CN117919490A

CN117919490A - 一种具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶及制备方法和应用

Info

Publication number: CN117919490A
Application number: CN202410109949.9A
Authority: CN
Inventors: 薛语萌; 闻梦瑶; 尚利
Original assignee: Chongqing Science And Technology Innovation Center Of Northwest University Of Technology; Northwestern Polytechnical University
Current assignee: Chongqing Science And Technology Innovation Center Of Northwest University Of Technology; Northwestern Polytechnical University
Priority date: 2024-01-25
Filing date: 2024-01-25
Publication date: 2024-04-26

Abstract

本发明公开了一种具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶及制备方法和应用，属于纳米生物材料技术领域，水凝胶制备过程包括：以抗坏血酸为主还原剂，丹酚酸B为表面配体和助还原剂，通过一步法在水相中还原硫酸铜溶液，制得丹酚酸B铜团簇纳米酶；将丹酚酸B铜团簇纳米酶负载于由羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶共交联的自愈合水凝胶中，得到具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶。本发明中纳米酶自愈合水凝胶的制备方法简单易行，反应条件温和，本发明所得到的纳米酶自愈合水凝胶具有高效类酶催化供氧和促血管生成性能，在组织修复等生物医学领域有巨大的应用潜力。

Description

一种具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶及制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米生物材料技术领域，涉及一种具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶及制备方法和应用。

背景技术

氧气作为一种重要的信号分子和代谢产物，在机体众多生理过程中发挥重要作用。缺氧通常会激活细胞内相关信号通路，诱导氧化应激和炎症、影响血管生成，进而导致细胞功能障碍，进一步加重组织损伤或功能障碍型疾病，如肾损伤、肺损伤、心血管疾病和慢性创面等。例如，由糖尿病微血管病变引起的血管损伤和微循环异常导致糖尿病慢性创面病灶部位严重缺氧，极易发生局部坏死、持续炎症和重度感染，在世界范围内已成为非创伤性截肢的主要原因。因此，针对病灶部位血运差、严重缺氧的糖尿病慢性创面，改善创面氧气供应并促进血管化并是非常有效的治疗手段。

为了缓解糖尿病慢性创面处严重缺氧的微环境从而促进创面愈合，研究者一直致力于开发有效的系统或者局部供氧策略。其中局部供氧策略如OxybandTM、OxyenesysTM等在国外已得到普遍应用。然而，此类输氧材料作用时间短，并且组织穿透深度有限。此外，血红蛋白及全氟化碳等氧气运输载体也存在着持续性供氧效率低及生物安全性隐患的问题。由于宿主血液是氧气和营养物质的主要来源，有效构建健康的血管网络有助于缓解局部缺氧，促进持续供氧和创面修复。此外，有效调节创面病理性微环境，如减轻氧化应激，对慢性创面修复也具有关键作用。因此，亟需发展一种能够高效持续供氧的同时缓解氧化应激、促进血管化的输氧敷料用于加速慢性创面愈合。

通过酶催化过氧化氢原位产生氧气是目前局部产氧的研究热点。然而，过量的过氧化氢对伤口部位易产生刺激损伤，且过氧化氢酶在复杂伤口环境中的稳定性及活性较差，从而限制了此类新型敷料的进一步应用。纳米酶因其成本低、稳定性高、易于大规模制备和进行表面修饰等优势，有望成为天然酶的替代品而得到广泛研究。尤其是利用兼具类超氧化物歧化酶和类过氧化氢酶催化活性的纳米材料可以通过纳米酶级联反应在清除活性氧，缓解氧化应激的同时持续产氧，进而缓解缺氧状态，促进组织修复。然而，大部分纳米酶生物学功能单一，例如缺乏诱导血管生成和调控组织再生动态过程的生物学活性。因此，有必要开发出一种兼具高效原位供氧、减轻氧化应激以及促血管化功能的新型纳米酶创面修复敷料。

发明内容

为了解决现有技术难以高效供氧和促进创面修复的不足，主要针对糖尿病创面缺氧和血供差的微环境特点，本发明的目的是提供一种具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶及制备方法和应用，该制备方法利用具有抗氧化和促血管化等生物活性的多酚类化合物丹酚酸B为配体合成铜团簇纳米酶，并将其负载于基于天然高分子的自愈合水凝胶中，所得到的纳米酶自愈合水凝胶具有高效类酶原位催化供氧和诱导血管生成性能。本发明中纳米酶自愈合水凝胶的制备方法简单易行，反应条件温和，无需复杂的仪器设备，制备的纳米酶水凝胶具有优异的类超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性，不仅能有效清除内源活性氧，而且可维持稳定的过氧化氢来源确保原位持续性催化供氧，同时还具有调控血管内皮细胞促进血管化的功能，在糖尿病慢性创面等缺氧和血管损伤导致的组织缺损的修复方面具有巨大的应用潜力。

