CN117929707A - 用于mmp-9检测的试剂盒 - Google Patents

Abstract

公开了免疫学检测试剂盒，其包括免疫学检测卡，其中所述检测卡包括支持物，与支持物固定连接的印迹膜，位于印迹膜的第一端的吸收性垫和位于印迹膜的第二端的样品接收垫，吸收性垫与样品接收垫在空间上彼此分离并且二者之间的印迹膜上存在靠近吸收性垫一侧的控制线和靠近样品接收垫一侧的检测线。

Description

用于MMP-9检测的试剂盒

本申请要求2022年9月30日向中国国家知识产权局提交的申请号为202211219926.0的发明名称为“泪液样本采集和处理装置”的在先申请的优先权。该在先申请的全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及基质金属蛋白酶9(MMP-9)检测的活性荧光检测试剂盒。

背景技术

泪液是弱碱性的透明液体，其主要包含水，并且还含有无机盐以及生物活性分子如蛋白质、脂类、溶菌酶、补体系统等物质，是组成非常复杂的体系。泪液均匀地分布在结膜囊内，由此形成被称为泪膜的液态薄膜。通常将位于角膜前的泪膜称为角膜前泪膜(PCTF)。角膜前泪膜具有仅6～10nm厚度，然而其能够保持眼球的湿润并且通过填充角膜上的微小起伏来改善眼镜的屈光。

人角膜前泪膜的分泌状况不仅受到眼表的代谢状态的影响，而且通过分析其组成还能检测眼表疾病的存在和人体内环境平衡。因此，PCTF成分的生化分析结果具有检测疾病存在或进展并应用于临床治疗的潜力。另外，由于泪液存在于体表(眼表)，因此对其进行采样的过程为非侵入性的，相比于采集血样、尿样和粪便样本而言，为受试者提供了更为舒适、卫生和简便的选择。

然而，相比于采集血样、尿样和粪便样本等临床上的常规样本，能够被采集到的泪液样本量过小。由此导致检测结果的检出率、准确性、可重现性、可靠性均较差，或者必须付出极大努力才能保证可靠结果。

此外，目前的泪液样本的采集方式主要包括刺激采泪法和毛细管采泪法。前者需要刺激泪液分泌，通常将刺激性物质如清凉油涂抹于下眼睑或使用针刺激睛明穴的方式来实现，容易导致受试者不适，样本量也不能定量采集，因而检测结果波动极大；后者需要眼部出现反射泪液之后用毛细管在眼表吸取泪液，对操作者的要求极高，否则易伤害到受试者眼部，并且受制于毛细管的容量，采集的样本量过少，不利于后续检测。另外，刺激采泪法由于使用了刺激性物质，因此存在污染样本的风险，不能真实反映泪液的情况。

同时，目前的免疫学检测技术，包括荧光免疫层析技术、胶体金免疫层析技术、磁颗粒免疫化学发光技术、乳胶微球免疫层析技术和酶联免疫吸附技术(ELISA)等，为了获得更可靠的检测结果，均需要大体积的样本以及多个单独的仪器设备配合，步骤繁琐冗长，对操作人员的操作要求高，流程耗费的时间长；因而限制了它们在检测小体积样本中的应用。而如果在这些方法中采用小体积的样本，则结果可靠性差，使得获得临床上有意义的判断依据存在困难。

因此，本领域亟需能够可靠地采集和处理小体积泪液样本的手段。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，发明人发现通过使用吸收性材料采集小体积的样本，可以使由此获得的样本直接与免疫学检测卡接触，从而测定感兴趣的待测物质。在另外的步骤中，还可以通过不同的待检测物质的分析结果，实现对受试者的各种生理参数的分析。由此，完成了本发明。

因此，在第一方面，本发明提供了一种免疫学检测试剂盒，其包括免疫学检测卡，其中所述检测卡包括支持物，与支持物固定连接的印迹膜，位于印迹膜的第一端的吸收性垫和位于印迹膜的第二端的样品接收垫，吸收性垫与样品接收垫在空间上彼此分离并且二者之间的印迹膜上存在靠近吸收性垫一侧的控制线和靠近样品接收垫一侧的检测线。

在一个实施方案中，支持物由选自以下的至少一种材料制成：聚合物、玻璃、玻璃纤维素、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯(PS)或其组合。

