CN117919517A - 去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓及其制备方法，该去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓以板层角膜基质透镜组织为主要原料；所述泪道栓形状为圆柱形或锥台型，圆柱形所述泪道栓直径为0.3～0.6mm，高度为2～4mm，锥台型所述泪道栓上端面直径为0.5～0.7mm，下端面直径为0.2～0.3mm，高度为4～6mm。该泪道栓创造性地以飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术的“剔除物”板层角膜基质透镜组织为主要原料，在生物胶作用下裹卷而成，可有效封堵泪小点及泪小管，能够显著提高泪液在眼表停留时间，实现对中重度干眼的辅助治疗，具有抗原性低、免疫排斥反应不明显、无毒无害的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓及其制备方法。
背景技术
干眼为一种多因素引起的慢性眼表疾病，多因泪液的质量及动力异常致使膜不稳定或眼表微环境失衡，可能伴有眼表炎症反应、组织损伤及神经异常，造成眼部多种不适症状，甚至引发视功能障碍。目前该病在我国眼科中的患病率约为30％，病因目前尚未明确，可能与遗传、眼部手术、炎症反应及环境因素有关，具有患病率高、病程长及预后差等特点，发病时患者表现为畏光、眼部疲劳、干涩等不适症状，若病情持续，甚至会影响患者日常生活及学习，故如何做到早诊断、早治疗及对症治疗，成为眼科临床关注的焦点。
目前对该病的治疗方法以缓解症状为主，包括使用眼部润滑剂、口服必需脂肪酸补充剂、眼睑卫生和温热敷、泪点闭塞、睑板腺阻塞的各种治疗、外用抗生素、外用皮质类固醇、外用促泌剂、外用非糖皮质激素免疫调节药物和巩膜隐形眼镜等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓及其制备方法，该去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓以飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术取出的板层角膜基质透镜组织为主要原料，在生物胶作用下裹卷而成，可有效封堵泪小点及泪小管，能够显著提高泪液在眼表停留时间，实现对中重度干眼的辅助治疗，具有抗原性低、免疫排斥反应不明显、无毒无害的特点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓，其特征在于，所述去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓以板层角膜基质透镜组织为主要原料；所述泪道栓形状为圆柱形或锥台型，圆柱形所述泪道栓直径为0.3～0.6mm，高度为2～4mm，锥台型所述泪道栓上端面直径为0.5～0.7mm，下端面直径为0.2～0.3mm，高度为4～6mm。
此外，本发明还提供一种制备上述去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓的方法，其特征在于，包括：
步骤一、处理板层角膜基质透镜组织，具体包括：
步骤101、将板层角膜基质透镜组织用含青霉素和链霉素的无菌生理盐水溶液浸泡冲洗，得到浸泡冲洗后组织；
步骤102、在20～30℃温度条件下，将所述浸泡冲洗后组织浸没于氯化钠溶液中进行高渗处理，洗涤，得到高渗处理后组织；
步骤103、将所述高渗处理后组织浸没于无菌去离子水中溶胀，得到溶胀后组织；
步骤104、在20～30℃温度条件下，将所述溶胀后组织用胰酶替代物震荡消化，得到震荡消化后组织；
步骤105、将所述震荡消化后组织用无菌生理盐水洗涤，然后用无菌去离子水漂洗，取出后置于无菌平皿中干燥脱水，得到干燥脱水后板层角膜基质透镜组织；
步骤二、提供生物胶原料，具体包括：
步骤201、将装有冻干纤维原的产品瓶和装有灭菌注射用水的产品瓶于30℃～37℃水浴中温热3～5min，取2mL所述灭菌注射用水注入装有冻干纤维原的产品瓶中继续水浴，得到纤维蛋白原溶液；
步骤202、将装有冻干人凝血酶的产品瓶和装有氯化钙溶液的产品瓶在30℃～37℃水浴中温热3～5min，取2mL所述氯化钙溶液注入装有冻干人凝血酶的产品瓶中，继续水浴至溶液澄清透明，得到凝血酶溶液；
步骤三、对所述干燥脱水后板层角膜基质透镜组织进行复水，在生物胶作用下进行滚卷，得到泪道栓。
上述的方法，其特征在于，步骤101中，所述板层角膜基质透镜组织直径为6～6.8mm，中央厚度为60～150μm，边缘厚度为10～35μm。