为实现上述目的，本申请采用的技术方案为：

一种具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

1)以抗坏血酸为主还原剂，丹酚酸B为表面配体和助还原剂，通过一步法在水相中还原硫酸铜溶液，制得丹酚酸B铜团簇纳米酶；

2)将丹酚酸B铜团簇纳米酶负载于由羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶共交联的自愈合水凝胶中，得到具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶。

进一步的，步骤1)具体过程为：将硫酸铜溶液和丹酚酸B溶液混合后搅拌均匀后加入抗坏血酸，加热下反应得到丹酚酸B铜纳米团簇。

进一步的，加热的温度为40-50℃，时间为6-24小时。

进一步的，丹酚酸B、抗坏血酸与硫酸铜用量比为1-5μmol：100μmol：10μmol。

进一步的，步骤2)中，羧甲基壳聚糖的氨基或过氧化氢酶的氨基与醛基化硫酸软骨素的醛基进行席夫碱反应，形成自愈合水凝胶。

进一步的，步骤2)的具体过程为：将丹酚酸B铜团簇纳米酶分散于醛基化硫酸软骨素溶液中，再与羧甲基壳聚糖溶液和过氧化氢酶溶液混合，形成具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶。

进一步的，羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为2.5-5：5：0-0.25。

进一步的，丹酚酸B铜团簇纳米酶在具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶中负载量为1-8mg/mL。

一种根据所述方法制备的具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶。

一种根据所述方法制备的具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶在糖尿病创面修复中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明中首先利用具有抗氧化和促血管化等生物活性的多酚类化合物丹酚酸B为配体合成丹酚酸B铜纳米团簇，基于丹酚酸B的酚羟基和铜形成铜配位结构，这种铜配位结构形成了类似天然氧化还原酶的催化活性中心，赋予铜团簇优异的类超氧化物歧化酶和类过氧化氢酶的级联催化活性。在铜团簇的类超氧化物歧化酶活性的作用下将超氧阴离子自由基歧化生成过氧化氢和氧气；随后基于丹酚酸B铜纳米团簇的类过氧化氢酶活性将过氧化氢分解为氧气和水，这种供氧方式能够在组织损伤部位将多余的活性氧转化为溶解氧，同时维持稳定的过氧化氢来源确保原位持续性催化供氧，避免了传统依赖气态氧的输氧方式穿透深度有限的问题。本发明中纳米酶自愈合水凝胶的组分均为天然活性物质或体内微量元素，具有高生物安全性，并且其制备方法简单易行，反应条件温和，无需复杂的仪器设备。

本发明中，将丹酚酸B铜团簇纳米酶负载于基于过氧化氢酶的天然高分子自愈合水凝胶网络中，所得到的水凝胶不仅具有高效的自愈合性能，避免使用过程中的机械损伤、确保使用周期，并且水凝胶的网络结构作为铜团簇纳米酶的载体在提高酶促反应的传质效率，提高催化稳定性以及在体内的滞留时间方面发挥重要作用。水凝胶组分中的天然过氧化氢酶有助于协同催化供氧，进一步提升氧气产生效率。基于羧甲基壳聚糖、过氧化氢酶和醛基化硫酸软骨素之间的席夫碱相互作用形成的自愈合水凝胶用于负载铜团簇纳米酶可以较好地适应创面形状，并且同时实现清除活性氧，改善氧化应激和缓慢释放氧气的功能。此外，丹酚酸B铜团簇和氧气释放的共同作用可以促进血管生成，从而实现慢性创面高效促修复功效。

本发明中，基于丹酚酸B的生物活性，丹酚酸B铜团簇纳米酶可以实现对血管化过程中关键细胞的调控，治疗血管损伤，进一步恢复血供、促进创面微环境调控，所以本发明的纳米酶自愈合水凝胶，在糖尿病慢性创面等缺氧和血管损伤导致的组织缺损的修复方面具有巨大的应用潜力。