在一个实施方案中，印迹膜包含选自以下的至少一种材料：纤维素、硝酸纤维素和/或其组合。

在一个实施方案中，样品接收垫为玻璃纤维素膜、尼龙材质纤维素、聚酯纤维素。在一个实施方案中，样品接收垫包含下述物质的任一种：荧光微球，如荧光乳胶微球、彩色乳胶微球、胶体金探针。优选地，荧光乳胶微球为结合荧光标记物探针的聚苯乙烯乳胶微球。

在一个实施方案中，免疫学检测包括荧光免疫层析、胶体金免疫层析、乳胶微球免疫层析、磁微粒化学发光和/或酶联免疫吸附等。在一个实施方案中，免疫学检测卡为荧光免疫层析检测卡或胶体金免疫层析检测卡。

在一个实施方案中，目标物质可以包括：IL-8、IL-1a、IL-1b、IL-12、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α(TNF-a)和干扰素γ(INF-g)、溶菌酶、乳铁蛋白、表皮生长因子(EGF)、脂质沉积蛋白-1、胱抑素S100、a1抗胰蛋白酶、α烯醇化酶、α-1-酸性糖蛋白1、S100 A8(钙粒蛋白A)、S100 A9(钙粒蛋白B)、S100 A4和S100 A11(钙质)、催乳素诱导蛋白(PIP)、脯氨酸蛋白4(PRR4)、PRR3、NACPP4、S100A6、膜联蛋白A1(ANXA1)、膜联蛋白A11(ANXA11)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-S(CST4)、磷脂酶A2、激活蛋白(PLAA)、乳珠蛋白B、亲脂素A、基质金属蛋白酶(MMP)-9、抗Ro\/SSA、La\/SSB抗体、抗a-福德林抗体、水通道蛋白5(AQP5)、补体C-3、白蛋白、钾离子、钠离子、氯离子等。

在一个实施方案中，检测线(12)包含鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG；优选地，检测线(12)的鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG浓度为约5.0mg/ml、4.0mg/ml、3.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml或这些值的任意两个作为端点的范围以及其中所包括的任意值。在一个实施方案中，控制线(b)包含羊抗鸡IgY。在一个实施方案中，荧光乳胶微球包含偶联鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG。在一个实施方案中，检测线(12)包含鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG、控制线(11)包含羊抗鸡IgY和荧光乳胶微球包含偶联鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG；因此免疫学检测卡可以用于检测人基质金属蛋白酶。

在一个实施方案中，免疫学检测卡还包括吸收性片材。

在第二方面，本公开还提供了一种免疫学检测卡的制备方法，包括以下步骤：

(i)提供具有控制线和检测线的印迹膜，任选地将其在37℃干燥8-20小时；

(ii)提供样品接收垫，并在样品接收垫上提供荧光乳胶微球或胶体金探针，任选地将其在37℃干燥8-20小时；

(iii)将样品接收垫放置在印迹膜的靠近检测线的第二端并使二者接触，和

(iv)将吸收性垫放置在印迹膜的靠近控制线的第一端并使二者接触。

在一个实施方案中，在样品接收垫上提供荧光乳胶微球。优选地，在样品接收垫上提供荧光乳胶微球包括以下步骤：

(ii-1)用活化液处理空白的荧光乳胶微球；

(ii-2)用偶联缓冲液处理步骤(ii-1)中获得的荧光乳胶微球，获得荧光乳胶微球混悬液；

(ii-3)用鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG处理步骤(ii-2)中获得的荧光乳胶微球混悬液；

(ii-4)用封闭液处理步骤(ii-3)中获得的荧光乳胶微球混悬液；

(ii-5)用第二洗涤液处理步骤(ii-4)中获得的荧光乳胶微球混悬液；

(ii-6)将步骤(ii-5)中获得的荧光乳胶微球混悬液用微球稀释液稀释后喷洒在空白的样品接收垫上。

优选地，在步骤(ii-1)之前还包括步骤(ii-0)用第一洗涤液洗涤荧光乳胶微球，以获得空白的荧光乳胶微球，更优选地，所述洗涤在超声下进行，还更优选地，所述洗涤还包括在超声处理之后离心。优选地，第一洗涤液包含吗啉乙磺酸，优选为吗啉乙磺酸的水溶液。

