，或在其整个序列长度上对SEQ ID NO:77(强启动子2)或在其整个序列长度上对SEQ ID NO:78(弱启动子)具有至少95％的同一性的KP34 RNA聚合酶的结合序列。有利地，根据本发明的启动子1.11是在其整个序列长度上对SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的T7 RNA聚合酶的启动子序列。
有利地，翻译1.12的片段是位于DNA分子1.10的5’UTR区(编码区的上游)的翻译增强子序列。编码区，即DNA分子1.10的编码部分在图1、2和3中用灰色方框表示。优选地，用于翻译1.12的片段是选自以下的翻译增强子/启动子序列：人巨细胞病毒(CMV)增强子、α或β-珠蛋白增强子、EF-1α增强子、猿猴病毒40(SV40)增强子、PGK1启动子、HSD17B4启动子、泛素C启动子和β-肌动蛋白启动子。更优选地，翻译1.12的片段是β-珠蛋白翻译增强子序列。有利的是，β-珠蛋白序列在其整个序列长度上对SEQ ID NO:2具有至少95％的同一性。
优选地，编码用于将肿瘤新抗原或来自感染因子的表位导向和/或稳定和/或靶向和/或转运至囊泡区的序列的片段2.11是用于内部处理的信号序列，例如溶酶体相关膜蛋白(LAMP1或LAMP2；例如SEQ ID NO:3)，可能是树突细胞(DC-LAMP)的信号序列或导向囊泡区以在那里与MHC-I受体偶联的序列(例如SEQ ID NO:5)。有利地，用于内部处理的信号序列，其中在其整个序列长度上对SEQ ID NO:3优选具有至少95％的同一性。
优选地，编码用于将编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位导向MHC分子的序列的片段2.21是用于呈递到T淋巴细胞的免疫处理。更优选地，片段2.21是树突细胞溶酶体相关膜糖蛋白信号序列，有利地，在其整个序列长度上对SEQ ID NO:5具有至少95％的同一性。
有利地，编码翻译增强子的片段2.31是优先位于DNA分子1.10的3’UTR区(编码区的下游)的翻译增强子和/或翻译稳定性序列。优选地，片段2.31是β-珠蛋白翻译增强子序列，其中β-珠蛋白翻译增强子优选在其整个序列长度上对SEQ ID NO:6具有至少95％的同一性。
优选地，片段2.41是至少68个核苷酸，优选至少100个核苷酸的3’聚A尾序列。
优选地，所述DNA分子可以进一步包含对应于保守序列元件的3’和/或5’片段(3’和/或5’CSE片段)。这些3’和/或5’CSE片段可被RNA依赖型RNA聚合酶(RdRp)有利地识别，从而允许被转录的DNA分子进行RNA扩增。
有利地，根据本发明的DNA分子的大小包括每条链100个核苷酸至每条链约2500个核苷酸，优选每条链300个核苷酸至每条链约800个核苷酸，更优选每条链约400个核苷酸至每条链约700个核苷酸，还更优选每条链约500个(或550个)核苷酸至每条链约650个(或600个)核苷酸。
图3显示，根据本发明，(互补的)DNA分子3.20包含(i)编码肽的片段2.21的(第二)部分的片段，所述肽用于将抗原(表位1.13)导向MHC分子，(ii)用于增加转录的RNA的稳定性或用于增加转录的RNA翻译成蛋白质的片段2.31，和(iii)编码聚A尾部的片段2.41。有利的是，根据本发明的DNA分子3.20是反义的，优选用于与有义DNA分子3.10碱基配对，所述有义DNA分子3.10包含编码抗原或表位的片段1.13，在转录成相应RNA分子的启动子的控制下，用于其翻译的片段1.12，编码用于将肿瘤新抗原或来自感染因子的表位导向和/或稳定和/或靶向和/或转运到囊泡区的序列的片段2.11和编码用于装载抗原以呈递至T淋巴细胞的肽的片段2.21的(第一)部分的片段，其中所述第一和第二部分形成用于装载抗原以呈递到T淋巴细胞的完整序列2.21，并且其中所述第一和第二部分是有义和反义的，呈递允许DNA分子3.10与DNA分子3.20碱基配对的重叠序列3.30。
有利地，重叠序列3.30是至少5个核苷酸、优选至少10个核苷酸、更优选至少15个核苷酸、有利地至少20个核苷酸和/或优选最多100个核苷酸、更优选最多75个核苷酸、有利地最多40个核苷酸的连续序列。优选地，重叠序列3.30位于恒定序列区。根据本发明，恒定序列区是指存在于根据本发明的每个DNA分子1.10中的序列区。