附图说明

图1是本发明丹酚酸B铜团簇纳米酶的类超氧化物歧化酶和类过氧化氢酶的催化活性表征，其中(a)为SalB-CuNCs(SalB-CuNCs为丹酚酸B铜团簇纳米酶)的超氧化物歧化酶模拟酶催化能力，主要通过对于超氧阴离子自由基(O₂ ^·-)的清除率来体现，具有浓度依赖性；(b)为SalB-CuNCs类过氧化氢酶的催化活性，主要通过测量不同浓度的SalB-CuNCs在100mmol/L H₂O₂溶液中增加的溶解氧来说明。

图2是本发明中实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中纳米酶自愈合水凝胶的各组分比例优化以及成胶过程。其中，(a)和(b)为实施例1和实例2中组分比例优化，(c)和(d)为实施例3和实例4组分比例优化，(e)和(f)为实施例4中纳米酶自愈合水凝胶的成胶过程。

图3是本发明纳米酶自愈合水凝胶的扫描电镜图。

图4是本发明纳米酶自愈合水凝胶的自愈合效果图。其中，(a)为0min水凝胶的自愈合效果，(b)为10min水凝胶的自愈合效果，(c)为20min水凝胶的自愈合效果，(d)为0min碎片状水凝胶的自愈合效果，(e)为20min碎片状水凝胶的自愈合效果，(f)为0min水凝胶的自愈合效果显微图像，(g)为5min水凝胶的自愈合效果显微图像，(h)为10min水凝胶的自愈合效果显微图像，(i)为15min水凝胶的自愈合效果显微图像，(j)为20min水凝胶的自愈合效果显微图像；图5是本发明纳米酶自愈合水凝胶细胞内催化供氧性能表征。

图6是本发明纳米酶自愈合水凝胶对糖尿病慢性创面第0、3、7、12和17天的治疗效果；

图7为创面愈合率。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达到目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明的具体实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明利用具有生物活性的多酚类化合物丹酚酸B为配体在水相中合成铜团簇纳米酶，并将其负载于基于天然高分子的自愈合水凝胶中，制备一种具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶用于促糖尿病慢性创面修复。选取具有抗氧化和促血管化等生物活性的多酚化合物丹酚酸B为配体，通过一步法在水相中合成丹酚酸B铜团簇纳米酶。铜纳米团簇在生理环境下易发生团聚或被氧化，从而影响其催化活性。本发明中选用多酚类生物活性分子丹酚酸B为配体，一方面可提升铜纳米团簇的稳定性，调控其类超氧化物歧化酶和过氧化氢酶催化活性，进而促进原位供氧功效；另一方面基于小分子配体丹酚酸B的促血管生成活性，丹酚酸B铜团簇纳米酶可以实现对血管化过程中关键细胞的调控，治疗血管损伤，进一步恢复血供、促进创面微环境调控。在此基础上，将铜团簇纳米酶固定于基于过氧化氢酶的天然高分子水凝胶中，所得到的水凝胶不仅具有高效的自愈合性能，避免使用过程中的机械损伤、确保使用周期，并且水凝胶的网络结构作为铜团簇纳米酶的载体，进一步提高催化稳定性和催化效率以及在体内的滞留时间，实现更高效的促糖尿病创面修复功效。

本发明一种具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

1)丹酚酸B铜团簇纳米酶的制备：以抗坏血酸为主要还原剂，丹酚酸B为表面配体和助还原剂，通过一步法在水相中还原硫酸铜溶液，制得丹酚酸B铜团簇纳米酶。具体地说，将硫酸铜溶液和丹酚酸B溶液混合后室温下搅拌。之后加入抗坏血酸后，在加热条件下继续反应得到淡黄色的丹酚酸B铜纳米团簇。

其中，丹酚酸B、抗坏血酸与硫酸铜用量比为1-5μmol：100μmol：10μmol。丹酚酸B和硫酸铜溶液混合搅拌时间为5分钟，加入抗坏血酸后加热温度为40-50℃，反应时间为6-24小时。

2)水凝胶前驱体醛基化硫酸软骨素的制备：水凝胶前驱体醛基化硫酸软骨素是以由高碘酸钠氧化硫酸软骨素获得的，具体过程为：硫酸软骨素在水中充分溶解后，剧烈搅拌下加入高碘酸钠溶液，避光反应。最后加入乙二醇终止反应，使用透析袋透析后进行冷冻干燥。

