CN117924457A - 宫腔粘连分子标记物、检测试剂盒及药物应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了宫腔粘连分子标记物、检测试剂盒及药物应用，具体涉及宫腔粘连分子标记物锌指蛋白521、锌指蛋白521在制备宫腔粘连检测试剂盒中的应用、宫腔粘连检测试剂盒，宫腔粘连检测试剂盒中含有锌指蛋白521检测试剂，通过检测锌指蛋白521表达量来风险预测、评估或诊断宫腔粘连疾病。本发明还涉及了锌指蛋白521抑制剂在制备治疗宫腔粘连疾病中的应用、在制备治疗子宫内膜纤维化引起的疾病的药物中的应用。ZNF521在宫腔粘连的诊断及治疗方面可发挥重要作用，ZNF521抑制剂可应用于制备治疗宫腔粘连、子宫内膜纤维化引起的疾病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及宫腔粘连分子标记物、试剂盒及诊断或治疗宫腔粘连的医药应用。
背景技术
女性子宫内膜是一类高度自我更新的组织，不同于其他组织伤口修复，子宫内膜的周期性再生是一种无瘢痕的功能性修复。而当子宫内膜受到严重损伤，内膜功能性修复障碍，子宫内壁粘连造成宫腔部分或完全闭塞，导致宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)。IUA的主要临床表现为月经量异常、不孕及反复流产等，是子宫性不孕的最常见原因之一，其典型病理特征是子宫内膜纤维化，而间质细胞向肌成纤维细胞转分化是子宫内膜纤维化的主要原因。近年来，随着无痛人流术等宫腔手术的增加，IUA的发病率呈上升趋势。目前，该病的首选治疗方法仍然是宫腔镜下粘连分离，但对重度IUA患者效果不明显，术后复发率达60％以上，造成妊娠率及活产率的显著下降，因此迫切的需要寻找一种新的针对重度IUA的检测及治疗方法。
锌指蛋白521(Zinc finger protein 521,ZNF521)属于C2H2型锌指蛋白家族，由1311个氨基酸序列组成，形成30个Kruppel样锌指结构域穿插在整个氨基酸序列中，这些锌指结构形成6个锌指结构簇。ZNF521通过不同的锌指结构簇与一系列伴侣蛋白相互结合，调控下游靶基因，进而在造血祖细胞稳态、神经元分化、脂肪分化、骨形成及癌症进展等生命过程中发挥关键调节作用，而ZNF521是否参与子宫内膜修复、纤维化相关疾病尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供宫腔粘连分子标记物、检测试剂盒及治疗药物的应用。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
宫腔粘连分子标记物，所述的宫腔粘连分子标记物是锌指蛋白521。
锌指蛋白521在制备宫腔粘连检测试剂盒中的应用，所述的宫腔粘连检测试剂盒以分子标记物锌指蛋白521的表达量作为宫腔粘连严重程度的判断标准。
一种宫腔粘连检测试剂盒，所述的宫腔粘连检测试剂盒中含有锌指蛋白521检测试剂，通过检测锌指蛋白521表达量来风险预测、评估或诊断宫腔粘连疾病。
所述的宫腔粘连检测试剂盒中含有锌指蛋白521基因的特异性引物序列(如PCR引物或qPCR引物)或检测锌指蛋白521蛋白的抗体。
锌指蛋白521抑制剂在制备治疗宫腔粘连疾病的药物中的应用。所述的锌指蛋白521抑制剂为靶向ZNF521蛋白质的si-RNA，其核苷酸序列为：GCTGAGCGATATCACAGAA。
锌指蛋白521抑制剂在制备治疗子宫内膜纤维化引起的疾病的药物中的应用。所述的锌指蛋白521抑制剂为靶向ZNF521蛋白质的si-RNA，其核苷酸序列为：GCTGAGCGATATCACAGAA。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过实验发现，在重度宫腔粘连患者子宫内膜中，ZNF521(锌指蛋白521)表达会显著增加，体外实验结果也证实了，靶向ZNF521蛋白水平的siRNA可以抑制间质细胞向肌成纤维细胞转分化，促进TGFβ1诱导的肌成纤维细胞去分化；ROC实验图表明，ZNF521的表达水平对宫腔粘连具有诊断价值。
因此，ZNF521在宫腔粘连的诊断及治疗方面可发挥重要作用，通过对子宫内膜组织中ZNF521表达水平检测，为宫腔粘连的风险预测、诊断以及为宫腔粘连的治疗和病情评估提供一个可靠的依据，如以ZNF521宫腔粘连分子标记物用于宫腔粘连检测试剂盒。