上述的方法，其特征在于，步骤101中，所述板层角膜基质透镜组织为经飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术取出的板层角膜基质透镜组织。
上述的方法，其特征在于，步骤102中，所述氯化钠溶液的浓度为1～2M，所述高渗处理的时间为1～3h。
上述的方法，其特征在于，步骤103中，所述溶胀的时间为0.5～2h。
上述的方法，其特征在于，步骤104中，所述震荡消化包括：将所述溶胀后组织浸没于胰酶替代物中，于速度为150～200转/分的摇床中震荡消化0.5～2h，完成震荡消化；所述胰酶替代物质量为溶胀后组织质量的10～50倍。
上述的方法，其特征在于，步骤201中，所述继续水浴的时间为10～15分钟。
上述的方法，其特征在于，步骤三具体包括：将所述干燥脱水后板层角膜基质透镜组织复水后展开，在向上的面上涂抹2～4微升所述纤维蛋白原溶液，然后涂抹2～4微升所述凝血酶溶液，立即从一边开始滚卷，滚卷完成后于无菌平皿中干燥脱水，然后用无菌手术刀片切割，进行钴60辐照消毒，得到泪道栓。
上述的方法，其特征在于，切割为按照预设泪道栓形状进行切割，所述泪道栓形状为圆柱形或锥台型，圆柱形所述泪道栓直径为0.3～0.6mm，高度为2～4mm，锥台型所述泪道栓上端面直径为0.5～0.7mm，下端面直径为0.2～0.3mm，高度为4～6mm。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1.本发明的去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓，创造性地以飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术的“剔除物”板层角膜基质透镜组织为主要原料，在生物胶作用下裹卷而成，可有效封堵泪小点及泪小管，能够显著提高泪液在眼表停留时间，实现对中重度干眼的辅助治疗，具有抗原性低、免疫排斥反应不明显、无毒无害的特点。
2.本发明去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓的制备方法，包括对板层角膜基质透镜组织进行PS浸泡、高渗和溶胀处理，以及消化干燥，得到泪道栓原料板层角膜基质透镜组织，可充分利用其作为人胶原蛋白组织的特性，具有抗原性低、韧性和膨胀性高、以及良好生物相容性的特点。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
说明书附图
图1为实施例1去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓的形貌图。
图2为实施例1拉伸实验测试结果示意图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓的制备方法，包括：
步骤一、处理板层角膜基质透镜组织，具体包括：
步骤101、将板层角膜基质透镜组织用含PS的无菌生理盐水溶液浸泡冲洗，至无异物残留，得到浸泡冲洗后组织；所述板层角膜基质透镜组织为经飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术取出的板层角膜基质透镜组织，所述板层角膜基质透镜组织直径为6.2mm，中央厚度为80μm，边缘厚度为20μm；所述含PS的无菌生理盐水溶液中，PS为青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度为0.06mg/mL，链霉素的浓度为0.1mg/mL；
步骤102、在25℃温度条件下，将所述浸泡冲洗后组织浸没于浓度为1.5M的氯化钠溶液中，进行2h的高渗处理，洗涤，得到高渗处理后组织；
步骤103、将所述高渗处理后组织浸没于无菌去离子水中，进行1h的溶胀，得到溶胀后组织；
步骤104、在25℃温度条件下，将所述溶胀后组织用胰酶替代物震荡消化1h，得到震荡消化后组织；所述胰酶替代物为非动物来源的重组酶TryplETMExpress，购买自美国gibco，型号为12604-021，规格为500mL；所述震荡消化具体包括：将所述溶胀后组织浸没于胰酶替代物中，于速度为180转/分的摇床中震荡1h，完成震荡消化；所述胰酶替代物质量为溶胀后组织质量的30倍；
步骤105、将所述震荡消化后组织用无菌生理盐水洗涤3次，然后用无菌去离子水漂洗10min，取出后置于无菌平皿中干燥脱水，得到干燥脱水后板层角膜基质透镜组织；所述洗涤中每次洗的时间均为10min，所述干燥脱水中干燥剂为无水氯化钙；
步骤二、提供生物胶原料，具体包括：