硫酸软骨素与高碘酸钠的用量比为0.5g：0.625mmol，避光反应时间为2小时，加入乙二醇的量为0.5mL。

3)纳米酶自愈合水凝胶的制备：羧甲基壳聚糖和过氧化氢酶的氨基和醛基化硫酸软骨素的醛基之间的席夫碱反应形成自愈合水凝胶。具体的，将丹酚酸B铜团簇纳米酶预先分散于醛基化硫酸软骨素溶液中，再与羧甲基壳聚糖溶液和过氧化氢酶溶液混合，形成纳米酶自愈合水凝胶。

其中，羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为2.5-5：5：0-0.25。

丹酚酸B铜团簇纳米酶在本发明纳米酶自愈合水凝胶中负载量为1-8mg/mL。

4)生物医学应用：将纳米酶自愈合水凝胶和人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)在缺氧条件下进行共培养，考察水凝胶对于内皮细胞的催化供氧性能。进一步，将纳米酶水凝胶作用于链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的创面处，探究水凝胶对于糖尿病慢性创面促修复功效。

实施例1

1)丹酚酸B铜团簇纳米酶的制备：以抗坏血酸为主要还原剂，丹酚酸B为保护剂和助还原剂，采用一步法在水相中制备丹酚酸B铜团簇纳米酶。具体地说，将硫酸铜水溶液(0.1mL,0.1mol/L)和丹酚酸B水溶液(0.25mL,8mmol/L)加入到10mL超纯水中，混合溶液在室温下搅拌5分钟。随后加入抗坏血酸(0.1mL,1mol/L)后，设置混合物溶液温度为50℃，搅拌24小时，得到呈现淡黄色的丹酚酸B铜纳米团簇。用截止分子量为3kDa的超滤离心管对制备的丹酚酸B铜纳米团簇进行超滤离心纯化，之后置于4℃保存备用。

2)水凝胶前驱体醛基化硫酸软骨素的制备：对硫酸软骨素(分子量5-10kD)使用高碘酸钠进行醛基化，得到水凝胶前驱体醛基化硫酸软骨素。具体制备步骤参考：Li,H.；Cheng,F.；Wei,X.；Yi,X.；Tang,S.；Wang,Z.；Zhang,Y.S.；He,J.；Huang,Y.,Mater.Sci.Eng.C 2021,118,111324.实验步骤如下：0.5g的硫酸软骨素溶于50mL超纯水中，剧烈搅拌下加入2.5mL的高碘酸钠(0.25mol/L)，避光反应2小时。然后加入0.5mL的乙二醇终止反应。使用透析袋透析4天后进行冷冻干燥，得到水凝胶前驱体醛基化硫酸软骨素。

3)纳米酶自愈合水凝胶的制备：羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为2.5：5：0。丹酚酸B铜团簇纳米酶在此纳米酶自愈合水凝胶中负载量为2mg/mL。具体的，将1.2mg丹酚酸B铜团簇纳米酶预先分散于150μL的浓度为20％wt的醛基化硫酸软骨素溶液中，旋涡混合30秒，混合均匀，得到丹酚酸B铜团簇纳米酶混合的醛基化硫酸软骨素溶液。将150μL的10％wt的羧甲基壳聚糖溶液加入300μL超纯水中，再与丹酚酸B铜团簇纳米酶混合的醛基化硫酸软骨素溶液混合均匀，形成纳米酶自愈合水凝胶。

实施例2

2)水凝胶前驱体醛基化硫酸软骨素的制备：对硫酸软骨素(分子量5-10kD)使用高碘酸钠进行醛基化，具体制备步骤参考：Li,H.；Cheng,F.；Wei,X.；Yi,X.；Tang,S.；Wang,Z.；Zhang,Y.S.；He,J.；Huang,Y.,Mater.Sci.Eng.C 2021,118,111324.实验步骤如下：0.5g的硫酸软骨素溶于50mL超纯水中，剧烈搅拌下加入2.5mL的高碘酸钠(0.25mol/L)，避光反应2小时。然后加入0.5mL的乙二醇终止反应。使用透析袋透析4天后进行冷冻干燥。

3)纳米酶自愈合水凝胶的制备：羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为2.5：5：0.25。丹酚酸B铜团簇纳米酶在此纳米酶自愈合水凝胶中负载量为2mg/mL。将1.2mg丹酚酸B铜团簇纳米酶预先分散于150μL的浓度为20％wt的醛基化硫酸软骨素溶液中，旋涡混合30秒混合均匀。将150μL的10％wt的羧甲基壳聚糖溶液加入到300μL的0.5％wt的过氧化氢酶溶液中，再与丹酚酸B铜团簇纳米酶混合的醛基化硫酸软骨素溶液混合均匀形成纳米酶自愈合水凝胶。