另一方面，将ZNF521作为靶点，将对应的抑制剂应用于制备治疗宫腔粘连、子宫内膜纤维化引起的疾病的药物产品，以满足临床需求，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：子宫内膜组织中ZNF521表达的qPCR检测及免疫组化分析；其中A：qPCR检测增殖晚期正常人和重度宫腔粘连患者子宫内膜组织中ZNF521的mRNA水平；B：免疫组化分析子宫内膜组织中ZNF521的表达量；
图2：si-ZNF521抑制细胞纤维化实验；其中A：qPCR检测子宫内膜间质细胞转染si-ZNF521后ZNF521和纤维化相关标志(ACTA2、col1、FN1)的mRNA水平；B：WB检测子宫内膜间质细胞转染si-ZNF521后ZNF521和纤维化相关标志(ACTA2、col1、FN1)的蛋白水平；C：子宫内膜间质细胞TGFβ1诱导后转染si-ZNF521,WB检测纤维化相关标志(ACTA2、col1、FN1)的蛋白水平；
图3：子宫内膜组织中ZNF521表达水平的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明中的部分名词解释如下：
本发明中所述的宫腔粘连是指由于子宫内膜基底层损伤，功能层再生修复障碍，形成以内膜纤维化为特征的子宫壁间粘连。
本发明中所述的子宫内膜纤维化引起的疾病指宫腔粘连或子宫内膜疤痕化以及由此导致的子宫性不孕、反复流产及胎盘植入等。
在本发明的部分实施方案中，提供了试剂盒或设备，用于疾病诊断或患病风险预测或评估，优选用于宫腔粘连相关状况评估，还可用于子宫内膜纤维化引起的疾病诊断或风险预测或评估；所述试剂盒或设备中含有用于检测受试者样品中生物标志物表达量的检测试剂，所述生物标志物是锌指蛋白521，检测试剂是锌指蛋白521基因的特异性引物序列(如PCR引物或qPCR引物)或检测锌指蛋白521蛋白的抗体。
在本发明的部分实施方案中，提供了制备锌指蛋白521抑制剂在治疗宫腔粘连疾病、子宫内膜纤维化引起的疾病的药物应用，锌指蛋白521抑制剂为靶向ZNF521蛋白质的si-RNA，其核苷酸序列为：GCTGAGCGATATCACAGAA。
本发明通过实验发现宫腔粘连患者子宫内膜组织中ZNF521表达显著增加。ROC图表明，ZNF521对宫腔粘连具有较好的诊断价值。体外结果显示，靶向ZNF521表达的小干扰片段可抑制间质细胞向肌成纤维细胞的转分化，促进肌成纤维细胞的去分化。因此，ZNF521在宫腔粘连检测和治疗方面可能发挥重要作用，ZNF521抑制剂可用于制备治疗宫腔粘连及其他与子宫纤维化相关疾病的药物。
以下结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明：
实施例1ZNF521在正常及重度宫腔粘连患者子宫内膜组织中的表达
本发明所研究的ZNF521引物序列：
Forward primer 5’-3’：AAGCAAGCGAAACCGAGATCC
Reverse primer 5’-3’：GCCTCTTCTTACAATCTAGTGCC
1、材料，试剂，设备
1.1人子宫内膜组织来源
收集12例正常子宫内膜组织以及12例重度宫腔粘连患者子宫内膜组织，获取子宫内膜组织时，根据激素水平确保内膜组织获取阶段全部统一为增殖晚期阶段。所有参与者签署知情同意书，并经过南京鼓楼医院伦理委员会批准。
1.2主要试剂
TRNzol(天根)、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC水、无酶水、反转录试剂(雅酶)、SYBRGreen(雅酶)、二甲苯、95％、80％及75％乙醇、3％双氧水、柠檬酸修复液、ZNF521抗体(NOVUS)、DAB显色液、苏木素、氨水、中性树脂。
1.3主要仪器
Nano Drop、金属浴、qPCR仪(Roche)、PCR仪(ABI)、烘箱、显微镜(Leica)。
1.4主要方法
1.4.1组织RNA提取及实时荧光定量PCR
采用TRNzol法提取子宫内膜组织总RNA。子宫内膜组织中加入1ml TRNzol溶液，充分匀浆，加入200μl氯仿，充分振荡，静置10min；在4℃12000rpm离心15min，吸取上清，加入等体积异丙醇，充分混匀，静置15min，4℃12000rpm离心15min；弃去上清，加入1ml DEPC水配置的75％乙醇，充分振荡，4℃7500g离心5min，弃去上清，重复75％乙醇清洗一次，室温干燥20min，加入20μL无酶水56℃金属浴溶解，测浓度及纯度。取1ug RNA反转录后得到cDNA，用适量体积的RNase-free水稀释后，SYBR Green方法进行荧光定量PCR检测，目标基因的表达量，采用18S作为内参，相对表达水平用2-ΔCT值表示。
1.4.2子宫内膜组织免疫组化