步骤201、将装有冻干纤维原的产品瓶和装有灭菌注射用水的产品瓶于35℃水浴中温热4min，取2mL所述灭菌注射用水注入装有冻干纤维原的产品瓶中，继续水浴12分钟，水浴过程中摇动所述产品瓶，避免产生气泡，取出后在光亮处目检，观察产品瓶中纤维蛋白原是否溶解完全，若溶解未完全，继续水浴摇动，至纤维蛋白原完全溶解，得到纤维蛋白原溶液；所述冻干纤维原购买自上海莱士血液制品股份有限公司，100mg/瓶；
步骤202、将装有冻干人凝血酶的产品瓶和装有氯化钙溶液的产品瓶在35℃水浴中温热4min，取2mL所述氯化钙溶液注入装有冻干人凝血酶的产品瓶中，继续水浴至溶液澄清透明，得到凝血酶溶液；所述冻干人凝血酶购买自上海莱士血液制品股份有限公司，1000IU/瓶；所述氯化钙溶液的浓度为40mmol/L；
步骤三、在生物胶作用下，滚卷所述干燥脱水后板层角膜基质透镜组织，具体包括：
步骤301、将所述干燥脱水后板层角膜基质透镜组织用步骤101所述含PS的无菌生理盐水溶液复水至可卷曲，展开，在向上的面上涂抹3微升所述纤维蛋白原溶液，然后涂抹3微升所述凝血酶溶液，立即从一边开始滚卷，滚卷完成后于无菌平皿中干燥脱水，然后用无菌手术刀片切割，进行钴60辐照消毒，得到泪道栓；所述滚卷为手动滚卷，滚卷过程包括边压紧边卷动；所述干燥脱水为用无水氯化钙进行干燥脱水，所述干燥脱水的时间可以为24h；切割为按照预设泪道栓形状进行切割，所述泪道栓形状为圆柱形或锥台型，圆柱形所述泪道栓直径为0.5mm，高度为3mm，锥台型所述泪道栓上端面直径为0.6mm，下端面直径为0.25mm，高度为5mm。
实施例2
本实施例提供一种去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓的制备方法，包括：
步骤一、处理板层角膜基质透镜组织，具体包括：
步骤101、将板层角膜基质透镜组织用含PS的无菌生理盐水溶液浸泡冲洗，至无异物残留，得到浸泡冲洗后组织；所述板层角膜基质透镜组织为经飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术取出的板层角膜基质透镜组织，所述板层角膜基质透镜组织直径为6.8mm，中央厚度为150μm，边缘厚度为35μm；所述含PS的无菌生理盐水溶液中，PS为青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度为0.06mg/mL，链霉素的浓度为0.1mg/mL；
步骤102、在30℃温度条件下，将所述浸泡冲洗后组织浸没于浓度为2M的氯化钠溶液中，进行1h的高渗处理，洗涤，得到高渗处理后组织；
步骤103、将所述高渗处理后组织浸没于无菌去离子水中，进行0.5h的溶胀，得到溶胀后组织；
步骤104、在30℃温度条件下，将所述溶胀后组织用胰酶替代物震荡消化0.5h，得到震荡消化后组织；所述胰酶替代物为非动物来源的重组酶TryplETMExpress，购买自美国gibco，型号为12604-021，规格为500mL；所述震荡消化具体包括：将所述溶胀后组织浸没于胰酶替代物中，于速度为150转/分的摇床中震荡0.5h，完成震荡消化；所述胰酶替代物质量为溶胀后组织质量的10倍；
步骤105、将所述震荡消化后组织用无菌生理盐水洗涤3次，然后用无菌去离子水漂洗10min，取出后置于无菌平皿中干燥脱水，得到干燥脱水后板层角膜基质透镜组织；所述洗涤中每次洗的时间均为10min，所述干燥脱水中干燥剂为无水氯化钙；
步骤二、提供生物胶原料，具体包括：
步骤201、将装有冻干纤维原的产品瓶和装有灭菌注射用水的产品瓶于37℃水浴中温热3min，取2mL所述灭菌注射用水注入装有冻干纤维原的产品瓶中，继续水浴15分钟，水浴过程中摇动所述产品瓶，避免产生气泡，取出后在光亮处目检，观察产品瓶中纤维蛋白原是否溶解完全，若溶解未完全，继续水浴摇动，至纤维蛋白原完全溶解，得到纤维蛋白原溶液；所述冻干纤维原购买自上海莱士血液制品股份有限公司，100mg/瓶；
步骤202、将装有冻干人凝血酶的产品瓶和装有氯化钙溶液的产品瓶在37℃水浴中温热3min，取2mL所述氯化钙溶液注入装有冻干人凝血酶的产品瓶中，继续水浴至溶液澄清透明，得到凝血酶溶液；所述冻干人凝血酶购买自上海莱士血液制品股份有限公司，1000IU/瓶；所述氯化钙溶液的浓度为40mmol/L；
步骤三、在生物胶作用下，滚卷所述干燥脱水后板层角膜基质透镜组织，具体包括：
步骤301、将所述干燥脱水后板层角膜基质透镜组织用步骤101所述含PS的无菌生理盐水溶液复水至可卷曲，展开，在向上的面上涂抹4微升所述纤维蛋白原溶液，然后涂抹4微升所述凝血酶溶液，立即从一边开始滚卷，滚卷完成后于无菌平皿中干燥脱水，然后用无菌手术刀片切割，进行钴60辐照消毒，得到泪道栓；所述滚卷为手动滚卷，滚卷过程包括边压紧边卷动；所述干燥脱水为用无水氯化钙进行干燥脱水，所述干燥脱水的时间可以为24h；切割为按照预设泪道栓形状进行切割，所述泪道栓形状为圆柱形或锥台型，圆柱形所述泪道栓直径为0.3mm，高度为2mm，锥台型所述泪道栓上端面直径为0.5mm，下端面直径为0.2mm，高度为4mm。