实施例3

3)纳米酶自愈合水凝胶的制备：羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为3.75：5：0。丹酚酸B铜团簇纳米酶在此纳米酶自愈合水凝胶中负载量为2mg/mL。将1.2mg丹酚酸B铜团簇纳米酶预先分散于150μL的浓度为20％wt的醛基化硫酸软骨素溶液中，旋涡混合30秒混合均匀。将225μL的10％wt的羧甲基壳聚糖溶液加入225μL超纯水中，再与丹酚酸B铜团簇纳米酶混合的醛基化硫酸软骨素溶液混合均匀形成纳米酶自愈合水凝胶。

实施例4

3)纳米酶自愈合水凝胶的制备：羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为3.75：5：0.19。丹酚酸B铜团簇纳米酶在此纳米酶自愈合水凝胶中负载量为2mg/mL。将1.2mg丹酚酸B铜团簇纳米酶预先分散于150μL的浓度为20％wt的醛基化硫酸软骨素溶液中，旋涡混合30秒混合均匀。将225μL的10％wt的羧甲基壳聚糖溶液加入到225μL的0.5％wt的过氧化氢酶溶液中，再与丹酚酸B铜团簇纳米酶混合的醛基化硫酸软骨素溶液混合均匀形成纳米酶自愈合水凝胶。

实施例5

3)纳米酶自愈合水凝胶的制备：羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为5：5：0.12。丹酚酸B铜团簇纳米酶在此纳米酶自愈合水凝胶中负载量为2mg/mL。将1.2mg丹酚酸B铜团簇纳米酶预先分散于150μL的浓度为20％wt的醛基化硫酸软骨素溶液中，旋涡混合30秒混合均匀。将300μL的10％wt羧甲基壳聚糖溶液加入到150μL的0.5％wt的过氧化氢酶溶液中，再与丹酚酸B铜团簇纳米酶混合的醛基化硫酸软骨素溶液混合均匀形成纳米酶自愈合水凝胶。

实施例6

1)丹酚酸B铜团簇纳米酶的制备：以抗坏血酸为主要还原剂，丹酚酸B为保护剂和助还原剂，采用一步法在水相中制备丹酚酸B铜团簇纳米酶。具体地说，将硫酸铜水溶液(0.1mL,0.1mol/L)和丹酚酸B水溶液(0.25mL,4mmol/L)加入到10mL超纯水中，混合溶液在室温下搅拌5分钟。随后加入抗坏血酸(0.1mL,1mol/L)后，设置混合物溶液温度为50℃，搅拌24小时，得到呈现淡黄色的丹酚酸B铜纳米团簇。用截止分子量为3kDa的超滤离心管对制备的丹酚酸B铜纳米团簇进行超滤离心纯化，之后置于4℃保存备用。

实施例7

1)丹酚酸B铜团簇纳米酶的制备：以抗坏血酸为主要还原剂，丹酚酸B为保护剂和助还原剂，采用一步法在水相中制备丹酚酸B铜团簇纳米酶。具体地说，将硫酸铜水溶液(0.1mL,0.1mol/L)和丹酚酸B水溶液(0.25mL,20mmol/L)加入到10mL超纯水中，混合溶液在室温下搅拌5分钟。随后加入抗坏血酸(0.1mL,1mol/L)后，设置混合物溶液温度为50℃，搅拌24小时，得到呈现淡黄色的丹酚酸B铜纳米团簇。用截止分子量为3kDa的超滤离心管对制备的丹酚酸B铜纳米团簇进行超滤离心纯化，之后置于4℃保存备用。

3)纳米酶自愈合水凝胶的制备：羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为3.75：5：0.19。丹酚酸B铜团簇纳米酶在此纳米酶自愈合水凝胶中负载量为2mg/mL。将1.2mg丹酚酸B铜团簇纳米酶预先分散于150μL的浓度为20％wt的醛基化硫酸软骨素溶液中，旋涡混合30秒混合均匀。将225μL的10％wt羧甲基壳聚糖溶液加入到225μL的0.5％wt的过氧化氢酶溶液中，再与丹酚酸B铜团簇纳米酶混合的醛基化硫酸软骨素溶液混合均匀形成纳米酶自愈合水凝胶。

