CN117929748A - Icam-1蛋白在制备非小细胞肺癌免疫治疗预测试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及ICAM‑1蛋白在制备非小细胞肺癌免疫治疗预测试剂盒中的应用。所述的预测试剂盒包括：ICAM‑1一抗、辣根过氧化物酶标记二抗和免疫组化试剂。本发明将ICAM‑1蛋白作为分子标记，通过利用所述的预测试剂盒检测ICAM‑1蛋白在非小细胞肺癌组织中的相对表达量，根据ICAM‑1蛋白在非小细胞肺癌组织中的相对表达量预测患者对免疫治疗的敏感性，对于非小细胞肺癌患者是否适用免疫治疗具有重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种ICAM-1蛋白在制备非小细胞肺癌免疫治疗预测试剂盒中的应用。
背景技术
近十几年来，免疫治疗为治疗恶性肿瘤提供了一种新的方法。PD-1/PD-L1抑制剂已获批的适应症包括：恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、膀胱癌、MSI-H/dMMR的实体瘤及胃癌和肝癌等。肿瘤细胞PD-L1的表达目前被认为是抗PD-1/PD-L1治疗的优势人群选择的最合理标志物，晚期肺癌的多项临床试验结果都表明肿瘤细胞PD-L1阳性表达与其疗效及预后相关。
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第一位。非小细胞型肺癌(NSCLC)包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，五年生存率很低。
目前临床上用于非小细胞肺癌的免疫治疗是指PD-1/PD-L1抑制剂。抑制性免疫检查点如程序性死亡蛋白-1及其配体(PD-1/PD-L1)的相互作用帮助肿瘤逃避机体免疫系统的攻击，影响癌症免疫周期(Cancer-Immunity Cycle,CIC)的启动。还有其它免疫抑制因素包括可溶性介质如IL-1β、TGF-β等会损害肿瘤抗原呈递的能力，从而间接导致T细胞启动和激活不理想，或抑制内皮细胞上粘附分子的表达，以阻止T细胞浸润。此外，在过表达PD-L1的情况下，肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞会损害CD8+细胞毒性T细胞的活性。所以，针对上述问题，免疫治疗应运而生。PD-1/PD-L1是最常见的免疫检查点，过表达PD-L1的肿瘤细胞可以逃避CD8+细胞毒性T淋巴细胞介导的免疫反应，当抑制肿瘤细胞表面的PD-L1与T淋巴细胞表面的PD-1结合，可激活先天性或适应性免疫反应并摧毁肿瘤细胞。免疫检查点抑制剂(ICI)，在过去的10年里给非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗带来了史诗级巨变，获批用于NSCLC一线治疗的免疫联合化疗、免疫单药治疗的药物已有十余种。
免疫球蛋白超家族(IgSF)指分子结构中有与免疫球蛋白类似的结构域的分子超家族，在细胞黏着中发挥作用。ICAM-1(intercellular cell adhesion molecule-1，即细胞间黏附分子-1)，又叫做CD54，属于黏附分子中免疫球蛋白超家族(IgSF)中的成员，是介导黏附反应重要的一个黏附分子。ICAM-1在静息的血管内皮细胞(VEC)上呈低水平表达，通过与血管内皮细胞表面上的特异性受体结合而发挥其生物学活性。作为白血球和内皮细胞跨膜的蛋白质，ICAM-1在稳定细胞间相互作用和促进白血球和内皮细胞的迁移起到重要作用。ICAM-1的受体有LFA-1(lymphocyte function associated antigen-1，即淋巴细胞功能相关抗原-1)和Mac-1，均属于整合素家族。LFA-1是ICAM-1的主要受体，而Mac-1与ICAM-1的亲和力较低。
ICAM-1在促进炎症部位的黏连性，控制肿瘤恶化和转移以及调节机体免疫反应中起重要作用。它通过与其受体的特异性结合，使白细胞、炎症细胞和肿瘤细胞等与内皮细胞间的黏附作用增强，促进内皮细胞活化，使它们更容易穿透内皮。内皮细胞上的细胞间黏附分子介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合，从而参与细胞的信号转导与活化、细胞组织生长及分化、免疫应答、炎症反应、血管生成及肿瘤转移等生理病理过程。
目前还未见ICAM-1与非小细胞肺癌免疫相关的任何研究报道，尤其缺乏ICAM-1蛋白在制备非小细胞肺癌免疫治疗疗效预测试剂盒中的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供ICAM-1蛋白在制备非小细胞肺癌免疫治疗预测试剂盒中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种ICAM-1蛋白在制备非小细胞肺癌免疫治疗预测试剂盒中的应用。
其中，所述的ICAM-1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，所述的预测试剂盒包括：ICAM-1一抗、辣根过氧化物酶标记二抗和免疫组化试剂。