优选地，重叠序列是在其整个序列长度上对对应于SEQ ID NO:5内的核苷酸30至52的序列具有至少95％同一性的序列。
优选地，根据本发明，制备所述DNA分子的方法包括在启动子的控制下进行编码肿瘤新抗原的DNA分子的化学合成的步骤。
优选地，化学合成是基于计算机DNA写入技术的单链寡核苷酸合成(即US2018104664A1)。
优选地，根据本发明的方法包括合成以下DNA分子的步骤：
(i)第一单链DNA分子3.10，包含用于在RNA中转录的启动子1.11、用于其翻译的片段1.12和用于内部导向与肿瘤新抗原或来自感染因子的表位1.13框内融合的靶向序列2.11和遗传元件2.21的第一部分，所述遗传元件2.21编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位以呈递至T淋巴细胞的序列，和
(ii)第二单链DNA分子3.20，编码遗传元件2.21的第二部分，所述遗传元件2.21编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的序列，以呈递至T淋巴细胞，其中所述第二单链DNA分子是反义的，并且其中所述第一部分和第二部分形成完整的序列2.21，用于装载肿瘤新抗原或来自感染因子的表位以呈递至T淋巴细胞，并且其中所述第一部分和第二部分存在允许特定碱基配对的重叠3.30(至少15个连续核苷酸)，
所述方法还包括使(i)中的DNA分子与(ii)中的DNA分子杂交并使两个分子延伸的步骤，以产生双链DNA分子和遗传元件，所述双链DNA分子编码启动子1.11、翻译起始子1.12、用于内部导向与肿瘤新抗原或来自感染因子的表位1.13框内融合的靶向序列2.11，所述遗传元件编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的序列2.21，以呈递至T淋巴细胞。
优选地，在根据本发明的方法中，DNA分子(ii)还包含3’-UTR 2.31和/或聚A尾2.41。
图4在4.10中进一步说明了第一单链DNA分子3.10，包含位于遗传元件2.21的第一部分的序列4.11，与位于第二单链DNA分子3.20的遗传元件2.21的第二部分的序列4.12重叠。第一单链DNA分子3.10包含肿瘤新抗原或来自感染因子的表位1.13的片段。第一单链DNA分子3.10通过重叠3.30与第二单链DNA分子3.20杂交(参见图4中的4.20)。然后，从重叠区3.30开始的延伸允许双链DNA分子4.30的产生。优选地，延伸是通过使用单链DNA分子3.10和3.20作为模板的DNA聚合酶进行的酶促步骤。
有利地，本发明还涉及根据本发明的DNA分子池或可通过根据本发明的方法获得的池，其中所述池包含多种不同的肿瘤新抗原或来自感染因子的不同表位。优选地，所述多种肿瘤新抗原中的每一种肿瘤新抗原是在患者的肿瘤中鉴定的特异性肿瘤抗原。有利地，分子3.20与分子池3.10相同且互补。
图5说明了根据本发明的DNA分子池5.10或可通过根据本发明的方法获得的池。有利地，所述池包含第一单链DNA分子3.10，所述第一单链DNA分子3.10包含位于遗传元件2.21的第一部分中的序列4.11，与位于第二单链DNA分子3.20的遗传元件2.21的第二部分中的序列4.12重叠。第一单链DNA分子3.10具有编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位1.13的序列。优选地，所述池还包含多个不同的第一单链DNA分子，例如3.10a和3.10b，其各自具有分别编码第二和第三特异性肿瘤新抗原1.13a和1.13b(或来自感染因子的第二和第三表位)的特异性序列。优选地，由序列1.13、1.13a和1.13b编码的肿瘤新抗原的氨基酸序列各自与相应的“参考”序列相差至少一个氨基酸，或者所述氨基酸序列是从仅存在于患者的肿瘤中而不存在于患者的正常细胞(即外周血单个核细胞(PBMC))中的开放阅读框编码的从头氨基酸序列。