实施例8

3)纳米酶自愈合水凝胶的制备：羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为3.75：5：0.19。丹酚酸B铜团簇纳米酶在此纳米酶自愈合水凝胶中负载量为1mg/mL。将0.6mg丹酚酸B铜团簇纳米酶预先分散于150μL的浓度为20％wt的醛基化硫酸软骨素溶液中，旋涡混合30秒混合均匀。将225μL的10％wt羧甲基壳聚糖溶液加入225μL的0.5％wt的过氧化氢酶溶液中，再与丹酚酸B铜团簇纳米酶混合的醛基化硫酸软骨素溶液混合均匀形成纳米酶自愈合水凝胶。

实施例9

3)纳米酶自愈合水凝胶的制备：羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为3.75：5：0.19。丹酚酸B铜团簇纳米酶在此纳米酶的自愈合水凝胶中负载量为4mg/mL。将2.4mg丹酚酸B铜团簇纳米酶预先分散于150μL的浓度为20％wt的醛基化硫酸软骨素溶液中，旋涡混合30秒混合均匀。将225μL的10％wt的羧甲基壳聚糖溶液加入到225μL的0.5％wt的过氧化氢酶溶液中，再与丹酚酸B铜团簇纳米酶混合的醛基化硫酸软骨素溶液混合均匀形成纳米酶自愈合水凝胶。

实施例10

同实施例1，与实施例1不同在于，步骤1)中，设置混合物溶液温度为40℃，搅拌24小时。

实施例11

同实施例1，与实施例1不同在于，步骤3)中，设置混合物溶液温度为50℃，搅拌6小时。

实施例12

同实施例1，与实施例1不同在于，步骤3)中，设置混合物溶液温度为45℃，搅拌12小时。

实施例13

同实施例1，与实施例1不同在于，步骤3)中，羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为2.5：5：0.1。

实施例14

同实施例1，与实施例1不同在于，步骤3)中，羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为3：5：0.25。

实施例15

同实施例1，与实施例1不同在于，步骤3)中，羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为5：5：0.2。

实施例16

同实施例1，与实施例1不同在于，步骤3)中，羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为4：5：0.05。

实施例17

同实施例1，与实施例1不同在于，步骤3)中，丹酚酸B铜团簇纳米酶在纳米酶的自愈合水凝胶中负载量为8mg/mL。

对比例1

同实施例4，与实施例4不同之处在于，步骤3)中，未加入丹酚酸B铜团簇纳米酶，制备了自愈合水凝胶。

对比例2

同实施例1，与实施例1不同在于，步骤1)中，设置混合物溶液温度为37℃，无法制备丹酚酸B铜团簇纳米酶。

对比例3

同实施例1，与实施例1不同在于，步骤1)中，搅拌时间不在6-24小时内，无法制备丹酚酸B铜团簇纳米酶。

从对比例2和对比例3可以看出，本发明中的纳米酶自愈合水凝胶中的丹酚酸B铜团簇纳米酶的制备必须采用本发明中的温度和时间。

本发明制得的丹酚酸B铜团簇的具有优异的类酶催化活性。图1是实施例1中制备的丹酚酸B铜团簇纳米酶的类超氧化物歧化酶和类过氧化氢酶的催化活性表征。丹酚酸B铜团簇纳米酶的类超氧化物歧化酶催化活性通过表征其对超氧阴离子自由基的抑制能力进行测定。具体来说，黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶作用产生超氧阴离子自由基，硝基蓝氯化四氮唑(NBT)作为比色探针。如图1中(a)所示，随着丹酚酸B铜团簇浓度的增加，对超氧阴离子的清除效率增加，说明其类超氧化物歧化酶活性越高，其中40μg/mL丹酚酸B铜团簇对超氧阴离子的抑制率为50％。使用便携式溶解氧仪测定丹酚酸B铜团簇在过氧化氢(100mmol/L,pH＝7.4)溶液中的溶解氧产生量来测定其类过氧化氢酶催化活性。如图1中(b)所示，25μg/mL的丹酚酸B铜团簇溶液在加入过氧化氢溶液10分钟后其溶解氧浓度显著增加6mg/L，说明丹酚酸B铜团簇具有良好的类过氧化氢酶催化活性，且这种溶解氧增加量也呈剂量依赖性。