石蜡切片80℃烘箱60min，二甲苯处理3次，每次5min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，流水冲洗适当时间，3％ H2O2 15min(去除内源性过氧化物酶)，流水冲洗适当时间；柠檬酸热修复，一抗37℃孵育2h，PBST冲洗3遍，每次5min，二抗孵育8min，PBST冲洗3遍，每次5min。显微镜下DAB显色，苏木素染核，氨水返蓝，中性树脂封片后显微镜观察并拍照。
2、实验结果
重度宫腔粘连患者子宫内膜组织中，ZNF521的mRNA和蛋白表达显著增加(图1)。实施例2靶向ZNF521的siRNA抑制纤维化
1、材料，试剂，设备
1.1主要试剂
I型胶原酶(Sigma)、胰酶(Gibco)、PBS、FBS血清(Gibco)、抗生素、TGFβ1(PeproTech)、ZNF521抗体(NOVUS)、电泳液、转膜液、脱脂牛奶(bio-rad)、TBST。
1.2主要仪器
滤网、离心机、细胞培养箱、摇床、PVDF硝酸纤维素膜、双垂直电泳槽、凝胶成像分析系统。
1.3主要方法
1.3.1人原代子宫内膜间质细胞分离培养
新鲜内膜组织用含抗生素的PBS清洗至无肉眼可见血块，于60mm培养皿中剪碎组织至无肉眼可见块状，加入胰酶，充分吹打混匀，37℃培养箱消化10min；去除消化液后加入I型胶原酶，37℃培养箱消化90min；加DMEM/F12完培终止消化，将组织悬液滴加到40μm孔径的滤网，得到间质细胞，DMEM/F12完全培养基培养，传代到第二代用于实验，细胞长至合适密度时予以TGFβ1(10ng/ml)/或转染，处理48h后提取蛋白。
1.3.2WB
弃去培基，用预冷的PBS清洗洗3-4遍，加适量细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解20min，刮下细胞4℃12000rpm离心15min取上清，BCA法测蛋白浓度，加loadingbuffer，99℃金属水浴锅加热10-15min。30μg上样量，转膜后5％牛奶封闭1h；一抗4℃孵育过夜，TBST洗5min，洗3遍，二抗室温孵育1h，TBST洗5min，洗3遍；曝光。
2、结果
si-ZNF521转染子宫内膜间质细胞48h后，ZNF521水平显著降低，α-SMA、collagen1基因表达显著降低；此外，在TGFβ1诱导肌成纤维细胞转分化后，si-ZNF521显著下调α-SMA、collagen1的表达，表明其抑制细胞纤维化过程(图2)。
实施例3ZNF521对宫腔粘连的诊断价值
1、统计学处理
用Graphpad prism软件对以上实施例中的检测结果数据进行统计学分析，P<0.05认为差异有统计学意义。
2、结果
正常及重度宫腔粘连患者子宫内膜组织中ZNF521表达量的ROC曲线可以看出ZNF521对宫腔粘连诊断具有诊断价值：AUC为0.8264，P值为0.009521，面积的95％ CI为0.6457–1.007(图3)。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。
Claims (8)
1.宫腔粘连分子标记物，其特征在于：所述的宫腔粘连分子标记物是锌指蛋白521。
2.锌指蛋白521在制备宫腔粘连检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述的宫腔粘连检测试剂盒以分子标记物锌指蛋白521的表达量作为宫腔粘连严重程度的判断标准。
3.一种宫腔粘连检测试剂盒，其特征在于：所述的宫腔粘连检测试剂盒中含有锌指蛋白521检测试剂，通过检测锌指蛋白521表达量来风险预测、评估或诊断宫腔粘连疾病。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的宫腔粘连检测试剂盒中含有锌指蛋白521基因的特异性引物序列或检测锌指蛋白521蛋白的抗体。
5.锌指蛋白521抑制剂在制备治疗宫腔粘连疾病的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的锌指蛋白521抑制剂为靶向ZNF521蛋白质的si-RNA，其核苷酸序列为：GCTGAGCGATATCACAGAA。
7.锌指蛋白521抑制剂在制备治疗子宫内膜纤维化引起的疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的锌指蛋白521抑制剂为靶向ZNF521蛋白质的si-RNA，其核苷酸序列为：GCTGAGCGATATCACAGAA。
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