具体的，所述的ICAM-1一抗为ICAM-1单克隆抗体或多克隆抗体，所述的辣根过氧化物酶标记二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。在本发明实施例中，所述的ICAM-1一抗为ICAM-1兔多克隆抗体，购自ProteinTech公司；所述的辣根过氧化物酶标记二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，购自江苏凯基生物技术有限公司。
具体的，所述的免疫组化试剂包括：体积分数2～4％ H2O2溶液、体积分数0.5～1.5％BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、二甲苯和乙醇。
其中，所述的免疫治疗为抗PD-1/PD-L1免疫治疗。所述抗PD-1/PD-L1免疫治疗的具体药物包括卡瑞利珠单抗、帕博利珠单抗、信迪利单抗，具体药物应用方式包括单药和联合化疗。
本发明还提供了将ICAM-1蛋白作为分子标记，通过使用所述的预测试剂盒检测ICAM-1蛋白在非小细胞肺癌组织中的相对表达量，根据ICAM-1蛋白在非小细胞肺癌组织中的相对表达量判断患者对免疫治疗敏感性的具体方法，包括以下步骤：
(a)利用所述的预测试剂盒对切片后的非小细胞肺癌组织进行免疫组化染色；
(b)利用显微镜和成像装置对步骤(a)免疫组化染色后的非小细胞肺癌组织拍照；
(c)利用生物图像处理软件分析非小细胞肺癌组织染色强度和阳性细胞所占比例，给出评分；
(d)根据评分标准计算非小细胞肺癌组织中ICAM-1蛋白的相对表达量。
其中，步骤(d)中，所述的评分标准分为染色强度评分标准和阳性细胞所占比例评分标准(注：对染色强度和阳性细胞所占比例预测时，只纳入高倍镜(200×)视野中的非小细胞肺癌细胞)。
具体的，所述的染色强度评分标准为：以多数非小细胞肺癌肿瘤细胞在高倍镜(200×)下呈现的染色特性分为阴性、弱阳性、中阳性、强阳性进行计分，无棕色显性记为阴性0分，浅棕色记为阳性1分，棕色记为中等阳性2分，深棕色记为强阳性3分；所述的阳性细胞所占比例评分标准为：即非小细胞肺癌肿瘤阳性细胞百分比(每200×高倍视野计数100个非小细胞肺癌细胞)，0分：<1％，1分：1％-25％，2分：26％-50％，3分：51％-75％，4分：>76％。
其中，步骤(d)中，所述的非小细胞肺癌组织中ICAM-1蛋白的相对表达量，以染色强度评分与阳性细胞所占比例评分的乘积记，即免疫反应性得分(immunoreactivityscore，IRS)，其分值范围为0～12分，标准分值为4分；当免疫反应性得分≤标准分值：ICAM-1蛋白低表达，患者对免疫治疗不敏感；当免疫反应性得分＞标准分值：ICAM-1蛋白高表达，患者对免疫治疗敏感。
进一步的，上述方法的具体步骤为：
(1)制作、切取石蜡4mm的非小细胞肺癌(NSCLC)组织切片；
(2)将步骤(1)所得的切片脱腊，具体操作为：二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→二甲苯Ⅲ10min→100％乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min→ddH2O5min；
(3)灭活酶：在步骤(2)处理后的切片上滴加2～4％体积分数的H2O2溶液，室温孵育20min；
(4)ddH2O洗涤5min×3；
(5)将步骤(4)经ddH2O洗涤的切片放入1×EDTA抗原修复液中煮沸，30min；
(6)自然冷却至室温，ddH2O洗涤5min×3；
(7)用体积分数1％ BSA在37℃下封闭30min后，甩去封闭液，不洗涤，直接加一抗孵育(ICAM-1兔多克隆抗体，ProteinTech公司，稀释比例1：8000)。置入湿盒中4℃冰箱过夜16小时；
(8)从4℃冰箱取出，室温复温15min，0.01mol/L PBS缓冲液洗涤5min×4；
(9)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体，江苏凯基生物技术有限公司，稀释比例1：200)37℃孵育45min；
(10)0.01mol/L PBS缓冲液洗涤5min×4后，用DAB显色试剂显色2-10min，镜下观察；
(11)用ddH2O冲洗，终止显色，然后利用苏木素复染10s；
(12)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
(13)脱水、透明、封片：将蒸馏水浸泡后的切片依次放入80％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇10min，二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，取出后滴入封片剂封片，置于通风橱晾干。
(14)将封片后的切片放入显微镜下观察阳性染色，从非小细胞肺癌组织随机选取3个视野并拍照；
(15)染色结果半定量测定：以高倍镜(200×)下染色强度和阳性细胞所占比例综合评价，进行半定量测定。