图2是本发明中纳米酶自愈合水凝胶的各组分比例优化以及成胶过程。图2中的(a)、(b)、(c)和(d)分别为实施例1、2、3和4中制备的水凝胶。图2中(e)和(f)为实施例4中制备的纳米酶自愈合水凝胶的成胶过程。在水凝胶的合成中，除了羧甲基壳聚糖的氨基与醛基化硫酸软骨素的醛基之间的席夫碱反应之外，天然的过氧化氢酶上的氨基在促进水凝胶的凝胶化中也起着关键的作用。通过优化浓度，发现图2中(a)和(b)在有无过氧化氢酶均未能形成良好的水凝胶。进一步增加羧甲基壳聚糖的含量后，虽未形成水凝胶结构(图2中(c))，但在加入过氧化氢酶后，在过氧化氢酶表面氨基作用下转换为水凝胶状态(图2中(d))。因此最终优化的羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为实施例4中的3.75：5：0.19。如图2中(e)所示，羧甲基壳聚糖和过氧化氢酶溶液呈现溶液状态，再加入丹酚酸B铜团簇纳米酶混合的醛基化硫酸软骨素后，如图2中(f)所示，溶液逐渐凝胶化得到纳米酶自愈合水凝胶(COC@SalB-Cu)。

图3是本发明纳米酶自愈合水凝胶的扫描电镜图。对实施例4制备的纳米酶自愈合水凝胶进行形貌表征，将制备好的水凝胶于液氮中速冻后置于冷冻干燥机中冻干，将冻干的水凝胶粘贴在导电胶上真空喷金，使用扫描电镜观察水凝胶的表面形貌。由图3可知，纳米酶水凝胶内部为多孔状，且孔径结构均匀。

图4中(a)-(j)是本发明纳米酶自愈合水凝胶的自愈合效果图。图4为实施例4中获得的纳米酶自愈合水凝胶，通过轻轻地贴附两段或小片段的水凝胶来研究水凝胶的自愈合性能。如图4所示，观察到水凝胶在20分钟内自动愈合，尤其是通过显微镜观察到随着时间的推移，两片水凝胶之间的间隙逐渐消失。本发明中纳米酶自愈合水凝胶的快速自愈合性能归因于醛基化硫酸软骨素中的醛基与羧甲基壳聚糖或过氧化氢酶中的氨基之间形成的动态可逆的共价席夫碱网络。

图5是本发明纳米酶自愈合水凝胶细胞内供氧性能表征。图5中的COC和COC@SalB-Cu水凝胶分别为对比例1和实施例4所获得的自愈合水凝胶和纳米酶自愈合水凝胶。利用氧气敏感荧光探针Ru(dpp)₃Cl₂测定水凝胶在HUVECs细胞内的催化供氧能力。将HUVECs接种于8孔板中，密度为2×10⁴细胞/孔，在缺氧条件下孵育18小时。利用缺氧小室模拟细胞培养的缺氧环境，在缺氧小室内提供1％的氧气，5％的二氧化碳和95％的氮气。将自愈合水凝胶、丹酚酸B铜团簇纳米酶和纳米酶自愈合水凝胶和H₂O₂(100μM)与HUVECs共孵育12小时，使用DPBS洗涤细胞，与Ru(dpp)₃Cl₂氧气敏感荧光探针(0.5μM)在缺氧条件下再培养4小时。用荧光共聚焦显微镜测定荧光探针的相对荧光强度(λex＝488nm)进而反映细胞内O₂水平。由图5可得，对照组和单独H₂O₂处理组出现明显的荧光信号，说明氧气含量较低。与此相比，自愈合水凝胶组和丹酚酸B铜团簇纳米酶组的荧光强度降低，且纳米酶自愈合水凝胶处理组表现为最低的荧光信号，说明本发明中的纳米酶自愈合水凝胶具有较好的细胞内催化供氧性能。