本实施例得到的泪道栓性能与实施例1基本一致。
实施例3
本实施例提供一种去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓的制备方法，包括：
步骤一、处理板层角膜基质透镜组织，具体包括：
步骤101、将板层角膜基质透镜组织用含PS的无菌生理盐水溶液浸泡冲洗，至无异物残留，得到浸泡冲洗后组织；所述板层角膜基质透镜组织为经飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术取出的板层角膜基质透镜组织，所述板层角膜基质透镜组织直径为6mm，中央厚度为60μm，边缘厚度为10μm；所述含PS的无菌生理盐水溶液中，PS为青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度为0.06mg/mL，链霉素的浓度为0.1mg/mL；
步骤102、在20℃温度条件下，将所述浸泡冲洗后组织浸没于浓度为1M的氯化钠溶液中，进行3h的高渗处理，洗涤，得到高渗处理后组织；
步骤103、将所述高渗处理后组织浸没于无菌去离子水中，进行2h的溶胀，得到溶胀后组织；
步骤104、在20℃温度条件下，将所述溶胀后组织用胰酶替代物震荡消化2h，得到震荡消化后组织；所述胰酶替代物(TryplETMExpress)为非动物来源的重组酶，购买自美国gibco，型号为12604-021，规格为500ml规格为500mL；所述震荡消化具体包括：将所述溶胀后组织浸没于胰酶替代物中，于速度为200转/分的摇床中震荡2h，完成震荡消化；所述胰酶替代物质量为溶胀后组织质量的50倍；
步骤105、将所述震荡消化后组织用无菌生理盐水洗涤3次，然后用无菌去离子水漂洗10min，取出后置于无菌平皿中干燥脱水，得到干燥脱水后板层角膜基质透镜组织；所述洗涤中每次洗的时间均为10min，所述干燥脱水中干燥剂为无水氯化钙；
步骤二、提供生物胶原料，具体包括：
步骤201、将装有冻干纤维原的产品瓶和装有灭菌注射用水的产品瓶于30℃水浴中温热5min，取2mL所述灭菌注射用水注入装有冻干纤维原的产品瓶中，继续水浴10分钟，水浴过程中摇动所述产品瓶，避免产生气泡，取出后在光亮处目检，观察产品瓶中纤维蛋白原是否溶解完全，若溶解未完全，继续水浴摇动，至纤维蛋白原完全溶解，得到纤维蛋白原溶液；所述冻干纤维原购买自上海莱士血液制品股份有限公司，100mg/瓶；
步骤202、将装有冻干人凝血酶的产品瓶和装有氯化钙溶液的产品瓶在30℃水浴中温热5min，取2mL所述氯化钙溶液注入装有冻干人凝血酶的产品瓶中，继续水浴至溶液澄清透明，得到凝血酶溶液；所述冻干人凝血酶购买自上海莱士血液制品股份有限公司，1000IU/瓶；所述氯化钙溶液的浓度为40mmol/L；
步骤三、在生物胶作用下，滚卷所述干燥脱水后板层角膜基质透镜组织，具体包括：
步骤301、将所述干燥脱水后板层角膜基质透镜组织用步骤101所述含PS的无菌生理盐水溶液复水至可卷曲，展开，在向上的面上涂抹2微升所述纤维蛋白原溶液，然后涂抹2微升所述凝血酶溶液，立即从一边开始滚卷，滚卷完成后于无菌平皿中干燥脱水，然后用无菌手术刀片切割，进行钴60辐照消毒，得到泪道栓；所述滚卷为手动滚卷，滚卷过程包括边压紧边卷动；所述干燥脱水为用无水氯化钙进行干燥脱水，所述干燥脱水的时间可以为24h；切割为按照预设泪道栓形状进行切割，所述泪道栓形状为圆柱形或锥台型，圆柱形所述泪道栓直径为0.6mm，高度为4mm，锥台型所述泪道栓上端面直径为0.7mm，下端面直径为0.3mm，高度为6mm。
本实施例得到的所述泪道栓性能与实施例1基本一致。
性能评价
韧性试验
图1为实施例1的泪道栓的形貌图，根据图1可见，该泪道栓结构清晰、稳定，具有可封闭性，可植入。
表1为实施例1板层角膜基质透镜组织拉伸实验测试结果，测试基于GB/T 1040.3-2006，试样形状为膜片，试验速度为5mm/min。图2为拉伸实验最大力实验示意图，根据表1和图2可知，板层角膜基质透镜组织的最大应力为2.46781N，羊膜的最大应力为0.28728N，表明本发明的原料板层角膜基质透镜组织具有较大的韧性。
表1实施例1板层角膜基质透镜组织拉伸实验测试结果
泪河实验
采用新西兰兔作为实验兔，左眼(OS)为泪道栓实验眼，右眼(OD)为未装泪道栓对照眼，泪河实验结果如表2所示。
表2泪河实验结果