有益效果：
申请人经深入研究发现，采用免疫组化方法检测ICAM-1在晚期应用免疫治疗的非小细胞肺癌患者组织中的表达量，能够判断患者对于免疫治疗的敏感性。本发明基于ICAM-1蛋白的表达量与非小细胞肺癌免疫治疗的这种相关性，以该蛋白作为分子标记，对其表达量进行检测，可以用于非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效的预测指标。
正是基于以上发现，本发明提供了一种通过ICAM-1蛋白预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效的方法及试剂盒，该方法将ICAM-1蛋白作为分子标记，利用ICAM-1单克隆抗体或多克隆抗体，以及相应的免疫组化试剂，分析ICAM-1蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达量，预测患者的对免疫治疗的敏感性。
本发明ICAM-1蛋白与非小细胞肺癌免疫治疗疗效相关性的发现，为临床上免疫治疗疗效预测提供了全新的生物标志物。当评分≤4分为ICAM-1蛋白低表达，患者对免疫治疗不敏感，临床获益不确切。当免疫组化评分＞4分为ICAM-1蛋白高表达，患者对免疫治疗敏感，临床获益显著。因此，检测ICAM-1表达对于辅助判断晚期非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效具有重要的指导意义。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为GSE126044公开队列中ICAM-1对免疫治疗的预测价值。(A)不同治疗反应的非小细胞肺癌组织中ICAM-1的表达；(B)ICAM-1表达量对诊断非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效价值的ROC分析。
图2为南京医科大学附属无锡人民医院收集的12例患者队列中ICAM-1对免疫治疗的预测价值。(A)不同治疗反应的非小细胞肺癌组织中ICAM-1染色的代表图；(B)不同治疗反应的非小细胞肺癌组织中ICAM-1的表达；(C)ICAM-1表达量对诊断非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效价值的ROC分析。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明提供一种ICAM-1蛋白在制备非小细胞肺癌免疫治疗预测试剂盒中的应用。其中，所述的免疫治疗预测指的是非小细胞肺癌患者在接受免疫治疗前，预测患者对免疫治疗的敏感情况。
其中，所述的ICAM-1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，所述的预测试剂盒，其配方包括：ICAM-1单克隆抗体或多克隆抗体，体积分数2～4％H2O2溶液，体积分数1％BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，二甲苯，乙醇。
下述实施例中，所用免疫组织实验试剂的配制：
1、梯度乙醇溶液的配制：体积分数75％、80％、85％、95％乙醇溶液均为用无水乙醇和蒸馏水进行稀释配制的。
2、1×EDTA抗原修复液(pH9.0)的配制：取121.1g Tris，加水至1L，再取186.1gEDTA，加水至1L。取1mL 1mol/L Tris和2mL 500mmol/L EDTA，调节pH至9.0，加水补足到1000mL。
实施例1
从南京医科大学附属无锡人民医院收集晚期非小细胞肺癌患者在接受免疫治疗前留取的穿刺或既往手术样本12例，采用免疫组化方法检测ICAM-1蛋白在非小细胞肺癌组织样本中的相对表达量，具体步骤如下：
(1)制作、切取石蜡4mm的非小细胞肺癌(NSCLC)组织切片；
(2)将步骤(1)所得的切片脱腊，具体操作为：二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→二甲苯Ⅲ10min→100％乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min→ddH2O5min；
(3)灭活酶：在步骤(2)处理后的切片上滴加2～4％体积分数的H2O2溶液，室温孵育20min；
(4)ddH2O洗涤5min×3；
(5)将步骤(4)经ddH2O洗涤的切片放入1×EDTA抗原修复液中煮沸，30min；
(6)自然冷却至室温，ddH2O洗涤5min×3；
(7)用体积分数1％ BSA在37℃下封闭30min后，甩去封闭液，不洗涤，直接加一抗孵育(ICAM-1兔多克隆抗体，ProteinTech公司，稀释比例1：8000)。置入湿盒中4℃冰箱过夜16小时；
(8)从4℃冰箱取出，室温复温15min，0.01mol/L PBS缓冲液洗涤5min×4；
(9)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体，江苏凯基生物技术有限公司，稀释比例1：200)37℃孵育45min；