图6和图7是纳米酶自愈合水凝胶对糖尿病慢性创面的治疗效果；其中，图6表示第0、3、7、12和17天创面图片；图7表示创面愈合率。使用链脲佐菌素构建糖尿病小鼠模型，给予高脂高糖饲料喂养，将小鼠维持在糖尿病状态下进行创面愈合实验。在对小鼠进行麻醉和脱毛后，使用小手术剪刀在每只小鼠的背部皮肤上制作两个直径为7毫米的全层皮肤伤口。再将小鼠随机分为4组：a)对照组，即不做处理的组；b)TegadermTM(3M)组，即在创面处敷以3M商用敷料的组；c)COC水凝胶组，即在创面处敷以对比例1得到的自愈合水凝胶和d)COC@SalB-Cu水凝胶组，即在创面处敷以实施例4得到的纳米酶自愈合水凝胶。分别于治疗后3、7、12、17天对创面进行拍照，采用Image J软件计算创面大小和愈合率。如图6和图7可得，具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶(COC@SalB-Cu)治疗组相比其他三组显示出较好的促伤口愈合效果。在第3天，与对照组(11.1％)、3M组(5.8％)和COC水凝胶组(14.5％)的创面愈合率相比，COC@SalB-Cu水凝胶处理的创面显示出较高的创面愈合率(37.5％)。第7天，COC@SalB-Cu水凝胶治疗组创面愈合率迅速上升至76.2％，至第12天达到95.2％。第17天，COC@SalB-Cu水凝胶治疗组创面完全闭合并被再生毛发覆盖，其余各组创面仍未愈合。值得注意的是，在17天的治疗期间，COC水凝胶组的伤口大小明显小于对照组和3M组，这表明单独的水凝胶通过其中的过氧化氢酶催化过氧化氢分解进而供氧促进糖尿病伤口的愈合。同时，COC@SalB-Cu水凝胶治疗组的促创面愈合性能最好，应当为纳米酶级联催化使其具有更优异的供氧效果以及纳米酶促进血管重塑共同作用的结果。综上，实施例4制备的供氧纳米酶自愈合水凝胶具有良好的促糖尿病慢性创面修复作用。

本发明通过一步法在水相中以多酚类化合物丹酚酸B为配体合成丹酚酸B铜团簇纳米酶，进一步的，将丹酚酸B铜团簇纳米酶负载于基于过氧化氢酶的天然高分子自愈合水凝胶网络中，水凝胶组分中的天然过氧化氢酶有助于协同催化供氧，进一步提升氧气产生效率。使用多酚类化合物丹酚酸B为配体一方面能够提高铜团簇的稳定性，调控其类酶催化产氧性能，另一方面也是实现组织修复过程中对于血管内皮细胞调控的关键，进一步恢复血供，促进供氧。

本发明不同于传统依赖气态氧为氧源的供氧策略，通过原位级联催化将多余活性氧转化为过氧化氢进而催化产生溶解氧，从而能够有效避免传统输氧方式组织穿透深度有限、作用时间短等不利因素。本发明中纳米酶自愈合水凝胶的组分均为天然活性物质或体内微量元素，具有高生物安全性，并且其制备方法简单易行，反应条件温和，无需复杂的仪器设备。由羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶共交联的自愈合水凝胶用于负载丹酚酸B铜团簇纳米酶可以较好地适应创面形状，并且同时实现清除活性氧，改善氧化应激和缓慢释放氧气的功能。此外，丹酚酸B铜团簇和氧气释放的共同作用可以促进血管生成，进一步恢复血供、促进创面微环境调控，本发明的纳米酶自愈合水凝胶在糖尿病慢性创面等缺氧和血管损伤导致的组织缺损的修复方面具有巨大的应用潜力。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims

1.一种具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤1)具体过程为：将硫酸铜溶液和丹酚酸B溶液混合后搅拌均匀后加入抗坏血酸，加热下反应得到丹酚酸B铜纳米团簇。

3.根据权利要求2所述的具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，加热的温度为40-50℃，时间为6-24小时。

4.根据权利要求1或2所述的具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，丹酚酸B、抗坏血酸与硫酸铜用量比为1-5μmol：100μmol：10μmol。

5.根据权利要求1所述的具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2)中，羧甲基壳聚糖的氨基或过氧化氢酶的氨基与醛基化硫酸软骨素的醛基进行席夫碱反应，形成自愈合水凝胶。

6.根据权利要求1所述的具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2)的具体过程为：将丹酚酸B铜团簇纳米酶分散于醛基化硫酸软骨素溶液中，再与羧甲基壳聚糖溶液和过氧化氢酶溶液混合，形成具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶。

7.根据权利要求1所述的具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，羧甲基壳聚糖、醛基化硫酸软骨素和过氧化氢酶的质量比为2.5-5：5：0-0.25。

8.根据权利要求1所述的具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，丹酚酸B铜团簇纳米酶在具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶中负载量为1-8mg/mL。

9.一种根据权利要求1-8任一项所述方法制备的具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶。

10.一种根据权利要求1-8任一项所述方法制备的具有催化供氧性能的纳米酶自愈合水凝胶在糖尿病创面修复中的应用。