多个不同的第一单链DNA分子3.10a和3.10b还包括位于遗传元件2.21的第一部分中的序列4.11，与位于第二单链DNA分子3.20的遗传元件2.21的第二部分中的序列4.12重叠。所述池还可以包括第一单链DNA分子(例如3.10、3.10a和/或3.10b)和第二单链DNA分子3.20(例如第一单链DNA分子3.10和第二单链DNA分子3.20之间的杂交分子4.20)之间的多个杂交分子，以及第一单链DNA分子3.10b和第二单链DNA分子3.20之间的杂交分子5.30。有利地，所述池还包含多个双链DNA分子，其中每个双链DNA分子包含对应于第一单链DNA分子的序列的一部分(例如3.10、3.10a或3.10b)及其互补序列，以及对应于第二单链DNA分子3.20的第二部分及其互补序列。在图5中，举例说明了包含第一单链DNA分子3.10和第二单链DNA分子3.20的双链DNA分子4.30，以及包含第一单链DNA分子3.10b和第二单链DNA分子3.20的双链DNA分子5.40。优选地，在根据本发明的池中，池中的多个DNA分子具有用于转录RNA中肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的相同启动子。
根据本发明，相应的“参考”序列对应于来源于患者正常细胞即PBMC细胞的DNA测序数据的预测肽序列。
更优选地，在根据本发明的池中，所述池的多个DNA分子具有编码用于肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的内部靶向的序列的相同的遗传元件，和/或相同的翻译增强子和/或编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的序列以用于呈递至T淋巴细胞的相同的遗传元件和/或相同的3’-UTR。
有利地，根据本发明的池包括多个第二单链DNA分子3.20，其中多个第二单链DNA分子3.20中的每个第二单链DNA分子3.20具有相同的DNA序列。
有利地，多个第二单链DNA分子3.20中的每个第二单链DNA分子3.20由在其整个序列长度上对SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的序列定义。
优选地，根据本发明的池包含多个第一单链DNA分子，所述第一单链DNA分子包含多个不同的肿瘤新抗原或来自感染因子的多个不同表位。
有利的是，因为第一单链DNA分子3.10和第二单链DNA分子3.20之间的重叠序列3.30是恒定序列区中的连续序列，所以它允许通过两个部分重叠和配对的链3.10和3.20的延伸产生双链DNA分子池。
有利地，第一单链DNA分子3.10、3.10a和3.10b是各自具有仅对于肿瘤新抗原或来自感染因子的表位1.13的片段彼此不同的序列的DNA分子，其可以编码多个不同的肿瘤新抗原或来自感染因子的多个不同的表位，即第一特异性肿瘤新抗原1.13，第二特异性肿瘤新抗原1.13a和/或第三特异性肿瘤新抗原1.13b。除了用于肿瘤新抗原或来自感染因子的表位1.13的片段之外，多个第一单链DNA分子中的每个第一单链DNA分子3.10的其它片段基本上相同，例如用于RNA转录的启动子1.11，用于其翻译的片段1.12和用于内部导向的靶向序列2.11，以及编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位以呈递至T淋巴细胞的序列的遗传元件2.21的第一部分。
有利地，编码肿瘤新抗原的片段，即1.13、1.13a或1.13b，产生与相应肽相比在氨基酸序列上具有质的差异的肿瘤新抗原和/或由开放阅读框编码的新氨基酸序列，其中所述开放阅读框仅存在于肿瘤中而不存在于患者的正常细胞中。优选地，多个不同肿瘤新抗原中的每个肿瘤新抗原由彼此之间至少一个氨基酸不同的氨基酸序列定义。
根据本发明，双链DNA分子池计数至少10，优选至少20，更优选至少40，甚至更优选至少60，有利地至少100个不同的双链DNA分子，每个编码不同的肿瘤新抗原(或来自感染因子的不同表位)，其中，如果所述双链DNA分子由编码肿瘤新抗原的序列定义，并且所述肿瘤新抗原具有与由所述另一双链DNA分子编码的另一新抗原的氨基酸序列至少一个氨基酸不同的氨基酸序列，则所述双链DNA分子不同于所述双链DNA分子池中的另一双链DNA分子。当然，所述池可能含有同一双链DNA分子的多个拷贝。