表2中为实验前及实验后两周兔眼的泪河实验结果，实验结果显示，实验眼(OS)泪河面积为0.319mm2，对照眼(OD)泪河面积为0.067mm2，表明本发明的基质透镜泪道栓具有封堵泪道、增加泪液量的作用。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (10)
1.一种去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓，其特征在于，所述去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓以板层角膜基质透镜组织为主要原料；所述泪道栓形状为圆柱形或锥台型，圆柱形所述泪道栓直径为0.3～0.6mm，高度为2～4mm，锥台型所述泪道栓上端面直径为0.5～0.7mm，下端面直径为0.2～0.3mm，高度为4～6mm。
2.一种制备如权利要求1所述去细胞角膜基质板层组织联合生物胶泪道栓的方法，其特征在于，包括：
步骤一、处理板层角膜基质透镜组织，具体包括：
步骤101、将板层角膜基质透镜组织用含青霉素和链霉素的无菌生理盐水溶液浸泡冲洗，得到浸泡冲洗后组织；
步骤102、在20～30℃温度条件下，将所述浸泡冲洗后组织浸没于氯化钠溶液中进行高渗处理，洗涤，得到高渗处理后组织；
步骤103、将所述高渗处理后组织浸没于无菌去离子水中溶胀，得到溶胀后组织；
步骤104、在20～30℃温度条件下，将所述溶胀后组织用胰酶替代物震荡消化，得到震荡消化后组织；
步骤105、将所述震荡消化后组织用无菌生理盐水洗涤，然后用无菌去离子水漂洗，取出后置于无菌平皿中干燥脱水，得到干燥脱水后板层角膜基质透镜组织；
步骤二、提供生物胶原料，具体包括：
步骤201、将装有冻干纤维原的产品瓶和装有灭菌注射用水的产品瓶于30℃～37℃水浴中温热3～5min，取2mL所述灭菌注射用水注入装有冻干纤维原的产品瓶中继续水浴，得到纤维蛋白原溶液；
步骤202、将装有冻干人凝血酶的产品瓶和装有氯化钙溶液的产品瓶在30℃～37℃水浴中温热3～5min，取2mL所述氯化钙溶液注入装有冻干人凝血酶的产品瓶中，继续水浴至溶液澄清透明，得到凝血酶溶液；
步骤三、对所述干燥脱水后板层角膜基质透镜组织进行复水，在生物胶作用下进行滚卷，得到泪道栓。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤101中，所述板层角膜基质透镜组织直径为6～6.8mm，中央厚度为60～150μm，边缘厚度为10～35μm。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤101中，所述板层角膜基质透镜组织为经飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术取出的板层角膜基质透镜组织。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤102中，所述氯化钠溶液的浓度为1～2M，所述高渗处理的时间为1～3h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤103中，所述溶胀的时间为0.5～2h。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤104中，所述震荡消化包括：将所述溶胀后组织浸没于胰酶替代物中，于速度为150～200转/分的摇床中震荡消化0.5～2h，完成震荡消化；所述胰酶替代物质量为溶胀后组织质量的10～50倍。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤201中，所述继续水浴的时间为10～15分钟。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三具体包括：将所述干燥脱水后板层角膜基质透镜组织复水后展开，在向上的面上涂抹2～4微升所述纤维蛋白原溶液，然后涂抹2～4微升所述凝血酶溶液，立即从一边开始滚卷，滚卷完成后于无菌平皿中干燥脱水，然后用无菌手术刀片切割，进行钴60辐照消毒，得到泪道栓。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，切割为按照预设泪道栓形状进行切割，所述泪道栓形状为圆柱形或锥台型，圆柱形所述泪道栓直径为0.3～0.6mm，高度为2～4mm，锥台型所述泪道栓上端面直径为0.5～0.7mm，下端面直径为0.2～0.3mm，高度为4～6mm。
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