(10)0.01mol/L PBS缓冲液洗涤5min×4后，用DAB显色试剂显色2-10min，镜下观察；
(11)用ddH2O冲洗，终止显色，然后利用苏木素复染10s；
(12)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
(13)脱水、透明、封片：将蒸馏水浸泡后的切片依次放入80％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇10min，二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，取出后滴入封片剂封片，置于通风橱晾干。
(14)将封片后的切片放入显微镜下观察阳性染色，从非小细胞肺癌组织随机选取3个视野并拍照；
(15)染色结果半定量测定：以高倍镜(200×)下染色强度和阳性细胞所占比例综合评价，进行半定量测定。
具体评分如下：
1、非小细胞肺癌肿瘤细胞染色强度评分标准：以多数非小细胞肺癌肿瘤细胞在高倍镜(200×)下呈现的染色特性分为阴性、弱阳性、中阳性、强阳性进行计分，无棕色显性记为阴性0分，浅棕色记为阳性1分，棕色记为中等阳性2分，深棕色记为强阳性3分。
2、非小细胞肺癌肿瘤阳性细胞所占比例评分标准：即非小细胞肺癌肿瘤阳性细胞百分比(每200×高倍视野计数100个非小细胞肺癌细胞)，0分：<1％，1分：1％-25％，2分：26％-50％，3分：51％-75％，4分：>76％。
3、最后将染色强度评分与阳性细胞所占比例评分相乘，得出IRS评分，范围0-12分。
采用以上免疫组化方法的试验步骤检测ICAM-1蛋白在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达情况，标准分值为4分，当评分≤4分为ICAM-1蛋白低表达，说明患者对免疫治疗不敏感，临床获益不确切。当免疫组化评分＞4分为ICAM-1蛋白高表达，说明患者对免疫治疗敏感，临床获益显著。
实验结果如图1和图2所示。以图1为参照，图1是基于GSE数据库通过生物信息学手段预测的GSE126044公开队列中ICAM-1对免疫治疗的预测价值。图2表示的是南京医科大学附属无锡人民医院收集的12例非小细胞肺癌患者队列中ICAM-1对免疫治疗的预测价值。从图1可以看出，GSE126044公开队列中，免疫治疗响应者非小细胞肺癌肿瘤组织中的ICAM-1表达较高；从图2可以看出，南京医科大学附属无锡人民医院收集的12例非小细胞肺癌患者队列中，免疫治疗响应者非小细胞肺癌肿瘤组织中的ICAM-1表达也较高。
综上，ICAM-1蛋白表达量与免疫治疗疗效密切相关，ICAM-1蛋白可以作为免疫治疗疗效预测的标志物。
本发明提供了一种ICAM-1蛋白在制备非小细胞肺癌免疫治疗预测试剂盒中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (9)
1.ICAM-1蛋白在制备非小细胞肺癌免疫治疗预测试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的ICAM-1蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预测试剂盒包括：ICAM-1一抗、辣根过氧化物酶标记二抗和免疫组化试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的ICAM-1一抗为ICAM-1单克隆抗体或多克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的辣根过氧化物酶标记二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的免疫组化试剂包括：体积分数2～4％H2O2溶液、体积分数0.5～1.5％BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、二甲苯和乙醇。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的免疫治疗为抗PD-1/PD-L1免疫治疗。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将ICAM-1蛋白作为分子标记，检测ICAM-1蛋白在非小细胞肺癌组织中的相对表达量，根据ICAM-1蛋白在非小细胞肺癌组织中的相对表达量判断患者对免疫治疗的敏感性。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(a)利用所述的预测试剂盒对切片后的非小细胞肺癌组织进行免疫组化染色；
(b)利用显微镜和成像装置对步骤(a)免疫组化染色后的非小细胞肺癌组织拍照；
(c)利用生物图像处理软件分析非小细胞肺癌组织染色强度和阳性细胞所占比例，给出评分；
(d)根据评分标准计算非小细胞肺癌组织中ICAM-1蛋白的相对表达量。
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