有利地，多种不同肿瘤新抗原中的每一种肿瘤新抗原由与其相应“参考”序列的氨基酸序列相比具有相同突变的氨基酸序列定义，或者由从头开放阅读框编码的从头氨基酸序列定义，所述从头开放阅读框仅存在于患者肿瘤的DNA中而不存在于患者正常细胞的DNA中，即PBMC，其中相同的突变位于所述多种不同肿瘤新抗原中的每一种新抗原的氨基酸序列中的不同位置。例如，对于第一肿瘤新抗原，第一突变基本上位于第一肿瘤新抗原的氨基酸序列的中间，而对于第二肿瘤新抗原，相同的第一突变基本上位于第二肿瘤新抗原的氨基酸序列的前半部分或第一个四分之一或后半部分或最后一个四分之一，其中肿瘤新抗原的第一氨基酸对应于肿瘤新抗原1.13片段的第一5’密码子。
优选地，使用正向引物5.50和反向引物5.60通过PCR扩增双链DNA分子池。优选地，根据本发明，反向引物是可延伸至DNA分子3’端的寡核苷酸聚T，如SEQ ID NO:79或SEQ IDNO:80。
优选地，双链DNA分子池的产生和双链DNA分子池的扩增使用相同的管进行，从而使用相同的反应物(引物对、聚合酶、dNTP、反应介质)，首先使两条链延伸，每条链充当另一条链延伸的模板，然后以同时或依次的方式扩增它们，分离两条延伸的链，在较低温度下进行特异性引物的碱基配对(5.50，5.60)，然后在较高温度下延伸。在另一种替代方案中，在第一次延伸后，即第一次延伸步骤完成后，将引物加入反应介质中。
优选地，双链DNA分子池还包含由RNA依赖型聚合酶识别的片段，例如α病毒nsP1-4的非结构蛋白。事实上，当双链DNA分子池用作在体外将DNA分子转录成RNA分子以生产RNA疫苗的模板时，所生产的mRNA能够反式扩增是有用的，例如基于编码的RdRp的反式扩增。这种RNA反式扩增允许减少给予患者的mRNA疫苗剂量。
优选地，本发明还涉及产生针对影响患者的癌症的RNA疫苗的方法，所述方法包括产生根据本发明的DNA分子或根据本发明的池的步骤和进行将所述DNA分子体外转录成RNA分子的步骤。
优选地，根据本发明的用于产生RNA疫苗的方法还包括将RNA分子配制成疫苗的步骤。
有利地，本发明还涉及可通过本发明的用于产生RNA疫苗的方法获得的疫苗。
有利地，本发明还涉及根据本发明可获得的用于治疗影响患者的癌症的疫苗。
实施例
实施例1：患者肿瘤的肿瘤新抗原的鉴定。
本发明人对来自患者肿瘤样品的DNA和来自患者外周血单个核细胞(PBMC)的DNA进行了全基因组测序。还对肿瘤样本进行了RNASeq分析。肿瘤新抗原的鉴定是基于开放阅读框(ORF)实现的，其中从肿瘤的RNASeq中鉴定mRNA，其中mRNA具有预测的肽序列，与参考肽序列相比具有至少一个鉴定的差异。所述参考肽序列是源自开放阅读框的预测肽序列，所述开放阅读框从患者PBMC的DNA的全基因组测序数据中鉴定。鉴定出的差异可能是与参考肽序列相比具有不同氨基酸的点突变的结果，也可能是易位、缺失和/或插入缺失或融合的结果。在专利申请EP21196366.5中可以找到鉴别患者肿瘤的肿瘤新抗原的详细方案。
实施例2：新抗原的氨基酸序列和DNA序列的鉴定。
本发明人鉴定了27个氨基酸的新抗原肽序列，其中与参考肽序列相比，所鉴定的差异基本上位于新抗原肽序列的27个氨基酸序列长度的中间。
新抗原肽序列通过在线工具转化为核酸序列。当核酸序列用作RNA疫苗中的模板时，此类工具优化密码子的使用以在人类中最佳表达，并减少RNA二级结构的形成以及不想要的免疫应答，或增加所需的免疫应答。
实施例3：包含多种肿瘤新抗原的本发明DNA分子池的合成。
本发明人使用包含实施例2中获得的多种肿瘤新抗原的DNA序列的基于计算机DNA写入技术(参见TWIST Bioscience的Twist Oligo-Pools技术)合成池中的单链DNA分子。在根据本发明的池中，合成了多个第二单链DNA分子，每个分子具有基本相同的序列SEQ IDNO:8，长度为297个核苷酸。池中还合成了多个60种不同的第一单链DNA分子，其中60种不同的第一单链DNA分子基本上具有SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:72的序列，其中序列SEQ IDNO:13至SEQ ID NO:72中的每一个都是长度为291个核苷酸的序列。反义的第二单链DNA分子可以与每个第一单链DNA分子杂交，重叠部分的序列对应于SEQ ID NO:5的核苷酸30至52(有义/反义配对的序列)。