优选地，步骤(ii-1)的用活化液处理空白的荧光乳胶微球包括用第一活化液和第二活化液处理空白的荧光乳胶微球。第一活化液为N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐在第一洗涤液中的溶液，优选地，N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐的浓度为10～30mg/mL。第二活化液为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐在第一洗涤液中的溶液，优选地，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为10～30mg/mL。封闭液包含酪蛋白、牛血清白蛋白和缓冲剂。

优选地，步骤(ii-2)的偶联缓冲液包含N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸，其浓度优选为约6g/L，优选具有约8.0的pH值。

优选地，在步骤(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)和/或(ii-5)的处理之后还分别包括离心，优选进行5～60min，更优选进行10～40min，还更优选进行10～30min。

优选地，在步骤(ii-0)和/或(ii-4)还包括使用超声辅助洗涤。

优选地，步骤(ii-6)中的喷涂以5-10μL/cm的使用量进行。

优选地，在步骤(ii-3)中，鼠抗人基质金属蛋白酶9(MMP-9)IgG与步骤(ii-2)中获得的荧光乳胶微球混悬液的质量比为(0.1-0.5):(1-5)。步骤(ii-3)的处理在35～40℃，优选37℃进行至少2小时，优选至少3小时的时间。

优选地，步骤(ii-4)的处理在35～40℃，优选37℃进行5～60min，更优选进行10～40min，还更优选进行10～30min的时间。

作为一个实例，第一洗涤液为具有约6.1的pH值的约10.66g/L的吗啉乙磺酸水溶液；第一活化液为约20mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐在第一洗涤液中的溶液；第二活化液为约20mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐在第一洗涤液中的溶液；偶联缓冲液为具有约8.0的pH值的约5.96g/L的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸溶液；封闭液为包含30g/L的酪蛋白，10g/L牛血清白蛋白与0.05mol/L的Trisbase缓冲液的溶液；第二洗涤液为具有约8.0的pH的6g/L的Trisbase缓冲液；和微球稀释液为具有约8.0的pH的30％蔗糖、0.5％酪蛋白、1％甘氨酸与50mM Trisbase的缓冲液。

在第三方面，本文中还提供了一种检测泪液中目标物质的方法。

在一个实施方案中，检测泪液中目标物质的方法包括以下步骤：

a’.使第一吸收性片材与眼表接触以采集泪液，获得经泪液至少部分饱和的第一吸收性片材，其中经泪液至少部分饱和的第一吸收性片材具有完全饱和的部分；

b’.使第一吸收性片材与本公开的第一方面中的免疫学检测卡接触。

在一个实施方案中，检测泪液中目标物质的方法包括以下步骤：

a’.使至少两个第一吸收性片材与同一受试者眼表在不同时间点接触以采集泪液，获得至少两个经泪液至少部分饱和的第一吸收性片材，其中经泪液至少部分饱和的第一吸收性片材具有完全饱和的部分；

b’.使至少两个第一吸收性片材分别单独与本公开的第一方面中的免疫学检测卡接触。

在一个实施方案中，同一受试者在不同时间点处于不同状态，例如分别处于健康状态或者疾病状态，尤其是例如在不同时间点均处于健康状态或均处于疾病状态，或者在至少一个时间点处于健康状态和在至少另一个时间点处于疾病状态。在一个实施方案中，本文中提供了针对同一受试者在不同时间点采集的一种或多种泪液中目标物质的定性、半定量或定量检测。在一个实施方案中，本文中提供了同一受试者在不同时间点的多个泪液样本中目标物质定量的方式检测。

在一个实施方案中，检测泪液中目标物质的方法包括以下步骤：

a’.使至少两个第一吸收性片材分别与不同受试者眼表在不同时间点接触以采集泪液，获得至少两个经泪液至少部分饱和的第一吸收性片材，其中经泪液至少部分饱和的第一吸收性片材具有完全饱和的部分；

b’.使至少两个第一吸收性片材分别单独与本公开的第一方面中的免疫学检测卡接触，以分析泪液中的目标物质。

在一个实施方案中，不同受试者处于相同或者类似状态，例如分别处于健康状态或患有相同或者类似疾病。在一个实施方案中，不同受试者为不同状态，例如分别处于健康或患有相同或类似疾病。在一个实施方案中，本文中提供了对不同受试者一种或多种泪液中的目标物质定性、半定量或定量的方式检测。在一个实施方案中，本文中提供了对不同受试者多种泪液中的目标物质定量的方式检测。