实施例4：根据本发明的DNA分子
根据本发明获得的DNA分子序列的示例如图6所示，示出了600个核苷酸的DNA序列。从第一个核苷酸1开始，DNA分子包含优化的T7 RNA聚合酶启动子片段(图6中DNA分子序列中粗体的小写字母)，后面是β-珠蛋白翻译增强子片段的序列(小写字母)。下一个片段是编码人LAMP-1信号肽的片段(粗体小写字母)，随后是编码27个氨基酸的肿瘤新抗原的片段(大写字母)。下一片段是编码DC-Lamp的片段(小写字母)。在DC-Lamp序列中，存在一个重叠序列(突出显示大写字母)，代表第一和第二个单链DNA分子之间的重叠序列。在DC-Lamp序列之后，存在用于翻译和稳定优化的3’UTRβ-珠蛋白片段(β-珠蛋白UTR)(粗体小写字母)，随后是70个核苷酸至105个核苷酸的聚A尾。
图7显示了相同的DNA分子序列，其中DNA序列编码部分的氨基酸序列与DNA序列并排。
图8类似于图7，其中示出了第一个单链DNA分子的5’至3’序列(正向引物)，还示出了与第一单链DNA分子反义的第二单链DNA分子的5’至3’序列(反向引物)。还示出了在随后的PCR扩增中使用的正向(PCR引物)和反向引物(gc-T150)。
实施例5：双链DNA分子池的建立
在实施例3中获得了第一和第二单链DNA分子之间的杂交DNA分子。从这些杂交的DNA分子中，使用DNA聚合酶对每条链进行延伸，以产生毫摩尔浓度水平的双链DNA分子。
实施例6：双链DNA分子池的扩增
为了能够制备后续体外转录所需的足够大量的双链DNA分子，允许制备将被掺入本发明RNA疫苗中的RNA分子，我们扩增了实施例5中获得的双链DNA分子池。为此，我们使用正向引物和反向引物对双链DNA分子进行了13个循环的PCR扩增，所述正向引物具有对应于SEQ ID NO:7的序列，所述反向引物具有对应于SEQ ID NO:79的序列。
PCR反应的组分有：
—5×KAPA高保真度缓冲液(1×)，
—每种dNTP混合物10mM，
—10μM正向引物，
—10μM反向引物，
—实施例4中获得的DNA分子池(20ng/ul)，
—KAPAHiFi热启动DNA聚合酶(1U/ul)，和
—PCR级用水。
PCR反应条件为：
—初始变性(95℃3分钟)
—变性(98℃20秒)
—退火(15秒)
—延伸(72℃15秒)
—最终延伸(72℃1分钟)。
实施例7：双链DNA分子池的体外转录
将实施例6中获得的扩增的双链DNA分子池在体外转录以制备相应的RNA分子池。
本发明人表明，扩增的双链DNA分子池和IVT后相应的mRNA分子池是正确产生的，其中DNA池中DNA片段的大小和RNA池中RNA片段的大小与DNA和RNA池的片段的预期理论大小相匹配。此外，本发明人表明，IVT之前的每个DNA分子的读取计数比率与IVT之后获得的每个相应RNA分子的读取计数比率正相关。最后，本发明人表明该池中的所有DNA分子都已被正确转录成mRNA分子。
应当理解，本发明不限于所描述的实施方案，并且可以在不超出权利要求范围的情况下有所变化。
Claims (15)
1.一种合成的DNA分子，所述合成的DNA分子包含在转录成相应RNA分子的启动子控制下编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的一个片段，以及将所述翻译的RNA分子翻译成肽的片段。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，还包含编码如下序列的片段，所述序列用于稳定和/或靶向和/或转运囊泡区的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位和/或将编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位导向MHC分子。
3.根据前述权利要求中任一项所述的DNA分子，还包含编码翻译增强子和/或3’-UTR和/或3’聚A尾片段和/或5’-UTR的片段。
4.根据前述权利要求中任一项所述的DNA分子，所述DNA分子是双链的，大小为每链100个核苷酸至约2500个核苷酸，优选每链300个核苷酸至约800个核苷酸，更优选每链约400个核苷酸至约700个核苷酸，还更优选每链约500(或550)个核苷酸至约650(或600)个核苷酸。
5.一种DNA分子，包含(i)编码肽的(第二)部分的片段，所述肽用于将抗原导向MHC分子，(ii)用于增加转录的RNA的稳定性或用于增加转录的RNA翻译成蛋白质的片段，和(iii)编码聚A尾的片段。
6.根据权利要求5所述的DNA分子，所述DNA分子是反义的，优选与前述权利要求1至4中任一项所述的有义DNA分子进行碱基配对。
7.根据前述权利要求1至4中任一项所述的DNA分子的制备方法，包括在启动子的控制下进行编码肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的DNA分子的化学合成的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，包括进行以下化学合成的步骤：(i)第一单链DNA分子，包含用于在RNA中转录的启动子、用于其翻译的片段和用于内部导向与肿瘤新抗原或来自感染因子的表位框内融合的靶向序列和遗传元件的第一部分，所述遗传元件编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位以呈递至T淋巴细胞的序列，和(ii)第二单链DNA分子，编码遗传元件的第二部分，所述遗传元件编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的序列，以呈递至T淋巴细胞，其中所述第二单链DNA分子是反义的，并且其中所述第一部分和第二部分形成完整的序列，用于装载肿瘤新抗原或来自感染因子的表位以呈递至T淋巴细胞，并且其中所述第一部分和第二部分存在允许特定碱基配对的重叠(至少15个连续核苷酸)，所述方法还包括使(i)中的DNA分子与(ii)中的DNA分子杂交并使两个分子延伸的步骤，以产生双链DNA分子和遗传元件，所述双链DNA分子编码启动子、翻译起始子、用于内部导向与肿瘤新抗原或来自感染因子的表位框内融合的靶向序列，所述遗传元件编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的序列，以呈递至T淋巴细胞。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中DNA分子(ii)还包含3’-UTR和/或聚A尾。
10.根据前述权利要求1至5中任一项所述的DNA分子池或可通过权利要求7至9所述的方法获得的池，所述池包含多种不同的肿瘤新抗原或来自感染因子的多种不同表位。
11.根据权利要求10所述的池，其中所述池的多个DNA分子具有用于转录RNA中肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的转录的相同启动子。
12.根据权利要求10或11所述的池，其中所述池的多个DNA分子具有编码用于肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的内部靶向的序列的相同的遗传元件，和/或相同的翻译增强子和/或编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染因子的表位的序列以用于呈递至T淋巴细胞的相同的遗传元件和/或相同的3’-UTR。
13.一种用于产生针对影响患者的癌症的RNA疫苗的方法，所述方法包括产生根据权利要求1至4中任一项所述的DNA分子或权利要求10至12中任一项所述的池的步骤，以及将所述DNA分子体外转录成RNA分子的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，还包括将所述RNA分子配制成疫苗的步骤。
15.一种可通过权利要求14的方法获得的疫苗，用于治疗影响患者的癌症或感染性疾病。
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