在一个实施方案中，第一吸收性片材的长度为至少约5mm，至少约6mm，至少约10mm，至少约15mm，甚至至少约20mm。在一个实施方案中，第一吸收性片材的宽度为至少约5mm，至少约6mm，或至少约7mm。

在一个实施方案中，本文中提供了不同的目标物质定性、半定量或定量的方式检测。在一个实施方案中，本文中提供了在同一泪液样本中对至少约2，至少约5，至少约10，至少约20，至少约50，至少或100，至少约200，或更多种不同的目标物质定性、半定量或定量的方式检测。在一个实施方案中，该同一泪液样本为小体积的样本，例如泪液样本的量少于约0.0050mL，优选少于约0.0040mL，更优选少于0.0030mL，最优选少于0.0025mL。在一个实施方案中，本文中提供了在同一泪液样本中对至少约2，至少约5，至少约10，至少约20，至少约50，至少约100，至少约200，或更多不同的目标物质进行定量和比较的方式检测。在一个实施方案中，本文中提供了在同一泪液样本中对至少约2，至少约5，至少约10，至少约20，至少约50，至少约100，至少约200，或更多不同的目标物质的相对量进行比较的检测方法。

在第四方面，本文中还提供了一种免疫学采样和检测试剂盒，其包括根据上述第一方面中免疫学检测卡。

在第五方面，本文中还提供了使用第一方面中的泪液样本采集和处理装置采集和处理泪液的用途。

本发明的有益效果

本发明的试剂盒通过采集泪液即可检测其中的多种免疫学目标物质，操作简单，检测可靠性和灵敏度均高，能够非常简便和快速地获得检测结果。

实施例

下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明的内容所实现的技术方案均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另外指明，否则下述实施例中所使用的实验方法均为本领域常规方法；下述实施例中所使用的试剂、原料、仪器、设备等，均可从商业途径获得。

实施例1胶体金检测卡的制备

1.制备印迹膜：将具有控制线和检测线的空白印迹膜在37℃干燥8-20小时。

2.制备样品接收垫：取1ml 40nm胶体金溶液，向其中加入10μl 50mM碳酸钾涡旋混匀，静置5min。取10μg鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG，直接加入胶体金溶液中，涡旋混匀，静置室温反应30min。反应结束后，加入浓度为10％的BSA(牛血清白蛋白)100μl，涡旋混匀，室温静置反应30min。反应结束后10000rpm离心20min，弃掉上清液。然后向残余物中添加0.1mL pH为8.0的包含30％蔗糖、0.5％酪蛋白、1％甘氨酸与50mM Trisbase的溶液定容，由此获得混合物并将其以5-10μL/cm的量喷涂至玻璃纤维素膜上，获得样品接收垫。

3.将上一步骤制备的样品接收垫以搭接方式放置在在印迹膜上靠近检测线的第二端；

4.将吸收性垫以搭接方式放置在印迹膜上靠近控制线的第一端。

实施例2样本洗脱率的检验

吸取100μl校准品，加入检测卡加样孔内，水平静置，避光反应15min后判读结果，提供的校准品为MMP-9(基质金属蛋白酶-9)的S0至S5的溶液，浓度梯度依次设置为0ng/ml、0.3ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、60ng/ml。

将上述不同浓度梯度的校准品分别上样至实施例1所制备的检测卡，以验证其准确性，获得下表1所述结果。

表1

实施例3泪液检测试验

使市售Schirmer泪液分泌实验的检测滤纸条与眼表接触以采集泪液，使该滤纸条被泪液饱和。将滤纸条放置在实施例3制备的试剂盒的样品接收垫上进行分析。获得下表2和3所示的结果。

表2

表3

上文对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.免疫学检测试剂盒，其包括免疫学检测卡，其中所述检测卡包括支持物，与支持物固定连接的印迹膜，位于印迹膜的第一端的吸收性垫和位于印迹膜的第二端的样品接收垫，吸收性垫与样品接收垫在空间上彼此分离并且二者之间的印迹膜上存在靠近吸收性垫一侧的控制线和靠近样品接收垫一侧的检测线。

2.根据权利要求1所述的免疫学检测试剂盒，其特征在于，支持物由选自以下的至少一种材料制成：聚合物、玻璃、玻璃纤维素、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯(PS)或其组合。

3.根据权利要求1或2所述的免疫学检测试剂盒，其特征在于，印迹膜包含选自以下的至少一种材料：纤维素、硝酸纤维素和/或其组合。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫学检测试剂盒，其特征在于，样品接收垫为玻璃纤维素膜、尼龙材质纤维素、聚酯纤维素；和/或样品接收垫包含下述物质的任一种：荧光微球，如荧光乳胶微球、彩色乳胶微球、胶体金探针；优选地，荧光乳胶微球为结合荧光标记物探针的聚苯乙烯乳胶微球。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫学检测试剂盒，其特征在于，免疫学检测包括荧光免疫层析、胶体金免疫层析、乳胶微球免疫层析、磁微粒化学发光和/或酶联免疫吸附；优选地，免疫学检测卡为荧光免疫层析检测卡或胶体金免疫层析检测卡。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫学检测试剂盒，其特征在于，免疫学检测的目标物质包括：IL-8、IL-1a、IL-1b、IL-12、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α(TNF-a)和干扰素γ(INF-g)、溶菌酶、乳铁蛋白、表皮生长因子(EGF)、脂质沉积蛋白-1、胱抑素S100、a1抗胰蛋白酶、α烯醇化酶、α-1-酸性糖蛋白1、S100 A8(钙粒蛋白A)、S100 A9(钙粒蛋白B)、S100 A4和S100 A11(钙质)、催乳素诱导蛋白(PIP)、脯氨酸蛋白4(PRR4)、PRR3、NACPP4、S100A6、膜联蛋白A1(ANXA1)、膜联蛋白A11(ANXA11)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-S(CST4)、磷脂酶A2、激活蛋白(PLAA)、乳珠蛋白B、亲脂素A、基质金属蛋白酶(MMP)-9、抗Ro\/SSA、La\/SSB抗体、抗a-福德林抗体、水通道蛋白5(AQP5)、补体C-3、白蛋白、钾离子、钠离子、氯离子。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫学检测试剂盒，其特征在于，检测线(12)包含鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG；优选地，检测线(12)的鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG浓度为约5.0mg/ml、4.0mg/ml、3.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml或这些值的任意两个作为端点的范围以及其中所包括的任意值；优选地，控制线(b)包含羊抗鸡IgY；优选地，荧光乳胶微球包含偶联鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG；优选地，检测线(12)包含鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG、控制线(11)包含羊抗鸡IgY和荧光乳胶微球包含偶联鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG；因此免疫学检测卡可以用于检测人基质金属蛋白酶。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫学检测试剂盒，其特征在于，免疫学检测卡还包括吸收性片材。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫学检测试剂盒中的免疫学检测卡的制备方法，包括以下步骤：

(i)提供具有控制线和检测线的印迹膜，任选地将其在37℃干燥8-20小时；

(ii)提供样品接收垫，并在样品接收垫上提供荧光乳胶微球或胶体金探针，任选地将其在37℃干燥8-20小时；

(iii)将样品接收垫放置在印迹膜的靠近检测线的第二端并使二者接触，和

(iv)将吸收性垫放置在印迹膜的靠近控制线的第一端并使二者接触。

其中，在样品接收垫上提供荧光乳胶微球；

优选地，在样品接收垫上提供荧光乳胶微球包括以下步骤：

(ii-1)用活化液处理空白的荧光乳胶微球；

(ii-2)用偶联缓冲液处理步骤(ii-1)中获得的荧光乳胶微球，获得荧光乳胶微球混悬液；

(ii-3)用鼠抗人基质金属蛋白酶-9IgG处理步骤(ii-2)中获得的荧光乳胶微球混悬液；

(ii-4)用封闭液处理步骤(ii-3)中获得的荧光乳胶微球混悬液；

(ii-5)用第二洗涤液处理步骤(ii-4)中获得的荧光乳胶微球混悬液；

(ii-6)将步骤(ii-5)中获得的荧光乳胶微球混悬液用微球稀释液稀释后喷洒在空白的样品接收垫上。

10.检测泪液中目标物质的方法，包括以下步骤：

a’.使第一吸收性片材与眼表接触以采集泪液，获得经泪液至少部分饱和的第一吸收性片材，其中经泪液至少部分饱和的第一吸收性片材具有完全饱和的部分；

b’.使第一吸收性片材与根据权利要求1至8中任一项所述的免疫学检测试剂盒中的免疫学检测卡接触。